Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно- биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно- биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им. М.П. ЧУМАКОВА

на правах рукописи

ГМЫЛЬ Лариса Вениаминовна

Молекулярно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки

03.00.06 - Вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л+ £ /-'---

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им. МЛ. ЧУМАКОВА

на правах рукописи

ГМЫЛЬ Лариса Вениаминовна

Мол скул ирно-биологическая характеристика вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки

03.00,06 - Вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени , кандидата биологических наук

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Кандидат биологических наук Каргшюва Галина Григорьевна, Кандидат медицинских наук Смирнова Светлана Егеньевна

Доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович,

Кандидат биологических наук Викторова Екатерина Георгиевна

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Защита состоится 2.3 2004 г. в часов на

заседании диссертационного совета Д.001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им, М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан /¿гРс/ХяЙ^?2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Медведкина О. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Крымекая-Конго геморрагическая лихорадка (ККГЛ) - природно-очаговая арбовирусная инфекция человека. Вирус. ККГЛ вызывает тяжелое острое лихорадочное заболевание, сопровождающееся геморрагическим и интоксикационным синдромом, с высокой летальностью до 50%. Для вируса ККГЛ характерно существование длительно молчащих очагов,: где имеет место циркуляция вируса в клещах и отсутствие случаев заболевания человека, с последующим неожиданным подъемом заболеваемости. Случаи заболевания ККГЛ регистрируются в странах Европы, Азии и Африки, В последние несколько лет наблюдалось значительное увеличение заболеваемости ККГЛ в южных регионах России, таких как Ростовская область, Волгоградская область, Ставропольский край и республика Калмыкия (1999-2000 гг.).

Актуальность изучения свойств вируса ККГЛ определяется тяжестью заболевания, высокой летальностью,: , широким распространением в мире, отсутствием вакцинных препаратов и скудностью знаний молекулярной биологии этого вируса. .

Цель я задачи работы Целью данной работы было изучение основных молекулярно-биодогических характеристик генома .вируса ККГЛ и виру специфических белков, синтезирующихся при репродукции вируса ККГЛ в культуре клеток. Дня этого необходимо было решить следующие задачи;

1. Определить нуклеотидную последовательность РНК 5, М сегментов и фрагмента Ь сегмента прототипного азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ и определить потенциальные характеристики вирусспецифических белков. , ■ ,

2. Провести сравнение полных нукдеотидных последовательностей . Б и М сегментов и фрагментов Ь сегментов и. выявить '■филогенетические взаимоотношения между штаммами вируса

ККГЛ из разных регионов мира.

3. Подобрать оптимальные условия для адаптации вируса ККГЛ к культуре клеток Уего-Еб, получить вариант, адаптированный к этой культуре, и изучить его свойства.

4. На модели полученного адаптированного к клеткам варианта штамма Ходжа идентифицировать и охарактеризовать структурные и неструктурные белки вируса ККГЛ, синтезирующиеся в процессе инфекции в культуре клеток Усго-Е6.

Научная новизна В результате проведенных исследований

впервые была определена полная нуклеотидная последовательность ; - ______..

- ..... ;

| у . '¿'¿{РТ-в

РНК Б и М сегментов прототипного азиатского штамма Ходжа, выделенного в 1967 году в СССР. Впервые для вируса ККГЛ была определена нукяеотидная последовательность фрагмента РЛК Ь „сегмента.для 4 штаммов, выделенных, в разные-годы и в разных .регионах ;; мира. . На основании полных нуклеотидных последовательностей 5и М сегментов, а также на основании части последовательности Ь сегмента были определены филогенетические отношения между штаммами вируса ККГЛ. Было показано, что филогенетические , группы формируются соответственно географическому месту циркуляции вируса на основе данных для в и Ь сегментов. По данным для полных М сегментов пггаммы вируса ККГЛ достоверно группируются в три кластера не зависимо от места, времени и источника выделения, этих штаммов. Получены .указания на возможность реассортации сегментов между природными штаммами вируса ККГЛ.

-.: Впервые, применен метод совместного культивирования инфицированных и не инфицированных клеток для адаптации вируса ККГЛ к культурам клеток. Впервые были идентифицированы и охарактеризованы структурные и неструктурные белки вируса ККГЛ.

Научно-практическая значимость работы

1. В данной работе была определена часть нуклеотидной последовательности Ь сегмента, что облегчит в дальнейшем расшифровку полной последовательности генома возбудителя такого тяжелого заболевания человека, как ККГЛ, и позволит провести функциональное картирование его генома.

2. Получен вариант вируса ККГЛ, адаптированный к-культуре . клеток, с более быстрым и высоким уровнем репродукции'в клетках.

Использование такого варианта позволит упростить наработку антигенного материала, удешевляет и облегчает приготовление диагностических наборов. Кроме этого,1 открываются новые возможности для получения вакцинных препаратов против вируса ККГЛ на культурадьном субстрате.

3. Для пополнения коллекции в процессе работы были идентифицированы и закреплены в пассажах б новых штаммов вируса ККГЛ, выделенных из клещей, собранных во время вспышки в Ставропольском крае в 2000 г»

4. Был предложен метод по выявлению РНК вируса ККГЛ с помощью обратной транскрипции и нолимеразной цепной реакция (ОТ-ВДР) на основе праймеров, подобранных к 8 и М сегментам. Схема метода позволяет исключить ложноположителъные случаи выявления РНК и использовать этот метод как в диагностических целях, так и для молекулярно-энидемиологаческих исследований.

А

Положения, выносимые на защиту:

1. Определены полные нуклеотидные последовательности РНК S и М сегментов, а также 5'-концевого участка внрионной РНК L сегмента прототнпного азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ. Определены также нуклеотидные последовательности 5*-концевого участка внрионной РНК L сегмента еще для 3-х штаммов вируса ККГЛ, выделенных на юге России и в Африке.

2. Филогенетический анализ показал, что группирование штаммов вируса ККГЛ на основе полных нуклеотидных последовательностей S и L сегментов идет по географическому признаку, а на основе полных нуклеотвдяых последовательностей М сегментов штаммы кластеризуются не зависимо от места их выделения. Таким образом, получены указания на возможность реассортаиши сегментов между природными штаммами вируса KKTJT.

3. По данным филогенетического анализа штаммы из Центральной Азии генетически более близки к китайским штаммам.

4. Адаптация вируса ККГЛ к кулыуре клеток Vero-Eó приводит к увеличению скорости и уровня репродукции этого вируса в клетках. Кроме того, адаптированный вариант оказывает ЦПД на эти клетки,

5. Идентифицированы и охарактеризованы виру сспецифичес кие белки, синтезирующиеся при репродукции вариантов Ходжа-А и Ходжа-М вируса ККГЛ в культуре клеток Vero-Eó. Белок р55 является нуклеокапсидным белком N, gp78 - структурным поверхностным белком Gl, а рЗб — структурным поверхностным белком G2,

6. Возможны альтернативные пути процессинга вирусных полипротеинов, кодируемых М сегментом, часть из которых реализуется.

7. Предложены и использованы праймеры для одновремешюго выявления РНК S и М сегментов вируса ККГЛ методом ОТ-ПЦР.

Апробация работы Материалы дассергации были доложены на: Научной конференции «Актуальные вопросы медицинской вирусологии», посвященной 90-летию со дйя рождения М.П. Чумакова (Москва, 23-25 ноября 1999 г.), VIH сьсздс всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-28 марта 2002 г.), Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses (Pisa, Italy, June 14 -19, 2003 г.), заседании Межлабораторного ученого совета ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМИ (26 нюня, 2003 г.), Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 4-5 сентября 2003 г.).

Публикации По результатам работы опубликовано 2 статьи в научных журналах, 6 - в сборниках материалов- научных конференций и 1 тезисы доклада на международной конференции. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 138 страницах компьютерного текста и состоит из традиционных разделов. Диссертация содержит 24 рисунка и 10 таблиц.'Список литературы включает 171 источник.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы_ В работе были использованы 15 штаммов • вируса ККГЛ, выделенных на юге России, в Таджикистане, а Узбекистане и в разных регионах Африки. Девять штаммов были получены из коллекции лаборатории геморрагических лихорадок ИПВЭ им, М.П. Чумакова РАМН, а 6 цпаммов были выделены в ходе данной работы. Основной моделью для изучения являлся узбекский штамм -Ходжа-М, пассируемый через мозг новорожденных белых мышей (ном), и полученный из1 него в : процессе данной работы вариант Ходжа-А, адаптированный к культуре клеток Vero-E6. ' " '

Работа была проведена на культуре клеток ночек зеленой мартышки Vero-Еб, которую культивировали, как описано ранее (Дзагурова и др., 1988).

Выращивание и титрование вирусов на нбм и по ЦПД в культуре клеток Vero-Еб с помощью НФА и непрямого МФА проводили, как описано ранее (Смирнова и др., 1979, 1997). Концентрированный вирус получали либо

ультрацентрифугированием вируссо держащей культуральной - жидкости (КЖ), либо осаждением с помощью 18% ПЭГ по ранее описанной методике (Дживакян и др., 1990).

Препараты вируса ККГЛ, меченные по белку, РНК, углеводам, а также двойной меткой, получали, как описано ранее (Дживанян и др., 1990). В качестве антисыворотки использовали иммунную асшггную жидкость (ИАЖ) против вируса ККГЛ, приготовленную по известной методике (Смирнова и др., 1997).

Обработку инфицированных клеток туникамицином проводили как описано в работе Гмыль и др, (2001).

Иммунопреципитацйю (ИП) вирусспе пифических белков осуществляли с применением ИАЖ против штамма Ходжа-М вируса ККГЛ с использованием протеин-А-сефарозы (Pharmacia, Швеция) с последующим электрофорезом в п о лиакри ламп дном геле (Ляпустин и др., 1988).

Ультрацентрнфугярование вируса ККГЛ в градиенте плотности сахарозы и выделение нуклеокапсидов вируса проводили, как описано в работе Гмыль с соавторами (2001).

б

Выделение РНК осуществляли экстракцией горячим фенолом. Синтез кДНК проводили в реакции обратной транскрипции со специфическими праймерами. Далее, при помощи ПЦР амплнфицировали специфические ДНК фрагменты. Некоторые из них клонировали в плазмиду E.coli и затем определяли нуклеотидную последовательность согласно инструкции к набору для сехвенирования «DNA Cycle Sequencing System», (Promega, США). Каждый полученный клон секвенировали три раза. Полученные нуклеогндные последовательности были выравнены при помощи программы ClustaiX (Thompson et al., 1997) с полными последовательностями других штаммов вируса ККГЛ, доступными в ГенБанке. Построение филогенетических деревьев проводили с помощью программы ClustaiX по алгоритму "Neighonr-joinmg". Компьютерный анализ нуклеотадвых и аминокислотных последовательностей проводился с использованием программы GeneRunner.

Результаты и обсуждение

На момент начала исследований в ГенБанке уже имелось 10 полных нуклеотидных последовательностей S сегментов разных штаммов вируса ККГЛ, а также 1 полная последовательность М сегмента. Подобрав праймеры к уже имеющимся нуклеотидпым последовательностям, мы амплнфицировали два перекрывающихся кДНК-фрагмента S сегмента и три перекрывающихся кДНК-фрашента М сегмента, которые были клонированы в плазмиду и отсеквенированы, Таким образом, быян определены полные нуклеотидные последовательности S и М сегментов прототипною узбекского штамма Ходжа вируса ККГЛ. Разработка схемы амплификации, а также подбор необходимых олигонуклеотидов для получения фрагментов L сегмента оказались сложной задачей. Все предпринятые попытки получить ДНК-фрагменты, содержащие L сегмент вируса ККГЛ, при использовании вырожденных олигоыуклеотидных праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности L сегмента вируса Дугбе (данный вирус являлся единственным представителем найровирусов, для которого определена нуклеотидная последовательность L сегмента), оказались безуспешными. Однако, при амплификации ¿"'-конца вирионной РНК М сегмента было замечено постоянное присутствие в ПЦР-пробах специфичного для вируса ККГЛ ДНК-фрагмента длиной -700 пар нуклеотидов. Данный фрагмент был выделен из геля, клонирован в бактериальную плазмиду и частично секвенирован со специфичных для плазмидагай последовательности олигонуклеотидов. Сравнение секвенированных участков клонированного ДНК-фрагмента с известной нуклеотидной и

выведенной аминокислотной последовательностями L сегмента вируса Дугбе позволило заключить, что .данный фрагмент является 51-концевым участком внрионной РНК L сегмента вируса ККГЛ.

На основании полученной последовательности нуклеотидов был синтезирован антисмысловой олигонуклеотид LB1 . и использован в паре со смысловым .од и гону клеотидом MEt в ПЦР. Это позволяло нам амшшфициррвать ДНК-фрагмент длиной -1300 пар нуклеотидов. Фрагмент был клонирован и секвенирован. Таким образом, нами была определена нукяеотндаая последовательность ДНК, комплементарная 5*-концевому участку геномной РНК L сегмента прототшшого азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ, а также фрагменты L сегментов еще 3 штаммов вируса ККГЛ..

После того, как мы отсеквеиировали S, М сегменты штамма Ходжа и фрагменты L сегментов 4 штаммов вируса ККГЛ, нами был проведен филогенетический анализ полные последовательностей S и М сегментов штаммов вируса ККГЛ, уже имеющихся в ГенЕанке, а также фрагментов L сегментов отсеквенированных нами штаммов. Проведенный нами анализ полных S сегментов 23 различных штаммов вируса ККГЛ (рисЛ) в целом подтвердил существующую концепцию географического распределения генотипов вируса ККГЛ вне зависимости от времени и источника выделения. Все штаммы по S сегменту разделились на 7 кластеров, при этом штаммы греческий Ар-92," сенегальский Dak8494 и угандийский Ug30l0 имели наибольшие отличия от других штаммов ■ вируса ККГЛ и сформировали отдельные ветви. Анализ отсеквенированного нами узбекского штамма Ходжа показал, .что он достоверно группируется с китайскими штаммами. Эти данные подтверждают недавно полученные результаты для другого узбекского штамма TI10145, выделенного из клещей в 1985 г. Узбекские штаммы кластеризуются с разными китайскими штаммами .и нуклеотидные различия между ними составляют 7,8% (рис,),), Возможно, на территории Узбекистана циркулируют несколько различных подтипов вируса ККГЛ, или за 20 лёт произошла смена популяции одного подтипа зируса ККГЛ на другой. С другой стороны сравнение астраханского ' штамма Дроздов П967) и ростовского .1128044 (2000), выделенных на близко лежащих территориях юга России с разницей s 30 лет, показал, что эти штаммы имеют, .незначительные нуклеотидные отличия на 1,3%, что указывает на высокую стабильность локальных вирусных популяций, причем скорость, эволюции, по-видимому, зависит от особенностей данного локального очага (рис, 1).

Филогенетический анализ. М сегментов проводили на основе 11 полных нуклеотндных последовательностей, уже опубликованных в ГенБанке, и одной отсеквенпрованной нами для

S

штамма Ходжа. Сравнительный анализ аминокислотных

последовательностей показал, что кодирующая область М сегмента

, ом,

80

100

-Оц^кШАгПЭг

0,5% 96

М£ШСв1»

- СЬ7МВ,Х|П1*. И]»(чдиш| ■ С4ТММ, Юта, (У78(тмяи*> СЬШ1№ Кнткй, ДО

98

9 100

100

59

82

94

100

100 63

Г

I- СМШ. К«™*, 1»Ч <КМЦ>

Кш^ (и»)

1.1«

^ НУ13, Кжп*, 1ЖЯ (шкво

ЛД*

7,8%

47

т

ТИМ45, У-Ляжл««, Швв (шна> — НшЬЬ», Уабндетм. МТ (ч«мвш>

р Л7!>»1, Кто*. 1И» №**ии»к)

9,9%

100

■ »•^•«-и.Иртк, ИТ6

7,6% ряо.пы»™,»*»

100

14,5% 100

ж

' ■■ - та

ДОкчПпокпи. ИТбЙсмО Щ-ОХЛ'Л, Лстриявь,

ТСЯЖ, Ростов, ЯН» <«лнц НиЭТПЗ, СгИрмлт, 2*** <*«ов«и)

17,6% 19.1%

7,3%

- иАг1*МЬН>г<рм, 1»М{кн«) ' ЯРГ 41!, ЮАР, 19в5 (шт)

21.2%

22,2%

- и«И>Л Угаиэ. 1И8 Счмом*)

- ОАКМН Смиты, |ИП|

- ЛР92,Гг»<иц 1976 <*л™) -НА2АЯА

31

52

53

84

Рисунок 1. Дендраграм ма сходства нуклеотидных последовательностей РНК 8 сегмента штаммов вируса ККГЛ,

делится на два участка: высоковариабельный и консервативный. Гетерогенность между нуклеотидными последовательностями в высоковариабельном регионе очевидна, и различия между штаммами составляют от 0,1 до 38%, а по аминокислотной последовательности от 0,4 до 30%, Однако, построение отдельных

филогенетических деревьев на основе нуклеотидных последовательностей вариабельного и консервативного участков М сегмента показало, что■/топология филогенетического: дерева остается неизменной. По-видимому, оба участка М сегмента эволюционируют вместе.

рк,

-ЯгЗ.Пжкнсгт.ЗОв»

- НмЫн, Узбмастзи, 1М7 <щ«доаек>

1401

і

ВарЫ-11,Прич т<

СЬТМЗчК»тЯ, 1978 (чыоэднЗ ІЬАг ІвПМ, Ніпрії, 1966 (ка«ц>

- СЫ5Ш9, Капі. 1966 (чиошк)

- Мшіп, Піккпи, Ш6 (чоловік) СЬЫЮ, Кіп І, 19»! М

СЪОДб6,Кат*й, Ю8в (человек) СЬ71»1, Кип«, 1979 (чеяомк)

КнтаМі Ш9 Ітушгаичак)

МІ

|М2

|мз

Рису но к 2. Декдрограмма сходства нуклеотщшых последовательностей РНК М сегментов штаммов вируса ККГЛ.

По данным филогенетического анализа полные кодирующие последовательности М сегментов 12 штаммов вируса ККГЛ достоверно группируются в три генетически различные группы не зависимо от места, времени и источника выделения этих штаммов (рис.2). "

При сравнении филогенетических деревьев, построенных на основании полных 5 и М сегментов, мы заметили несоответствия. Два китайских штамма СЬ7001 и СЬ79121, формирующие группу МЗ, достоверно составили единую группу со штаммом Ходжа по Б сегменту, а на дереве, построенном на основе М сегмента, штамм Ходжа оказался в другой филогенетической группе М1, и

нуклеотидные отличия между китайскими штаммами СИ7001 и Ch79121 и штаммом Ходжа стали значительными. Кроме того, два пакистанских штамма, Мартин и SR-3, кластеризующиеся вместе по S сегменту, попали в разные филогенетические труппы по М сегменту (рис.1 и 2). Подобные перестановки штаммов вируса ККГЛ на дендрограммах свидетельствуют о реассортации сегментов при смешанной инфекции в переносчиках или прокормителях. Распространение вируса с одного континента на другой, по-видимому, осуществляется перелетными птицами, которые могут переносить иксодовых клещей на большие расстояния (Hoogstraal, 1979; Zeller et al., 1994). Нами это впервые показано для представителей семейства Bunyaviridae, переносимых клещами.

Нам впервые удалось отссквенировать часть L сегмента для четырех штаммов вируса ККГЛ, выделенных в разных регионах мира. Мы отсеквенировали З'-нетранслируемую область (НТО) и конец кодирующего региона L сегмента. Для всех штаммов мы получили разную длину З'-НТО от 229 до 254 нт, при этом длина кодирующего региона в полученных нами фрагментах у всех 4 штаммов оказалась одинаковой. Длина З'-НТО вируса Дугбе в два раза короче и составляет 104 irr. Сравнительный анализ участков отсеквенироваипых нами нуклеотидных последовательностей З'-НТО L сегментов 4 штаммов вируса ККГЛ и еще одной последовательности, любезно предоставленной нам английскими коллегами,. показал, что наиболее близкими друг другу оказались два африканских штамма. Два азиатских штамма составили также единую группу, а европейский штамм из Астрахани хоть и сформировал отдельную ветвь, но лежал ближе к африканским штаммам.

Анализ только кодирующей области L сегмента показал сходную топологию филогенетического дерева, хотя вероятность формирования кластеров значительно уменьшилась из-за высокой гомологии анализируемых участков. Опираясь на нуклеотидные последовательности 1, сегментов только 5 штаммов, сложно делать какие-либо заключения, но можно предположить, что по L сегменту штаммы вируса ККГЛ будут кластеризоваться по географическому признаку вне зависимости от времени и источника выделения этих штаммов, как было показано при филогенетическом анализе и по S сегменту. .

Н<*ЬЬа, Узбекистан, 1$67 (человек)

98

■ КЗД-243, Астрахань, 1984

00

1ЬЛг19200, Нш^рня, 1966 (клещ)

1ЬАи762в, Нинряя, 1965 (к«и»). ' , V

Увдуиок 3. Дендрограмма сходства 5'-концевой част иуклйоггвдных последовательностей РНК Ь сегмента штаммов вируса ККГЛ.

В ходе данной работы были подобраны праймеры для специфической идентификации РНК М и 3 сегментов основных циркулирующих генотипов вируса ККГЛ: два пранмера длиной 20 ну клсотидов (МЕ2 к МЕЗ), комплементарные наиболее консервативным областям М сегмента, и два праймера, комплементарные нуклеотидной последовательности 5 сегмента. Еще один праймер (МЕ1) для обратной транскрипции нам удалось подобрать так, чтобы его последовательность была комплементарна З'-концу геномной РНК-М и 8 сегментов. Этот праймер оказался универсальным для получения кДНК как М, так и Б сегментов одновременно, что по желанию позволяет амплифицировать фрагменты обоих сегментов любых штаммов вируса ККГЛ. Благодаря данной схеме появилась возможность уменьшения числа ложноположительиых результатов и использования продуктов ПЦР для дальнейших молекулярно-биологических исследований обоих сегментов.

ОТ-ПЦР с использованием предложенных праймеров специфично выявил РНК 16 штаммов вируса ККГЛ, выделенных в период с 1969-2000 гг. в разных регионах России, в Болгарии, в

Центральной Азии ' й Африке. При использовании в качестве вируссодержащего материала 10% мозговой суспензий инфицированных мышей нам удалось выявить 10 ЛД50 вируса. При использовании лизатов и КЖ инфицированных клеток результаты выявления вируса с помощью ИФА и ОТ-ПЦР полностью совпали по числу положительных проб.

Анализ " нуіслеотидной . и выведенной аминокислотной последовательностей 8 сегмента штамма Ходжа проводили., с помощью программы Оепегцпег. Полная длина РНК Б сегмента штамма Ходжа вируса ККГЛ составляет 1673 нт (рис.4). Длина НТО на 5'-конце 56 нт, а на 3*-конце 169 нт. Сравнение нуклеотидных последовательностей 3'- й 5'-кондов показало, что 29 нт на обоих койцах; частично коплементарны друг другу. РНК в сегмента штамма Ходжа, как и у других штаммов вируса ККГЛ, в комплементарной последовательности имеет большую ОРС длиной 482 ак, которая кодирует белок с расчетной мол. массой 53Д,кДа (рйс:4), Предполагаемая изоэлсктрическая точка белка.,-. 8,3. .Пр#. анализе аминокислотной последовательности, 8 сегмента штамма Ходжа, мгі обнаружили 4 потенциальных сайта гдикозилирования по М-типуі Три из них консервативны у всех отсеквенированпых уже на данный момент штаммов вируса ККГЛ. Кроме большой ОРС в вирионной РНК Б сегмента имеется дополнительная ОРС длиной 474 нт, которая потенциально могла бы кодировать белок с молекулярной массой 17,ЗкДа. ОРС, кодирующая белок 17,3 кДа; (рис.4), консервируется во всех РНК 8 сегментов отсеквенированных на данный момент штаммов вируса ККГЛ, кроме греческого штамма Ар-92.

ШВт

221275 293 475

Рисунок 4. Схема кодирования РНК Е> сегмента штамма Ходжа вируса ККГЛ. А:.- потенциальные сайты гликозвлирования.

Полная длина РНК М сегмента штамма Ходжа вируса ККГЛ составляет 5356 нт. Длина НТО на 5'-конце 77 нт, а на 3'-конце 210 пт. Сравнение нуклеотидных последовательностей 3'- и 5'-концов

и

РНК М сегмента показало, что 23 нт на обоих концах частично коплеменгарны друг другу.

Анализ нуклеотидной последовательности М сегмента штамма Ходжа вируса ККГЛ показал, что в комплементарной росдедовательности содержится большая ОРС длиной 1689 ак, кодирующая полипротеин с расчетной молекулярной массой 187,3 )сДа с р! .7,7 (рис.5). Последовательность подипрэтеина. содержит 13 потенциальных сайтов гликозилирования по N-типу, 7 из которых консервативны для всех отсеквенированных штаммов вируса ККГЛ. Анализ аминокислотной последовательности, кодирующей поли протеин, показал наличие 6 трансмембранных доменов в положениях: 1-19 ак, 697-721 ак, 825-847 ак, S69-903 ак, 979-1005 ак и 1623-1689 ак (рнс.5). Для вируса Дугбе известен N-конец белка G1. По аналогии с вирусом Дугбе мы предсказали для штамма Ходжа место предположительного отщепления N-конца белка G1 от большого полипротеина и расчетную молекулярную массу белка G1, которая равна 72,6 кДа. Более детальный анализ последовательности, кодирующей беяок G1, показал, что этот белок имеет один трансмембранный региону положении 1590-1625 ак не далеко от С-конца, а следовательно, этот белок может заякореваться в мембрану и является поверхностным структурным белком. Так же можно предсказать, что pi этого белка,- 7,39, и он имеет три сайта гликозирования по N-типу. Два из них консервативны для всех пггаммов. Недавно для штамма Матин были предсказаны сайты расщепления высокомолекулярного предшественника, кодируемого М сегментом (Sanchez et al, 2002). По аналогии с этим штаммом мы провели анализ кодирующей области М сегмента штамма Ходжа (рис.5). Тетрапептиды RRLL и RRPL являются сайтами отщепления клеточной протеиназой N-концов поверхностных гликоп'ротеинов G2 и G1, соответствешю. Потенциальный сайт RKLL, вероятно, является С-концом белка G2. Кроме этих основных сайтов разрезания был предсказан дополнительные сайт в положении (249 ак), который консервируется у всех штаммов ККГЛ и вируса Дугбе (рис.5). При реализации этого сайта расщепления может образовываться низкомолекулярный белок 23,5 кДа. Черными полосами на рис.5 изображены транс-мембранные домены, после которых есть вероятность расщепления клеточными сигнал азам и. В таблице указаны наиболее вероятные пути реализации генома М сегмента. Такое большое количество путей расщепления большого полипротеина, кодируемого М сегментом, на предшественники структурных гликопротеинов демонстрирует вариабельность способов процессинга белков вируса ККГЛ (рис.5 и табл.1).

»

Мупвно-аодобний

ШШ ■ 1 жш»

125 в^З 10« 16»

RSKR RttLL RKLL RKPL

Рисунок 5- рхрма кодирующей области РНК Мсегмента вируса ККГЛ (цгтамм Ходжа),

ТаблйцяЛ Потенциальные ^ сайты расщепления в белки, кодируемые аминокислотной последовательностью М сегмента штамма Хпджа вируса ККГЛ.,

. Поза пи я* в выведенной аминокислотной последовательности,ак' Обозначен ая белкой Потенциально кодируемые белки, «Да

■ ■ от 1 до 1689 i- IIPe-G2-Gl 187,3

от 27 до 248 NSml 22,6

от 27 до 521 NSm2 53,2

от 27 до 807 Пре-GI 85,4 . .

от 253 до 521 NSm3 30,5.

от 253 до 807 TIpe-G2 63,»

от 524 дп 807 G2 32,3

от 524 до 847 Пре-GZ 36.3

от 524 до 905 ' ■ Пре-С2 42.6 ■

от 524 до 1005 IIpe-G2 53.7 '

от 811 до 1689 Пре-GI 94,6

or 905 до 1689 Пре-GI 88,4

от 1005 до 1689 Пре-С1 ■ .w.. ... .п..

от 1041 до 1689 G1 72,6

* Указаны позиции аминокислот от начала основной ОРС

На данный момент для штамма Ходжа и еще трех штаммов вируса 1 ККГЛ нами определена часть нуклеотидаой последовательности РНК Ь сегмента длиной 1336 нт|'состоящая из З'-нетранслируемой области, и кониа кодирующего решона комплементарной геномной РНК Ь сегмента. При более детальном анализе было установлено, что все штаммы вируса ККГЛ имеют разную длину З'-НТО. Кроме того, мы обнаружили, что 28 нт на 3'-конце у всех анализируемых последовательностей одинаковые.

Для- дальнейшего изучения путей реализация генома и характеристики вирусе пецифических. белков, сшггезирующихся в процессе репродукции штамма Ходжа вируса ККГЛ, "нужна .была адекватная модель для получения достаточного количества белков этого вируса. Известно, что вирус ККГЛ плохо адаптируется к

культурам клеток и не оказывает цитопатическое действие (ЦПД) на клетки. Подбор оптимальных, условий для культивирования вируса in vitro оказался не простой задачей. Для адаптации вируса ККГЛ к культуре клеток Уего-ЕЗб^ у нами был применен метод со^льтивирбвания инфицированных и неинфшированных клеток?В процессе адаптации штаМЙ Ходжа стал оказывать ЦПД на клетки Vero-Еб, а так же наблюдалось нарастание титров инфекционного вируса и вирусного антигена в КЖ и в лизатах инфицированных клеток. Новый вариант Ходжа-А, адаптированный к культуре клеток, обладал более быстрым и более высоким уровнем репродукции в клетках Vero-Еб и вызывал более медленную инфекцию при интрацеребральном заражении нбм. По данным электронной микроскопии вариант Ходжа-А имел сходную морфологию вирионов и морфогенез с исходным вариантом Ходжа-М. На основании серологических данных, получешщх в реакции ИФА и МФА с использованием.,., ИАЖ к обоим вариантам, можно сделать заключение, что вариант Ходжа-А не изменил своих антигенных характеристик (табл.2).

Таблица 2. Сравнительная характеристика вариантов штамма Ходжа, адаптированных к культуре клеток Vero-Еб (Ходжа-А) и мозгу белья мышей (Ходжа-М)^ '

Характеристики 1 Ходжа-А . . Ходжа-М

Культура клеток VeroE-6; ЦПД V + -

Максимальные титры АГ « КЖ(ЙФА) 1(512-1:1180 1:10-1:16

Максимальные титры АГв лимонах (ИФА) 1:512-1:2560

Максимальное кол-во инфицированных клеток (МФА).,. Время инфицирования 80% клеток (МФА) ' 1в0% к 4 суткам 80-85% K№1cjtkiin

Максима, титры инфекционного еируса » КЖ: Титроеание на ном Титрование на культуре клеток УегоЕ-6 3,5-4,0 kg ЛДк/0,1мл 3,5-4,5 IgAWOA мл Нв TDTpVCTtO ПО Ц11Д

Мыши (заражение нбм i/c): инкубационный период 7-9 суток 4-5«утек

титры « молу 4,7-5,3 ¡еЛДЛШл 7,2-74 иЛДа/0,Ь1Л

При использовании адаптированного варианта нам удалось идентифицировать вирусспецифические белки,., которые синтезируются при репродукции вируса ККГЛ в культуре, клеток Уего-Еб. Адаптированный вариант не подавлял клеточный белковый синтез. В зараженных клетках на 4 сутки на фоне, большого количества ..клеточных белков отмечали. значительное, накопление только одного вирусного белка с мол. массой 55 кДа.:: После проведения с помощью ИАЖ ИП белков из лизатов зараженных клеток, меченных [МС]-гидролгезатом хлореллы, были выявлены вирусспецифичные белки с мая. массами 83, 78, 57,55, 45, ;42, 36, 23 и 21 кДа (рис.6). Эти белки отсутствовали в контроле ней нфициро ванных клеток. Было отмечено, что в лизатах инфицированных клеток белки 57 и 55 кДа обычно идут широкой полосой, как один белок, но при небольших их количествах можно различить две отдельные полосы (рис. 6А). В ряде случаев, в ,.КЖ инфицированных клеток белки 55-57 кДа тоже можно было видеть в виде, двух полос (рис. 6С), и по электрофоретической подвижности они совпадали с их внутриклеточными формами.

Л Б В"

Рисунок Ви русс пгаифкчес кие белки вируса ККГЛ (карпанты Хо.т-ка-А и Ходжа-М), синтезирующиеся при репродукции в культуре клеток Усго-Ёб-Велки метили (14С]-гилролизатом хлореллы и выявляли с помощью ИП с ИАЖ И Злекторофореча & ПААГ, А - э лектрофореграмШ белков в лнзатах клеток; Б -хпектрофореграмма бспков в сконцентрированной ОС клеток; В - разделение бедков с мол. массой. 55 и 57 кД. Треки 3.7 - лизаты неикфииировакнш клеток; треки 4. 9 - КЖ незаряженных клеток; трек 1 - лнзат клеток, зараженный варнак) ом Холжа-М; 2, 6 - лилаты клеток, зараженный вариантом Ходжа-А; треки 5, 8 - КЖ клеток, зараженных вариантом Ходжа-А, Слева указаны молекулярные массы белков-маркеров.

Мозговой вариант, как и адаптированный не подавлял клеточный синтез. Накопление вирусспецифических белков в клетках, инфицированных вариантом Ходжа-М, было снижено, тем не менее, нам удалось установить, что набор вирусспецифических белков у мозгового варианта аналогичен набору у адаптированного варианта (рис 6А).

Для изучения белкового состава вирионов вирусную РНК варианта Ходжа-А метили {3 Н]-уридином, а белки [14CJ-гидролизатом хлореллы. КЖ инфицированных клеток концентрировали с помощью ультрацентрифугированих и разделяли в градиенте плотности сахарозы. Фракции, содержащие вирионы, выявляли по пику радиоактивности и инфекционности. В этих фракциях с помощью ИП были идентифицированы белки с мол. массами 83, 78, 55-57 и 36 кДа, однако без использования ИП выявлялось небольшое количество и клеточных белков. По аналогии с другими найровирусами мы предположили, что белок с мол. массой 55 кДа является нуклеокапсидным белком N, р78 - GI, рЗб -G2. Белок с мох массой 83 кДа, который выявлялся наряду с другими структурными белками в КЖ и лизатах инфицированных клеток, возможно, входит в состав вириона.

Для того чтобы узнать, какие белки входят в состав нуклеокапсида, вирионы разрушали с помощью тритона Х-100, а коровые ■ частицы очищали осаждением при ультрацентрифугиро вашш через 40% сахарозную подушку. В очищенных препаратах нуклеокапеидов были обнаружены мажорный белок 55-57 кДа н минорный белок с мол. массой около180 кДа. Описанный нами белок с мол. массой около 55 кДа является нуклеокапсидным белком N. Это совпадает с расчетной величиной, - полученной из данных о нуклеотндной последовательности S сегмента геномной РНК вируса KKTJI. Белок 180 кДа, вероятно, является полимеразой. В этом эксперименте не удалось разделить белки 55 и 57 кДа. Остается не выясненной природа бело с мол. массой 57 кДа и наличие его в нукпеокапсиде.

При выращивании вируса ККГЛ в присутствие [14С]-галактозы было обнаружено включение сахарной метки в белки с мол, массами 83, 73, 55-57 кДа. Кроме того, был выявлен белок с мол. массой 110 кД, который не был обнаружен в других эксперментах (рис.7). Нуклеокапсидный белок 55-57 кДа также метился другими сахарными метками: [14С]-глюкозамином н [14С]-макнозой (рис.7).

Характер гдцкозилировшия вирусспецифических белков определяли с помощью туникамицина, ингибирующего начальную стадию глшсознлирования по N-типу. За 2 часа до введения метки в

is

КЖ : инфицированных вариантом Ходжа-А клеток . Уего-Еб добавляли 1 мг/мд туникамицина. Вирусные низкомолекулярные белки не были обнаружены в этом эксперименте. При этом в .обработанных туникамицином лиззтах инфицированных клеток наблюдали изменение электрофорети чес ко й подвижности белков $р83 и ср78 (рис.7), что свидетельствует о том, что эти белки гликозилированы но К-гипу. Это подтверждает, что gp78 является поверхностным, структурным белком 01. Мы не получили данных, указывающих на то, что белок в2 - 36 кДа является гликопротеином. Это может быть связано с тем, что внутри клеток он накапливается в меньших количествах или содержание антител к этому белку в.ИАЖ крайне мало. Белок 55-57 кДа, меченный [14С]-гидролизатом хлореллы, в присутствие туникамицина не изменил подвижность в ПА А Г, однако наблюдалось снижение включения сахарных меток в этот белок (рис.11), хотя количество этого белка, меченного [14С]-гидролизатом хлореллы, не изменилось. Это свидетельствует О ТОМ, что хотя бы часть гликозклирования идет по И-типу. Мы не видели изменения подвижности белка 55-57 кДа в ПААГ. Возможно, не связанная с РНК негликозилированная форма нестабильна и быстро подвергаться протеолизу. Известно, что коровые белки не

А Б

1114 5 к 7 I ) 19 II II |)

+ +■ + - + - ■ . -туникамицик

Рисунок 7. Гликозилировакие вирусспештфическпх белков'впруса ККГЛ. А - вьшвление в лнгатач инфицированных клеток вирусспеиифкческих белков, включающих сахарную метку; Б - синтез виру специфических белков в присутствии гуникамишна. Треки 2. 4, И, 12 и 13 - меюрофоре грамма белков, меченных [14С]-гидролиз-атом хлореллы; треки К 3 - |14С)-галактозой; треки 5, б, 7 - [ 14С]-мэннозой; треки 8, 9, 10 - [14С]-глюкозами ном; треки 5, 8, И (+) -вирусные белка в инфицированных метках, обработанных туникамицином; треки 3, 4, 6, 9, 12 (-) - без обработки туникамицином; треки 1, 2, 7, Ю и 13-белки а незаряженных клетках. Слева указаны молекулярные массы белков-маркеров.

г ли козилируются. Однако при анализе аминокислотной последовательности Б сегмента штамма Ходжа, мы обнаружили наличие 4 потенциальных сайтов гликозшгарования по №типу, три из которых консервативны у всех штаммов вируса ККГЛ. При изучении вирусспецифпческих белков с использованием двумерного электрофореза нами были выявлены 8 форм белка 55-57 кДа с кратно отличающимися изоэлеюрическими точками в пределах р] 7,5-9,0 что совпадает с расчетными данными по аминокислотной последовательности для N белка штамма Ходжа. Можно предположить, что это 8 форм фосфорилирования белка. Ранее нами были предсказаны 12 сайтов фосфорилирования для белка N. вероятно, не все из них реализуются. При использовании сахарной метки при анализе белков в двумерном электрофорезе нами также были обнаружены 7 форм белка 55-57 кДа, но они отличались по изоалектрическим точкам от белков, меченных гидролизатом. Из восьми форм совпадали только четыре. По крайней мере, две формы, меченные [14С]-гидролизатом хлореллы, не метились сахарной меткой. Все изложенные данные позволяют предположить, что белок N находится внутри клеток в двух формах: гликозилированноЙ и негликозилированной. В составе яуклеокапсвда коровый белок находится в негликсии лированной форме, тогда как гликозилированная форма выполняет еще не известные функции. Тем не менее, МЫ не" можем ИСКЛЮЧИТЬ, что белки 55 и 57 кДа являются разными ■ вирусспецифическими белками, близкими по мол. массе и заряду, тем более, что потенциал кодирования для таких белков в геноме вируса ККГЛ есть (табл. 3).

В литературе данные о низкомолекулярных неструктурных белках найровирусов отсутствуют, хотя потетшал для кодирования подобных белков в РНК найровирусов большой. Нам» впервые были выявлены для вируса ККГЛ шгасомолекулярные неструктурные ' вирусспецифическяе белки с молекулярными массами 45,42,23 и 21 кДа.

Таким образом, полученные данные показывают многообразие способов созреиания белков вируса ККГЛ и, по-видимому, большинство предсказанных выше нами сайтов расщепления реализуется. Из таблицы 3 видно, какие из предсказании; белков синтезируются в процессе инфекции в культуре клеток \'еп>Е6. Эти данные значительно расширяют существующее представление о путях реализации генома у найровирусов.

Таблица 3. Вирус специфические белки вируса ККГЛ (ют. Ходжа), иредсказанные по данным анализа генома РНК ■■ выявляемые в КЖ и лвзатах инфицированных клеток.

Вируссптифические белки, Белки,' Обозначение'

выявляемые в КЖ и потенциально белков 1

лнзатак, инфицированных кодируемые в и М

клеток (кДа) сегментами (цДа)*

«Ш «5,4 Пре-С2

, .е»83 78 11р«-С1

ЕР 78 73 С1

55 53,9

53,9 ■ N ■:

.55-57 53,3 N5102

53,7 Пре-П!

45 ' 42,6 11ре-С2

« 36,3 Пре-С2

36 323 Пре-Г,1

23 22,6 N8011

21 173

* Позиции а вьшаденной аминокислотной последовательности указаны в таблице 2.

Выводи

1. Определены йодные нуклеотидные последовательности Э и М сегментов РНК прототипного азиатского штамма Ходжа вируса ККГЛ. Впервые для вируса ККГЛ определена часть нуклеотидной последовательности РНК Ь сегмента 4-х штаммов вируса ККГЛ.

2. По данным филогенетического анализа полные кодирующие последовательности 5 сегментов 22 штаммов вируса ККГЛ кластеризуются по географическому признаку вне зависимости от источника и времени выделения; штаммы, циркулирующие в Центральной Азии, составляют одну филогенетическую группу с китайскими штаммами. По данным филогенетического анализа полные кодирующие последовательности М сегментов 12 штаммов вируса ККГЛ группируются в три генотипа не зависимо

. от места, времени н источника выделения этих, штаммов. По данным филогенетического анализа фрагментов нуклеотидньгх последовательностей Ь сегментов 5 штаммов вируса ККГЛ группирование штаммов идет по географическому признаку. Получены свидетельства о возможности реассоргацни сегментов в эволюционной истории вируса ККГЛ. '

3. Получен вариант штамма Ходжа, адаптированный к клеткам Уето-Еб, который оказывает выраженное ЦПД, а также обладает более быстрым и высоким уровнем репродукции в этих клетках.

4. При репродукции вируса ККГЛ (штамм Ходжа) в культуре клеток Vero-Еб синтезируются вирусспецифические белки с молекулярными массами 180 кДа, 110 кДа, 83 кДа, 78 кДа, 55-57 кДа, 45 кДа, 42кДа, 36 кДа, 23 и 2ЬкДа. Вирусспецифические белки вируса ККГЛ 110 кДа, 83 кДа, 78кДа, 55-57 кДа являются гликопротеинами, а белки 83 кДа и 78кДа гликозилированы по N-типу. Белок 55 кДа является нуклеокапсидным белком N, гликопротеин 78 кДа — структурным поверхностным белкой Gl, а белок 36 кДа - структурным поверхностным белком G2.

5. Сконструированы праймеры для специфической идентификации РНК М и S сегментов основных циркулирующих генотипов вируса ККГЛ с помощью метода ОТ-ПЦР.

Список работ, опубликованные по теме диссертации

1. Смирнова С.Е., Карганова Г.Г., Гмыль Л.В. Адаптация вируса Крымской-Конголезской лихорадки к культуре клеток Vero-E6. Вопр. вирус'ач., 1997,1, с, 280-283.

2. Карганова Г.Г., Гмыль Л.В., Смирнова С.Е., Ткаченко Е.А., Лашкевич В,А. Белки вируса крымской-конголезской геморрагической лихорадки (ККГЛ). Сборник материалов научной конференции ИПВЭ РАМИ «Актуальные вопросы современной вирусологии» (23-25 ноября 1999 г.), М., 1999, с, 68.

3. Смирнова С.Е., Карганова Г.Г., Гмыль Л.В„ Соболев СтГ., Терешкина Н.В., Ткачснко Е.А. Сравнительное изучение вируса крымской-конголезской геморрагической лихорадки (ККГЛ) в пассажах mi виво и ин витро. Сборник материалов научной конференции ИПВЭ РАМН ^Актуальные вопросы современной вирусологии» (23-25 ноября 1999г.), М„ 1999, с. 86.

4. Гмыль Л.В., Карганова Г.Г., Смирнова С.Е., Лашкевич В.А. — Вирусспецифические белки вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки. Вопр. вирус on., 2001,3, с. 16-21.

5. Гмыль Л.В., Смирнова С.Е., Карганова Г.Г. Выявление РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки с помощью полимеразной цепной реакции. Материалы V1U Всероссийского Съезда эпидемиологов, микробиолологов и паразитологов, 2002, 3, с 243-244..

6. Смирнова С.Е., Карганова Г.Г., Гмыль Л.В., Седова А.Г., Тохов Ю.М-, Сысолятипа Г.В., Ковалев Н.Г., Яшкулов К.Б. Современное состояние очагов Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) на юге России. Материалы VIII Всероссийского Съезда эпидемиологов, микробиолологов и паразитологов, 2002,1, с 397-398.

7. Гмыль Л.В., Гмыль А.П., Смирнова С.Е., Карганова Г.Г. Фенотипические и генетические изменения вируса ККГЛ при адаптации к культуре клеток Vero-Еб. Материалы Научной конференции и VIII съезда Итало-Российского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 5-6 декабря 2002), 2002, с 80-81.

8. Hewson R., Lloyd G., Clegg С., Jamil В., Hasan R., Gmyl A.P., Gmyl L.V. , Smirnova S.E., Lukashev A.N, Karganova G.G. Sequence analysts of Crimean-Congo heamorrhagic fever virus. Abstracts, Twelfth International Conference on Negative Strand Viruses (Pisa, Italy, June 14 -19, 2003), 2003, p. 221.

p, Гмыль Л.В., Hewson R-, Clegg Ch., Смирнова C.E., Карганова Г.Г., Гмыль А.П. Молекулярная эпидемиология вируса ККГЛ по данным анализа S, М и L сегментов. Материалы Международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 4-5 сентября 2003), 2003, с. 130.

7 1 7