Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу классической чумы свиней

Колбасова, Ольга Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу классической чумы свиней
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу классической чумы свиней"

УДК 619:578.883.27.

*РГВ ОД" * 5 ДЕК

На правах рукописи

КОЛБАСОВА ОЛЬГА ЛЬВОВНА

КАРИОЛОГИЧЕСКАЯ И ЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИНИЙ КЛЕТОК

ПЕРМИССИВНЫХ И НЕПЕРМИССИВНЫХ (РЕЗИСТЕНТНЫХ) К ВИРУСУ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ

СВИНЕЙ

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров 2000 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник С.Г. Юрков Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Т. Ночевный (ВГНКИ) кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Э.В. Рудобель-ский (ВНИИВВиМ)

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ) Минсельхоза России, г. Владимир

Защита состоится 2 6 декабря 2000 года в 10 — часов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01. при Всероссийском НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской обл., ВНИИВВиМ

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ Автореферат разослан «24» ноября 2000 года Ученый секретарь

диссертационного совета В.Я. Савукова

1.Общая характеристика работы

Актуальность выбранной темы

Создание эффективных систем культивирования вирусов во многом определяется биологическими характеристиками и свойствами применяемых клеточных субстратов. В настоящее время недостаточно рекомендовать для проведения того или иного исследования клеточные культуры вообще: в каждом конкретном случае необходим обоснованный выбор клеточных культур определенных типов, наиболее отвечающим целям и задачам планируемого эксперимента.

В то же время не вызывает сомнения, что большая часть перевиваемых линий клеток состоит из неоднородных в генетическом и физиологическом отношениях клеточных элементов и даже соблюдение неизменного режима культивирования не гарантирует стандартности результатов при вирусологических исследованиях [Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., 1996; Мамаева С.Е., 1996].

При использовании перевиваемых культур клеток нельзя не учитывать изменчивость их морфофизиологических и генотипических свойств, которые отражаются на результатах вирусологических экспериментов и, в частности, на чувствительности культур к некоторым вирусам [Дьяконов Л.П., 2000; Миронова Л.Л., 1994, Подчерняева Р.Я., 1996].

Эта проблема возникла при изучении одной из опасных вирусных болезней животных - классической чумы свиней (КЧС). Высокая контагиозность и смертность среди заболевшего поголовья при данной инфекции диктуют необходимость совершенствования диагностических методов и профилактических препаратов, получение которых невозможно без подбора эффективных систем культивирования [Цыбанов С.Ж., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л., 1995; Сергеев О.В. 1997].

вительности клеточных культур даже к адаптированному вирусу КЧС, широкая вариабельность в вирусрепродуцирующих свойствах различных субпопуляций клеток РК-15, полученных из различных лабораторий мира, периодические потери чувствительности этими клетками к вирусу КЧС, отмеченные как в отечественных, так и в зарубежных исследованиях [ Ыезэ, 1988; Floegel а а1., 1998; Куриннов В.В., 2000; ], наряду с важностью совершенствования средств диагностики, профилактики, биотехнологического обеспечения производства вакцины против КЧС, высокопродуктивными клеточными субстратами требует детального изучения взаимоотношений клетки и вируса, вьмснение механизмов пермиссивности и резистентности клеточных культур к данному возбудителю.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы является изучение факторов, определяющих пермиссивность и резистентность клеточных линий к вирусу КЧС.

Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести кариологический анализ всех сублиний клеточной культуры почки поросенка РК-15, имеющихся в коллекции ВНИИВВиМ;

2. Клонировать клетки РК-15 и получить популяции, отличающиеся по своим биологическим характеристикам;

3. Провести цитогенетический и рецепторный анализы полученных клонов с различной чувствительностью к вирусу КЧС;

4. Установить связь между кариологическими и цитохимическими характеристиками и их чувствительностью к вирусу КЧС;

5. Стабилизировать биотехнологические свойства высокочувствительных к вирусу КЧС клонов клеток.

Научная новизна результатов

Научная новизна проведенных исследований заключается в том, что:

1. Показана гетерогенность перевиваемой линии клеток почки поросенка PK-15 по цитоморфологическим, ростовым, кариотипическим характеристикам и фактору пермиссивности к вирусу КЧС;

2. Впервые получены клоны перевиваемой линии клеток PK-15, высокочувствительные к вирусу КЧС, содержащие 31 хромосому в клетках модального класса - РК-15/В5 и РК-15/А11, полученные кло-нальные сублинии клеток депонированы во ВСКК СХЖ;

3. Установлено, что ведущая роль в механизме пермиссивности и резистентности клеток клонов к вирусу КЧС принадлежит внутриклеточным факторам, подтверждением чему служит эквивалентность показателей уровня рецепторо-зависимой сорбции вируса клетками с различными вирусрепродуцирующими свойствами (от 2,5 до 7,5 lg ККИД50/мл);

4. Установлена связь между уровнем пермиссивности клеточных культур к вирусу КЧС и активностью фермента неспецифических эсте-раз;

5. Определены оптимальные условия поддержания полученных клеточных культур, стабилизирующие биологические свойства клонов.

Практическая значимость результатов

На основе экспериментальных исследований рекомендованы для диагностических целей и экспертизы патологического материала на КЧС и производства вакцины против КЧС высокочувствительные и стабильные клональные сублинии клеток РК-15/В5 и РК-15/А11. Полученные сублинии депонированы во ВСКК СХЖ.

Разработаны и утверждены:

1. Методические рекомендации по поддержанию и хранению культур клеток РК-15/В5 и РК-15/А11, полученных из перевиваемой линии клеток почки поросенка PK-15;

2. Методические рекомендации по определению активности неспецифических эстераз в культурах клеток;

3. Паспорта на клональные сублинии внесены в каталог клеточных культур ВНИИВВиМ

Апробация работы н публикации результатов исследований

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» в ВНИТИБП (Щелково, Московской обл., 2000 г.), международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (Покров, 2000г.) и на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (1998-2000 гг.).

По материалам исследований опубликовано 7 научных работ.

В выполнении различных разделов диссертации принимали участие и оказывали консультативную и практическую помощь сотрудники института: д.б.н. Середа А.Д., к.в.н. Куриннов В.В., Дмитренко В.В., Кушнир С.Д., Бузун А.И., к.б.н. Чермашенцева H.A., Смыслова Н.Ю., Лыска В.М., аспиранты Луговцев В.Ю., Степанов A.B. За что приносим им свою благодарность.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Экспериментально-теоретическое обоснование клонального анализа ПЖ для изучения факторов пермиссивности и резистентности клеток к вирусу КЧС;

2. Получение клонов перевиваемой линии клеток PK-15 и изучение их культуральных, морфологических, кариологических, цитохимических характеристик и вирусрепродуцирующих свойств;

3. Данные экспериментов по определению факторов вирусной пермиссивности полученных клонов, выявивших взаимосвязь чувствительности клеток свиного происхождения с уровнем активности неспецифических эстераз клеток;

4. Стабилизация высокочувствительных к вирусу КЧС клонов клеток по культуральным, морфологическим, кариологическим, цитохимическим и вирусрепродуцирующим характеристикам и их использование в вирусологической практике.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состо-из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения зультатов, выводов и практических предложений. Иллюстрирована 12 табли-ми и 15 рисунками. Список используемой литературы включает 123 наиме-вания из них 130 отечественных и 93 зарубежных.

2. Собственные исследования

2.1 Материалы и методы.

В работе использованы:

Культуры клеток: Сублинии перевиваемых культур клеток: почки порога (РК-15), почки сибирского горного козерога (ПСГК), тестикулярной ши поросенка (ПТП) из коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ, первич-I культура лейкоцитов свиньи (ЛС).

Среды: Среда Игла МЕМ, среда 0,1% ГЛА на солевом растворе Хенкса.

Сыворотки: Сыворотка крови новорожденных телят, КРС, лошадей, шей.

Вирусы:

вирулентный штамм вируса КЧС «Ши-Мынь», в виде культуральной жидкости зараженной культуры клеток РК-15 с активностью 5,0 ^ ККИД50/ мл, 47 пассажа;

вирулентный штамм вируса КЧС «А1Гог1 - 187», в виде культуральной жидкости зараженной культуры клеток РК-15 с активностью 5,5 ККИД50/ мл, 12 пассажа;

- вакцинный штамм вируса КЧС «Ж-ВНИИВВиМ» в виде нативного клею ного лизата культурального варианта, с титром инфекционной активности 5,5 lg БОЕ5о/мл, 44 пассажа;

- сухая культуральная вирусвакцина «ЛК-К» против КЧС с активностью 3,0 ККИД50/ мл;

- эпизоотический штамм вируса ЧМЖ, адаптированный к первичной культур клеток тестикул ягненка, с титром инфекционной активности 5,0 lg ТЦЦзо/см3, 4 пассажа;

- вакцинный штамм вируса ЧМЖ «45g35», адаптированный к первичной культуре клеток тестикул ягненка, с титром инфекционной активности 5,0 ТЦД50/см3,4 пассажа;

- вирус ПВО штамм «Moredun», адаптированный к первичной культуре клеток тестикул ягненка, с титром инфекционной активности 3,0 lg ККИД50/см3, 10 пассажа;

- вирус ПВО штамм «Irich», адаптированный к первичной культуре клеток тестикул ягненка, с титром инфекционной активности 3,2 lg ККИД50/см3, пассажа;

- вирус BDV шт. «Oregon C24V», адаптированный к перевиваемой культуре клеток ПС, с титром инфекционной активности 4,0lgККИДзо/см3, 5 пасса жа;

- вирус болезни Тешена шт. «Навля-96», 6-9 пассажа, адаптированный к nef виваемой культуре клеток ПТП с титром инфекционной активности 7,5-8,1 lgTLHWcM3.

Культивирование клеток.

Перевиваемые культуры клеток поддерживали общепринятым методом

последовательных пересевов. Первичные культуры клеток лейкоцитов крови

свиней готовили в соответствии с методическими указаниями [Юрков С.Г.,

Шевченко Л.В., Аверина Н.Н., Курносов А.Н., 1985]

Морфологическое исследование культур клеток.

Для морфологического изучения культуры выращивали на покровных :клах, фиксировали в растворе Буэна и окрашивали гематоксилином-

1ИН0М.

Кариологические методы.

Для кариологического анализа хромосомные препараты готовили стан-этным колхициновым методом с последующей окраской 2%-ным водным :твором Гимза [Ford, 1956; Мамаева С.Е., 1988]. Проводили подсчет числа эмосом в метафазных пластинках в 50-100 клетках каждой линии.

Цитохимические методы.

Активность неспецифических эстераз определяли методом азосочетания [спользованием в качестве субстрата альфа-нафтилацетата. Продукты реак-и выявляли под микроскопом в виде гранул черного цвета в цитоплазме эаботанных клеток. Активность НЭ оценивали "полуколичественным" мето-v! с учетом процента положительно реагирующих клеток, интенсивности эаски и рассчитывали средний показатель активности (СПА).

Вирусологические методы.

Титрование вируса КЧС проводили при помощи реакции иммунофлуо-¡ценции (МФА) и метода иммуноферментного анализа (ИФА). Инфекцион-о активность вирусов других таксономических групп определяли по цитопа-юскому эффекту. Титр вируса вычисляли по Риду и Менчу и выражали в ¡точных культуральных инфекционных дозах (ККИД50), в иммунизирующих я Д50) в зависимости от метода титрования вируса.

Бактериологические методы

Стерильность расплодок клеток, питательных сред, сывороток крови, ¡творов и других компонентов определяли путем высева в жидкие и твердые гательные среды: МПА, МПБ, Китт-Тароцци тиогликолевую, Сабуро.

Статистическая обработка результатов исследований

Полученные результаты подвергали статистической обработке общепри-ыми методами, используемыми в биологии [Лакин Г.Ф.,1990]. Достовер-

ность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента - Фишера.

3. Результаты исследований.

3.1. Клональная характеристика перевиваемой линии клеток почк1 поросенка РК-15.

3.1.1. Кариологический анализ сублиний клеточной культуры почки п< росенка РК-15.

Была проведена оценка 12 сублиний перевиваемой линии клеток поч поросенка РК-15, имеющихся в коллекции ВНИИВВиМ, полученных из р; личных лабораторий мира: Франции, Португалии, Бразилии, Швеции, Т1 Польши, Германии, США и Голландии, отличающихся по составу ростов] сред, индексу пролиферации, чувствительности к вирусу КЧС.

В результате проведенных исследований было показано, что перевив, мые линии клеток почки поросенка всех поступивших сублиний имеют суп ственные кариологические различия как по модальному числу и его величш так и по интервалу варьирования числа хромосом в клетках. За исключени сублинии РК-15 (ВНИИВВиМ), целенаправленно полученной для целей 61 технологии, остальные клеточные популяции именовались также, как и исхс ная ПЖ почки поросенка, т.е. РК-15, из чего можно сделать вывод, что э кариотипические изменения и связанная с ними вариабельность в вирусрепр дуцирующей активности, установленная при паспортизации этих клеток коллекцию клеточных культур ВНИИВВиМ была результатом не направле ной селекции, а действием факторов культивирования, индуцирующих хрол* сомную нестабильность, но устанавливающих количественный баланс меж клетками с разным числом хромосом.

3.1.2. Клонирование культуры клеток РК-15 (Португалия). Наиболее широкое применение в России и странах СНГ при прове; нии диагностических исследований и изучении вируса КЧС нашла субли

1-15, полученная из Португалии в 1978 году. Эта сублиния обладает высоким овнем чувствительности к вирусу КЧС, и именно поэтому дальнейшая работа оводилась именно с этой сублинией. Кариологический анализ данной линии казал, что модальный класс представлен клетками, содержащими 50 хромом при его величине 30%. Размах варьирования количества хромосом состав-л от 25 до 52. Таким образом, было показано, что культура генетически гете-генна по своему популяционному составу. Именно это обстоятельство не зантирует стандартности результатов при проведении вирусологических следований. Основным методом изучения гетерогенных культур и получе-я однородных клеточных популяций, имеющих стабильный генотип являет-клонирование.

Выделение клонов проводили методом предельных разведений в питанной среде с повышенным до 20% содержанием сыворотки крови новорож-нных телят, а также в кондиционированных средах в атмосфере с 5% содер-нием С02, относительной влажностью 90% и температуре 37,0±0,5°С. Кло-рованные культуры поддерживали методом последовательных пересевов с ресадкой клеток 2-3 раза в неделю постепенно снижая содержание сыворот-в среде культивирования до 5%.

В результате проведенной работы из перевиваемой линии клеток почки росенка РК-15 было получено 28 клональных сублиний клеток, отличаю-[хся по морфологическим и ростовым показателям.

3.1.3. Изучение вирусрепродуцирующих свойств клонов культуры клеток РК-15 к вирусу КЧС

Жизнеспособные клоны, прошедшие 5-7 пассажей заражали вирусом [С и определяли титр вируса методом иммуноферментного анализа.

Накопление вируса КЧС в исследуемых клонах колебалось в пределах 3-7,5 ^ ККИД5(>/мл, причем 21,4% полученных клонов обладали высокой зствительностью (накопление вируса более 6,5 1ц ККИДзо/мл), 67,9% имели еренный уровень чувствительности (4,0-6,5 ^ ККИД50/МЛ), и 10,7% были ко чувствительны (менее 4,0 ^ ККИД50/мл).

С целью получения резистентных к вирусу КЧС клеточных популя! было проведено реклонирование низкочувствительного клона. В результ были получены 6 новых клеточных популяций, которые обладали низк уровнем пермиссивности к вирусу, однако резистентных клонов получено было.

3.1,4. Кариотипирование клонов культуры клеток почки поросенка РК-15.

Кариологическое исследование сублиний и клонов клеток, обладают различной чувствительностью к вирусу, представляет собой один из возмс ных подходов к установлению зависимости между изменениями наследств« ного аппарата клетки и ее пермиссивностью.

Кариологические исследования высокочувствительных к вирусу К1 клонов А11 и В5 (7,5 1§ ККИД5о/мл) показали, что модальное число хромосом обоих клонах представлено 31 хромосомой и величина модального клас составляет соответственно 77 и 61% при размахе варьирования хромосом от до 33 для клона А11 и от 28 до 33 для клона В5. В кариотипе клона В5 удалс выявить маркерную хромосому - большой метацентрик с разрывом, обна{ женной в 85% исследованных клеток и отсутствующей в клоне АН, что у! зывает на их разное клональное происхождение, несмотря на одинаков] модальный класс.

Исследования кариотипа низкочувствительного к вирусу КЧС (2,5 ККИД50/МЛ) реклонированного клона В7-Р выявили, что модальный кла (42%) представлен клетками, содержащими 48 хромосом при размахе варьир вания их количества от 32 до 50.

Кариологический анализ низкочувствительного по отношению к виру КЧС (3,33 ^ ККИД50/МЛ) клона 04 показал, что модальное число хромосс данного клона соответствует модальному числу хромосом исходной родител ской популяции клеток РК-15 равному 50, величина которого составляет 64 при размахе варьирования их количества от 45 до 54,

Кариологический анализ клона Н12 с высокой чувствительностью к в русу КЧС (7,0 ^ ККИД50/МЛ) выявил, что модальное число хромосом как

родительской популяции представлено клетками, содержащими 50 хромосом (66%) при интервале варьирования их количества от 46 до 53.

Таким образом, кариологический анализ популяционного состава ПЛК РК-15, проведенный на основе изучения выделенных клонов выявил генетическую гетерогенность исходной культуры клеток, что очевидно и обуславливает отсутствие стабильности ее биологических и вирусрепродуцирующих показателей.

В результате кариологических исследований удалось выделить клоны не относящиеся к клеткам модальной группы исходной сублинии РК-15 (клоны АН и В5), но имеющих высокую чувствительность к вирусу КЧС.

Клоны Э4 и Н12, полученные из клеток модальной группы и содержащие 50 хромосом в стволовой части, как и в исходной клеточной популяции, резко отличаются по пермиссивности к вирусу КЧС, что говорит о гетерогенности клеток модальной группы сублинии РК-15 по уровню экспрессии генов, кодирующих синтез факторов чувствительности (резистентности).

Кариологический анализ не выявил четкой взаимосвязи между изменением количественных показателей хромосомного состава клеток клонов и их чувствительностью к вирусу КЧС.

3.2. Изучение клеточных факторов пермиссивности и резистентности к вирусу КЧС клонов перевиваемой линии клеток РК-15.

3.2.1. Изучение динамики рецепторо-зависимой сорбции вируса клетками клонов линии РК-15, имеющих различную чувствительность к вирусу КЧС.

Одним из факторов, определяющих чувствительность клеточных культур к вирусам, является наличие на поверхности клеток специфических рецепторов, необходимых для адсорбции вируса.

Была изучена динамика рецепторо-зависимой сорбции вируса клетками клонов линии РК-15, имеющих различную чувствительность к вирусу КЧС.

Исследованы начальные этапы взаимодействия вируса КЧС и клеток исходной популяции и ее клонов. Принцип оценки количества адсорбированных

и проникших вовнутрь клеток вирусных частиц состоял в определении радиоактивности клеток через различные интервалы инкубирования с радиомарки-рованным по РЖ очищенным и концентрированным вирусом. Было показано, что все исследованные клеточные популяции имели специфические рецепторы к вирусу КЧС независимо от их вирусрепродуцирующей способности. Можно предположить, что в данном случае уровень чувствительности клеточных культур к вирусу зависит не только от наличия специфических рецепторов, но и от внутриклеточных факторов (механизмов) пермиссивности.

3.2.2. Изучение активности неспецифических эстераз клеток полученных клонов с различной чувствительностью к вирусу КЧС.

При изучении внутриклеточных факторов пермиссивности нами был отмечен тот факт, что в гетерогенной по популяционному составу культуре лейкоцитов крови свиней и костного мозга свиней чувствительными к вирусу КЧС являются клетки системы мононуклеарных фагоцитов различных уровней дифференцировки, а цитохимическим маркером этих клеток служит фермент неспецифическая эстераза и именно поэтому представляло интерес изучить взаимосвязь активности именно этого фермента с пермиссивностью и резистентностью культур к вирусу.

Для выявления возможной связи чувствительности клеточных культур к вирусу КЧС и активности НЭ в клетках наряду с полученными клонами были изучены эти показатели у ряда перевиваемых и первичной клеточных культур пермиссивных и резистентных к вирусу КЧС.

С этой целью нами были разработаны методические рекомендации по определению активности неспецифических эстераз в культурах клеток.

Продукты цитохимической реакции выявляли в виде черных гранул различной величины в месте локализации эстераз. Оценку эстеразной активности клеток проводили полуколичественным методом по Кар1о\у (1969).

Проведенные исследования показали, что как в полученных клонах клеток РК-15, так и в первичной культуре ЛС и перевиваемых линиях РК-15, ПСГК, ПТП наблюдается четкая корреляция между уровнем чувствительности клеток к вирусу КЧС и активностью НЭ, что позволяет предложить последние

в качестве цитохимического маркера чувствительных к вирусу КЧС клеточных культур свиного происхождения.

Для изучения возможного влияния вирусной репродукции на изменение уровня активности НЭ было проведено цитохимическое определение данного фермента в зараженных вирусом КЧС клетках с высокой (клон All) и низкой (клон B7-F) чувствительностью в динамике инфекционного процесса. В результате проведенной работы было установлено, что нарастание активности НЭ в зараженной и интактной культурах клона All не отмечалось. В клоне B7-F фермент обнаружен не был. Таким образом, можно предположить, что НЭ участвуют в начальных (пусковых) механизмах пермиссивности клеток к вирусу КЧС.

В целом, исследования, проведенные по данному направлению выявили высокий уровень кариотипической изменчивости ПЖ почки поросенка РК-15, что обуславливает отсутствие стандартности ее биологических свойств, поэтому нами был проведен контроль стабильности высокочувствительных по отношению к вирусу КЧС клоны клеток В5 и All и изучена возможность их использования для целей биотехнологии.

3.3. Стабилизация биологических свойств клонов клеток

для биотехнологических целей.

3.3.1. Биотехнологическая характеристика высокопродуктивных по отношению к вирусу КЧС клонов клеток в процессе длительного культивирования.

Полученные клональные популяции клеток почки поросенка РК-15 клон В5 и клон All, культивируемые в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови новорожденных телят, были охарактеризованы по морфологическим, культу-ральным, кариологическим и вирусрепродуцирующим показателям в процессе длительного культивирования (45-50 непрерывных пассажей).

В результате было установлено, что культуральные показатели (морфология, урожай клеток, сроки переживания монослоя), кариологические показате-

ли и накопление вируса КЧС исследуемых клонов в процессе длительного культивирования оставались стабильными (табл).

Таблица

Биотехнологические показатели клонов В5 и А11

в процессе длительного культивирования.

Кло клетс Пассажны уровень Морфология культуры Сроки форм рования монослоя Урожай клет с литровог матраса, м; Сроки пережива! монослоя, суток Накопление вируса КЧС, lg ККИД)0/мл

llt Alfort-18 шт, Ши-Мынь

В5 8 Эпителиоподобные клетки с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками. 2-3 сутки 50-58 10-12 7,5 ±0,12 6,5 ±0,5

25 52-59 11-12 7,5 ±0,12 6,5 ± 0,66

45 50-55 10-12 7,5 ±0,1 6,5 ± 0,8

АГ б Эпителиоподобные клетки полигонально! формы. Округлое или овальное ядро с мелке зернистой структурой с 1-3 ядрышками 2-3 сутки 40-45 11-14 7,5 ±0, 16 6,0 + 0,12

30 38-40 12-13 7,5 ±0,11 6,0 ± 0,36

50 35-42 12-14 7,5 ±0,19 6,0 ± 0,26

3.3.2. Получение кпонального тгюфоварианта клеток РК-15 для производственных целей. Биотехнологическое использование сублинии РК-15 и ее клонов лимитирует необходимость включения в состав ростовой среды сыворотки крови плода КРС или сыворотки крови новорожденных телят, что неприемлемо по экономическим соображениям. Поэтому была проведена адаптация высокочувствительного клона Al 1 к культивированию в среде, содержащей 5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ.

После 5 пассажей монослой культуры был представлен мелкими эпите-лиоподобными клетками с умеренно зернистой цитоплазмой и четко очерченными границами, отмечены фокусы многослойного роста. Ядро округлой формы с 1-2 ядрышками

На протяжении 60 (срок наблюдения) последовательных пассажей цито-морфологические и культуральные характеристики данного трофоварианта, оставались стабильными. Накопление вируса составило 6,0 ± 0,5 lg ККИД50/МЛ.

Клональная сублиния клеток РК-15/А11 была адаптирована к выращиванию в условиях кругового монослоя. При этом культура полностью сохранила

свои ростовые, морфологические и вирусрепродуцирующие показатели, что позволит использовать ее для крупномасштабного производства противовирусных вакцин.

С использованием клональной сублинии клеток почки поросенка РК-15/А11 были получены три экспериментальные серии вакцины против КЧС из штамма ЛК-ВНИИВВиМ, успешно прошедшие испытания на безвредность и иммуногенность в отделе биологического контроля ВНИИВВиМ.

3.3.3.Изучение влияния сыворотки крови различной видовой принадлежности на ростовые, цитоморфологические показатели и репродукцию вируса КЧС клональной сублинии клеток РК-15/В5.

Было проведено изучение влияния видовой принадлежности сыворотки крови в среде культивирования на биологические показатели полученной нами клональной сублинии клеток почки поросенка РК-15/В5 и ее чувствительность к вирусу КЧС.

Данная культура была адаптирована к культивированию в среде Игла MEM с сыворотками различной видовой принадлежности: сыворотки КРС, обработанной ПЭГ, свиней, лошадей. Фетальная сыворотка телят служила в качестве контроля. При этом отмечались различия в морфологии культур и скорости их роста.

Накопление вируса КЧС составило: 6,5±0,1 lg ККИД50/мл для культуры, выращиваемой в среде с сывороткой крови КРС, обработанной ПЭГ; 6,5±0,03 lg ККИД50/мл для культуры, выращиваемой в среде с сывороткой крови свиней; 7,00±0,01 lg ККИД5о/мл для культуры, выращиваемой в среде с сывороткой крови лошадей. В контрольной культуре, культивируемой в среде с фе-тальной сывороткой телят накопление вируса - 7,50±0,12 lg ККИД50/мл.

Таким образом, проведенные исследования показали, что клон клеток РК-15/В5 достаточно хорошо адаптируется к выращиванию в среде с сыворотками различной видовой принадлежности, однако пролиферативный потенциал клеток в наибольшей степени реализовывается в среде с использованием сыворотки крови КРС, при этом вирусрепродуцирующие свойства клеток были снижены на порядок по сравнению с культивированием в питательной среде

Игла MEM, содержащей фетальную сыворотку крови телят. Полученные тро-фоварианты клеток могут быть использованы, как резервные, при отсутствии фетальной сыворотки крови телят.

3.3.4. Изучение чувствительности полученных клонов к пестивирусам и вирусам других таксономических групп.

В опытах по изучению репродукции вируса ЧМЖ в клетках клонов HI 2 и B7-F после первых трех "слепых" последовательных пассажей титры вируса составили: 4,75 lg ТЦЦ50/мл для эпизоотического, 1,5 lg ТЦД50/МЛ для вакцинного штамма. В. клетках клона B7-F вирус не репродуцировался. Репродукция вирусов ПВО и ВДВ в клетках клонов А11 и B7-F не была обнаружена.

Накопление вируса болезни Тешена в клетках сублинии РК-15/В5, адаптированной к культивированию в среде с 5% сыворотки крови КРС, обработанной ПЭГ, составила 7,0 - 7,5 lg ТЦД50/МЛ

4. Выводы.

1. В результате кариологического анализа 12 сублиний клеток почки поросенка РК-15, полученных из лабораторий разных стран, установлен высокий уровень спонтанной кариотипической изменчивости исходной культуры клеток РК-15 (АТСС CCL-33), что и обуславливает различия в их биологических показателях.

2. Получены 28 клонов перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15. Изучены их цитоморфологические, культуральные, кариологические характеристики. Исследования показали, что исходная (родительская) линия клеток представлена клеточными субпопуляциями неоднородными по этим показателям.

3. Клональный анализ исходной сублинии клеток почки поросенка РК-15 выявил ее гетерогенность по фактору пермиссивности к вирусу классической чумы свиней (от 2,5 lg ККИД50/мл до 7,5 lg ККИД50/МЛ).

4. Впервые получена клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/В5 (модальное число хромосом -31, величина модального класса - 61%, присутствует маркер - большой метацентрик с разрывом) высокочувствительная к вирусу классической чумы свиней (7,5 lg ККИД50/мл) и стабилизированы ее биологические характеристики. Клон РК-15/В5 предложен в качестве культуральной клеточной системы для проведения экспертизы патологического материала и титрования вируса КЧС.

5. Впервые получена клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/А11 (модальное число хромосом - 31, величина модального класса -77%) высокочувствительная к вирусу классической чумы свиней (7,5 lg ККИД50/МЛ), адаптированная к выращиванию в среде Игла МЕМ, содержащей 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ. Биологические свойства стабильны в течение 60 пассажей. Оптимизированы параметры его роллерного культивирования. Клон РК-15/А11 предложен в качестве клеточного субстрата для производства вакцины против классической чумы свиней.

6. Изучена рецепторо-зависимая сорбция вируса клетками клонов линии РК-15, имеющих различную чувствительность к вирусу классической чумы свиней. Показано, что чувствительность данных клеточных систем зависит не только от наличия специфических рецепторов на поверхности клеток, но и от внутриклеточных факторов (механизмов).

7. Изучена активность неспецифических эстераз полученных клонов линии РК-15 и ряде перевиваемых (ПТП, ПСГК) и первичной культуре клеток J1C, имеющих различную чувствительность к вирусу классической чумы свиней. Показана, четкая корреляция между уровнем пермиссивности клеточных систем и активностью неспецифических эстераз, что позволяет предложить последние в качестве цитохимического маркера чувствительных к вирусу классической чумы свиней клеточных культур.

8. Показана возможность использования сыворотки крови различной видовой принадлежности (новорожденных телят, КРС, свиней, лошадей) для культивирования полученных клонов клеток и вируса классической чумы свиней.

9. Установлено, что клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/В5, адаптированная к выращиванию в среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ, является чувствительной для цитопатогенного вируса болезни Тешена. Титр вируса составил 7,0-7,5 lg ТЦДзо/мл, клон Н12 культуры клеток РК-15 репродуцировал вирус чумы мелких жвачных (титр вируса 4,25±0,50 lg ТЦЦ50/МЛ для эпизоотического штамма. Показана непермисивность клонов клеток А11 и B7-F к пес-тивирусам - пограничной болезни овец и вирусной диареи КРС.

5. Практические предложения.

1. Полученная высокочувствительная к вирусу КЧС клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/В5, культивируемая в среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки крови новорожденных телят, рекомендована в качестве клеточного субстрата при проведении диагностических исследованиях патологического материала на КЧС. Данная сублиния депонирована в ВСКК СХЖ.

2. Полученная высокочувствительная к вирусу КЧС клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/А11 культивируемая в среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки крови КРС, обработанной ПЭГ, рекомендована в качестве клеточного субстрата при производстве вирусвакцин против КЧС. Данная сублиния депонирована в ВСКК СХЖ.

3. Разработаны методические рекомендации по поддержанию и хранению культур клеток РК-15/В5 и РК-15/А11, полученных из перевиваемой

линии клеток почки поросенка PK-15, утвержденные директором ВНИИВ-ВиМ.

4. Разработаны методические рекомендации по определению активности неспецифических эстераз в культурах клеток, утвержденные директором ВНИИВВиМ

Список опубликованных работ по материалам диссертации.

1. Колбасова О.Л., Юрков С.Г., Куриннов В.В., Смыслова Н.Ю., Черма-шнцева H.A. Кариотипирование клонов клеток почки поросенка PK-15 с раз-ичной чувствительностью к вирусу классической чумы свиней (КЧС) // Науч-ые основы производства ветеринарных биологических препаратов: Тез. докл. аучно-практ. конф. ВНИТИБП, Щелково, 2000, с. 61-64.

2. Колбасова О.Л., Юрков С.Г., Дмитренко В.В. Получение и характери-гика клональной сублинии клеток почки поросенка для целей биотехнологии Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Тез. окл. научно-практ. конф. ВНИТИБП, Щелково, 2000, с. 109-110.

3. Юрков С.Г., Колбасова О.Л., Кушнир С.Д, Куриннов В.В., Чермашен-ева H.A., Неверовская Н.С. Эстеразная активность клеток перевиваемых ли-ий, имеющих различную чувствительность к вирусу классической чумы сви-ей (КЧС) // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, аотическими и зооантропонозными болезнями животных: Материалы меж-унар. научно-практ. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 2000, с. 181-183.

4. Колбасова О.Л., Юрков С.Г., Середа А.Д., Куриннов В.В., Чермашен-ева H.A. Изучение рецепторо-зависимой сорбции вируса клетками клонов янии РК-15, имеющих различную чувствительность к вирусу классической умы свиней (КЧС) // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо пасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных: Мате-яалы междунар. научно-практ. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 2000, с. 183-185.

5. Колбасова О.Л., Юрков С.Г., Куриннов В.В. Биотехнологическая ха-актеристика высокопродуктивных по отношению к вирусу классической чумы

свиней (КЧС) клонов клеток в процессе длительного культивирования // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных: Материалы междунар. научно-практ. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 2000, с. 185-188.

6. Колбасова О.Л., Юрков С.Г., Куриннов В.В. Изучение влияния сыворотки крови различной видовой принадлежности на культуральные и вирусре продуцирующие показатели клона клеток РК-15/В5 // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных: Материалы междунар. научно-практ. конф. ВНИИВВиГ« Покров, 2000, с. 188-190

7. Колбасова O.JL, Юрков С.Г., Куриннов В.В., Середа А.Д., Чермаше: цева H.A., Кушнир С.Д. Клональная характеристика перевиваемой линии кл ток почки поросенка PK-15 // Доклады Россельхозакадемии, 2000 №4, с. 39-41

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Колбасова, Ольга Львовна

Список сокращений

1. Введение

1.1. Актуальность темы

1.2. Цель работы и основные задачи исследований

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1.6. Апробация и публикации результатов

2. Обзор литературы

2.1. Клеточные культуры в биотехнологии

2.1.1. Первичные культуры клеток

2.1.2. Перевиваемые линии клеток

2.1.3. Контаминация клеточных культур

2.2. Клеточные культуры в изучении вируса классической чумы 19 свиней

2.3. Проблемы вирусной пермиссивности и резистентности кле- 21 точных культур

2.4. Методические подходы к изучению механизмов пермиссив- 23 ности

2.4.1. Клонирование как метод получения и изучения 24 пермиссивности клеточных культур к вирусам

2.4.2. Кариологический анализ

2.4.3. Цитохимический анализ

2.4.4. Рецепторный анализ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу классической чумы свиней"

тераз клеток полученных клонов с различном чувствительностью к вирусу КЧС

3.3.3. Стабилизация биологических свойств клонов клеток для биотехнологических целей

3.3.3.1. Биотехнологическая характеристика высокопродуктивных по отношению к вирусу КЧС клонов клеток в процессе длительного культивирования

3.3.3.2. Получение клонального трофоварианта клеток РК-15 для производственных целей

3.3.3.3. Оптимизация роллерного метода культивирования клональной сублинии РК-15/А11

3.3.3.4. Изучение влияния сыворотки крови различной видовой принадлежности на ростовые, ци-томорфологические показатели и репродукцию вируса КЧС клональной сублинии клеток РК-15 /В5

3.3.3.5. Изучение чувствительности полученных клонов к пестивирусам и вирусам других таксономических групп

4. Обсуждение

5. Выводы

6. Практические предложения

7. Список литературы

8. Приложения

71 76

85 88

91 101 103 105 120

Список сокращений

АТСС - Американская коллекция клеточных культур (American

Type Culture Collection);

АЧС - африканская чума свиней;

БРКИ - банк рабочих клеток изготовителя;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ВБН - вирус болезни Ньюкасла;

ВНИИВВиМ - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии;

ВНК-21 - перевиваемая линия почки новорожденного сирийского хомячка;

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;

ВСКК СХЖ - Всероссийская коллекция клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных;

ГБК-С - ферментативный гидролизат белков крови сухой;

ГЛА - ферментативный гидролизат лактальбумина;

Игла MEM - минимальная среда Игла;

ИП - индекс пролиферации;

ИРТ - инфекционный ринотрахеит;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ККИД - клеточно-культуральная инфекционная доза;

ККМС - клетки костного мозга свиней;

КРС - крупный рогатый скот;

КЧС - классическая чума свиней; лс - первичная культура лейкоцитов свиньи; лхм - лимфоцитарный хориоменингит;

МФА - метод флюоресцирующих антител; нэ - неспецифические эстеразы;

ПБО - пограничная болезнь овец;

ПГ-3 - парагрипп-3; плк - перевиваемая линия клеток; по - перевиваемая линия клеток почки овцы;

ППК/Д - перевиваемая монослойносуспензионная клональная линия клеток эмбриона свиньи;

ППК-666 - монослойно-суспензионная клональная сублиния перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи;

ПС - перевиваемая линия клеток почки сайги;

ПСГК - перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога;

ПТП - перевиваемая линия клеток тестикулярной ткани поросенка;

ПХ - пероксидаза хрена;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СПА - средний показатель активности;

СПЭВ - перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи версенизированная);

ТГЭС - трансмиссивный гастроэнтерит свиней;

ТЦД - тканевая цитопатическая доза;

ФГМ-С - ферментативный гидролизат мышечных белков сухой;

ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат;

ХИК - хронически инфицированные клетки;

ЦПД - цитопатическое действие;

ЧМЖ - чума мелких жвачных;

ВБУ - вирусная диарея крупного рогатого скота;

РК-15 - перевиваемая линия клеток почки поросенка;

ЭМБО - диметилсульфоксид;

БК - перевиваемая линия клеток почки кошки;

НеЬа - перевиваемая линия клеток карциномы шейки матки человека;

1ВК8-2 - перевиваемая линия клеток почки поросенка;

Маге-145 - клоновый вариант линии клеток МА-104 (эмбриональная почка обеэьяны-резус);

ЯК-13 - перевиваемая линия клеток почки кролика;

8К-6 - перевиваемая линия клеток почки поросенка.

1. Введение

1.1. Актуальность темы

В то же время не вызывает сомнения, что большая часть перевиваемых линий клеток состоит из неоднородных в генетическом и физиологическом отношениях клеточных элементов [62, 64, 88] и даже соблюдение неизменного режима культивирования не гарантирует стандартности результатов при вирусологических исследованиях.

Эта проблема возникла при изучении одной из опасных вирусных болезней животных - классической чумы свиней (КЧС). Высокая контагиоз-ность и смертность среди заболевшего поголовья при данной инфекции диктуют необходимость совершенствования диагностических методов и профилактических препаратов, получение которых невозможно без подбора эффективных систем культивирования [91, 112, 157].

Перевиваемая линия клеток почки поросенка РК-15 является общепризнанной культуральной системой, используемой при идентификации вируса КЧС, а так же для его накопления и титрования. Однако, нестабильность чувствительности клеточных культур даже к адаптированному вирусу КЧС, широкий разброс в вирусрепродуцирующих свойствах различных субпопуляций клеток РК-15, полученных из различных лабораторий мира, периодические потери чувствительности этими клетками к вирусу КЧС, отмеченные как в отечественных, так и в зарубежных исследованиях [55,187], наряду с важностью детального изучения этого возбудителя и совершенствования средств профилактики, биологического обеспечения производства вакцины против КЧС, требует детального изучения взаимоотношений клетки и вируса, а также выяснения условий пермиссивности и резистентности клеточных культур к изучаемому возбудителю.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Колбасова, Ольга Львовна

5. Выводы

1. В результате кариологического анализа 12 сублиний клеток почки поросенка РК-15, полученных из лабораторий разных стран, установлен высокий уровень спонтанной кариотипической изменчивости исходной культуры клеток РК-15 (АТСС ССЬ-ЗЗ), что и обуславливает различия в их биологических показателях.

3. Клональный анализ исходной сублинии клеток почки поросенка РК-15 выявил ее гетерогенность по фактору пермиссивности к вирусу классической чумы свиней (от 2,5 ^ ККИД50/мл до 7,5 ^ ККИД50/мл).

5. Впервые получена клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/А11 (модальное число хромосом - 31, величина модального класса -77%) высокочувствительная к вирусу классической чумы свиней (7,5 lg ККИД5о/мл), адаптированная к выращиванию в среде Игла MEM, содержащей 5%о сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ. Биологические свойства стабильны в течение 60 пассажей. Оптимизированы параметры его роллерного культивирования. Клон РК-15/А11 предложен в качестве клеточного субстрата для производства вакцины против классической чумы свиней.

7. Изучена активность неспецифических эстераз полученных клонов линии PK-15 и ряде перевиваемых (ПТП, ПСГК) и первичной культуре клеток JIC, имеющих различную чувствительность к вирусу классической чумы свиней. Показано, что наблюдается четкая корреляция между уровнем пермис-сивности клеточных систем и активностью неспецифических эстераз, что позволяет предложить последние в качестве цитохимического маркера чувствительных к вирусу классической чумы свиней клеточных культур.

8. Показана возможность использования сыворотки крови различной видовой принадлежности (новорожденных телят, КРС, свиней, лошадей) для культивирования клонов и вируса классической чумы свиней.

9. Установлено, что клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/В5, адаптированная к выращиванию в среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ, является чувствительной для цитопатогенного вируса болезни Тешена. Титр вируса составил 7,0-7,5 lg ТЦД50/мл, клон HI2 культуры клеток РК-15 репродуцировал вирус чумы мелких жвачных в титрах 4,25±0,5 lg ТЦД50/мл для эпизоотического штамма. Показана непермиссивность клонов клеток А11 и B7-F к пестивирусам - пограничной болезни овец и вирусной диареи КРС.

6. Практические предложения

1. Полученная высокочувствительная к вирусу КЧС клональная сублиния клеток почки поросенка РК-15/В5, культивируемая в среде Игла MEM, содержащей 5% сыворотки крови новорожденных телят, рекомендована в качестве клеточного субстрата при проведении диагностических исследований патологического материала на КЧС. Данная сублиния депонирована в ВСКК СХЖ.

3. Разработаны методические рекомендации по поддержанию и хранению культур клеток РК-15/В5 и РК-15/А11, полученных из перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15, утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Практические предложения104

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Колбасова, Ольга Львовна, Покров

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. // М., "Мир", 1983, 258 с.

2. Амченкова А.И., Гулувич Н.Е. Морфологическое и цитохимическое изучение клеток лейкемии, чувствительных и резистентных к вирусу Коксаки ВЗ. // Вопр. Вирусол., 1968, №1, стр. 67-72

3. Амченкова A.M., Норовлянский А.Н., Хесин Я.Е., Гулевич Н.Е. Изменение кариоти-па культур человеческих клеток в процессе реверсии чувствительности к вирусу Коксаки В. //Вопр. вирусол., 1980, № 3, стр. 311-314

4. Амченкова A.M., Советова Г.П. Этиологические механизмы специфического противовирусного иммунитета. // Вопр. вирусол., 1968, №5, стр. 560-566

5. Анджапаридзе О.Г., Богомолова H.H. Особенности взаимодействия вирусов и клеток в хронически инфицированных культурах // Вопр. вирусол., 1973, №6, стр. 643-649

6. Анджапаридзе О.Г., Богомолова H.H., Борискин Ю.С. Персистенция вирусов // М.: Медицина, 1984, 256 с.

7. Анисимова Л.И., Недосеков В.В., Прилепская Е.П., Юрков С.Г. Трофоварианты клеток почки сайги, адаптированных к среде с низким содержанием сыворотки и их чувствительность к вирусу бешенства: Мат. науч. конф., г. Покров, 1998, стр.120

8. Багрянцева М.П. Технология изготовления и свойства питательной среды сухой стерильной на основе гидролизатов. // Автореф. канд. дис., Кольцово, 1999, 28 с.

9. Балышев В.М., Башаев В.В., Жестерев В.И. и др. Способ получения вакцины против оспы овец. // Патент РФ №2138291, приоритет от 30.03. 1998, зарегистрирован в Госреестре изобр. 27.09. 1999г.

10. Балышев В.М., Вишняков И.Ф., Федорищев И.В. и др. Вакцина против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных. // Патент РФ №2154496, приоритет от 04.12.1997. зарегистрирован в Госреестре изобр. 20.08.2000г.

11. Белун О.В., Сокова В.А., Курносов А.Н. Клонирование перевиваемой линии клеток почки поросенка. // Вопр. вет. вирусол., микробиолог, и эпизоотолог.: Тез. докл., Покров, 1978,стр. 16

12. Богомолова H.H., Шухмина Н.Р., Анджапаридзе О.Г. Исследование клонов клеток, полученных из перевиваемых культур, отличающихся по чувствительности к вирусу клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол., 1975, №1, стр.71-74

13. Буреев И.А., Гавриченко В.А., Жестерев В.И., Калантаенко Ю.Ф. Установка промышленного типа для культивирования клеток и вирусов в роллерных бутылях. // Материалы научно-практич. конф. ВНИИВВиМ, Покров 1995г.

14. В.Д. Соловьев, Я.Е. Хесин, А.Ф. Быковский. Очерки по вирусной цитопатологии. // М„ "Медицина", 1979, 320 с.

15. Валишина Т.В. Совершенствование средств и методов лабораторной диагностике бешенства. // Автореф. канд. дисс., Покров, 1992, 24 с.

16. Велямов В.Т. Чувствительность клеточных культур, выращенных в питательных средах из гидролизатов белков гороха и сои, к вирусам парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота. // Автореф. канд. дисс., М., 1986, стр.14-18

17. Вишняков И.Ф. Диагностика классической чумы свиней. // Ветеринария, 1986, № 3, стр. 27-30.

18. Вишняков И.Ф., Жестерев В.И., Башаев В.В. и др. Использование перевиваемой культуры клеток почки сайгака в вирусологической практике. // Цитология, 1994, т. 36, №6, стр. 549

19. Вишняков И.Ф., Карпов Г.М., Куриннов В.В. и др. Способ получения вакцины против чумы плотоядных. // Патент РФ №2129442, приоритет от 18.07.1996, зарегистрирован в Госреестре изобр. 27.04. 1999г.

20. Ворошилова М.К., Тольская Е.А., Лаврова И.К. и др. Об опасности малигнизации непрерывно растущих клеточных штаммов и их применение для вирусологических целей. // Вопр. вирусол., 1960, № 3, стр. 360.

21. Гаврилов В.И. Перевиваемые клетки в вирусологии, М., 1964, 267 с.

22. Гальнбек Т.В. Клеточные культуры щитовидной железы и кишечника свиньи и их использование в вирусологической практике. // Автореф. канд. дисс., М., 1991, стр.16

23. Гасанова Б.С. Культивирование клеток млекопитающих с различными видами сывороток и заменителями сывороток. // Автореф. канд. дисс., М., 1993, с. 8-10

24. Георгадзе И.И. Изучение естественных изменений восприимчивости клеток in vitro к некоторым вирусам.// Автореф. дис. канд. биол. наук., М., 1966, 26 с.

25. Герасимов В.Н., Герасимова Н.И., Федорова Е.Е. и др. Клеточные культуры в биотехнологии противоящурных вакцин. // Проблемы инфекц. патологии с-х животных: Тез. докл. конф., Владимир, 1997, с. 41-42

26. Герасимов В.Н., Кулешбякова Ш.К., Гусев А.А. и др. Морфологические и кариоло-гические характеристики постоянных линий при длительном культивировании. // Цитология, 1999, т. 41, №3-4, стр. 226

27. Глузман Д.Ф., Надгорная В.А. Цитохимическая диагностика вариантов острого лейкоза и метастазов рака в костный мозг и лимфатические узлы. // В сб. Ультраструктура и гистохимия нормальных и опухолевых клеток, 1980, стр. 105-111

28. Голубев Д.Б., Соминина А.Л., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. // Л., Медицина, 1976, 224 с.

29. Грачев В.П. Современные аспекты крупномасштабного культивирования клеточных субстратов и вирусов. // Культивирование клеток животных и человека: Тез. докл., Пущино, 1985, стр. 61-64

30. Гулевич Н.Е., Бахуташвили В.И., Гринберг К.Н. Сравнительное изучение хромосом в восприимчивых и резистентных к вирусу клетках. // Мат. XV съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов., 1970, ч.2, стр. 276-277

31. Дубровская Р.В., Гулевич Н.Е. Вирусологическое изучение клоновых вариантов резистентных клеток лейкемии 34-3.// Теория и практика использования культур клеток в вирусологии: Мат. VI науч. конф., М., 1965, стр. 67

32. Жестерев В.И. , Мищанин В.А., Чурбанова Г. К. и др. Возможность экспресс-защиты свиней от заболевания классической чумы свиней // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1992, ч. 1, стр. 104

33. Жестерев В.И., Мищанин В.А., Хрипунов В.М. и др. Вирусвакцина против болезни Ауески. // Патент РФ №2138289, приоритет от 24.02.1998, зарегистрирован в Госреестре изобр. 27.09.1999г.

34. Закутский Н.И. Особенности культивирования вакцинного штамма ТК-А вируса инфекционного ринотрахеита КРС для изготовления инактивированной вакцины. // Докл. РАСХН, 1998, №5, стр. 42-43

35. Илькив Р.И., Лыска В.М. Использование клеток, выращенных на полистироловых пластинах, при выделении вируса классической чумы свиней // Вопр. вет. вирусол., микробиол. эпизоотол.: Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1992, ч.1, стр. 125126

36. Ингрэм В.М. Биосинтез макромолекул. М., "Мир", 1975, 416 с.

37. Карпов Г.М., Вишняков И.Ф., Куриннов В.В. и др. Аттенуированный штамм вируса чумы плотоядных Virus pestis car nivorum. // // Патент РФ №2108385, приоритет от 18.06.1996., зарегистрирован в Госреестре изобр. 10.04.1998г.

38. Ковалева И.А., Худяков Г.А., Кудрявцева Г.А., Манин Б.Л. Исследование кариотипа перевиваемых культур клеток для определения их стабильности. // Акту ал. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. научно-практ. конф., Владимир, 1983, стр. 17-18

39. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Дьяконов Л.П. Аттестация культур клеток почек овец на спонтанную контаминацию прионами скрепи. // Цитология, 1999, т. 41, №34, стр. 281-282

40. Кудрявцева Г.А. Цитохимические показатели культур клеток БП и их связь с чувствительностью клеток к вирусу ящура. // Актуальные проблемы вет. вирусол.: Тез. докл. научно-практ. конф., Владимир, 1978, стр. 45

41. Кукайн P.A., Канель И.А., Индулен М.К. и др. Культивирование клеток перевиваемых линий на микроносителях. // Цитология, 1983, т. XXV, №9, стр. 1085

42. Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A., Герасимов В.Н. и др. Цитогенетический анализ сублиний клеточных линий ВНК-21 и СПЭВ. // Цитология, 1999, т. 41, №3/4, стр. 286

43. Куриннов В.В. Эпизоотологические, клинические и диагностические исследования при классической чуме свиней. // Доклады РАСХН, 1999, №1, с. 42-45

44. Курносов А.Н., Зуев В.В., Опарин В.Н., Юрков С.Г. Инструкция по приготовлению питательных сред и клеточных культур. // ГУВ Госагропром СССР, М., 1987, 154 с.

45. Курносов А.Н., Юрков С.Г., Опарин В.Н. и др. Суспензионные культуры клеток в ветеринарной вирусологии. // Вирусные болезни с-х животных: Тез.докл. научно-практ. конф., Владимир, 1995, стр. 103-104

46. Лакин Г.Ф. Биометрия. // М., 1990, 352 с.

47. Лузянина Т.Я., Бисенова М.И. Интенсивность адсорбции и проникновения миксови-русов в клетки резистентных культур.// В кн.: Актуальные вопросы противовирусного иммунитета при гриппе и других респираторных инфекциях. Д., 1969, стр. 12-15

48. Лымарь В.Т., Прохор В.Ф., Ялышев М.Р. и др. Характеристика постоянной линии клеток ВНК-21 после 20 лет непрерывного хранения при температуре минус 196°С. // Биотехнология, 1992, №5, стр. 75-77. 241

49. Малярец П.В., Гусева Е.В., Ануфриева Т.А. Классическая чума свиней (обзор литературы) // Владимир, 1995, стр. 14

50. Мамаева С.Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре. // Цитология, 1996, т.38, №8, стр. 787-804

51. Мамаева С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток. // В кн.: Методы культивирования клеток, 1988, стр.78

52. Мамаева С.Е., Литвинчук Л.Ф., Пинаев Г.П. Закономерности кариотипической изменчивости в перевиваемых клеточных линиях человека. // Докл. Академии наук СССР, 1983, т.270, №2, стр. 456-458

53. Миронова Л.Л. Клеточные культуры и применение их для изготовления противовирусных препаратов. // Автореф. док. дисс., М., 1968, 26 с.

54. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х. Культивирование клеток животных для медицинской биотехнологии. // М., 1995, 148 с.

55. Миронова Л.Л., Хапчаев Ю.Х., Попова В.Д. и др. Применение линии 4647 для крупномасштабного производства ВАКУУМ. // Цитология, 1994, том 36, №6, стр. 573

56. Мискарова Э.Д. Цитохимия диплоидных клеточных культур из кроветворных органов кролика при риккетсиозной инфекции.// Автореф. канд. дис., М., 1970, 25 с.

57. Муканов К.К. Морфология и некоторые биофизические свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. // Автореф. канд. дисс., М., 1982, 24 с.

58. Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцины против бешенства.// Автореф. канд. дисс., 1998, стр. 17

59. Новохатский A.C. Клеточные культуры в вирусологии. // В кн.: Общая и частная вирусология, М. Медицина, 1982, стр. 463-493

60. Новохатский A.C. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. // Итоги науки и техники, ВИНИТИ, сер. Вирусология, 1979, т.8, стр. 3-135

61. Ночевный В.Т. Биологический контроль ростовой активности питательных сред и сыворотки крови животных. // Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток.: Тез. докл. конф., Кольцово, 1991, стр. 46

62. Панкова Г.Е. Селекция клеточных популяций и морфологическая характеристика клонов из перевиваемых линий клеток почки поросенка ПП (PS) и РК-15 // Цитология, 1976г., т. XVIII, №8, стр. 1036-1038

63. Полянская Г.Г. Влияние условий культивирования на кариотипическую структуру двух клеточных линий фибробластов кожи индейского мунтжака. // Цитология, 1989, т 31, № 7, стр. 807-817

64. Полянская Г.Г., Дьяконова М.Ю. Влияние условий культивирование на кариотипическую структуру клеточной сублинии почки кенгуровой крысы. // Цитология, 1988, т. 30, № 11, стр.1355-1363

65. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую структуру клеточной линии фибробластов кожи индейского мунтжака. // Цитология, 1992, т. 34, № 3, стр. 82-88

66. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н . Влияние микоплазменной контаминации и деконта-минации с помощью ципрофлоксацина на кариотипическую структуру клеточной линии легкого китайского хомячка V-79.//Цитология, 1993, т 35, №8, стр. 71-78

67. Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., Лизова JT.C. Влияние микоплазменной контаминации на кариотипическую изменчивость в клеточных линиях с разной структурой карио-типа. // Цитология, 1996, № 2, т. 38, стр. 243-244

68. Полянская Г.Г., Сизова JI.C., Николаенко JI.C. Кариотипические характеристики линии фибробластов кожи индийского мутжака при культивировании с разными сыворотками.//Цитология, 1993, т.35, № 2, стр. 86-96

69. Попов В.И. Ветеринарно-санитарными, зоогигиеническими правилами по кормлению, содержанию, уходу и использованию свиней-доноров биосырья свободных от возбудителей инфекционных болезней (СВИБ). // Покров, 1983, 5 с. 252

70. Попова H.A., Мамаева С.Е., Аркина М.А. и др. Цитогенетическая и вирусологическая характеристика исходной линии и клонов клеток RH с различной чувствительностью к вирусу клещевого энцефалита. // Цитология, 1988, т. XXX, №4, стр. 454-459

71. Попова H.A., Кузьменко М.И. Изменение кариотипа постоянной клеточной линии RH в процессе клонирования. // Цитология, 1987, т. XXIX, №9, стр. 1100-1101

72. Пригодность клеточных субстратов для производства биологических препаратов // Бюл. ВОЗ, сер. техн. докл., №747, Женева, 1988

73. Рингерц Н., Севидж Р. Гибридные клетки. // Изд. «Мир», М., 1979, 416 с.

74. Савельева Л.Г., Мамаева С.Е. Популяционные аспекты кариотипической гетерогенности в линиях различного гистогенеза. // Цитология, 1987, т. XXIX, №9, стр. 1102

75. Семенова Е.Г., Хоменко A.B., Мамаева С.Е. Изменение клеточного цикла и кариоти-па клеток L мыши при смене способа культивирования. // Цитология, 1984, т.26, №10, стр. 1156-1160

76. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. // Киев, «Урожай», 1993, 368 с.

77. Сергеев О.В. Пестивирусы (Обзор). // Вопросы вирусологии, 1997, №1, стр. 5-10

78. Советова Г.П., Марченко В.И., Амченкова A.M. и др. Хроническая вирусная инфекция в перевиваемых культурах клеток. // Вопр. вирусол., 1971, №6, стр. 10-16

79. Сокова В.А., Трапезникова Т.М., Яснова Л.С. Кариологическая характеристика и ростовые свойства в однослойных культурах нескольких сублиний клеток ВНК-21. // Актуальные вопр. вет. вирусолог.: Тез. докл. научно-практ. конф., Владимир, 1976, стр. 67-69

80. Сокова В.В., Сочнова О.В., Николаев А.К. Получение и использование клонов клеток ВНК-21 для промышленного выращивания вируса ящура. // К новой стратегии борьбы с ящуром: Мат. междунар. конф., Владимир, 1991, стр. 107-108

81. Соловьев В.Д., Хесин Я.Е. Хроническая инфекция и противовирусный иммунитет клеток. // "Вестн. АМН СССР", 1970, № 10, стр. 20—31

82. Соловьев В.Д., Георгадзе И.И., Варшавер М.Б. Изучение естественных изменений восприимчивости к вирусам в перевиваемой культуре клеток J-96 и в клонированных субкультурах. // Вопр. вирусол., 1965, № 6, стр. 699

83. Соловьев В.Д., Гулевич Н.Е., Варшавер Н.Б. Вирусологическое и кариологическое изучение резистентной к вирусу полиомиелита клеточной линии. // Вопр. вирусол, 1963, №5, стр. 580—583

84. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных // Москва, ВНИТИБП, 1998, 928 с.

85. Тарасов В.Н. Клеточные культуры в вирусологии. // М., 1990, т. 19, 167 с.

86. Тарасов В.Н. Клеточные культуры в производстве биопрепаратов. // Итоги науки и техники, ВИНИТИ, сер. Вирусология, М., 1991, т. 21, 172 с.

87. Тимаков В.Д., Зуев В.А. Латентные и хронические вирусные инфекции (Состояние и основные аспекты исследований) //"Вестн. АМН СССР'", 1970, № 10, стр. 3-12

88. Тимаков В.Д., Зуев В.Л., Петере В.В. Латентная инфекция культур клеток, нечувствительных к цитопатическому действию вируса. I. Реакция культуры клеток L на заражение вирусом гриппа типа А. //Вопр. вирусол., 1971. № 3, стр. 281-285

89. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемых для производства биологических препаратов. // Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов (серия технических докладов ВОЗ №745), М., 1988, стр. 85-98

90. Феннер Ф., Макс-Ослен Б.Миме С. и др. Биология вирусов животных. М., 1977, т.2, 624 с.

91. Хесин Я.Е., Амченкова A.M., Козьяков С.Я. Содержание основных белков в ретикулярных клетках перевиваемых линий, чувствительных и резистентных к энтеровиру-сам. // Бюллетень эксп. биологии и медицины, 1971, № 11, стр. 116-118

92. Хесин. Я.Е., Амченкова A.M., Воронина Ф.В., Советова Г.П., Гулевич Н.Е. Связь клеточного метаболизма с чувствительностью клеток к энтеровирусам. // Мат. XV съезда эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, 1970, ч. 2, стр. 291-292

93. Хижинская Т.М., Подчерняева Р.Я., Мельниченко Е.И. Культивирование клеток на пористом микроносителе с использованием различных видов сывороток. // Биотехнология, 1998, №5, стр. 38-41

94. Цыбанов С.Ж., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Семенихин A.JI. Современные достижения в изучении пестивирусов (Описание вирусов и заболеваний, вызываемых ими). // Ветеринария, 1995, №3, стр. 14-18

95. Чевелева Т.С., Цыбанова Л.Я., Вишняков И.Ф. и др. Идентификация микоплазм методом полимеразной цепной реакции. // Научные основы технологии промыш. Пр-ва ветер, биолог, препаратов: Тез. докл. конф., Щелково, 1996, стр. 43-44

96. Ченчев И., Милев Н., Пеев Я. и др. Доказване на вируса на чумата по свинете чрез заразяване на клетъчни культури с лимфоцита лизарини червени кръвни клетки. // Вет. мед. науки. 1985. т. 22, № 10, стр. 16-19

97. Чермашенцев В.И., Зуев В.В. Поиск новых культур клеток, высокочувствительных к вирусу классической чумы свиней. // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1992, ч. 1, стр. 121

98. Чермашенцев В.И., Юрков С.Г. Методические указания по обнаружению , идентификации и титрованию вируса классической чумы свиней в культуре J1C свиней-доноров. // Покров, 1988, 21 с.

99. Чермашенцева H.A. Деконтаминация культуры клеток ППК-666 от персистирующе-го вируса классической чумы свиней и стабилизация свойств полученных клонов. // Автореф. канд. дис., 1996г, 23 с.

100. Чермашенцева H.A. Изучение стабильности и оценка ростовых свойств клонов клеток, свободных от вируса-контаминанта КЧС. // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф., Покров, 1992, стр. 287-288

101. Чермашенцева H.A., Куриннов В.В., Чермашенцев В.И. Чувствительность клонов Д114 и Д191 перевиваемой культуры клеток ППК-666 к вирусам КЧС и АЧС.// Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф., Покров, 1992, стр.37

102. Чернов В.М., Чернова O.A. Микоплазменные инфекции как возможный фактор генетических изменений в клетках высших эукариот. // Цитология, 1996, т. 38, № 2, стр. 107-114

103. Черное В.И., Гуткина A.B., Гендон Ю.З. / Сравнительное изучение репродукции вирусов подгруппы оспы-осповакцины в клетках L. // Вопр. вирусол., 1968, № 4, стр. 408

104. Чурбанова Г. Н. , Жестерев В. И. , Балышева В. И. и др. Размножение аттенуирован-ного и вирулентного штаммов вируса КЧС // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1992. ч. 1, стр. 118-119

105. Шалунова Н.В. Принципы стандартизации клеточных линий, применяемых в биотехнологии. // Тез. докл. конф., М., 1985, стр. 223-224

106. Шевак И.М. В кн. Иммунология под редакцией У. Пола, М. "Мир", 1987, стр. 117

107. Юрков С.Г. О перекрестной контаминации перевиваемых культур клеток. // Вопр. вирусол., 1995, №5, стр. 255-227

108. Юрков С.Г., Курносов А.Н. Вопр. вет. вирусол., микробиолог, и эпизоотол. Тез. докл. ВНИИВВиМ, г. Покров, 1992. стр. 283-284129130131132133134135136.137,138.139.140.141.142.143.144.

109. Юрков С.Г., Курносов А.Н., Витина С.А. и др. Универсальная роллерная технология культивирования перевиваемых клеток животных // Ветеринария, 1995, №9 , стр. 2934

110. Юрков С.Г., Шевченко J1.B., Аверина Н.Н., Курносов А.Н. Инструкция по изготовлению культур клеток костного мозга и лейкоцитов крови свиней. // Покров, 1985, 24 с.

111. Baird, S, Raschke W. & Weissman, I. С. Evidence that MULV-induced thymic lymphoma cells possess specific cell membrane binding sites for MULV. Submitted for publication

112. Bang F.B., Warwick A. Mouse macrophages as host cells for the mouse hepatitis virus and genetic basis of their susceptibility. // Proc. nat. Acad. Sci. USA, 1960, vol 46, p. 1065— 1075

113. Barbara J., Potts PhD, Kenneth P., et al. Border disease: Tissue culture studies of the virus in sheep. // American Journal Veterinary research, 1982, vol. 43, №8

114. Barile M.F. Mycoplasma tissue cell interactions // The mycoplasmas, vol. 2, Human and animal mycoplasmas. New. York ets.: Acad. Press., 1979, 500 p.

115. Barnaure G., Popa M., Dimitrescu G. Recherches concernant la valeur immunogene dune souche vaccinale attenuee antipeste porcine, cultivi sue cellule tripsinesees. // Lucr. Inst, cecr. vet. dioprep. "Pasteur", 1977, № 13, p. 15-22

116. Boynton W. H. Preliminary report of the propagation of hog cholera virus in vitro. // Vet. Med. 1946, vol. 41, p. 364

117. Breese SS jr.: Virus-like particles occurring in cultures of stable pig kidney cell cultures. Arch ges Virusforsch, 1970, vol. 30, p. 401-404

118. Buonavoglia C., Falcone E., Pestalozza S. et al. Susceptibility of a mining kidney cell line (MPK) to hog cholera virus. // Microbiologica, 1988, vol. 11, p. 263-264

119. Caij A., Desmet A., Dubois N., Koenen F. High titre hog cholera virus production on cy-todex 3R nucrocarrier cultures// Arch. Virol, 1989, vol. 105, № 1/2, p. 113-118

120. Carbrey E. The role of immune tolerance in transmission of hog cholera. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1965. vol. 146, p. 233-237

121. Carbrey E. Routine laboratory diagnosis of hog cholera employing the flyorescent antibody tissue culture technique. FAO/OIE International Meeting on Hog Cholera and African Swine Fever. // Rome. 1965

122. Carbrey E., Ericson G., Metz C. Diagnosis of hog cholera. // Prev. Vet. Med., 1984, № 2, p.103-108

123. Carrit В., Goldfarb P. A human chromosome determinant for susceptibility to herpes simplex virus. // Nature, 1976, vol. 264, p. 556—558

124. Chernov V.M., Chernova O.A., Volkova E.N., Sitnikova S.N., Chekmenjeva J.J., Malcev S.V. Chromosome abnormalities in human cells infected with mycoplasmas. // IOM Leff., 1994, vol.3, p. 642

125. Chessin L.N. & Hirchhorn K. Virus resistance and sensitivity in cultured human synovial cells as a possible genetic marker.// Exp. Cell res., 1961, 23, p. 138-144

126. Clarke G.B., Spier R.E. Variation in the susceptibility of BHK population and cloned cell lines to three strains of Foot-and-mouth disease virus.// Arch. Virol., 1980, vol.63, p.1-9

127. Couillin P. Evidence for synteny between a polio receptor gene and glucose phosphate isomerase (GPI) by analysis of human — mouse hybryda. // Cytogen. Cell Genet., 1976, vol. 1, p. 111—113

128. Creagan R.P., Chen S., Ruddle F. Genetic analysis of the cell surface: association of human chromosome 5 with sensitivity to diphtheria toxin in mouse— human somatic cell hybrides. // Proc. nat Acad. Sci. USA, 1975, vol. 72, p. 2237-2247

129. Croce C., M., Koprowski 9l. Assignment of gene(s) for cell transformation to human chromosome 7 carrying the Simian Virus 40 genome. // Proc. nat. Acad. Sci. USA, 1975, vol. 72, p. 1658—1660

130. Croghan DL, Matchett A, Koski TA: Isolation of porcine parvovirus from commercial trypsin. Appi Microbiol., 1973, vol. 26, p. 431-433

131. Dales, S. Early events in cell-animal virus interactions. // Bact. Rev., 1973, vol. 37, p.103

132. Danner K., Bachmann P.A. Vermenhrung und Ausbreitung von Schweinepest-Virus, Stamm Munchen-1, in PK-15-zellkulturen. // Zbe. Vet. Med. Reihe B., 1970, vol. 17, №3, p. 353-362

133. Deesp J., Schmid E., Bauchiger M. The cytogenetic effect of bleomycin on human peripheral lymphocytes in vitro and in vivo. // Mut. Res., 1978, vol.56, p.341-353

134. Diderholm H., Dinter Z. The use of SV 40-transformed cell for titration of bovine viral dir-roea and hog cholera viruses // Zbl. Vet. Med, 1965, vol. 12, p. 469-475

135. Enders J.E., Holloway A., Grogan E.A. Replication of poliovirus I in chick embryo and hamster cells exposed to Sendai virus. II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1967, vol. 57, p. 637-644

136. Ferrari M. A tissue culture vaccine with lapinized Chinese (LC) strain of hog cholera virus (HCV) // Conp. Immun. Microbiol. Infect. Dis., 1992, vol. 15, № 3, p. 221-228

137. Flotgel G., Depner K., Paton D., Koenen F. Proposal for eu diagnostic manual for classical swine fever (CSF) diagnosis: CSF virus isolation. // Eu. Ref. Leff. Repl., 1998, № 3, p. 4748

138. Ford C.E., Hamerton J.L. A colchicines, hypotonic, citrate, squash sequence for mammalian chromosomes. // Stain Technol., 1956, vol. 31, p. 247-251

139. Fuchs F., Schweinepest // Handbuch der Virusinfektionen bei Tieren. Bd. 3/1. Part. 2. Jena: Fischer Verl., 1968.

140. Garhia P., Garhia M., Zand H. Effect of bleomycin on Down's syndrome lymphocutes in culture. // Mut.Res., 1988, vol.207, p.153-158

141. Gazdar A.F., Russell E.K., Minna J.D. Replication of mouse-tropic and xenotropic strains of murine leukemia virus in human x mouse hybrid cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 1974, vol.71, p. 2642-2645

142. Genest P. & Daniel Ph. Genomic modification in cell line cultures chronically infected with a myxovirus // Proc. Sol. Exper. Biol. Med., 1966, vol. 123, p. 722-725

143. Goldman R., Lieve L. Heterogeneity of antigenic-sidechain ength in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and almonella typhimurium LT2. // Eur. J. Biochem. vol. 107, p. 145-153

144. Goodman G.F., Koprowski H. Study of the mechanism of innate resistance to virus infection. // J. Cell. Comp. Physiol., 1961, vol. 59, p. 333—373

145. Gratzek JB, Segre D, Berman DT: Detection and isolation of a virus contaminating a stock of virus diarrhea virus. Am J Vet Res., 1964, vol. 25, p. 374-379

146. Hausen H. et al. Chromosomale Aberrationen nach langeren Infection lines klonierten L-Zellstammes mit Vaccinia-Vires.//Zs. Med. Microbiol., 1966, vol. 152, p. 66-72

147. Hayflick L., Moorpead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains .// Exp. Cell Res., 1961.vol. 25, p. 585-621

148. Holland J, Mc. Laren L., Syverton J. The mammalian cell-virus relationship. VI Infection of naturally unsusceptible cell with enterovirus nucleic acid. // Exp. Med., 1959, №110. p. 65-80

149. House J., House C., Lewellyn M. Characteristics of porcine kidney cells line IB-RS-2 clone D10 (IB-RS-2 D10) which is free of hog cholera virus // In Vitro Cellular., 1988, vol. 24, №7, p. 677-682

150. Hughes, R.C. Glycoproteins as components of cell membranes // Progr. Biophis. Mol. Biol., 1973, vol. 26, p. 189

151. Hulst M.M., Panoto F.E., Hoekman A. et al. Inactivation of the RNAse activity of glycoprotein E of classical swine fever virus results in a cytopathogenie virus. // J. Virol., 1998, vol. 72, № l,p. 151

152. Jaenisch, R., Fan, H. & Croker, B, Infection of preimplantation mouse embryos and of newborn mice with leukaemia virus: Tissue distribution of viral DNA and RNA and leu-kemogenesis in the adult animal. // Proc. nat. Acad. Sci., 1975, vol72, p.4008

153. Jrjima K., Morimoto K., Koizumi A., Higurashi M., Hirayama M. Bleomycin-induced chromosomal abberrations and sister chromatid exchanges in on Down's lymphocutes in culture. // Hem. Geneet., 1984, vol. 66, p. 57-61

154. Kano, S., Bloom, B.R. & Howe, M.L. Enumeration of activated thymus lymphocytes by the virus plaque assay. // Prog. Nat. Acad. Sci., 1973, vol. 70, p.2299

155. Karasszon D., Bodon L. Demonstration of the swine fever virus in tissue culture by immunofluorescence. // Acta Mikrobiol. Acad. Sci. Hung., 1963, № 10, vol. 3, p. 287-291

156. King AA, Harkness JW: Viral contamination of fetal bovine serum. Vet. Rec., 1975, vol. 97, p. 16

157. Klein G., Dombos, I. & Gothoskar, B, Sensitivity of Epstein—Barr virus (EBV) producer and non-producer human lymphoblastoid cell lines to superinfection with EB-virus. // Int. J. Cancer, 1972, vol. 10, p. 44

158. Klein, G., Sugden, B. Leibold, W. & Menezes, /. Infection of EBV-genome negative and positive human lymphoblastoid cell lines with biologi-cally different preparations of EBV. //Intervirology, 1974, vol. 3, p.232

159. Kniazeff AJ, Wopschall LJ, Hopps H.E., Morris CS: Detection of bovine virus in fetal bovine serum used in cell culture. In Vitro, 1975, vol. 11, p. 400-403

160. Kohn, A. & Fuchs, P. Initial effects of viral infection in bacterial and animal host cells. // Adv. Virus Res., 1973, vol. 18, p.159

161. Kress J., Stewart W., Carbrey E. et al. Sensitivity of swine buffy coat culture to infection with hog cholera virus. //Am. J. Vet. Res. 1976, vol. 37, № 11, p. 1315-1318

162. Kresse JI, Stewart WC, Carbrey EA, Snyder, ML: End-point dilution-fluorescent antibody technique for cloning hog cholera virus. Am. J/ Vet. Res., 1982, vol. 43, p. 497-498

163. Kusano T., Wang R. Human-mouse hybrid cell lines and susceptibility to poliovirus. II. Polio sensivity and the chromosome constitution of the hybrids. // J. Virol, 1970, vol. 5, p. 682—685

164. Lefevre P.C., Diallo A. Peste des petits ruminants. // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 1990, vol. 9, №4, p. 951-96

165. Liess B. Persistent infections of hog cholera: a review. // Preventive Veterinary Medicine. 1984. vol.2, p. 109-113

166. Liess. Classical swine fever virus and related viral infections. Boston, 1988, 298 p.

167. Lonberg-Holm K. & Philipson, L. Early interaction between animal viruses and cells. In Melnic, J.L. (ed). Monographs in Virology 9, S. Karger.- Basle, 1974, p. 1

168. Medina M.R. Peste suina classica. II. Estudo sobre urn virus amostra chinesa, adaptado ao cultlvo celular (amostra Porto Alegre) // Arq. Bras. Med. Vet. Zootechn., 1991, vol. 43, № 4, p. 301-314

169. Medrano, L. & Green, H. Picornavirus receptors and picornavirus multiplication in humanmause hybrid cell lines. // Virology, 1973, vol. 54, p. 515

170. Mengeling W. and Torray J. Evaluationof the Fluorescent Antibody-Cell Culture Test fo Hog Cholera Diagnosis. // Am. J. Vet. Res., 1967, vol. 127, № 28, p. 1653-1659

171. Merten O.-W., Kallel H. , Maunguerra J.-C. The new medium MDSS2N, free of any animal protein supports cell growth and production of various viruses. // Cytotechnology, 1999, vol. 30, №1-3, p. 191-201

172. Miller O.J. Assigment of a poliosensitivity gene to human chromosome 19.// Am. J. hum. Genet, 1973, vol. 25, p. 52

173. Miller D.A., Miller O.J., Dev V.G. et al. Human chromosome 19 carries a poliovirus receptor gene.//Cell, 1974, vol. 1, p. 167-170

174. Miller D.A., Miller O.J., Dev Y.G., Hashmi, S. & Tantravahi, R. Human chromosome 19 carries a polio virus receptor gene cell. // Cell, 1974, vol. 1, p. 167

175. Mittelholzer C., Moser C., Fratschin J.D., Hofmann M.A. Generation of cytophatogenic subgenomik RNA of classical swine fever virus in persistently infected porcine cell lines. // Virus Research, 1997, vol. 51, № 2, p.125-137

176. Moennig V. Characteristics of the virus // Classical swine fever and related viral infections. -Boston, 1983, p. 55-80

177. Paul John. Cell and tissue culture. // 5th ed Edinbinburghe.a. Churchill Livingstone. 1975, p. 484

178. Paul P.W., Buul van Goudzwaard I.H. Bleomycin-induced structural chromosomal abber-rations in spermatogonia and lonemarrow cells of mice. // Mut. Res., 1980, vol.69, p. 319324

179. Pearse J., Williams A.F. The chemical basis of the virulence of Brucella abortus. II. Etyth-ritol. A constituent of bovine foetal fluids with stimulates the growth of Br. abortus in bovine phagocytes. // Brit. J. Exp. Path.,1962, vol. 43, p. 31—37

180. Peeples M., Levine S. Characteristics of a persistent respiratory synsytial virus infection in Helia cells//Virology, 1981, vol. 113, p. 141-149

181. Petricciani J. Cells, science and health. // Dev. Boil. Stand., 1989, 70, p. 3-10

182. Petricciani J. Changing attitudes and actions governing the use of continuous cell lines for the production of biological. // In: Animal cell biotechnology, Acad. Press., London, 1988, vol. 3

183. Puck T.T., Marcus P.I., Cieciura S.J. Clonal growth of mammalian cells in vitro. Growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. // Exp. Mtd., 1956, vol. 103, p. 273-284

184. Remond M., Larenaudie B., Dhennin L et al. Essais d'un vaccin inactive contre la peste porcine classique: Etude de différents paramétrés et adaptaftion a la production industrielle // Bull. Soc. Vet. Prat. Fr., 1984, vol. 68, № 5, p. 325-333

185. Ressang A. and Boer J. The diagnosis of hog cholera in the Netherlands. // Bull. of. int. epiz. 1971, vol. 75, p. 519-531

186. Rivero V.B., Guaiandi G. L , Ferrari M. et al. The lapinized Chinese (LC) strain of hog cholera virus (HCV) protects pigs against experimental infection with virulent HCV // Microbiología, 1990, vol. 13, № 3, p. 185-189

187. Roehe P.M., Edward S. Comparison of pesti virus multiplication in cells of different species. // Research in Veterinary, 1974, vol. 57, p. 210-214

188. Rumenapf Т., Meyers G., Stark R. et al. Molecular characterization of hog holera virus. // Arch. Virol. Supp., 1991, vol. 1, № 3, p. 7-18

189. Sergeev V., Dudnikov L., Gruzdev K. et al. Some aspects of hog cholera virus (HCV) cultivation // 3-й симпозиум по пестивирусам, г. Лесистад, 1996

190. Stewart S.D., Watson H.L., Cassell G.H. Investigation of the clastogenic potential of Urea-plasma urealyticum on human leckocytes // IOM Leff., 1994, vol. 3, p. 662-663

191. Tamoglia TW: Laboratory evaluation of bovine respiratory disease vaccines for safety. J Am Vet Med. Ass., 1968, vol.152, p. 847-850

192. Ten Broeck C. Cultivation of hog cholera virus. // J. Exp. Med., 1941, vol. 74, p. 427-432

193. Terpstra C., Woortmeyer R., Barteling S. J. Development and properties of a cell culture produced vaccine for cholera based on the Chinese strain // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr., 1990, vol. 97, №2, p. 77-79

194. Timakov V.D., Zuev V.A. Alterations of L-cell cultures infected by influenza viruses. // Arch. ges. Virusforsch., 1972, vol. 37, p. 279—281

195. Vasic В., Kesic Z., Vasic N. Umnozavanje virusa svinjske kuge a celijkim kulturama Bu-brega zamoraca i svinja. // Vet. Glasnik, 1972, vol. 26, № 10, p. 739-744.

196. Vogt M. A study of the relationship between karyotype and phenotype in cloned lines of strain HeLa.// Genetics, 1959, vol. 44, p. 1257-1270

197. Wang R., Pollack R., Kusano T. Huma-mouse hybrid cell lines and susceptibility to poliovirus. I. Conversion from polio sensivity to polio resistance accompaniyng loss of human gene — dependent receptors. // J. Virol, 1970, vol. 5, p. 667—681

198. Ward GM, Roberts SJ, McEntee K, Gillespie J.H: A study of experimentally induced bovine viral diarrhea-mucosal disease in pregnant cows and their progeny. Cornell Vet., 1969, vol. 59, p. 525-538

199. Wheelock, E.F. & Toy, S.T. Participation of lymphocytes in viral infections. // Adv. Immunol., 1973, vol. 16, p. 123

200. Wild Т., Bijlenga G. A rabies virus persistent infection in BHK-21 cells // Gen. Virol. -1981, vol. 57, p. 169-177

201. Woodruff, J.J. & Woodruff, J.F. virus- induced alteration of lymphoid tissues. II. Lymphocyte receptore for Newcastle disease virus. // Cell Immunol., 1972. vol. 5, p. 296.

202. Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии ВНИИВВиМ1. АКТг. Покрово комиссионной проверке клона В 5 и трофоварианта клона А11, полученных из сублинии перевиваемой культуры клеток почки поросенка РК-15.

203. Для морфологического изучения исследуемые культуры клеток, выращенные на предметных стеклах, фиксировали в жидкости Буэна и окрашивали гематоксилин-эозином.

204. Ростовые характеристики изучаемых клонов оценивали на протяжении 40 последовательных пассажей. Определяли сроки формирования монослоя, урожай клеток при образовании сплошного клеточного пласта и время его переживания.

205. Культивирование клеток осуществляли в матрасах РУ, пробирках со стеклянными пластинами и микропанелях в условиях стационарного монослоя.

206. Жизнеспособность клеток определяли методом витального окрашивания 0,5%-ным водным раствором трипановой сини.

207. Способность клеток репродуцировать- вирус КЧС (шт. ЛК4 Л 1 ч>> туг Г 1 сгюварианча /\1х, а качестве контроля — исходной линии ^ последующим титрованием в испытуемых культурах. Оценку титрования проводили по п. 2.6.3. Результаты исследований.

208. Изучение стабильности морфологических свойств клеток клона В5 и трофоварианта клона А11 на разных уровнях пассажа.

209. Изучение кариологических свойств клеток клона В5 и трофовариантаiviOnii rij. i .

210. На протяжении 40 пассажей отмечена стабильность кариологических показателей обоих клонов.

211. Изучение чувствительности клона В5 к вирусу КЧС (шт. А1й)й-187, Ши-Мынь).

Информация о работе

Колбасова, Ольга Львовна
кандидата биологических наук
Покров, 2000
ВАК 03.00.06

Диссертация

Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу классической чумы свиней - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы