Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка и оптимизация условий ее культивирования

Жданова, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка и оптимизация условий ее культивирования
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка и оптимизация условий ее культивирования"

УДК 691:573.6:578

На правах рукописи

Жданова Наталья Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИОННОЙ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК ТЕСТИКУЛ ПОРОСЕНКА И ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ЕЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров-2008

003458950

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском I учно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробио гии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РО СЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель

доктор биологических наук, Сергей Григорьевич Юрков

профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Вера Ивановна Балышева

старший научный сотрудник

доктор ветеринарных наук, Виктор Николаевич Герасимов

старший научный сотрудник

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всеросс ский научно-исследовательский и технологический институт биологическ промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук.

Защита диссертации состоится 22 января 2009 года в II30 часов на заседай диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском НИИ вете нарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владим! екая обл., ГНУ ВНИИВВиМ. Тел./факс: (49243) 62125.

С диссертационной работой можно ознакомиться в научной библиоте

ГНУ ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан"

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Савукова В.Я.

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы

Развитие биотехнологии противовирусных вакцин во многом обусловлено достижениями в области выращивания культур клеток. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням животных до сих пор остается напряженной, несмотря на большой арсенал профилактических противовирусных препаратов [Бакулов И.А., 1998; Смирнов A.M., 2003]. В связи с этим актуальным является совершенствование биотехнологического процесса получения клеточного субстрата и вирусного сырья для разработки высоко эффективных вакцинных препаратов.

Наиболее перспективным в области крупномасштабного производства противовирусных вакцин для животных является суспензионный способ выращивания клеток и вирусов. Он имеет ряд важных преимуществ, основными из которых являются: возможность быстрого масштабирования клеток, получение клеток в одном ферментере с высокой плотностью популяции; равномерные условия клеточного микроокружения по всему объему выращивания; контроль и регулировка условий культивирования, высокая экономичность метода и др. [Самуйленко А.Я., 2000; Жестерев В.И., 2003; Воронин Е.С., 2005].

Эффективность использования этого метода для биотехнологии противовирусных препаратов во многом определяется биологическими характеристиками выбранного клеточного субстрата и тщательностью отработки параметров выращивания, оптимизацией условий культивирования вируса с сохранением его иммунобиологических свойств.

Однако, количество клеточных культур, способных к активной пролиферации при безопорном (суспензионном) способе выращивания, крайне ограничено. В тоже время отдельные стабильные варианты линий клеток даже одного происхождения, как правило, характеризуются совокупностью присущих только им ростовых, морфологических, генетических свойств, чувствительностью и уровнем пермиссивности к вирусам.

Коллекция клеточных культур ВНИИВВиМ располагает значительны числом сублиний и трофовариантов клеток тестикулярной ткани поросенк чувствительных к вирусам различных таксономических групп и имеющих п тенции к росту в суспензионных условиях [Горшкова Т.Ф. и др., 1996; Вишн ков И.Ф. и др., 1999; Балышев В.М. и др., 2000; Юрков С.Г. и др., 2000; Бал шева В.И., 2005]. В связи с этим, представляется актуальным получение перев ваемой линии клеток тестикул поросенка, способной к безопорному росту, о тимизация биотехнологических параметров их суспензионного культивиров ния, изучение и стабилизация их биологических свойств в процессе непреры ного суспензионного культивирования. Цель и задачи исследований

Целью исследования являлось получение суспензионной перевиваем линии клеток тестикул поросенка, оптимизация условий суспензионного кул тивирования клеток данной линии и оценка их вирусрепродуцирующей акти ности к адаптированным вирусам.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следу щие задачи:

1. Методом селекции получить новую сублинию перевиваемых клеток ПТ 1 способную к безопорному росту.

2. Оптимизировать условия суспензионного культивирования линии клето ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах (посевную концентрацию клеток, врем культивирования, скорость перемешивания, условия аэрации, состав питатель ной среды) для обеспечения их максимального накопления.

3. Стабилизировать основные биологические характеристики клеток ПТП-с/0 и определить пассажный интервал использования клеток, в течение которог сохраняется их стандартность, включая кариологические показатели.

4. Определить вирусрепродуцирующую активность линии клеток ПТП-с/06 адаптированным вирусам.

5. Изучить возможность использования ряда антимикробных препаратов дл

повышения уровня надежности процесса суспензионного культивирования клеток по фактору бактериальной контаминации.

Научная новизна

1. Получена новая суспензионная перевиваемая линия клеток тестикул поросенка ПТП-с/06, имеющая индекс пролиферации 4 - 6 в среде с 0,25 % ФГМС на солевом растворе Эрла (без солей кальция и магния) и 10 % сыворотки крови КРС.

2. Оптимизированы условия суспензионного выращивания перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах, обеспечивающие через 72 часа культивирования накопление клеток с плотностью 1,8 - 2,1 млн кл/см3.

3. Установлена пермиссивность линии клеток ПТП-с/06 к вирусу болезни Тешена (штамм «Закарпатский») и вирусу инфекционного гепатита собак (штамм «Корнелл-2»),

4. Определена возможность применения антибактериального препарата - цеф-триаксона и изучена его стабильность в среде при различных методах культивирования клеток для профилактики контаминации клеточных культур.

Практическая значимость работы

1. Получена и стабилизирована по биологическим свойствам суспензионная

перевиваемая линия клеток ПТП-с/06 и создан рабочий банк клеток изготовителя (БРКИ) для глубинного культивирования вирусов болезни Тешена и инфекционного гепатита собак.

2. Паспортизирована перевиваемая линия клеток ПТП-с/06, (паспорт утвержден директором ГНУ ВНИИВВиМ 01.02.2008 г.), и разработаны «Методические рекомендации по поддержанию и хранению перевиваемой суспензионной линии клеток ПТП-с/06», утвержденные в установленном порядке РАСХН.

3. Для профилактики бактериальной контаминации клеточных культур предложен цефтриаксон и схема его применения при различных способах культивирования клеток.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Культуральные, цитоморфологические, кариологические и вирусрепроду цирующие характеристики суспензионной перевиваемой линии клеток тес тикул поросенка ПТП-с/06 и ее использование в вирусологической практи ке.

2. Биотехнологические параметры суспензионного способа культивирован указанных клеток ПТП-с/06.

3. Стабильность биологических свойств суспензионной перевиваемой лин клеток тестикул поросенка ПТП-с/06 в процессе непрерывного суспензио ного культивирования (15 пассажей).

4. Биологические свойства, включая антимикробную активность, антибиоти цефтриаксона при различных способах культивирования клеток (стациона ный, роллерный монослойный и суспензионный способы).

Личный вклад соискателя

Основная часть диссертационной работы автором выполнена самосто тельно. Исследования по определению чувствительности линии клеток ПТ с/06 к вирусам различных таксономических групп проводились на базе лабор торий «Эпизоотологии» и «Музейных штаммов». При выполнении отдельны фрагментов работы оказывали методическую или консультативную помощь с трудники лаборатории «Культур клеток с музеем клеточных штаммов». Авто выражает искреннюю благодарность Юркову С.Г., Смысловой Н.Ю., Кушни С.Д., Анисимовой Л.И., Филатову A.B., Неверовской Н.С., Леонтьевой Н.А Телковой H.A., Стрижакову A.A., Бурдинской О.Н., Балышеву В.М., Румянц вой Е.А.

Апробация результатов

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях:

- Ученого совета ВНИИВВиМ (2006 - 2008 гг.);

- Международной научно-практической конференции «Научные основы прои водства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2007 г.;

- Научной секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной м

дицины Россельхозакадемии, Щелково, 2008 г.

Публикации по работе

Основные результаты диссертации опубликованы в 3 научных работах, в том числе 1 - в научном журнале по перечню ВАК.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Иллюстрирована 17 таблицами и 7 рисунками. Список используемой литературы включает 265 источников, в том числе 69 на иностранных языках.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

Культуры клеток: трофовариант перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП, культивируемый в среде с 0,5% ФГМС на солевом растворе Эрла с добавлением 10% сыворотки крови свиней; перевиваемые свиные гете-роплоидные клетки (ПСГК-60/cl) получены в 2007 г. Филатовым A.B., любезно предоставленная автором; сублиния перевиваемых клеток почки свиньи SK-6 (катал. № 58.2) из «Коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ» (2000 г.). Культуры клеток получены из лаборатории «Культуры клеток с музеем клеточных штаммов».

Питательные среды: Игла-МЕМ на солевом растворе Эрла с незаменимыми аминокислотами; 0,25% ферментативный гидролизат мышечных белков (ФГМС) на модифицированном растворе Эрла (без солей кальция и магния с увеличенным содержанием глюкозы 2 г/дм3). Питательная среда готовится для суспензионного культивирования ряда культур клеток и вирусов группой «Питательных сред и сывороток» в промышленных объемах.

Сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) квалификации «для культур клеток» изготовлена во ВНИИВВиМ из сырья, полученного в условиях мас-

сового убоя животных на мясоперерабатывающих предприятиях.

Вирусы: вирус болезни Тешена (ВБТ) штамм «Закарпатский» с инфекци онной активностью 8,0-9,0 lg ТЦД50/СМ3, инв. № 1790; вирус инфекционног гепатита собак (ВИГС) штамм «Корнелл-2» с инфекционной активностью 6,0 6,75 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 225. В работе использованы вирусы, полученные и лаборатории «Музейных штаммов».

Микрофлора: золотистый стафилококк - Staphylococcus Aureus (штамм 209Р), инв. № 2; кишечная палочка - Escherichia coli (штамм К-12), инв. № 17. Бактериальные штаммы получены из лаборатории «Бактериологии».

Культивирование клеток: перевиваемые культуры клеток поддерживал общепринятым методом последовательных пересевов в соответствии с «ИН' рукцией по приготовлению питательных сред и культур клеток» [Курносо А.Н., 1987].

Для диспергирования клеток при пересевах использовали смесь 0,02 % ра твора версена и 0,25 % раствора трипсина в соотношении 9 : 1 и 3 : 1 (в завис мости от вида культур) при температуре 37,5 ± 0,5°С.

Кариологические методы: для кариологического анализа хромосомны препараты готовили стандартным колхициновым методом с последующей окра ской 2%-ным водным раствором Гимза [Ford и др., 1956, Мамаева С.Е., 1988 Проводили подсчет числа хромосом в метафазных пластинах в 50-100 клетка каждой линии.

Вирусологические методы: титрование вирусов болезни Тешена и инфе ционного гепатита собак проводили в культуре клеток ПТП по общепринято методике [Сюрин В.Н. и др., 1984]. Титр вируса рассчитывали по Риду и Менч и выражали в логарифмах ТЦД 50/см3.

Бактериологические методы: стерильность расплодок клеток, питатель ных сред, сывороток крови, растворов, вирусного сырья определяли путем вы сева на жидкие и твердые бактериальные среды: мясопептоный бульон (МПБ мясопептонный агар (МПА), Китта-Тароцци, тиогликолевую, Сабуро.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами, используемыми в биологии [Лакин Г.Ф.,1980].

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка

2.2.1.1. Характеристика и оценка банка перевиваемой линии клеток тестикул поросенка музея клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ

Перевиваемая линия клеток тестикул поросенка ПТП (кат. № 10.1.) получена в 1988 г. Жуковским А.Н. и соавторами в Украинском НИВИ из первичной культуры тестикул поросят-гнотобиотов. В УкрНИВИ клетки выращивали в пристеночных культурах в среде с 5 % гемогидролизата и 10 % сыворотки крови КРС. Эта линия на уровне 68 пассажа поступила во ВНИИВВиМ, где ее поддерживали путем последовательных пересевов на протяжении 190 пассажей.

В лаборатории «Культур клеток с музеем клеточных штаммов» ВНИИВВиМ в банке храниться 10 монослойных перевиваемых линий клеток (ПЛК) тестикул поросенка. Данные клеточные линии обладают широким спектром чувствительности к вирусам различных таксономических групп (инфекционный гепатит собак, болезнь Ауески, болезнь Тешена, трансмиссивный гастроэнтерит свиней). Все сублинии культуры клеток ПТП при стационарном выращивании образуют конфлюэнтный монослой, состоящий из клеток эпителиоподобной формы, с четкими границами, с прозрачной цитоплазмой, а также из клеток округлой формы, находящихся на поверхности монослоя или в свободном состоянии. Клетки, находящиеся во взвеси, образуют конгломераты из 3 и более клеток, которые увеличиваются в размерах, то есть клетки способны размножаться в субстратнезависимом состоянии.

Оценка биологических характеристик всех трофических вариантов ПЛК тестикул поросенка позволила отобрать для исследований в качестве исходной культуры монослойную линию клеток ПТП, выращиваемую в среде с 0,5 % ФГМС и 10 % сывороткой крови свиней, культивируемую стационарным способом. Данная сублиния клеток ПТП не паспортизирована и заморожена на уровне 18 пассажа в 1991 г.

Бактериологический контроль показал, что данная клеточная расплодка н содержит бактериальных и грибных контаминантов и по результатам полим разной цепной реакции (ПЦР) свободна от микоплазм.

2.2.1.2. Трофическая адаптация отобранной популяции клеток ПТП к выращ ванию в среде 0,25% ФГМС с сывороткой крови КРС

Адаптацию перевиваемой линии клеток ПТП в среде с сывороткой кров КРС осуществляли на 4 пассаже после размораживания из жидкого азота в ма расах Ру методом последовательных пересевов без трофопаузы с полной зам ной сыворотки крови свиней на сыворотку крови КРС в конечной концентраци 5 %. Культивирование осуществляли в среде с 0,25 % ФГМС на солевом ра творе Эрла для монослойного выращивания клеток.

В течение пяти последовательных пассажей культура сохранила свои о новные цитоморфологические характеристики и ростовые свойства.

Таким образом, показано, что сублиния клеток тестикул поросенка облад ет высокой трофической пластичностью, что соответствует данным ряда иссле дователей [Кушнир С.Д., 1992; Ставничий Е.В., 2003; Стегний Б.Т., 2008].

2.2.1.3. Селекция и отбор пула перевиваемой линии клеток ПТП в условиях рол лерной суспензии

Сублиния клеток ПТП, адаптированная к ростовой среде с сывороткой кро ви КРС, использована для получения новой суспензионной сублинии клето ПТП методом селекции при безопорном способе выращивания в условиях рол лерной суспензии.

С целью отбора более устойчивого пула клеток ПТП уменьшили концен трацию сыворотки крови КРС до 1 %. Одновременно проводили адаптацию суспензионной среде 0,25 % ФГМС на солевом растворе Эрла без солей кальци и магния. Селекцию проводили в условиях роллерной суспензии в 0,5 дм3 фла конах при скорости вращения 18-25 об/мин методом последовательных пере севов. В течение первых 8 пассажей при посевной концентрации 0,15 - 0,20 мл кл/см3 отмечали незначительный прирост клеток. Через 48 часов определял

концентрацию жизнеспособных клеток по тесту витального окрашивания три-пановым синим, которая составляла 40 - 60 % живых клеток.

С целью защиты клеток от повреждений повышали вязкость среды, последовательно увеличивая содержание сыворотки в среде культивирования до 10%. При этом индекс пролиферации клеток в суспензии повысился до 2 - 2,5, а жизнеспособность клеток в суспензии достигла 70 - 78 %.

На уровне 30 - 35 пассажей отмечена стабилизация ростовых и цитомор-фологических характеристик клеток и отобрана суспензионная популяция клеточной линии тестикул поросенка (ПТП/с), которую в последующем и использовали для адаптации к выращиванию в лабораторных ферментерах.

Полученный трофовариант клеток заморожен по стандартной методике в криозащитной среде (питательная среда - 75 %, сыворотка крови КРС - 15 %, диметилсульфоксид - 10 %) и хранится в жидком азоте на 35 пассаже. При их размораживании из жидкого азота жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим находилась в пределах 80 - 85%. Клетки хорошо восстанавливали ростовые свойства на 2 - 3 пассаже.

Таким образом, в результате отбора трофоварианта перевиваемой линии клеток ПТП, выращиваемой на среде с 0,5 % ФГМС с 10 % сыворотки крови свиней, и ее переадаптации к среде с 0,25 % ФГМС на солевом растворе Эрла без солей кальция и магния, с 10 % сыворотки крови КРС в роллерной суспензии, получена ПЛК ПТП/с, способная к активной пролиферации при безопорном способе выращивания.

2.2.1.4. Адаптация клеточной популяции ПТП/с к выращиванию суспензионным методом в лабораторных ферментерах

Полученную ПЛК в течение 3 пассажей адаптировали к безопорному способу культивирования в лабораторных ферментерах фирмы «МА1ШВ18Н1», вместимостью 1 дм3, с автоматической системой поддержания параметров культивирования: температура среды, скорость вращения мешалки.

Выбрали в качестве исходных следующие параметры:

❖ поддерживающая среда - 0,25 % ФГМС на модифицированном растворе Э ла (без солей кальция и магния), с 10 % сыворотки крови КРС;

❖ заполнение ферментера на 0,7 от объема;

❖ посевная концентрация в пределах 0,45 ± 0,05 млн кл/см3; ♦> pH среды 7,3 - 7,4;

❖ температура культивирования 38°С;

❖ скорость перемешивания 200 ±10 об/мин;

❖ аэрация посредством барботирования воздухом при его расходе 0,5 - 2,0 дм на литр среды в час;

❖ продолжительность культивирования 48 - 72 ч.

В результате адаптации ПТП/с к суспензионному культивированию в лабо раторных ферментерах в течение 3 последовательных пассажей при выше ука занных условиях индекс пролиферации составлял 2-2,5.

Адаптированную к безопорному методу выращивания перевиваемую сус пензионную сублинию клеток тестикул поросенка в последующем стали имено вать перевиваемой суспензионной линией клеток тестикул поросенка ПТП-с/06.

2.2.2. Оптимизация параметров суспензионного культивирования клето ПТП-с/06

2.2.2.1. Изучение влияния концентрации сыворотки крови в ростовой среде i скорости перемешивания суспензии на жизнеспособность и рост клеток ПТП с/06

При проведении исследований в опытах на каждом последующем этапе ра боты использовались клеточные суспензии, полученные при наиболее оптими зированных параметрах культивирования клеток предыдущего этапа, которы криоконсервировали при минус 70°С в объемах, необходимых для проведени серий опытов, обеспечивающих статистическую достоверность полученных ре зультатов.

Во всех экспериментах использовали среду 0,25 % ФГМС на модифициро ванном растворе Эрла (без солей кальция и магния с содержанием глюкозы

г/дм3), 600 мг/дм3 глютамина, 0,05 % экстракта пивных дрожжей и 10 % сыворотки крови КРС.

Так как полученная нами суспензионная линия клеток ПТП-с/06 адаптирована к ростовой среде с содержанием 10 % сыворотки крови КРС, проведено изучение влияния концентрации сыворотки в диапазоне 7,5 и 12,5 % на проли-феративную активность данной культуры (табл. 1).

Таблица 1

Влияние концентрации сыворотки крови КРС в среде выращивания на пролиферативную активность клеток линии ПТП-с/06 в суспензии

п=3

Содержание сыворотки крови КРС в пит. среде (%) Посевная концентрация клеток (млн кл/см3) Максимальное накопление клеток (млн кл/см3) Время максимального накопления клеток (час) Индекс пролиферации

7,5 0,4 ± 0,05 1,1 ±0,03 72 2,5-2,9

10 1,5 ±0,04 48 3,5-4,2

12,5 1,6 ±0,06 48 3,7-4,5

В результате экспериментов определено, что снижение концентрации сыворотки крови КРС до 7,5 % приводит к замедлению клеточного роста, а при повышении содержания сыворотки до 12,5 % плотность клеточной суспензии не увеличивается и индекс пролиферации практически равен тому же, что и при 10%.

Изучение влияния скорости перемешивания на жизнеспособность и рост клеток ПТП-с/06 в суспензии при безопорном культивировании клеток показало, что скорость перемешивания от 150 до 200 об/мин обеспечивает равномерное распределение клеток по всему объему суспензии. При 150 об/мин образуются нижние угловые зоны застоя клеток, что нарушает трофику клеток, а увеличение скорости вращения выше 200 об/мин способствует повышенному пе-нообразованию, что приводит к разрушению клеточных мембран части клеток и снижает показатель жизнеспособности клеточной суспензии.

Таким образом, при суспензионном способе выращивании культуры клеток

ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах оптимальным определено содержани сыворотки крови КРС в ростовой среде на уровне 10 % от объема питательно среды и скорость перемешивания в диапазоне от 150 до 200 об/мин.

2.2.2.2. Оптимизация посевной концентрации клеток ПТП-с/06 в суспензии

Начальная посевная концентрация клеток в суспензионных культурах явля ется одним из факторов, оказывающих существенное влияние на динамику про лиферативной активности клеток, время культивирования и их жизнеспособ ность. Этот показатель, наряду с урожаем клеток, является определяющим пр расчете эффективности масштабирования клеток в биотехнологии (табл. 2).

Таблица

Динамика пролиферативной активности клеток ПТП-с/06 в суспензии в зависимости от начальной посевной плотности

п=.

Посевная плотность (млн кл/см3) Концентрация клеток в процессе культивирования (млн кл/см3)

24 час. 48 час. 72 час.

0,2 ± 0,04 0,38 ±0,02 (1,9) 0,74 ± 0,07 (3,7) 1,23 ±0,08 (6,2)

0,3 ± 0,03 0,68 ± 0,05 (2,3) 1,25 ±0,11 (4,2) 1,01 ±0,05

0,4 ± 0,05 0,84 ±0,03 (2,1) 1,55 ± 0,15 (3,9) 1,15 ±0,07

0,5 ± 0,03 1,02 ±0,06 (2,1) 1,57 ±0,13 (3,2) 1,00 ±0,09

0,6 ± 0,05 1,28 ±0,04 (2,1) 1,59 ±0,06 (2,7) 1,02 ±0,09

0,7 ± 0,06 1,35 ±0,07 (1,9) 1,64 ±0,11 (2,3) 1,04 ±0,10

0,8 ± 0,07 1,08 ±0,10 (1,4) 2,03 ± 0,14 (2,5) 1,20 ±0,08

Примечание: в скобках указан индекс пролш ерации клеток.

Из полученных данных видно, что максимальное накопление клеток про исходит при посадочной концентрацией 0,8 ± 0,07 млн кл/см3 через 48 ч культи вирования и составляет 2,03 ± 0,14 млн кл/см3, но при этом индекс пролифера ции равен 2,5. При концентрации клеток 0,2 ± 0,04 млн кл/см3 максимальное на копление клеток наблюдали через 72 ч и составляет 1,23 ± 0,08 млн кл/см3, индексом пролиферации 6,2. Максимальное накопление клеток при посевных концентрациях 0,3 ± 0,03 и 0,4 ± 0,05 млн кл/см3 наблюдали через 48 ч и составляет 1,25 ± 0,11 и 1,55 ± 0,15 млн кл/см3, а индекс пролиферации равен 4,2 и 3,9, соответственно.

Таким образом, оптимальными для суспензионного культивирования клеток ПТП-с/06 являются посевные концентрации 0,3 - 0,4 млн кл/см3, при которых максимальное увеличение плотности клеток происходит от 3,9 до 4,2 раза через 48 часов.

2.2.2.3. Оптимизация величины рН и аэрация среды при выращивании культуры клеток ПТП-с/06 суспензионным методом

Оптимизацию технологических режимов для безопорного роста клеток ПТП-с/06 проводили в лабораторных ферментерах вместимостью 1 дм3 при посевной концентрации 0,4 ± 0,05 млн кл/см3.

При отработке количественных параметров аэрации клеточной суспензии методом барботирования в ходе экспериментов определено, что при расходе воздуха 0,5 - 0,7 дм3 на 1 дм3 среды в час отмечены наилучшие показатели динамики пролиферативной активности клеток (табл. 3).

Таблица 3

Влияние аэрации барботированием на накопление клеток ПТП-с/06 при суспензионном способе культивирования

п=3

Барботирование воздухом на дм3 среды (дм3) Посевная концентрация клеток (млн кл/см3) Уровень максимального накопления клеток (млн кл/см3) Время максимального накопления клеток (ч)

0,3 - 0,4 0,4 ± 0,05 1,2 ±0,09 48

0,5 - 0,7 1,5 ±0,14 48

0,8 - 0,9 1,3 ±0,11 72

Однако в результате барботирования образуется пена, содержащая клетки, которые впоследствии погибают, и уровень жизнеспособности клеточной популяции снижается. Это явилось основанием использовать другой метод аэрации - поверхностное наслоение, и установлено, что оптимальным режимом является расход воздуха 2,0 дм3 на 1 дм3 среды в час, при котором уровень жизнеспособности клеточной популяции повысился до 95 %.

Оптимальной температурой культивирования для линии клеток ПТП-с/06 определена 37,5 ± 0,5°С, так как при увеличении или уменьшении данного тех-

нологического параметра происходит замедление скорости роста клеточной п пуляции.

Уровень рН питательной среды при поддержании суспензии линии клет ПТП-с/06 находится в пределах 7,2 - 7,4, который поддерживали добавление бикарбоната и аэрацией.

Широкое варьирование количественных значений технологических пар метров и их разнообразных сочетаний позволило определить наиболее благ приятные режимы суспензионного культивирования, которые представлены табл. 4.

Таблица

Оптимизированные технологические режимы суспензионного культивирования линии клеток ПТП-с/06

Наименование параметров (показателей)

Значения параметров

Посевная концентрация (млн кл/см )

0,35 - 0,45

Объем заполнения сосуда ферментера (%)

50-70

Скорость перемешивания суспензии (об/мин)

175 ±25

Температура культивирования (°С)

37,5 * 0,5

рН питательной среды в процессе выращивания

7,2-7,4

Способ аэрации:

поверхностное наслоение воздуха барботитрование

(расход воздуха в литрах на 1 дм3 среды в час)

2,0 0,5 - 0,7

Общая продолжительность культивирования (час)

Конечная плотность клеток (млн кл/см )

1,5 ± 0,09

Процент мертвых клеток в популяции

3-9

Приведенные в таблице условия суспензионного выращивания данн клеточной культуры обеспечивали постоянство морфологического состава к точной суспензии. Клеточная популяция суспензии представлена одиночны округлыми клетками с неповрежденной мембраной и гомогенной или мел зернистой цитоплазмой с небольшой долей клеток, объединенных в конгло раты (от 3 до 8).

Отклонение выше перечисленных условий культивирования в ту и иную сторону приводило не только к снижению плотности клеточной попу

ции, но и к морфологическим изменениям клеток.

2.2.2.4. Коррекция состава питательной среды в процессе суспензионного выращивания клеток

Цель исследования - продление лог-фазы роста линии клеток ПТП-с/06 в процессе культивирования с помощью дополнительной «подкормки» для повышения максимальной клеточной плотности.

При достижении популяцией плотности ПТП-с/06 на уровне 1,1 ± 0,1 млн кл/см3 в качестве дополнительной «подкормки» клеток мы использовали следующие компоненты:

- 3% глютамин, из расчета 20 см3 на литр среды (600 мг/дм3);

- 50% глюкоза из расчета 4 см3 на литр среды (2 г/дм3);

- 7,5% бикарбонат натрия из расчета 10 - 15 см3 на литр среды (750-1000 мг/дм3). Динамика роста клеток представлены на рис. 1.

Время культивирования клеток ПТП-с/06 (час)

_ кривая роста клеточной популяции с «подкормкой»

_ кривая роста клеточной популяции без «подкормки» (контроль)

Рис. 1. Влияние дополнительного введения питательных компонентов на плотность клеточной популяции ПТП-с/06 в суспензии

Такая добавка позволила продлить фазу логарифмического роста популяции на 24 ч и увеличить плотность клеточной популяции до 1,8-2,1 млн кл/см3 на 3 - 4 сут культивирования, тогда как ранее максимальное накопление клеток на 2 сут выращивания составляло 1,5 млн кл/см3.

Таким образом, применяемая для безопорного культивирования клет ПТП-с/06 «подкормка» клеточной суспензии, включающая в свой состав гл тамин, глюкозу и бикорбанат натрия, позволила повысить урожай клеток бол чем на 25 %, что значительно увеличивает биотехнологический ресурс при ма штабировании линии клеток данной популяции.

2.2.3. Стабилизация биологических свойств и паспортизация суспензио ной культуры клеток ПТП-с/06

2.2.3.1. Пролиферативная стабильность клеток ПТП-с/06 при длительн культивировании в суспензии

Изучение пролиферативной стабильности полученной суспензионной л нии клеток ПТП-с/06 при отработанных и оптимизированных условиях культ вирования проводили на протяжении 15 последовательных пассажей. В качес ве критериев оценки использовали показатели динамики плотности клеточн популяции, уровня жизнеспособности (по тесту витального окрашивания тр Пановым синим) и морфологии клеток. Результаты исследования представле в табл. 5.

Таблиц

Пролиферативная характеристика клеток ПТП-с/06 в процессе непрерывного суспензионного культивирования

Пассажи клеток Серии: среда/ сыворотка Посевная концентрация Плотность клеточной суспензии через 72 ч Жизнеспособность (%)

(млн кл/см3)

1-5 2/9 0,37-0,42 1,8-2,0 95 ±3

5-10 3/11 0,35-0,40 1,8-2,1 96 ±2

10-15 4/12 0,34-0,45 1,9-2,1 95 ±2

В течение всего указанного периода регистрировали 4-6-кратный прир клеток, при этом популяция была представлена одиночными и объединенны в небольшие конгломераты (3 - 8) клетками, округлой формы с неповрежд ной оболочкой и прозрачной или мелкозернистой цитоплазмой.

Таким образом, показана стабильность ростовых и цитоморфологических свойств полученной ПЛК на протяжении 15 непрерывных циклов суспензионного культивирования в лабораторных ферментерах при отработанных технологических режимах.

2.2.3.2. Кариологическая стабильность клеток ПТП-с/Об при длительном культивировании в суспензии

Проведенный по стандартной методике кариологический анализ матричной перевиваемой культуры клеток ПТП, адаптированной к среде с 0,5 % ФГМС и 10 % сыворотки крови свиней, после криоконсервирования и восстановления в течение 5 последовательных пассажей, показал, что число хромосом в клетках колеблется от 34 до 45, а модальный класс представлен клетками с 40 хромосомами (величина модального класса - 52 %).

На уровне 15 пассажа кариологический анализ клеток ПТП-с/06 показал незначительное снижение величины модального класса (49 %) при сохранении его числа (40 хромосом) и интервала варьирования числа хромосом в клетках (от 34 до 45) (рис. 2).

60 50 40

количество

клеток

20 10 о

34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

количество хромосом

Рис. 2. Гистограмма распределения хромосом в клетках суспензионной культуры перевиваемой линии клеток ПТП-с/06.

В целом, следует отметить высокий уровень кариологической стабильности популяций клеток ПТП и полученной ПТП-с/06 в процессе длительного культи-

вирования, несмотря на смену питательных сред (0,5 % ФГМС на 0,25 % ФГМ суспензионную) и сывороток крови (свиной на КРС), а также смену метод культивирования. На основании выше перечисленных результатов культу клеток ПТП-с/06 можно отнести к группе стабильных по кариотипу клеточнь линий [Полянская Г.Г., 1996].

2.2.3.3. Создание банка суспензионной перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 жидком азоте и его оценка

В результате проведенных исследований по данному этапу суспензионн перевиваемая линия клеток тестикул поросенка (ПТП-с/06) паспортизирова по цитоморфологическим, ростовым и кариологическим характеристикам, о сутствию контаминирующих агентов. Определены условия криоконсервации восстановления клеток после низкотемпературного хранения (жизнеспосо ность клеток составляет 80-90 %). Создан банк посевного материала в колич стве 400 млн клеток.

Паспорт на культуру клеток ПТП-с/06 рассмотрен на Ученом совете и вержден директором ГНУ ВНИИВВиМ (01.02.08). «Методические рекомен ции по культивированию и хранению суспензионной перевиваемой линии к ток тестикул поросенка (ПТП-с/06)» рассмотрены на заседании секции «Ве ринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозака мии, утверждены академиком-секретарем РАСХН 06.10.08 г.

2.2.4. Изучение вирусрепродуцирующих свойств суспензионной перевив мой линии клеток ПТП-с/06

В ряде работ установлено, что монослойная культура клеток ПТП чув вительна к вирусам болезни Тешена и инфекционного гепатита собак. [Горш ва Т.Ф. и др., 1995; Балышев В.М. и др., 2000; Коломыцев A.A., 2001; Балыш В.И., 2005; Шишкова A.A., 2007]. В связи с этим, нами проведена оценка вир репродуцирующей активности полученной линии клеток ПТП-с/06, выращ ной в условиях суспензионной культуры, по отношению к данным вирусам.

В результате проведенных опытов установлено, что максимальное нак

пление вируса БТ происходит в течение 48 ч и достигает 8,5 ± 0,10 ТЦД5о/см3 при множественности заражения в пределах 3 - 0,03 ^ ТЦД5о/кл.

Установлена принципиальная возможность использования суспензионной перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 для накопления вируса инфекционного гепатита собак. Максимальное накопление вируса 6,50 ^ ТЦД5о/см3 происходило на третьи сутки после заражения.

2.2.5. Оценка возможности применения новых антибактериальных препаратов для профилактики контаминации при суспензионном способе культивирования клеток

Изучена возможность использования ряда антимикробных препаратов, относящихся к группе цефалоспоринов (цефазолин и цефтриаксон) и фторхи-нолонов (пефлоксацин и ципрофлоксацин) для профилактики бактериальной контаминации культур клеток.

Установлено, что препараты группы цефалоспоринов менее токсичны, так как максимальная переносимая доза (МПД) для клеток линий ПТП-с/06, ПСГК-60/с1, БК-6 находится в пределах от 50 до 100 мкг/см3, а минимальная цитоток-сическая доза (МЦД) - выше 100 мкг/см3 по сравнению с фторхинолоновой группой антимикробных препаратов, где максимальная переносимая доза для ПЛК находится в пределах от 6,25 до 50 мкг/см3, а МЦД - от 12,5 до 100 мкг/см3.

Определено, что цефтриаксон в эффективной концентрации не обладает токсичностью и не оказывает заметного влияния на морфологические и ростовые свойства всех испытанных культур клеток, а его МПД и МЦД превышали 100 мкг/см3, что значительно выше минимальной бактерицидной дозы.

Установлено, что цефтриаксон сохраняет антибактериальную активность на протяжении всего времени культивирования клеток стационарным и роллер-ным способами. При суспензионном способе выращивания происходит быстрая инактивация препарата, что, вероятнее всего, связано с интенсивным клеточным метаболизмом, перемешиванием и аэрацией клеточной суспензии. В ре-

зультате чего при безопорном способе культивирования возникает необход мость дополнительного введения препарата через 24 часа культивирования , профилактики бактериальной контаминации ПЛК (табл. 6).

Таблица

Динамика антибактериальной активности цефтриаксона в среде при раз

личных способах культивирования ПЛК

Способы культивирования Активность цефтриаксона в среде (%)

во время культивирования (час)

0 24 48 72 96

Стационарный 100 50 50 12,5 6,12

Роллерный 100 12,5 6,12 0 0

Суспензионный 100 6,12 0 0 0

Нами установлено, что цефтриаксон в рекомендуемой концентрации оказывает заметного влияния на морфологические и кариологические харак ристики клеток, а также на вирусрепродуцирующую активность линии клет ПТП-с/06 к вирусу болезни Тешена (штамм «Закарпатский»),

3. Выводы

1. Получена новая перевиваемая суспензионная сублиния клеток тестикул п росенка ПТП-с/06, имеющая индекс пролиферации 4 - 6 в среде с 0,25 ФГМС на солевом растворе Эрла (без солей кальция и магния) и 10 % сыворо ки крови крупного рогатого скота и стабильная по кариотипу: модальный кла равен 40, а его величина составляет 49 %, варьирование числа хромосом клетках от 34 до 45.

2. Определены технологические параметры суспензионного культивирован линии клеток ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах: посевная концентраци: пределах 0,4 ± 0,5 млн кл/см3; заполнение ферментера на 0,5 - 0,7 объема; ] среды 7,2 - 7,4; температура культивирования 37 ± 0,5°С; скорость перемеш вания суспензии 150 - 200 об/мин; аэрация воздухом в количестве 0,5 - 0,7 д на 1 дм3 среды в час посредством барботирования или 2,0 дм3 на 1 дм3 средь час при аэрации наслоением; продолжительность культивирования 72 часа.

3. Установлено, что при суспензионном культивировании клеток ПТП-с/06 дополнительное введение глютамина, глюкозы и бикарбоната натрия при достижении клетками плотности 1,1 ± 0,1 млн кл/см3 продлевает логарифмическую фазу их роста на 24 ч и повышает конечную плотность до 1,8 - 2,1 млн кл/см3.

4. Показана стабильность ростовых, цитоморфологических свойств и кариоло-гических характеристик полученной линии клеток ПТП-с/06 на протяжении не менее 15 непрерывных циклов суспензионного культивирования в лабораторных ферментерах при отработанных технологических режимах.

5. Вирусрепродуцирующая активность полученной сублинии ПТП-с/06 в отношении адаптированных вирусов составляет 8,25 - 8,50 ^ ТЦД50/см3 - для вируса болезни Тешена (штамм «Закарпатский»); 6,0 - 6,5 ^ ТЦД50/см3 - для вируса инфекционного гепатита собак (штамм «Корнелл-2»),

6. Установлена возможность использования цефтриаксона для профилактики бактериальной контаминации, который в концентрации 100 мкг/см3 при культивировании суспензионной перевиваемой культуры клеток тестикул поросенка не оказывает токсического действия и заметного отрицательного воздействия на биологические и вирусрепродуцирующие свойства клеток.

4. Практические предложения

1. Предложена новая суспензионная перевиваемая клеточная линия ПТП-с/06, представлен паспорт, утвержденный директором института ГНУ ВНИИВВиМ, включен в «Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ» и создан криобанк культуры в количестве 400 мнл клеток.

2. Разработаны «Методические рекомендации по поддержанию и хранению перевиваемой суспензионной сублинии клеток тестикул поросенка ПТП-с/06», утвержденные академиком-секретарем отделения ветеринарной медицины РАСХН 06.10.2008 г.

3. Предложена схема применения антибактериального препарата цефтриаксона при различных способах культивирования клеток для профилактики бактериальной контаминации клеточных культур.

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. Жданова, H.A. Оптимизация параметров суспензионного культивиров ния перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП/с / H.A. Жданова Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов : мат риалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИТИБП. - Щелково, 2007.- С. 202 206.

2. Жданова, H.A. Получение и свойства суспензионной перевиваемой лин клеток тестикул поросенка / H.A. Жданова, С.Г. Юрков, О.Н. Бурдинская // В теринария. -2008. - № 7.-С. 57-58.

3. Оценка антибактериальных препаратов для профилактики контаминац перевиваемых линий клеток / С.Г. Юрков, H.A. Жданова, Е.В. Ставничий, А. Филатов, С.Д. Кушнир, Л.И. Анисимова, Н.Ю. Смыслова // Актуальные воп сы аграрной науки и образования : материалы Междунар. науч.-практ. конф УГСХА. - Ульяновск, 2008. - Т. IV. - С. 139 - 143.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров, Владимирской области. Тираж 75 экземпляров.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жданова, Наталья Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы

1.2. Цель и задачи исследований

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость работы

1.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1.6. Апробация и публикации результатов исследований

1.7. Личный вклад

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Перевиваемые линии клеток и методы их культивирования

2.2. Получение суспензионных культур клеток

2.3. Факторы, влияющие на размножение клеток в суспензии

2.4. Размножение вирусов в суспензии перевиваемых линий клеток

2.5. Проблема контаминации клеточных культур микроорганизмами и ее профилактика

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка и оптимизация условий ее культивирования"

1.1. Актуальность темы

Развитие биотехнологии противовирусных вакцин во многом обусловлено достижениями в области выращивания культур клеток. Эпизоотическая ситуация по вирусным болезням животных до сих пор остается напряженной, несмотря на большой арсенал профилактических противовирусных препаратов [Бакулов И.А., 1998; Смирнов A.M., 2003]. В связи с этим актуальным является совершенствование биотехнологического процесса получения высоко эффективных вакцинных препаратов.

Наиболее перспективным в области крупномасштабного производства противовирусных вакцин для животных является суспензионный способ выращивания клеток и вирусов. Он имеет ряд важных преимуществ, основными из которых являются: возможность быстрого масштабирования, культивирование большого количества клеток и вирусов в одном ферментере с высокой плотностью популяции; равномерные условия для клеток и вирусов по всему объему выращивания; эффективный контроль и регулировка условий культивирования, высокая экономичность метода и др. [Самуйленко А.Я., 2000; Жестерев В.И. и др., 2003; Воронин Е.С., 2005].

Эффективность использования этого метода для биотехнологии противовирусных препаратов во многом определяется биологическими характеристиками выбранного клеточного субстрата, тщательностью отработки условий и параметров его выращивания, оптимизацией условий культивирования вируса с сохранением его иммунобиологических свойств [Danes B.S., 1957; Bryant J.С. и др., 1958; Katinger H.W., 1982; Maldarelli F., 1986; Балышева В.И. и др., 1995; Crouch J.H. др., 1998; Гунин М.А., 2000].

Однако, количество клеточных культур, способных к активной пролиферации при безопорном (суспензионном) способе выращивания, крайне ограничено. В тоже время отдельные стабильные варианты линий клеток даже одного происхождения, как правило, характеризуются совокупностью присущих только им ростовых, морфологических, генетических свойств, уровнем пермиссивности к вирусам [Owens О., 1953; Earle W.R., 1956; Опарин В.Н. и др., 1983; Pay T.W. и др., 1985; Saha S.N., 1988; Чермашенцева Н.А., 1996; Ojioto Е., 1999; Каталог РККК, 1999; Юрков С.Г., 2000; Ben-Tchautchavadze М. и др., 2006].

Несмотря на перспективность суспензионного метода выращивания клеток и вирусов, до сих пор производство ветеринарных вирусных вакцин (кроме вакцин противоящурной, антирабической и против блютанга) основано на использовании клеток, культивируемых в условиях стационарного или роллерно-го монослоя. Такими малопроизводительными, трудоемкими и неэкономичными способами осуществляется наработка вирусов классической чумы свиней (КЧС), трансмиссионного гастроэнтерита (ТГС), парвовируса свиней (ПВС), оспы овец, чумы КРС и др. [Балышев В.М. и др., 2000; Бузун А.И. и др., 2001; Грачев Д.В., 2004; Михалкин И.П. и др., 2005; Шишкова А.А. и др., 2007].

Коллекция клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ располагает значительным числом сублиний и трофовариантов клеток тестикулярной ткани поросенка, чувствительных к вирусам различных таксономических групп и имеющих потенции к росту в суспензионных условиях [Горшкова Т.Ф. и др., 1996; Вишняков И.Ф и др., 1999; Юрков С.Г. и др., 2000; Балышев В.М. и др., 2000; Юрков С.Г. и др., 2000; Балышева В.И., 2005]. В связи с этим представляется актуальным получение перевиваемой линии клеток тестикул поросенка, способной к безопорному росту, оптимизация биотехнологических параметров ее суспензионного культивирования, изучение и стабилизация ее биологических свойств в процессе непрерывного суспензионного культивирования.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Жданова, Наталья Александровна

5. ВЫВОДЫ

1. Получена новая перевиваемая суспензионная сублиния клеток тестикул поросенка ПТП-с/06, имеющая индекс пролиферации 4 - 6 в среде с 0,25 % ФГМС на солевом растворе Эрла (без солей кальция и магния) и 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота и стабильная по кариотипу: модальный класс равен 40, а его величина составляет 49 %, варьирование числа хромосом в клетках от 34 до 45.

2. Определены технологические параметры суспензионного культивирования линии клеток ПТП-с/06 в лабораторных ферментерах: посевная концентрация в

•j пределах 0,4 ± 0,5 млн кл/см ; заполнение ферментера на 0,5 - 0,7 объема; рН среды 7,2 - 7,4; температура культивирования 37,5 ± 0,5°С; скорость перемешивания суспензии 150 — 200 об/мин; аэрация воздухом в количестве 0,5 - 0,7 дм на 1 дм3 среды в час посредством барботирования или 2,0 дм3 на 1 дм3 среды в час при аэрации наслоением; продолжительность культивирования 72 часа.

3. Установлено, что при суспензионном культивировании клеток ПТП-с/06 дополнительное введение глютамина, глюкозы и бикарбоната натрия при дости

•j жении клетками плотности 1,1 ± 0,1 млн кл/см продлевает логарифмическую фазу их роста на 24 ч и повышает конечную плотность до 1,8-2,1 млн кл/см .

5. Вирусрепродуцирующая активность полученной сублинии ПТП-с/06 в отношении адаптированных вирусов составляет 8,25 - 8,50 lg ТЦД5о/см - для вируса болезни Тешена (штамм «Закарпатский»); 6,0 - 6,5 lg ТЦД50/см - для вируса инфекционного гепатита собак (штамм «Корнелл-2»).

6. Установлена возможность использования цефтриаксона для профилактики бактериальной контаминации, который в концентрации 100 мкг/см при культивировании суспензионной перевиваемой культуры клеток тестикул поросенка не оказывает токсического действия и заметного отрицательного воздействия на биологические и вирусрепродуцирующие свойства клеток.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

2.6. Заключение

Анализ отечественной и зарубежной научной литературы по вопросам культивирования клеток показал, что преобладающей тенденцией в разработке профилактических противовирусных препаратов является использование в качестве субстратов для накопления вирусной биомассы суспензионных перевиваемых линий клеток. Безопорный метод является более технологичным по сравнению со стационарным и роллерным методами, обеспечивает высокую плотность клеточной популяции, и соответственно высокий выход вируса. Он также является более экономичным в отношении трудозатрат, времени.

Однако количество культур клеток, способных пролиферировать при суспензионном способе выращивания, ограниченно и в клеточной биотехнологии преобладают субстратзависимые клеточные линии.

При получении новых суспензионных культур клеток используются методы клонирования, селекции, адаптации хорошо известных линий клеток с отбором субстратов с требуемыми клеточными функциями.

Перевиваемые культуры клеток свиного происхождения широко применяются в вирусологической практике и биотехнологии в виду широкого спектра их чувствительности к представителям вирусов различных таксономических групп. Монослойная перевиваемая линия клеток тестикул поросенка (ПТП) чувствительна к вирусам болезни Тешена, гепатита собак, трансмиссионного гастроэнтерита свиней и является субстратом при изготовлении вакцинных препаратов против этих болезней.

На основании выше изложенного мы сформулировали концепцию данной диссертационной работы следующим образом:

Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП, оптимизация технологических параметров суспензионного выращивания клеток, стабилизация биологических свойств в процессе непрерывного суспензионного культивирования и оценка вирусрепродуцирующей активности в отношении к адаптированным вирусам, паспортизация и создание рабочего банка полученной линии клеток.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационные исследования выполнены в период с 2004 по 2008 годы в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии в рамках плановой НИР по темам 01.02.04. «Поддержание и развитие коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ для диагностических, исследовательских и биотехнологических целей» и 08.01.03.06. «Поддержание и развитие коллекции клеточных культур для научных исследований, диагностики и биотехнологии противовирусных препаратов» программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации.

3.1. МАТЕРИАЛЫ и МЕТОДЫ 3.1.1. Культуры клеток

В работе использованы следующие культуры клеток:

- перевиваемая линия клеток тестикул поросенка ПТП, катал. № 10.1 «Коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ» (2000 г.);

- трофовариант перевиваемой линии клеток тестикул поросенка ПТП, культивируемый в среде с 0,5 % ФГМС на солевом растворе Эрла с добавлением 10 % сыворотки крови свиней (1991, 18 пассаж, музей клеточных культур ВНИИВВиМ).

- клональная перевиваемая линия клеток ПСГК-60/cl (перевиваемые свиные гетероплоидные клетки Sus scrofa), получена в 2007 г. Филатовым А.В. и соавторами во ВНИИВВиМ из перевиваемой линии клеток почки сибирского горного козерога, любезно предоставленная автором;

- сублиния перевиваемых клеток почки свиньи SK-6, во ВНИИВВиМ поступила из Польши в 1994 г. на уровне 22 пассажа (Кат. № 58.2 «Коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ» (2000 г.))

Культуры клеток получены из лаборатории «Культуры клеток с музеем клеточных штаммов».

3.1.2. Питательные среды, растворы и сыворотки

В работе использованы следующие питательные среды:

- Игла-MEM на солевом растворе Эрла фирмы «HyClone» (USA) и фирмы «Sigma» с незаменимыми аминокислотами.

- 0,25 % ферментативный гидролизат мышечных белков (ФГМС) на модифицированном растворе Эрла (без солей кальция и магния с увеличенным содержанием глюкозы 2 г/дм3), Россия.

Сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) и сыворотка крови свиней квалификации «для культур клеток», изготовленная во ВНИИВВиМ из сырья полученного в условиях массового убоя животных на мясоперерабатывающих предприятиях.

Фетальная сыворотка крови КРС (Fetal Bovine Serum, cat. № CH30160.03 фирмы «HyClone» (USA).

Питательные среды, забуференный физиологический раствор с рН 7,2 -7,4; дистиллированная вода; 7,5 %-ный раствор бикарбоната натрия; 3 %-ный раствор глютамина; 50 %-ный раствор глюкозы; 0,02 %-ный раствор версена; 0,25 %-ный раствор трипсина; 5 %-ный экстракт пивных дрожжей готовятся для культивирования ряда культур клеток и вирусов группой «Питательных сред и сывороток» в промышленных объемах.

3.1.3. Вирусы

В работе использованы следующие вирусы, полученные из лаборатории «Музейных штаммов»:

Вирус болезни Тешена (ВБТ) штамм «Закарпатский», адаптированный к перевиваемой культуре клеток ПТП в монослое, с инфекционной активностью 8,0 - 9,0 lg ТЦДзо/см3, инв. № 1790.

Вирус инфекционного гепатита собак (ВИГС) штамм «Корнелл-2», адаптированный к перевиваемой культуре клеток ПТП в монослое, с инфекционо ной активностью 6,0 - 6,75 lg ТЦД50/см , инв. № 225.

3.1.4. Микроорганизмы

- Золотистый стафилококк - Staphylococcus Aureus (штамм 209Р), инв. № 2.

- Кишечная палочка - Escherichia coli (штамм К-12), инв. № 17.

Бактериальные штаммы получены из лаборатории «Бактериологии». 3.1.5. Реактивы

В работе использованы следующие реактивы: колхицин; метанол; этанол; уксусная кислота; раствор Буэна; раствор Гимза; гематоксилин-эозин; ксилол; ацетон; 0,5 %-ный водный раствор трипа-нового синего; диметилсульфоксид (DMSO). Антибиотики:

• Бензилпенициллина натриевая соль (1 ООО ООО ЕД), порошок для приготовления раствора для инъекций (Россия);

• Гентамицина сульфат, 4 % раствор (Россия);

• Антибактериальные препараты, относящиеся к группе фторхинолонов: л

1. Пефлоксацин 20 мг/см (Россия); матричный раствор стерилизовали фильтрованием через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм;

2. Препараты ципрофлоксацина - «Циплокс» - ципрофлоксацин 2 мг/см , в 1 см раствора содержится ципрофлоксацин - 2 мг, вспомогательные вещества: натрия хлорид, ЭДТА двунатриевая соль, натрия гидроксид, вода - (Индия, Мумбаи, компания ЦИПЛА Лимитед) и «Ципрофлоксацин» - 2 мг/см , в л

1см раствора содержится ципрофлоксацин - 2 мг в форме лактата (Индия, Нью Дели).

• Антибактериальные препараты, относящиеся к группе цефалоспоринов:

1. Цефазолин, антибиотик I поколения, 3 серии, изготовленные из исходной субстанции различных производителей (Россия, ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко»): Орхид CZSU 060069 - серия 040107 ✓ Харбин А12120061101 -серия 050107 S Ауробиндо FAZY 1150110 - серия 520706

2. Цефтриаксон III поколения, 4 серии, изготовленные из исходной субстанции различных производителей (Россия, ЗАО «Фармацевтическая фирма

Лекко»):

S Чейл Чеданг 601604168 - серия 010207 S Орхид CFX 2050006 - серия 020207 S Кенгбо F 604200 - серия 030307 S Харбин А 20070415 - серия 100807

3.1.6. Оборудование

В работе использовано следующее оборудование: световые микроскопы («Opton», Германия) и МБИ-3 (Россия); отечественный бытовой холодильник (2 - 8°С); низкотемпературный холодильник (минус 70°С) («Kelvinator», США); термостат (ПО «Медлабортехника», Россия), термостат T304GF81 с автоматическим регулированием и контролем температуры, концентрации углекислоты и относительной влажности типа Не013 («Ассав», Швеция); роллерные установки, разработанные и изготовленные во ВНИИВВиМ для промышленного культивирования клеток и вирусов, позволяющие работать в режимах монослойного и суспензионного культивирования [Бур'еев И. А., 1994]; ферментеры 1-литровые («MARUBISHI», Япония); ламинар с вертикальным потоком очищенного воздуха и УФ-лампой II класса защиты («Bellco», Канада); камера Горяева; весы аналитические; полистироловые 96-луночные панели для культур клеток («Costar»); микропипетки-капельницы с объемом капли 0,025 см3 и 0,05 см3 («Titertek»); перистальтический насос (Польша), фильтро-держатели «Swinex) и мембранные фильтры, 0,22 мкм («Millipore», USA), лабораторная посуда для культур клеток и общего назначения.

3.1.7. Методы культивирования перевиваемых линий клеток Перевиваемые однослойные линии клеток поддерживали методом последовательных пересевов в соответствии с Инструкцией по приготовлению питательных сред и культур клеток [Курносов А.Н. и др., 1987].

Контроль ростовых свойств культур клеток ПТП, ПТП-с/06, а так же концентрацию и жизнеспособность клеток определяли визуально и подсчетом под микроскопом суспензии клеток с витальным красителем (0,5 % раствором три-панового синего) в камере Горяева с расчетом по формуле: ж + м) х 2 х 1000

Х= - , где

0,9

X - количество клеток в 1 см суспензии; ж - количество жизнеспособных клеток в камере; м - количество мертвых клеток в камере;

2 - коэффициент разведения исходной клеточной суспензии раствором красителя;

1000 - количество кубических мм в 1 см ; 0,9 - объем счетной камеры Горяева в см .

Монослойное культивирование клеток ПТП проводили стационарным о методом в матрасах (вместимостью от 0,1 до 1,5 дм ) и динамичным — во фла

3 3 конах (вместимостью 0,5 дм ) и роллерных сосудах (вместимостью 3 дм ). Пассирование проводили в следующем порядке: из культуры со сформировавшимся монослоем удаляли ростовую среду и заливали подогретой до 37,5 ± 0,5°С смесью 0,02 %-ного раствора версена и 0,25 %-ного раствора трипсина в соотношении 9:1. Количество диспергирующей жидкости зависело от вместимости

3 3 3 культуральных сосудов (10 - 15 см на 0,5 дм флаконы, 25 - 40 см на 1 и 1,5

1 о о дм матрасы; 30 - 80 см на 3 дм роллерные сосуды). После этого сосуды с культурой клеток укладывали вниз монослоем. В течение 3-5 минут наблюдали феномен «струйного стекания» клеток при вертикальном положении сосуда, т.е. происходило ослабление и разрушение межклеточных связей и снижение уровня адгезии клеточного монослоя к субстрату (подложке), проявляющегося в частичном отслоении клеток от стенки культурального сосуда. Затем его переворачивали клеточным слоем вверх, удаляли диспергент, оставляя несколько миллилитров, в зависимости от вместимости сосуда, встряхивали клетки и вносили ростовую среду.

В зависимости от метода культивирования использовали следующие посевные концентрации: для культивирования в условиях стационарного моноо слоя - 0,08 - 0,10 млн кл/см ; для культивирования в условиях роллерного монослоя - 0,13 - 0,15 млн кл/см3.

Селекцию клеток ПТП для получения новой суспензионной сублинии клеток ПТП/с проводили в условиях роллерной суспензии во флаконах объемом 0,5 дм при скорости вращения 18-25 об/мин.

При культивировании перевиваемой линии клеток ПТП-с/06 в суспензии использовали питательную среду для безопорного выращивания 0,25 % ФГМС на солевом растворе Эрла (без солей кальция и магния, с увеличенным содеро о жанием глюкозы до 2 г/дм ), с добавлением 600 мг/дм глютамина, 0,05 % экстракта пивных дрожжей и 10 % сыворотки крови КРС.

Криоконсервирование клеточных расплодок осуществляли в сосудах Дьюара с жидким азотом (минус 196°С) и низкой температуре в камерах холодильников (минус 70°С).

Для хранения в жидком азоте суспендированные в защитной среде клетки разливали по 1 - 2 — 5 см соответствующего объема в стерильные ампулы. Криоконсервирование проводили с эквилибрацией при 4°С в течение 60 минут, далее клетки помещали сразу на минус 70°С на 1 - 2 сут, а затем подвергали глубокому замораживанию, перенося в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Для замораживания суспензионной популяции ПТП-с/06 в азоте использовали клеточную суспензию с плотностью 15-20 млн кл/см3 среды.

Замораживание и хранение клеточного материала при минус 70°С применяли преимущественно для формирования производственного резерва клеток со сроком хранения 1-1,5 года. Для замораживания отбирали клеточную культуру в состоянии монослоя, с характерной морфологией клеточного пласта, состоящего из прозрачных незернистых клеток, диспергировали обычным способом и переносили клеточную суспензию в центрифужные флаконы.

При суспензионном способе выращивания клетки отбирали в логарифмической фазе роста на пике плотности клеточной популяции. Клетки освобождали от детрита путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин, а клеточный осадок ресуспендировали в необходимом объеме криозащитной среды, состоящей из 75 % ростовой среды, 15 % сыворотки крови КРС и 10 % химически чистого глицерина или диметилсульфоксида, тестированного для культур клеток.

Для хранения в низкотемпературном холодильнике подготовленную суспензию с концентрацией 5-8 млн кл/см3 разливали во флаконы вместимостью 7

100 см , при их заполнении на 0,3 - 0,5 объема, перекрывали резиновыми пробками, обматывали лейкопластырем, маркировали и помещали в камеру холодильника. Необходимую температуру хранения (минус 70°С) материал приобретает через 1,5-2 часа.

3.1.8. Методы культивирования и титрования вирусов в культуре клеток

Выращивание вирусов БТ и ИГС в перевиваемой культуре клеток ПТП проводили в монослое по общепринятой методике в ферментерах фирмы «MARUBISHI» вместимостью 1 дм3. Вирусрепродуцирующую способность суспензионной культуры клеток ПТП-с/06 в отношении вирусов болезни Тешена и инфекционного гепатита собак определяли заражением их и культивированием вирусов при температуре 37,5 ± 0,5°С. Определение активности полученных вирусных материалов проводили методом титрования по стандартной методике в монослойных культурах клеток ПТП по характерному ЦПД. Титр вируса рассчитывали по Риду и Менчу и выражали в логарифмах ТЦД50/см [Сюрин В.Н., 1984].

3.1.9. Методы цитоморфологического и кариологического анализа

Морфологическое изучение монослойных и суспензионных культур клеток проводили путем микроскопирования нативных препаратов клеток с оценкой показателей состояния клеточных мембран, зернистости и степени вакуолизации цитоплазмы, а при изучении цитотоксичности антибактериальных препаратов - по развитию дегенеративных процессов.

Для кариологического изучения клетки на стадии активного роста инкул бировали в среде с колхицином (0,05 мкг/см среды) в течение 3 часов. Клетки диспергировали смесью 0,02 % раствора версена и 0,25 % раствора трипсина в соотношении 9:1, подогретой до 37,5 ± 0,5°С. Полученную взвесь клеток обрабатывали гипотоническим раствором (1 часть сыворотки крови КРС и 4 части дистиллированной воды) и выдерживали в термостате при температуре 37 ± 0,5°С в течение 15—20 минут, фиксировали смесью метанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1, наносили на поверхность предметных стекол и окрашивали 2%-ным водным раствором Гимза [Пинаев Г.П. и др., 1988].

Кариологические исследования проводили подсчетом метафазных хромосом в 50 - 100 клетках данной популяции.

3.1.10. Методы бактериологического контроля

Стерильность каждой серии питательных сред для культур клеток, сыворотки крови КРС, посевного материала и ростовых добавок определяли высевом на жидкие и твердые питательные среды — мясопептонный агар (МПА), мя-сопептоный бульон (МПБ), Китта-Тароцци, тиогликолевую, Сабуро. Первые четыре бактериальных среды инкубировали при температуре 37°С, последнюю - при комнатной температуре в течение 14 сут.

Определение содержания антибиотиков в культуральной среде при различных методах культивирования клеток проводили методом серийных разведений, по схеме Ермольевой З.В. и Ведьминой Е.А. [Лабинская А.С., 1978].

3.1.11. Статистические методы

Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами, используемыми в биологии [Лакин Г.Ф., 1980; Дмитрен-ко Н.В., 1993].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жданова, Наталья Александровна, Покров

1. А. с. 1025722 СССР. Питательная среда для выращивания культур клеток животных / Г. Е. Панкова и др.. 1983.

2. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме; под ред. д-ра биол. наук В. Ю. Полякова. М.: Мир, 1983. - 263 с.

3. Акатов, В. С. Управление физико-химическими свойствами околоклеточного микроокружения в культуре / В. С. Акатов, Э. И. Лежнев // Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. 2-го Всесоюз. совещания. — Пущино, 1985.-С. 68.

4. Анисимова, Л. И. Получение перевиваемых культур клеток, адаптированных к росту в питательных средах с пониженным содержанием сыворотки крови КРС : автореф. дис. . канд. биол. наук : 03.00.23 / Анисимова Любовь Ивановна. Покров, 2003. - 22 с.

5. Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии / В. Ф. Ковалев и др.. М. : Агропромиздат, 1988. - 223 с.

6. Антивирусная и антибактериальная активность новых химических соединений / М. М. Зубаиров, А. В. Киселев, В. М. Котляров, В. А. Гаврилов, Ю.

7. B. Числов, Э. JI. Бурдакова // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных : материалы Между-нар. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ. Покров, 1998. - С. 278 - 279.

8. Бакулов, И. А. Новые проблемы эпизоотологии / И. А. Бакулов // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных : материалы Междунар. конф. / ВНИИВВиМ. Покров, 1998.-С.135 - 138.

9. Балашова, Е. А. Разработка средств и методов лабораторной диагностики болезни Акабане : автореф. дис. . канд. биол. наук : 03.00.06. / Балашова Елена Алексеевна. — Покров, 1993. 22 с.

10. Балышева, В. И. Ассоциированная инактивированная вакцина против болезней Ауески и Тешена / В. И. Балышева, А. А. Шишкова, В. И. Жестерев // Ветеринария. 2007. - № 6. - С. 20-23.

11. Белун, О. В. Клонирование перевиваемой линии почки поросенка / О. В. Белун, В. А. Сокова, А. Н. Курносов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии : тез. докл. / ВНИИВВиМ. Покров, 1978. —1. C. 16.

12. Биотехнология / под ред. Е. С. Воронина и др.. СПб. : ГИОРД, 2005. -792 с. : ил.

13. Борхсениус, С. Н. Микоплазмы. Молекулярная и клеточная биология, па-тогенность, диагностика / С. Н. Борхсениус, О. А. Чернова. М. : Наука, 1989.-С. 156.

14. Браплавец, Н. Ф. Очистка культур тканей от микоплазм / Н. Ф. Браплавец // Вирусы и вирусные заболевания. Респ. межвед. сб. 1975. - Вып. 3. - С. 117-120.

15. Ван Везель, А. А. Биотехнология клеток животных / А. А. Ван Везель. — М., 1981.

16. Витакер, А. Среды для культивирования клеток млекопитающих // Новые методы культуры животных тканей / под ред. Фридлянского. М.: Мир, 1976.-С. 18.

17. Влияние фракции компонентов кожи на пролиферацию эпидермальных клеток в культуре / О. В. Белова и др. // Цитология. 1996. - Т. 38, № 2. -С. 179- 180.

18. Волкова, И. Ю. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование мер борьбы с артритом-энцефалитом коз в РФ : автореф. дис. . канд. вет.наук : 16.00.03. / Волкова Ирина Юсупджановна. Покров, 2008. - 26 с.

19. Выбор наиболее эффективных сывороток крови различных видов животных как компонента питательной среды для культивирования клеточных линий / Г. А. Костина и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 558.

20. Гаврилов, В. И. Перевиваемые клетки в вирусологии / В. И. Гаврилов. — М. : Медицина, 1964. 267 с.

21. Герасимов, В. Н. Получение и использование постоянных линий клеточных культур в ветеринарной вирусологии : автореф. дис. . док. вет. наук / В. Н. Герасимов. — Владимир, 1998. 61 с.

22. Гидролизаты молочных, мышечных растительных белков как основы питательных сред для культивирования клеток и вирусов / Л. П. Дьяконов и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 522.

23. Глинских, Н. П. Клеточные культуры в вирусологии и биотехнологии / Н. П. Глинских, Т. Г. Колесникова // Вопросы эпидемиологии, иммунологии, диагностики вирусных инфекций. 1991. —Ч. 1, — С. 157- 162.

24. Голубев, Д. Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии / Д. Б. Голубев, А. А. Соминина, М. Н. Медведева. JL: Медицина, 1976.-224 с.

25. Грачев, В. П. Оценка перевиваемых клеточных линий как субстрата для производства биологически активных веществ / В. П. Грачев, Д. С. Петри-чиани // ЖМЭИ. 1988. - № 2. - С. 46 - 51.

26. Гунин, М. А. Исследование жизнеспособных клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях : дис. . канд. биол. наук / М. А. Гунин. Щелково, 2000. - 22 с.

27. Гурбанов, С. М. Суспензионное культивирование клеток и вирусов в среде, изготовленной на основе ФГМ-с : автореф. дис. . канд. биол. наук / С. М. Гурбанов. М., 1987. - 24 с.

28. Дмитренко, Н. В. Основы статистической обработки результатов микробиологических и вирусологических исследований / Н. В. Дмитренко. Покров, 1993. - 39 с. - (Учебно-методическое пособие для аспирантов и соискателей).

29. Дьяконов, JI. П. Животная клетка в культуре (методы и применения в биотехнологии) / под ред. проф. JI. П. Дьяконова, проф. Ситькова В.И. М. : Компания Спутник+, 2000. - 400 с.

30. Егоров, Н. С. Основы учения об антибиотиках / Н. С. Егоров. М. : Высшая школа, 1979. - 455 с.

31. Жарова, Н. Н. Сравнительное испытание эффективности различных методов обработки сыворотки КРС с целью освобождения ее от микоплазм / Н. Н. Жарова // Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. Владимир, 1987.-С. 15-17.

32. Завальный, М. А. Выбор типа микроносителей в зависимости от свойств применяемой культуры клеток / М. А. Завальный, В. П. Грачев, А. X. Зицма-нис // Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. Пущино, 1985.-С. 132.

33. Зуев, В. В. Коллекция культур клеток / В. В. Зуев, С. Г. Юрков, А. Н. Кур-носов // Вестник российской академии сельскохозяйственных наук. 1997. -№ 2. - С. 69 - 70.

34. Зусман, Ф. Я. Опыт использования антибиотиков для деконтаминации клеточных культур от микоплазм / Ф. Я. Зусман // Диагностика и профилактика вирусных инфекций : сб. Свердловск, 1974. - С. 20 - 26.

35. Зыкин, JI. Ф. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей / JI. Ф. Зыкин, 3. Ю. Хапев. М.: КолоС, 2006. -96 с. - (Учебники и учеб. пособия для студентов высших учеб. заведений).

36. Инструкция по приготовлению питательных сред и клеточных культур / А. Н. Курносов, В. В. Зуев, В. Н. Опарин, С. Г. Юрков; ГУВ Госагропром СССР.-М., 1987.- 154 с.

37. Использование бессывороточной среды и с сывороткой, обработанной по-лиэтиленгликолем для культивирования клеток ВНК-21 / JI. А. Алеева и др. // Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии. Владимир, 1983. -С. 6-7.

38. Использование сыворотки КРС, обработанной ПЭГ, для культивирования клеток ВНК-21 / В. А. Карпук и др. // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. 1985. - № 1. — С. 4 - 6.

39. Испытание различных белковых гидролизатов в составе питательных сред для культивирования культур клеток / Н. И. Емельянов и др. // Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. 2-го Всесоюз. совещания. -Пущино, 1985. С. 23 - 24.

40. Исследование кариотипа клеток почки африканской зеленой мартышки линии 4647, длительно культивируемых в средах с различными сыворотками / А. А. Исаенко и др. // Цитология. 1990. - Т. 32, № 7. - С. 736 - 740.

41. Итоги изучения методов криоконсервирования и длительного хранения культур клеток сельскохозяйственных животных / JI. П. Дьяконов и др. // 2-я Всесоюз. конф. по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. Харьков, 1984. -№ 1.-С. 131.

42. Каган, Г. Я. Микоплазма инфекция в культурах ткани / Г. Я. Каган, И. В. Раковская. - Л. :Медицина, 1968. - 173 с.

43. Кариологические исследования перевиваемых клеток, полученных из тканей свиней / Ф. В. Сушков и др. // Вопросы ветеринарной вирусологии. -1966.-№2.-С. 80- 85.

44. Кариотип постоянных клеточных линий. 1 изменчивость кариотипа клеток M-HeLa при статическом и роллерном способах культивирования / JI. Ф. Литвинчук и др. //Цитология. 1986. -Т. 28, №1. -С. 56-61.

45. Каталог Российская коллекция клеточных культур (РККК) / редакционная колл. Г. П. Пинаев и др.. Санкт- Петербург, Омск : издательство ОмГПУ, 1999.-226 с.

46. Кисленко, В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология / В. Н. Кис-ленко, Н. М. Колычев. М.: КолоС, 2006. - Ч. I. Общая микробиология. -183 с.

47. Клеточные культуры в биотехнологии противоящурных препаратов / В. Н. Герасимов и др. // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных : тез. докл. Междунар. конф. / ВНИИЗЖ. Владимир, 1997.-С. 41-42.

48. Коломыцев, А. А. Энтеровирусный энцефаломиелит свиней / А. А. Коломыцев // Ветеринарная газета. 2001. - № 14.

49. Корнеева, А. И. Разработка питательной среды для культивирования клеток млекопитающих на основе ферментативного гидролизата казеина : авто-реф. дис. . канд. биол. наук / А. И. Корнеева. М., 1995. -22 с.

50. Куликова, И. JI. Микоплазма-контаминация клеток животных в культуре клеток (цитопатогеннее действие, диагностика и деконтаминация) / И. JI. Куликова, JI. П. Дьяконов // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 525 - 526.

51. Культивирование в суспензии клеток перевиваемых линий, адаптированных к среде с гидролизатом лактальбумина / В. И. Жестерев, В. А. Сергеев, Ф. В. Сушков, С.П. Качанова // Доклады ВАСХНИЛ. 1965. - № 11. - С. 35 -40.

52. Культивирование вируса диареи КРС в суспензии клеток ВНК-21 / Т. К. Ким и др. // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных : тез.докл. Всерос. науч.-практ. конф. / ОПИиНИ ВНИИЗЖ. Владимир, 1995. -С. 84.

53. Культивирование клеток и тканей животных / JI. П. Дьяконов и др.. -Ставрополь : Ставроп. правда, 1988. 96 с. - (Учебно-методическое пособие (часть 2))

54. Культивирование перевиваемых клеток ПСГК-60 и гибридомных клеток SS-3 в альгинат-хитозановых микрокапсулах / В.И. Балышева, Р. Б. Аронов,

55. B. И. Жестерев, Е. А. Марквичева, И. С. Черняева, А. И. Албунов, С. М. Шинкарев // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов : труды Междунар. научн.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ. Покров, 2003. - Ч. 2.1. C. 553.

56. Культура животных клеток. Методы / под ред. Р. Фрешни. М. : Мир, 1989.-333 с.

57. Культура ткани в вирусологических исследованиях / О. Г. Анджапаридзе и др.. М. : Мир, 1962. - 233 с.

58. Лабинская, А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. С. Лабинская. М. : Медицина, 1978. - 349 с.

59. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1980.

60. Ламберт, К. Дж. Среды для выращивания клеток / К. Дж. Ламберт, Дж. Р. Берг // Биотехнология клеток животных. М., 1989. - С. 98 - 138.

61. Макаров, А. В. Кариотипическая стабильность и биотехнологические показатели перевиваемых линий клеток, культивируемых в среде с ликвором : дис. . канд. ветер, наук / Макаров Александр Васильевич. Саранск, 2004. - 170 с.

62. Малахова, М. С. Проблема контаминации клеточных субстратов в биотехнологии / М. С. Малахова, В. В. Макаров // Культивирование клеток животных и человека : III Всесоюз. сов., тез. докл. М., 1990. - С. 117 - 118.

63. Мамаева, С. Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре / С. Е. Мамаева // Цитология. 1996. - Т. 38, № 8. - С. 787 - 814.

64. Мамаева, С. Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток / С. Е. Мамаева // Методы культивирования клеток. Л., 1988. - 78 с.

65. Методы культивирования клеток : сб. науч. тр. / отв. ред. Г. П. Пинаев. -Л. : Наука, 1988.-320 с.

66. Миронова, Л. Л. Тест-система для определения ростовых свойств сыворотки и контроля их на спонтанную вирусную контаминацию / Л. Л. Миронова, Н. К. Преображенская, В. Г. Козлов // Цитология. — 1994. Т. 36, № 6. -С. 572-573.

67. Модифицированная питательная среда для выращивания клеток и вирусов / Л. И. Анисимова, Е. П. Прилепская, С. Г. Юрков и др. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии : материалы науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ.-Покров, 1995.-С. 191.

68. Насосы для подачи жидкой и газовой сред перистальтического типа / В. Т. Ларин и др. // Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. — Пущино, 1985.-С. 137.

69. Недосеков, В. В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства : дис. . канд. вет. наук. Покров, 1998.- 182 с.

70. Непрерывное поддержание суспензионных культур клеток в лабораторных условиях / С. Н. Гаврилов, В. Н. Опарин, А. Н. Курносов, С. Г. Юрков // Вопросы вирусологии, микробиологии и эпизоотологии / ВНИИВВиМ. -Покров, 1983.-С. 9- 10.

71. Неустроева, В. В. Контаминация культур клеток микоплазмами. Принципы и методы деконтаминации : автореф. дис. . канд. биол. наук / Неустроева В. В.-М., 1969.-23 с.

72. Новохатский, А. С. Проблема контаминации клетками и новые подходы к контролю перевиваемых линий / А. С. Новохатский, Г. Р. Михайлова, А. А. Царева // Вопросы вирусологии. 1977. - № 4. - С. 396 - 408.

73. Новохатский, А. С. Ростовые факторы сыворотки и крови. Новые возможности получения и применения / А. С. Новохатский // Цитология. 1994. -Т. 36, №6.-С. 506.

74. Новохатский, А. С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии / А. С. Новохатский // Итоги науки и техники, ВИНИТИ.- М., 1979. Т.8. - С. 3 - 135. - (Серия Вирусология).

75. Ночевная, Т. В. Оптимизация условий культивирования штаммов вируса энтерита норок и изучение его биологических свойств : автореф. дис. . канд. биол. наук / Ночевная Татьяна Викторовна. — Владимир, 2005. 26 с.

76. Ночевный, В. Т. Биологический контроль ростовой активности питательных сред и сыворотки крови животных / В. Т. Ночевный // Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток : тез. докл. Всесоюз. конф. -Новосибирск, 1991. С. 46.

77. Оленова, Ю. М. Новые методы культуры животных тканей / под ред. Ю.

78. М. Оленова. М., 1976. - 255 с.

79. Оптимизация режимов лабораторного культивирования клеток ППК-666 в суспензии / С. Н. Гаврилов, В. Н. Опарин, А. Н. Курносов // Вопросы вирусологии, микробиологии и эпизоотологии / ВНИИВВиМ. Покров, 1983. -С. 8-9.

80. Опыт культивирования клеток в роллерных и суспензионных условиях / Т. П. Лисок и др. // Проблемы гриппа и острых респираторных заболеваний. 1973. - Т.8. - С. 152 - 157.

81. Отечественные линии перевиваемых клеток почек теленка субстрат для биотехнологии / Л. Л Миронова и др. // Биотехнология. - 1998. - № 5. - С. 25-31.

82. Панкова, Г. Е. Гидролизат мышечных белков как источник питания при культивировании клеток in vitro / Г. Е. Панкова // Ветеринария. 1976. - № 1. -С. 98- 100.

83. Пат. 2036233. RU МКИ С 12 № 5/00. Питательная среда для выращивания первичных и перевиваемых культур клеток / А. В. Слободенюк, Г. Г. Колесникова. опуб. 1995, Бюл. № 15.

84. Пат. 2057176, Россия, МКИ С 12 №5/00. Питательная среда для выращивания культур клеток человека и животных / К. И. Спыну, П. К. Киптя, Т. П. Грушко. 1996, Бюл. №1.

85. Пат. 5318906 США, МКИ С 12 № 5/00, А 61 К 35/14, НКИ 435/2402. Agent for stimulating growth of animal cells and serum-free medium containing same / T. Tackzono, K. Sakato. Опуб. 1994.

86. Перспективы использования культур клеток ПСГК в вирусологической практике / В. И. Балышева, В. И. Жестерев, И. Ф. Вишняков, М. Б. Новикова // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 544 - 545.

87. Пиле, Э. Р. Современное состояние проблемы контроля биологических препаратов на отсутствие вирусов-контаминантов / Э. Р. Пиле, С. Г. Дзагу-ров // Материалы науч. конф. гос. контрольного института им. Л.А. Тарасе-вича.-М., 1970.-С. 129-141.

88. Пинаев, Г. А. Культуры клеток животных и биотехнология / Г. А. Пинаев // Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. — Пущино, 1985. -С. 72-73.

89. Питерских, Г. П. Разработка перемешивающих устройств ферментера для выращивания клеток млекопитающих / Г. П. Питерских, А. Г. Рапуто, В. С.

90. Фаустов // Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. Пу-щино, 1985.-С. 156.

91. Полянская, Г. Г. Влияние микоплазменной контаминации и деконтамина-ции с помощью ципрофлоксацина на кариотипическую структуру клеточной линии легкого китайского хомячка V-79 / Г. Г. Полянская, Т. Н. Ефремова // Цитология. 1993.-Т. 35, № 8.-С. 71-78.

92. Полянская, Г. Г. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую структуру клеточной линии фибробластов кожи индийского муит-жака / Г. Г. Полянская, Т. Н. Ефремова // Цитология. — 1992. Т. 34, № 3. — С. 82-88.

93. Полянская, Г. Г. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость в клеточных линиях с разной структурой кариотипа / Г. Г. Полянская, Т. Н. Ефремова, Л. С. Сизова // Цитология. 1996. - Т. 38, № 2. - С. 243 - 244.

94. Полянская, Г. Г. Влияние условий культивирования на кариотипическую структуру клеточной сублинии почки кенгуровой крысы / Г. Г. Полянская, Л. П. Дьяконов // Цитология. 1988. - Т. 30, № 11. - С. 1355 - 1363.

95. Полянская, Г. Г. Деконтаминация культивируемых клеток от микоплазм с помощью ципрофлоксацина: цито- и генотоксического эффекта / Г. Г. Полянская, Т. Н. Ефремова, И. И. Фридлянская // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6.-С. 534.

96. Полянская, Г. Г. Кариотипические характеристики линии фибробластов кожи индийского мунтжака при культивировании с различными сыворотками / Г. Г. Полянская, Л. С. Сидова, Н. С. Николаенко // Цитология. 1993. -Т. 35, №2.-С. 86-96.

97. Применение линии 4647 для крупномасштабного производства ВАКЧУМ / Л. Л. Миронова и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 573.

98. Прохор, В. Ф. Деконтаминация постоянных линий клеток животных от микоплазм с помощью микоциклина / В. Ф. Прохор, Ю. И. Пащенко, С. А. Мельников // Цитология. 1992. - Т. 34, № 9. - С. 96.

99. Работнова, И. Л. Хемостатное культивирование и ингибирование роста микроорганизмов / Л. И. Работновой, И. Н, Позмогова. М. : Наука, 1979. -208 с.

100. Радчук, Н. П. Ветеринарная микробиология и иммунология / Н. П. Рад-чук. М. : Агропромиздат, 1991. - С. 220 - 222.

101. Размножение клеток на кремнеземных микроносителях / Р. А. Кукайн и др. / Культивирование клеток животных и человека : тез. докл. Пущино, 1985.-С. 136.

102. Репродукция штамма Рокборн вируса чумы плотоядных в клетках линии 4647, культивируемых на микроносителях / Ю. X. Хапчаев и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 584.

103. ТИБП. Щелково, 1996. - С. 240.

104. Рубан, Е. А. Оптимизация и масштабирование процессов глубинного культивирования микроорганизмов и клеток животных с использованием методов системного анализа : дис. . док. биол. наук : 03.00.07 / Рубан Евгений Александрович. М., 1995. - 56 с.

105. Самородова, И. М. Цефалоспорины — антибиотики нового поколения / И. М. Самородова, С. Ж. Гюрджи-Оглы, М. И. Рабинович // Био. 2004, №1. -С. 2-4.

106. Самуйленко, А. Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов / А. Я. Самуйленко, Е. А. Рубан. М., 2000. - Т. 1. -С. 190-241.

107. Связь между составом сыворотки КРС и ее способностью стимулировать рост клеточных культур / JI. И. Игудин и др. // Цитология. 1983. - № 10. -С. 1216-1217.

108. Семенова, Е. Г. Изменение клеточного цикла и кариотипа клеток L мыши при смене способа культивирования / Е. Г. Семенова, А. В. Хоменко, С. Е. Мамаева // Цитология. 1984. - Т. 26, № 10. - С. 1156 - 1160.

109. Сергеев, В. А. Вирусы и вирусные вакцины / В. А. Сергеев, Е. А. Непоклонов, Т. И. Алипер. М. : Библиотека, 2007. - 524 с.

110. Скичко, Н. Д. Гидролизат животных белков основа питательных сред для промышленного производства биопрепаратов : дис. в виде научного доклада . докт. биол. наук : 03.00.06, 03.00.07 / Скичко Николай Данилович.-М., 1992.-49 с.

111. Смирнов, А. М. Состояние и перспективы научно-исследовательских работ по зооантропонозам / А. М. Смирнов // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов : труды Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИ

112. ИВВиМ. Покров, 2003. - C.l 1 - 16.

113. Смирнова, Т. Д. Деконтаминация клеточных культур от микоплазм: сравнение трех методов / Т. Д. Смирнова // Цитология. 1986. - Т. 28, № 10. - С. 1113-1116.

114. Смирнова, Т. Д. Новый способ контроля свойств сыворотки крови КРС / Т. Д. Смирнова, J1. Ф. Литвинчук, Л. С. Сизова // Цитология. 1996. - Т. 38, №2.-С. 240-250.

115. Совершенствование питательной среды для суспензионного выращивания клеток ППК-666 / В. Н. Опарин, С. Н, Гаврилов, А. Н. Курносов, А. Д. Петрачев // Вопросы вирусологии, микробиологии и эпизоотологии / ВНИИВВиМ. Покров, 1983. - С. 4 - 5.

116. Сокова, В. А. Цитологическое изучение различных клеточных культур в норме и после инфицирования их микоплазмами : автореф. дис. . канд. биол. наук : 03.00.17 / Сокова Валентина Александровна. Покров, 1973. -20 с.

117. Спиер, Р. Е. Биотехнология клеток животных / Р. Е. Спиер, Г. Д. Адаме, Дж. Б. Гриффите. М. : Агропромиздат, 1989. - 520 с.

118. Способы поддержания асептических условий при культивировании / И. В. Тихонов и др.. М. : МГАВМиБ, 2002. - (Учебно-методическое пособие по биотехнологии).

119. Сравнительный анализ аминокислотного состава сывороток крови различных видов животных при культивировании клеточных линий / Г. А. Костина и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 558.

120. Ставничий, Е. В. Внутривидовые и межвидовые гибридные популяции клеток и их биологические свойства : автореф. дис. . канд. биол. наук : 03.00.23. / Ставничий Евгений Валерьевич. Покров, 2003. - 25 с.

121. Стегний, Б. Т. Цитогенетический метод оценки стабильности биотехнологических параметров перевиваемых клеточных линий / Б. Т. Стегний, М. Ю. Стегний, А. А. Лаврик // Цитология. 2008. - Т. 50, № 9. - С. 823 - 824.

122. Стимулирующее влияние адгезивного фактора сыворотки крови КРС на пролиферацию культивируемых клеток млекопитающих / Э. И. Буеверова и др. // Цитология. 1983. - Т. 25, № 9. - С. 1079.

123. Страчунский, Л. С. Влияние фармакодинамики различных классов антибактериальных препаратов на режимы их дозирования / Л. С. Страчунский, А. А. Муконин // Антибиотики и химиотерапия. — 2000. Т. 45, № 4. - С. 40 -44.

124. Стренк, Ф. Перемешивание и аппараты с мешалками / Ф. Стренк. J1. : Химия, 1975.

125. Сюрин, В. Н. Ветеринарная вирусология / В. Н. Сюрин, Р. В. Белоусова, Н. В. Фомина. М. : Колос, 1984. - 376 с. : ил. - (Учебники и учеб. пособия для высш. с.-х. учеб. заведений).

126. Тарасов, В. Н. Аппаратура для культурально-технологических процессов в микробиологии / В. Н. Тарасов. — М. : Онтимикробиопром, 1984.

127. Тарасов, В. Н. Культуры клеток в вирусологии / В. Н. Тарасов // Итоги науки и техники / ВИНИТИ. М., 1990. - № 19. - С. 167. - (Серия Вирусология).

128. Терехина, Н. К. Эффективность некоторых методов приготовления и контроля клеточных культур : автореф. дис. . канд. биол. наук / Терехина Н. К. Ленинград, 1973. - 25 с.

129. Технологические разработки инактивированной антирабической вакцины / Т. Ф. Горшкова, В. В. Недосеков, В. И. Жестерев, О. Г. Лаптева // Нейро-инфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельдта

130. Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена : материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ. Покров, 2001.-С. 57-59.

131. Тихонов, И. В. Проблемы и перспективы биотехнологии / И. В. Тихонов, В. А. Гаврилов // Ветеринарная медицина. -2003. № 3.

132. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемых для производства биологических препаратов // Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. М., 1988. - С. 85 - 98. - (Серия технических докладов ВОЗ № 745).

133. Трошкова, Г. П. Разработка технологии производства и методов контроля препаратов для культур клеток в сухой стерильной форме : автореф. дис. . докт. биол. наук / Трошкова Галина Павловна. Кольцово, 2004. - 42 с.

134. Усовершенствование технологии изготовления антирабической вакцины / В. И. Шипилов и др. // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных : тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. / ВНИИЗЖ. Владимир, 1995. - С. 149.

135. Установка промышленного типа для культивирования клеток и вирусов в роллерных бутылях / И. А. Буреев, В. А. Гавриченко, В. И. Жестерев, Ю. Ф. Калантаенко : материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. Покров, 1994. - С. 76.

136. Физико-химические и биологические свойства сред, составленных из компонентов отечественного производства / Н. В. Цупкина и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 541.

137. Филатова, М. А. Получение и паспортизация селекционированногоштамма РБ-71/10 вируса бешенства : автореф. дис.канд. вет. наук :1600.03 / Филатова Мария Александровна. Покров, 2008. - 26 с.

138. Цитология с основами патологии клеток / Ю. Г. Васильев, В. М. Чучков, Т. А. Трошина ; под ред. Ю. Г. Васильев М. : Зоомедлит, 2007. - 231 с.

139. Цыбанов, С. Ж. Свойства РНК вируса болезни Тешена и его взаимодействие с клеточными системами различной пермиссивности : автореф. дис. . канд. биол. наук : 03.00.06 / Цыбанов Содном Жамьянович. Покров, 1981.22 с.

140. Цыренов, В. Ж. Основы биотехнологии: Культивирование изолированных клеток и тканей растений / В. Ж. Цыренов. Улан-Удэ : ВСГТУ, 2003. - 56 с. - (Учебно-методическое пособие).

141. Чернов, В. М. Микоплазменные инфекции как возможный фактор генетических изменений в клетках высших эукариот / В. М. Чернов, О. А. Чернова // Цитология. 1996. - Т. 38, № 2. - С. 107 - 114.

142. Шевченко, JT. В. Тестирование сывороток крови свиней, используемых при культивировании клеток / JI. В. Шевченко, А. Н. Курносов, С. Г. Юрков // Ветеринария. 1986. - №11. - С. 25 - 28.

143. Щука, JI. Применение фторхинолонов в ветеринарии и появление резистентных к ним бактерий / JI. Щука // Российский ветеринарный журнал. -2005.-№ 1.-С. 37-38.

144. Эффективная основа питательных сред для культивирования клеток / А. Ф. Карышева и др. // Ветеринария. 1995. - № 9. - С. 34 - 37.

145. Юрков, С. Г. Метод контроля стерильности культур клеток, питательных сред и сыворотки / С. Г. Юрков, А. Н. Курносов // Вопросы вирусологии, микробиологии и эпизоотологии : тез. докл. науч. конф. / ВНИИВВиМ. -Покров, 1983.-С. 3.

146. Юрков, С. Г. Механизм межклеточной контаминации и некоторые проблемы безопасности при работе с культурами клеток / С. Г. Юрков, А. Н.

147. Курносов // Культивирование клеток животных и человека : тез.докл. 3-го Всесоюзн. совещ.-М., 1990.-С. 149- 150.

148. Юрков, С. Г. О перекрестной контаминации перевиваемых культур клеток / С. Г. Юрков // Вопросы вирусологии. 1995. - № 5. - С. 225 - 227.

149. Юрков, С. Г. Сокультивирование клеток ППК-666 и JIC / С. Г. Юрков, А. Н. Курносов // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных : тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. / ВНИИЗЖ. Владимир, 1995. - С. 106.

150. A high-yielding serum-free, suspension cell culture process to manufacture recombinant adenoviral vectors for gene therapy / G. Schoofs et al. // Cytotechnology. 1998. - Vol. 28, № 1-3.-P. 81-89.

151. An experimental rabies vaccine produced with a new BHK-21 suspension cell culture process: use of serum-free medium and perfusion-reactor system / P. Perrin et al. // Vaccine. 1995. - Vol. 13. - P. 1244 - 1250.

152. Barnes, D. Lethods for growth of cultured cells on serum-free medium / D. Barnes, G. Sato // Anal. Biochem. 1980. - № 102. - P. 255 - 270.

153. Bryant, J. C. Massive fluid suspension cultures of certain mammalian tissue cells / J. C. Bryant, E. L. Schiling, W. R. Early //Nat. Cancer Inst. (US). 1958. -Vol.21.-P.331.

154. Butler, M. In. A comparative review of microcarriers available for the growth of anchorage dependent animal cells / M. In. Butler // Animal Cell Biotechnology. 1988. - Vol. 3. - P. 284 - 300.

155. Carrel, A. Human sarcoma cultivated outside of the body / A. Carrel, M. J. Buitows // Am. Med. Ass. 1910. - Vol. 8. - P. 1289.

156. Cell growth on reduced charge microcarriers / D. W. Levine et al. // Dev. Biol. Stand. 1979. - Vol. 42. - P. 159 - 163.

157. Chapman, W. G. Growth of the IB-RS-2 pig kidney cell line in suspension culture and its susceptibility to Foot-and-Mouth disease virus / W. G. Chapman, I. A. Ramshan//Appl. Microbiol. 1971. - Vol. 22, № 1. - P. 1 - 5.

158. Continuous cell suspension processing using magnetically stabilized fluidized beds / Terranova et al. // Biotechnol. Bioengin. 1991. - Vol. 37. - P. 110 -120.

159. Continuous protein separations in a magnetically stabilized fluidized bed using nonmagnetic supports / Chetty et al. // Biotech. Bioeng. 1991. - Vol. 38. - P. 963 -971.

160. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels / H. Yi et al. // J. BIOSCI. BIOENG. 2006. - Vol. 102, №5. -P. 430 -435.

161. Danes, B. S. Suspension cultures of strain L muos fibroblasts. I. A glass stirrer apparatus for the cultivation of cell suspension / B. S. Danes // Exp. Cell Res. -1957.-Vol. 12, № l.-P. 169.

162. Davis, E. V. Proliferation of human amnion cells (FL) in submerged culture / E. V. Davis, F. Glover, W. F. McLimans // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1958. -Vol. 97, № 2,. - P. 454.

163. De Castro, M. Behavior of foot-and-mouth disease virus in cell culture: susceptibility of the JB-RS-2 swine cell line // Arg. Inst. Biol. 1964. - Vol. 31.-P. 63-78.

164. Design and optimisation of a small-scale bioreactor for in vivo NMR analysis of CHO cells / M. Ben-Tchavtchavadze et al. // Campus Connection Web Site. -2006.

165. Dulbecco, R. Freedman G. Plaque production by the polyoma virus / R. Dulbecco // Virology. 1959. - Vol. 8. - P. 396 - 397.

166. Dulbecco, R. Topoinhibition und Serum Requirement of Transformed and Untransformed cells / R. Dulbecco // Nature. 1970. - Vol. 227, № 5260. - P. 802-806.

167. Eagle, H. Amino acid metabolism in mammalian cell cultures / H. Eagle // Science. 1959. - Vol. 130. - P. 432 - 437.

168. Eagle, H. Buffer combinations for mammalian cell culture / H. Eagle // Science, 1959. Vol. 174. - P. 500 - 503.

169. Eagle, H. Media for animal cell culture / H. Eagle // Tissue Cult. Assoc. Manual. 1977.-Vol. 3.-P. 517-520.

170. Expression of hemagglutinin protein from the avian influenza virus H5N1 in a baculovirus/insect cell system significantly enhanced by suspension culture / N. New et al. // BMC Microbiology. 2006.

171. Gey, G. O. An improved technic for massive tissue culture / G. O. Gey // Amer. J. Cancer. 1933. - Vol. 17. - P. 752 - 756.

172. Gratzek, J. B. Detection and isolation of a virus contaminating a stock of virus diarrhea virus / J. B. Gratzek, D. Segre, D. Berman // Amer. J. Vet. Res. 1964. -Vol. 25.-P. 374-379.

173. Griffiths, B. Closing the culture gap / B. Griffiths // Biofutur. 1992. - Vol. 1. -P. 30-32.

174. Growth and metabolism of cultured bone cells using microcarrier and monolayer techniques / J. S. Tang et al. // Clin Orthop. 1994. - Vol. 300. - P. 254-258.

175. Growth of a cloned strain of hamster kidney cells in suspended cultures and their susceptibility to the virus foot-and-mouth disease / P. B. Capstick et al. // Nature : London, 1962. Vol. 195. - P. 1163 - 1166.

176. Growth of cell suspension in tissue culture / W. R. Earle et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1956. - Vol. 63. - P. 666.

177. Gupta, P. Non randon dictribution of aberrations and identification with C- and G-bandings of the position of breakage points on Muntiac chromosomes inducedby mytomycine C, bromodeoxyuridine and hydroxylamine / P. Gupta, T. Sharma

178. Mut. Res. 1981.-Vol. 81.-P. 63-74.

179. Harris, S. G. Growth of endothelial cells on microfabricated silicon nitride membranes for an in vitro model of the blood-brain barrier / S. G. Harris, M. L. Shuler // Biotechnology and Bioprocess Engineering. 2003. - Vol. 8. - P. 1-8.

180. Induction of carcinoembryonic antigen expression in a three-dimensional culture system / J. M. Jessup et al. // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 1997. -Vol. 33, №5.-P. 352-357.

181. Influence of serum proteins on the kinetics of attachment of Vero cells to cytodex microcarriers / A. Mukhopadhyay et al. // J. Chem. Techno.l Biotechnol. 1993. - Vol. 56, № 4. - P. 369 - 74.

182. Iscove, N. N. Complete replacement of serum by albumin, transferrin and soybean lipid in cultures of Cipopolysaccharide reactive B-lymphocytes / N. N. Iscove, F. Melchers // Exp. Med. 1978. - Vol. 147. - P. 923 - 933.

183. Kasza, L. Establishment, viral susceptibility and biological characteristics of a swine kidney cell line SK-6 / L. Kasza, J. A. Shadduck // Res Vet Sci. 1972. -Vol. 13, № l.-P. 46-51.

184. Katinger, H. W. Status and developments of animal cell technology using suspension culture techniques / H. W. Katinger, W. Scheirer // Act. Biotechnol. -1982.-Vol. 2.-P. 3-41.

185. Klein, F. Growth of human lymphoid cell (Raji Strain) in a five-liter fermentor / F. Klein, B. G. Mahlandt, R. E. Lincoln // Appl. Microbiol. 1971. - Vol. 22, № l.-P. 145- 146.

186. Linda, H. L. Virus morphogenesis of Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus in Helicoverpa zea serum-free suspension culture / H. L. Linda, Lua, R. Steven // Journal of General Virology. 2000. - Vol. 81. - P. 2531 -2543.

187. Maldarelli, F. Increased yield of mouse mammary tumor virus (MMTV) by cultivation of monolayer-derived mammary tumor cells in suspension / F. Maldarelli, M. J. Yagi // In Vitro Cell Dev Biol. 1986. - Vol. 22. - P. 542 - 548.

188. Maroudas, N. G. Sulphonated polystyrene as an optimal substratum for the adhesion and spreading of mesenchymal cells in monovalent and divalent saline solutions /N. G. Maroudas // J. Cell. Physiol. 1977. - Vol. 90. - P. 511 - 520.

189. McGarrity, G. J. Mycoplasma infection of cell cultures / G. J. McGarrity, D. Murphy, W. Nichols. London : Plenum Press, 1978. - 243 p.

190. Mckenna, K. A. Increased virus production in suspension culture by a Trichoplusia ni cell line in serum-free media Biotechnology progress / K. A. Mckenna, M. L. Shuler, R. R. Granados // Biotechnol. prog. 1997. - Vol. 13, № 6.-P. 805 -809.

191. Meigner, B. Cell culture on beads used for industrial production of foot and mouth virus vaccine / B. Meigner // Dev. Biol. Stand. 1979. - Vol. 42. - P. 141 - 145.

192. Microcarrier culture of fish cell and viruses cell culture bioreactor / Z. Chen et al. // Can. J. Microbiol. 1992. - Vol. 3. - P. 222 - 225.

193. Montagnon, B. J. Industrial scale production of inactivated poliovirus vaccine prepared culture of Vero cells on microcarriers / B. J. Montagnon, B. Fanget, J. C. Vincent-Falquet // Rev. Infect. Dis. 1984. - Vol. 6, № 2. - P. 341 - 344.

194. Montagnon, B. J. Polio and rabies vaccines produced in continuous cell lines: a reality Vero cell line / B. J. Montagnon // Dev. Biol. Stand. 1989. - Vol. 70. - P. 27-42.

195. Moulton, J. E. Tumors in domestic animal / J. E. Moulton. Univ. California Press, Berkeley. - 1990.

196. Nikolai, T. J. Cultivation of mammalian cells on macroporous microcarriers / T. J. Nikolai, W. S. Hu // Enzyme Microb. Technol. 1992. - Vol. 14, № 3. - P. 203 -208.

197. Ojioto, E. Low-protein, serum-free medium for the cultivation of CHO cells in suspension culture / E. Ojioto, M. Fernander, E. Chico // Int. Meet. Products fromcells. Cell as Products. Switzerland, 1999. - Vol. 25-29. - P. 220.

198. Original article epstein-barr virus suspension cell assay using in situ hybridization and flow cytometry / J. Crouch et al. // Cytometry. 1998. - V. 29, Issue l.-P. 50-57.

199. Owens, O. A new method for cutivation of mamalian cells suspended in agitated fluid medium / O. Owens, G. O. Gey, M. K. Gey // Proc. Am. Ass. Cancer Res. 1953.-Vol. l.-P. 41.

200. Petricciani, J. Regulatory consideratins for products derived from the new biotechnology / J. Petricciani // Pharmaceutical Manufactura, 1985. Vol. 5. - P. 31-34.

201. Production of malignancy in vitro mouse fibroblast cultures and changes seen in living cells / W. R. Earle et al. // J. nat. Cancer Inst. 1943. - Vol. 4. - P. 165.

202. Production of rabies vaccine by an industrial scale ВНЕС 21 suspension cell culture process / T. W. Pay et al. // Dev Biol Stand. 1985. - Vol. 60. - P. 171 -174.

203. Production of reovirus type-1 and type-3 from Vero cells grown on solid and macroporous microcarriers / J. M. Berry et al. // Biotechnol Bioeng. 1999, Vol. 5.-№62(1).-P. 12-9.

204. Repeated batch cultivation of rBHK cells on Cytodex 3 microcarriers: antithrombin III, amino acid, and fatty acid metabolic quotients / G. Schmid et al. // Appl Microbiol Biotechnol. 1992. - Vol. 38, № 3. - P. 328 - 333.

205. Replication of classical swine fever virus strains and isolates in different procine cell lines / B. Grummer et al. // Dtsch Tierarztl Wochenschr. 2006. -Vol. 113, №4. -P. 138- 142.

206. Replication of Venezuelan equine encephalomyelitis virus in suspension cell cultures grown in serum-free and defined media / H. R. Tribble et al. // J. Gen. Virol. 1971.-Vol. 10.-P. 231 -236.

207. Saha, S. N. Replacement of amino acids and tryptose phosphate broth with protein hydrolysates for the growth of FMD virus BHK-21 cells / S. N. Saha // Indian Vet. J. 1988. - Vol. 65. - P. 757 - 760.

208. Salk, J. The spectre of malignancy and criteria for cell lines as substrates for vaccines / J. Salk // Adv. Exp. Med. Biol. 1979. - Vol. 118. - P. 107 - 113.

209. Scherer, W. Preservation at subzero temperatures of mause fibroblasts (strain L) and humen epithelial cells (strain HeLa) / W. Scherer, A. C. Hoogasian // Proc. Soc. exp. Biol. Med. 1954. - Vol. 87. - P. 480.

210. Shipman, C. Control of culture pH with synthetic buffers / C. Shipman. New York :Tissue culture. - 1973. - P. 709 - 712.

211. Spier, R. E. Animal Cell Technology: an overview / R. E. Spier // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1982. - Vol. 32. - P. 304 - 312.

212. Spier, R. E. Animal cells in culture: moving into the exponential phase / R. E. Spier // TIBTECH. 1986. - Vol. 1. - P. 2 - 6.

213. Spier, R. E. The biotechnological future for animal cells in cultures / R. E. Spier, F. Horaud // Ani. Cell. Biotechnol. 1985. - Vol. 2. - P. 431 - 458.

214. Studies on amino control of cellular function / V. Morhenn et al. // Cell. -1974. Vol. 1, № 2. - P. 91 - 94.

215. Terpstra, C. Development and properties of a cell produced vaccine for hog cholera based on the Chinese strain / C. Terpstra, R. Woortmeyer, S. J. Barteling // Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1990. - Vol. 97, № 2. - P. 77 - 79.

216. Tovey, M. G. Adv. Cancer Res. 1980. - Vol. 33. - P. 1.

Информация о работе

Жданова, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Покров, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Получение суспензионной перевиваемой линии клеток тестикул поросенка и оптимизация условий ее культивирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы