Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение линий диплоидных клеток из тканей крупного рогатого скота для вирусологических целей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение линий диплоидных клеток из тканей крупного рогатого скота для вирусологических целей"



МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-КОНТРОЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

СИМЕИРЦЕВ НИКОЛАЙ ПЕТРОВИЧ

УДК 619:578.23

ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЛИНИЙ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ИЗ ТКАНЕЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

/ / (/.

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красног Знамени государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

Осидое Д.Ф.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Ночевный В.Т. доктор медицинских наук

Степанова Л.Г. кандидат биологических наук Панкова Г.Е.

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии

им. Я.Р.Коваленко

Защита состоится " /$ " I99T г. ь Jf- ^ --

в / j часов на заседании специализированного совета Д.120.85.01 при Всесоюзном государственном научно-контрольнг институте ветеринарных 1фепаратов Главного управления взте-рийирии при Государственной комиссии Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам по адресу: 123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВПКИ ветпрепаратов.

Автореферат разослан " ft " /ft^Sj-Ji 1991 г. Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат ветеринарных наук К).А.Козырев

^Шхг'е--;'.*

л ОЬЩАЛ ХАРАКТЕРИСТМА РЛ1ЮШ

' -—Моральность теми. Вирусология как наука тесно связана с развитием методов культивирования вирусов. В развитии вирусологии цожно вычленить три исторических этапа: использование для культивирования вирусов организма восприимчивых животных, второй этап - применение более удобно!! и аффективной культу-ральной модели - эмбрионов птиц и третий этап - это применение культур клеток.

Относительная простота получения, возможность использования дешевшс сред обусловили широкое применение культур клеток. Необходимо однако отметить, что технология получения первичных культур клеток многостадийна, трудоемка и требует постоянных источников ткани, значительных затрат труда, времени и материалов. Кроме того, первичные культуры клеток характеризуются неоднородностью клеточной популяции, обуславливающей их различную чувствительность к вирусам.

Весьма перспективны в научном и практическом плане перевиваемые линии клеток. Они высокопродуктивны, хорошо сохраняются в жидком, азоте, пригодны для массового получения вирус-оодеркащих материалов, в том числе и в суспензии и характеризуются относительно однородной клеточной популяцией. Несмотря на целый ряд неоспоримых достоинств, перевиваемые линии клеток - это трансформированные клетки, обладающие онкогенной активностью, часто контамштрованы, изменяются в процессе культивирования, нередко требуют для своего развития сложных по составу питательных сред и высококачественных сывороток крови животных, ¿¡со это накладывает серьезные ограничения на их практиче ско о исполъ з ование.

Существенные недостатки, характерные для первичных к перевиваемых линий клеток, послужили основанием дая создания диплоидных линий клеток, которые сочетают в себе подожитель-иые свойства, присущие указанным выше куЛьтурадышм иодедяи. Генеягаеекая однородность клеточной популяции, стабильность основных биологических свойств на разных уровнях пассажей, отоутегвне контамииаигов и туморогенной активности, возможность длительного поддержан,а я хранения, а также высокая чувствительность к вирусам обусловили выраженные преимущества днплонддых лаосК клеток перед другими типами культур клеток.

К оожадеиив, вопросы целевого получения диплоидных линий клеток хз тхаией животных и особенно их практического применения в вирусологической практике не подучили достаточного экспериментального обоснования и освещения в работах отечественных > зарубежных исследователей. Кроме того, в коллекциях нашей страны н &а рубежом практически отсутствуют охарактеризованные диплоидные линии клеток животного происхождения или имеется .^значительный запас клеток ранних пассажей. Это делает невозможным кх широкое применение в научных целях, дня поддержания музейных штаммов вирусов, а также для изготовления вирусных препаратов.

цель и зшчи исследований

Целью данной работы было получение, сохранение и применение диплоидных линий клеток эмбриона коровы для поддержания производственных и контрольных штаммов вирусов пневмоэн-тврнтов крупного рогатого скота.

Лдш достижения атой цели были поставлены следующие задачи:

ч »

- получение и создание банка даплоидных лиявй клеток из тканей и органов эглбрионов коров;

- отработка оптимального состава криозащатяой среда и режимов замораживания клеток диплоидаых линий в жидком азоте;

- изучение куль'туральннх свойств и кариологичеокой характеристики диплоидных линий клеток эмбриона коровы; .

- оценка полученных клеток в отношении их безопасности: отсутствия контаминантов и туморогенности;

- определение чувствительности полученных линий клеток к вирусам плевмоэнтеритов крупного рогатого скота.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Показана принципиальная возможность целевого получения диплоидных лшшй клеток из различных органов эмбриона коровы.

Впорвио установлена трехстадийлость в становлении диплоидных линий клеток из первичных культур клеток. •

Впервые определена стимулирующая соль ДМЗО в воссталов-лении культур клеток после их замораживания в жидком азоте.

Установлена равнозначная чувствительность диплоидных клеток эмбриона коровы в отношении вирусов пкевмоэнтеритов крупного рогатого скота.

Оптоделетш оптимальные условия выращивания диплоидных лилий клеток.

Впервые установлена принципиальная возможность длительного хранения диплоидаых клеток п монослойной культуре.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Получены и охарактеризованы диплоидные линии клеток из почек и легких эмбриона корош.

Создан банк паспортизированных диплоидных линий клеток эмбриона коровы на различных уровнях пассажей.

Показана принципиальная возможность использования паспортизированных диплоидных линий клеток эмбриона коровы для поддержания производственных штаммов вирусов крупного рогатого скота.

' АПРОБАЦИЯ PAE0DJ

Основные положения диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого совета ЫНКИ ветпрепа-ратов в отчетах за 1987, 1988, 1989 гг. на:

- IX и X научных конференциях молодых ученых ВШКИ вет-препаратов (г. Москва) 1987, 1988 гг.

- Конференции молодых ученых ВИЭВ (г. Москва, 1988 г.)

- Всесоюзной научно-практической конференции (г. Сумы, 1989 г.).

ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, I сдана в печать.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЩрт Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 29 рисунками. Библиографический список включает 216 наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории культур тканей, питательных сред и растворов ВШКИ ветппепаратов в I986-I9R9 гг.

Донош ткани. Донорами ткани служили 3-9-месячные эмбрионы коров. После извлечения из матки эмбриона из пупочного канатика собирали кровь. Сыворотку готовили общепринятым методом и исследовали на наличие антител к вирусам диареи крупного рогатого скота (РН), респираторно-синцитиальному (РИГА), лейкоза (РДП), инфекционного ринограхеита (РИГА) и парагрнппа-З (РТГА).

Для получения диплоидных линий клеток служили ткани легких, почек, селезенок, тимуса, кишечника и тестикул эмбрионов коров. Для предотвращения контаминации получаемых суспензий клеток микроорганизмами измельченную ткань в отдельных случаях заливали средой Игла с антибиотиками и инкубировали 18 часов при температуре 6±2 °С.

Поддержание диплоидных линий клеток бесцентрифужным методом. Клетки диплоидных лшшй после образования монослоя снимали со стекла смесью 0,25$ раствора трипсина и 0,02$ раствора версена, взятых в соотношении 1:3,или раствором химопсина (100 мкг/л) в версене. Кратность рассева культур составляла 1:2.

Вирусы. В работе использовали вирусы пневмоэнтеритов КРС: штамм "Оренбург" вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ), штамм ЗКСМ вируса парагриппа-3 (ПГ-3), штамм Орегон С247 вируса диареи (ЦД) и штамм В-10 аденовируса (АД).

Наркологический анализ. Для приготовления кариологических препаратов был использован модифицированный метод ГНсе-гЛльс! f?

- б -

(i960).

Контроль на конгаммнашто микоплазмами. Данный контроль проводили микробиологическим методом путем высева ыа 0,3$ полужидкий агар, на триптическом переваре бычьего сердца с добавлением 10% дрожжевого экстракта, а также оливомициновым методой путей окраски ДНК микоплазм антибиотиком оливомици-ноа и электронномикроскопическим методом.

Контроль на вирусную контаминацию. Контроль проводили на мышах-сосунках, на взрослых мышах, на морских свинках, на куриных эмбрионах, на гомологичных культурах клеток.

ИзсхЬерментный анализ диплоидных линий клеток. Определение количества и электрофоретической подвижности изоформ лак-татдегидрогеназы проводили методом электрофореза в полиакрил-амидном геле.

Анализ гуморогонности диплошшых линий клеток. Определена туыорогенной активности испытуемых клеток проводили путем инъекции мышам линии СМ, которым для подавления иммунитета вводили антитиыоцитарную сыворотку. .

3. РЕЗУЛЬТАТА ИССЛЕДОВАНИЙ

Долуч^И^? FYUJiniiNWti линий клеток из тканей эмбрионов коров. В качестве исходных источников, ткани для изготовления ттпттпитршт линий клеток (ДДК) служили эмбрионы от коров на 3-9 месяце стельности. Сыворотки крови от эмбрионов исследовали на наличие специфических антител к вирусам лейкоза и пневмоэнтеритов КРС. В результате исследований во всех образцах сывороток крови не. обнаружены антитела к вирусам лейкоза и респираторно-синцитиальному в РДИ, диареи КРС в РН, инфекционного ринотрахеига и аденовируса в РИГА и парагриппа-З в

РТГА.

Было предпринято 8 попыток получения ДНК из тканей легких, почки, кишечника, тимуса и селезенки эмбрионов коров. Всего было получено 21 клеточная культура, срок жизни которых составил от I до 50 пассажей. Анализируя плотность'и сроки формирования монослоя культуры клеток, можно выделить три периода жизни: становления, активного роста и старения. Период становления линий клеток можно разделить на три этапа. На первом этапе становления ДЛК плотность монослоя снижалась. На втором этапе она стабилизировалась на низком уровне. На третьем этапе урожай клеток возрастал, достигая средних значений, характерных для данной клеточной линии в период активного роста. Отличный от предадущих линий клеток тип развития имела линия из эмбриональной ткани кишечника (КБ). Эта линия имела неоднородную клеточную популяцию, состоящую как из фибробласто-подобных, так и эпителиоподобшх клеток. Следует отметить, что до естественной гибели клеток на 14 пассаже не отмечалась тенденция замены одних клеточных элементов другими.

Изучали пригодность и перспективность практического применения суспензий клеток, снятых со стекла через 2, 4 и К суток выращивания культур в матрасах. Установлено, что максимальными ростовыми свойствами обладали клетки 4-суточной культуры.

Морфологическая характеристика развития диплоидных линий клеток. Первичные культуры клеток формировали монослой, состоящий из фибробласто- и эпителиоподобных клеток разного размера. Последние составляли основную массу клеточной популяции. В стадии становления отмечали значительное увеличение популяции фибробластов и постепенное вытеснение эпителиальных клеток.

К концу стадии становления культура клеток становилась однородной и была представлена фибробластоподобными клетками. Б течение 20-ти последующих пассажей морфологическая характеристика культуры не менялась. К 28-35 пассажу отмечали старение культуры, проявляющееся в появлении крупных,зернистых дегенерирующих фибробластов с увеличенным соотношением ширины к длина клетки. В клеточной популяции появлялись крупные клетки с гигантскими ядрами и двуядерные, возрастали сроки формирования монослоя и резко снижался выход клеток с сь£ площади сосуда. Ыевду 35-40 пассажами длй образования полного монослоя требовалось 10-15 суток, а после 40 пассажа клетки становились крупными, менее вытянутыми, сохраняли жизнеспособность, но одаф&> не пролиферировали.

Паспортизапия диплоидных линий клеток из тканей эмбрионов коров.

Кариологический анализ культур. Для выявления численных и структурных нарушений хромосом изучали ДДК на уровнях 16-28 пассажей. Полученные данные показывают, что линии клеток Л5М и Д5М имели диплоидный набор хромосом в 93-97# случаев. Минимальное количество тетра-плоидных (12) и гиперплоидных (2-45?) клеток указывают на то, что полученные ДНК не имели существенных различий в кариотипе по сравнению с кариотипом исходной ткани.

Контроль Д1К на контаминацию. Бактериальную и грибковую контаминацию выявляли путем посева среды инкубирования на бактериальные среды.

Выявление вирусов-контаминантов проводили на мышах, морских свинках, куриных-эмбрионах и двух перевиваемых линиях клеток. Контаминацию микоплазмами выявляли микробиологическим

и электронномикроскоинчоскшл методами, окраской оливомицшоы. » Видовую специфичность полученных линий определяли изофермент-ным анализом.

Проведенное комплексное исследование ДДК на наличие кон-таминирующих агентов показало, что каких-либо контаминантов - вирусов, микоплазц, клеток других видов животных, а также бактерий и грибов выявлено не было.

Контроль тумовогенной активности диплоидных линий клеток. Туморогелпую активность изучаемых клеток исследовали на имму-носупрессированных мышах, которым вводили антитимоцитарную сыворотку. У мышей, которым вводили исследуемые культуры, образования опухолей выявлено не было как макроскопическими, так и гистологическими исследованиями. В контроле отмечали образованно опухолей.

Проведенная работа по паспортизации полученных линий клеток подтвердила, что они являются диплоидными линиями со всеми присущими им свойствами: диплоидным набором хромосом, отсутствием контаминантов и туморогенности, ограниченным периодом жизни.

Изыскание оптимальных условий культивирования диплоидных линий к л е к г о к эмбриона коровы. Определено, что оптимальной посевной концентрацией ДЛК при посеве в матрасы является 40 тяс.кл/мл, а в пробирки 60 тыс.кл/мл в объеме 2 мл. Решающее значение для роста клеток тлеет содержание 5% СО2 в газовой фазе. Показано, что максимальный урожай клеток в матрасах наблюдался на 3-4 сутки их культивирования. Для культивирования ДЛК из тканей эмбриона коровы приемлемы сыворотки крупного рогатого скота, телят, северных оленей, однако

- ТО -

наибольшими стимулирующими рост клеток свойствами обладала сыворотка плодов корой.

Проведенные исследования показали, что сыворотка в питательной среде опродоляет не скорость пролиферации клеток диплоидных линий, а их урожай на стекле, зависящий от свойств сыворотки, ее концентрации и сроков культивирования клеток.

Криоконсервирование клеток диплоидных линий. Проведенные исследования позволяют утверждать, что оптимальным содержанием сыворотки 1фови в среде для криоконсервирования является 10%, эквилиб-рацию следует осуществлять I час при 22±2 °С, а замораживание - суспензии клеток необходимо проводить со скоростью 1-4 °С/мин до -80°С с последующим погружением в жидкий азот. Размораживание суспензии клеток необходимо осуществлять в водяной бане с температурой 37-40°С. Соблюдение этих условий'обеспечивает сохранность клеток в жидком азоте и формирование монослбйных культур на 3-5 сутки инкубирования. Отмечено также, что жизнеспособность клеток после замораживания-оттаивания, определяемая при помощи витального окрашивания метиленовым синим, не всегда адекватно отражает их сохранность, о которой более точно можно судить по скорости формирования; ыонослоя. Срок формирования монослойных культур можно рассматривать как интегрированный показатель сохранности адгезивных свойств и пролиферативной активности клеток, обусловленных отсутствием нарушений в их субклеточных структурах.

Показано, также, что содержание 1фиопротектора ДМСО в концентрациях 0,01-0,0001$ оказывает стимулирующее действие на рост клеток и быстрая смена питательной среды для его удаления не всегда желательна. Показано стимулирующее воздействие

дао (0,01-0,0001$) на рост других типов клаток: первичных, перевиваешь, что связано с повышением проницаемости клеточных мембран к питательным веществам.

Изучение условий хранения диплоидных линий клеток в м о н о -слойной культуре. Изучение влияния температуры культивирования и состава питательной среды на сроки сохранности монослоя клеток. Доказано, что ДИК могут длительно (до 2-х месяцев) храниться в монослое при температуре 37°С без смены среда культивирования, однако ппи этом наблюдается сокращение срока жизни ДИК с ¿0 до 32 пассажей.

Изучение чувствительности клеток диплоидных линий к вирусам. Проводя 5 последовательных пассажей вирусов на ДЛК и проткгровав их пробы, как на первичных, так и на исследуемых даплощщых линиях клеток, можно заключить, что чувствительность ДЛК и первичных культур клеток к вирусам идентична, а для адаптации вируса к новой культуре требуется не более 3-х пассажей.

Таким образом результаты научных изысканий свидетельствуют о том, что полученные линии клеток являются диплоидными.

ВЫВОДЫ

1. Получены диплоидные линии ¡слеток из легких (Д5М) и почек (П5Ы) эмбрионов коров, срок :шзни которых составил 40-42 пассажа. В своем развитии культуры клеток прошли три фазы развития: становление, активный рост и старенио.

2. Выявленная общая закономерность в изменении морфологии культур клеток легких и почки эмбриона коровы з процессе

развития ДЖ характеризуется постепенным замещением эпителио-подобных клеток фибробластоподобными. Показано, что становление ДЖ происходит в три этапа, различающихся выходом клеток с а? площади сосуда.

3. Максимальный ыыход клеток культур Л5М и П5М наблюдался на уровне 8-30 пассажей на 4 сутки культивирования при посевной концентрации 40 тыс.кл/мл, использовании среда ИгЛа с 10% сывороток крови телят, эмбрионов коров, северных оленей

и вхрослого крупного рогатого скота, обладающих высокими ростстимулирующими свойствами. Повышение концентрации сыворотки крови и сроков культивирования ДИК не влечет за собой существенного увеличения урожая клеток.

4. Культуры клеток Д5М и П5М характеризуются равноценной с исходными первичными культурами клеток чувствительностью' к вирусам пневмоэнтеритов крупного рогатого скота. Вирусы инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, диареи, респираторно-синцитиального и аденовируса крупного рогатого скота накапливаются в культурах клеток I5M и П5М в титрах соответственно: 6,67, 6,0; 5,0, 6,0; 7,0, 6,33; 3,98, 3,96 и 6,0, 4,75

Ч ^О/мл*

5. Установлена принципиальная возможность длительного хранения культур клеток Д5М и П51Л в монослое при температуре 37°С без предварительной смены среды на поддерживающую

(до 2-х месяцев). Разработаны оптимальные условия криокон-сервирования ДЖ JL5M и П5М в жидком азоте.

6. Показано, что диметилсульфоксид (ДИСО) в концентрации 0,05-0,001/5 стимулирует клеточную пролиферацию первичных (ТБ, ФЭП), перевиваемой (СПЭВ) и диплоидной (Л5М) культур клеток.

7. Создан банк ДМ эмбриона коровы в количестве 292 ампул. Выживаемость клеток после размораживания составляет для культуры Л5Ы 64,4-86,6$, для культуры П5М 69,8-99,2$. Клетки обладают выраженными адгезивными и ростовыми свойствами и формируют монослой на 2-4 сутки культивирования и сохраняют исходную морфологическую характеристику.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПИЗЦЮ2ЕШС1

На основе полученных результатов били сделаны следующие практические предложения:

- полученные диплоидные линии клеток являются неконтами-нировашшми и биологически безопасными субстратом для поддержания вирусов пневмоэнтеритов крупного рогатого скота и, следовательно, наиболее приемлемым субстратом для поддержания музейшх штаммов вирусов;

- быстрая замена питательной среды после размораживания из жидкого азота суспензии клеток не требуется, если конечная концентрация диметилсульфоксида не превышает 0,01$;

- для стимулирования роста диплоидных, перевиваемых и первичных культур клеток следует применять ДИКО в концентрации 0,01-0,0001$ от объема питательной среды;

- при получении ДЛК из тканей эмбрионов крупного рогатого скота следует учитывать, что период становления линии состоит из трех этапов, отличающихся друг от друга плотностью монослоя клеток.

СШ1С0К РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ 1 ДИССЕРТАЦИИ

1. Строганова И.Л., Сиыбирцев Н.П. Чувствительность диплоидных культур клеток к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота //Тез.докл. Всесоюзной науч.-пряктич.конф. Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной экономической реформы.-Суш, 1989.-Я. 175-Т76.

2. Симбирцев II.II.. Ночевный В.Т., Осидзе П.ф. Некоторые особенности получеши!, паспортизации и применения диплоидных линий клеток эмбриона коровы //Вестник сельскохозяйственной науки.-1991.-."4 5.-С. 76-81.