Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика линий перевиваемых клеток почек овец

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика линий перевиваемых клеток почек овец"

о. ^

0 ^ росснйскля лк иг.мил медицинских наук | В институпюлшпшклтл и вирусных

энцефалитов им. м.п. чумакова

УДК 619: 578.085

на правах рукописи

КО НЮ Ш КО ОЛЬГА ИВАНОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА линии ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕ ГОК ПОЧЕК ОВЕЦ

ОЗЛЮ.ОО - вирусология

\вторсферат диссергаини на соискание у>шчой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор ЛЛ, Миронова

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор А.М. Бутенко доктор медицинских наук, профессор Е.С. Лозовская

Ведущая организация : Научно - исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф, Гамалеи РАМН

Защита состоится: ^час.

На заседании диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу : 142782, Московская область,Ленинский район,и/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

( О.А. Медведкина)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальное п. проблемы Выполнение программы Всемирной Оргашпации Здравоохранения " К 2000 году здоровье для всех", а также разработка концентрированных противовирусных вакцин потребует значительных количеств клеточной массы. В настоящее время для производства большинства таких препаратов используют первичные культуры клеток, получаемые из эмбрионов птиц и тканей почек млекопитающих: обезьян, сирийских хомяков, морских свинок, кроликов я других животных. Эти клеточные системы часто коптамшшровапы посторонними агентами, неоднородны, у них варьируй г чувствительность различных партий культур клеток, полученных от животных одного вида, к одному и тому же вирусу. Кроме этого недостаток животных - доноров ткани и высокая их стоимость не позволяют рассматривать первичные культуры как перспективный и безопасный субстрат для производства биологических препаратов. Перечисленных недостатков лишены линии перевиваемых клеток, контроль которых проводят в процессе их установления с одновременной закладкой банка посевных клеток, способного обеспечить любое круппосерийное производство. Наиболее безопасными признаны линии диплоидпых клеток, что связано с устойчивостью их биологических свойств, происхождением из нормальных тканей и препараты, полученные на их основе,не нуждаются в очистке от клеточной ДНК. Разработана международная регламентированная система получения и контроля, обеспечивающая производство качественных субстратов. За рубежом с использованием линий диплоидных клеток получены вакцины против полиомиелита, корн, краснухи, бешенства, гепатита и различные диагностические препараты.

Наиболее полное удовлетворение запросов производства иммунобиологических препаратов может быть достигнуто за счет применения линий гетероплоидных клеток, полученных из тканей здоровых животных. Эти линии обладают неограниченным сроком жизни вне организма, чувствительностью к широкому спектру вирусов, меньшей требовательностью к условиям культивирования. Использование гетероплоидных клеток дает возможность применять передовые технологии для их выращивания, в частности, на микроносителях в условиях автоматического контроля и управления всеми жизнешюважными параметрами. Единственным недостатком этих клеточных систем является необходимость освобождения приготовленных на них вакцин от клеточной ДНК.

На основании вышеизложенного расширение набора линий диплоидных и гетероплоидных клеток с побробно изученными морфобиологичесхими и генетическими свойствами и отконтролированных на безопасность, способных расти на отечественных средах и сыворотках позволяет решить задачу накопления стандартных субстратов для производства иммунобиологических препаратов.

Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в получении н характеристике линий диплоидных и гетероплоидных клеток почек эмбрионов овец и новорожденных ягнят, разработке и выборе надежных контролен безопасности этих субстратоЕ. Изучение возможности использования новых линий в качестве стандартных систем в научно-экспериментальных исследованиях и в практической деятельности.

Для выполнения поставленной дели решались следующие основные задачи.

1. Установление линий перевиваемых клеток почек эмбрионов овец и новорожденных ягнят и изучение их морфобиологических свойств.

2. Определение чувствительности полученных линий клеток к заражению различными вирусами. Предложение клеточных систем для вирусологический исследований.

3. Выбор линий, перспективных для практической работы, полная характеристика их свойств, проведение контроля безопасности в соответствии с международными и национальными требованиями к вакцинным субстратам.

Научная новизна работы

1. Установлены и впервые охарактеризованы в соответствии- с требованиями ВОЗ и ГИСК им. Л.А.Тарасевича две липии клеток почек новорожденных ягнят (91 и 574) и эмбриона овцы (41). Показало, что они обладают свойствами, характерными для линий диплоидных клеток, не содержат посторонних агентов, не имеют онкогенных потенций. Получена новая линия гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы 4184, которая также охарактеризована в отношении безопасности согласно требованиям ВОЗ и ГИСК к вакцинным: клеточным субстратам и полностью им удовлетворяет.

2. Впервые на крупных выборках установлены количественные цитогенетические параметры первичных культур клеток почек овец, необходимые при оценке линий диплоидных клеток и уровней гипер- и полиплоидии гетероплоидной линии клеток животных этого вида.

3. Впервые предложен и проведен контроль клеток почек овец на наличие агента скрепи.

Практическая ценность Линия 91 защищена авторским свидетельством №1427827 (1988 г.). Она предложена в качестве субстрата для размножения вакцинного штамма вируса кори ЭШЧ. Составлена Инструкция на изготовление соответствующей вакцины, одобренная Ученым Советом ИИВЭ им. М..П. Чумакова РАМН 7 июля 1989 года.

На линию 4184 получен Патент РФ № 1559700 (1993 г.). С использованием клеток линии 4184 изготовлены диагностикумы клещевого и японского энцефалитов. Разработала методика культивирования клеток этой линии на микроносителях в спйннерах "Биотех М" и "ТесЬпе", что позволит при необходимости масштабировать процесс репродукции клеток.

Установление трех новых линий диплоидных клеток почек новорожденных ягнят и эмбриона овцы (41, 91, 574), а также линии гетероплоидных клеток 4184 увеличивает число отечественных стандартных клеточных субстратов, которые растут на доступных средах и сыворотках и могут быть использованы вместо первичных культур как для лабораторных исследований, так и для изготовления иммунобиологических препаратов. Созданы банки рабочих и посевных клеток этих линий, сохраняемые в криоконсервированпом состоянии.

Публикация результатов исследования и апробация работы По теме диссертации опубликовано 14 работ. Получено одно авторское свидетельство и один Патент РФ. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ угвсрждены Методические рекомендации по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи (23.08.96). Материалы доложены на И Всесоюзной конференции по

криобиологии и медицине, Харьков, 1984, на П, III и IV Всесоюзных совещаниях "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1985, 1990,1994.

Апробация работы состоялась на заседании Ученого Совета ИПВЭ им. М.И. Чумакова РАМН 17 июня 1996 года.

Объем и структура работы Диссертация изложена на 138 стр. машинописного текста (без списка литературы), иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей-.. Работа состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований, обсуждения и заключения, а также выводов. Список литературы включает 217 источников, в том числе 96 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Почки эмбрионов овец и новорожденных ягнят получали во время массового забоя животпых в каракулеводческих хозяйствах. Расщепление ткани осуществляли с помощью дробной щадящей трипсинизации (Миронова Л.Л., 1968). Подсчет клеток проводили к камере Фукс-Розенталя, клетки инкубировали в стационарном положении в матрасных колбах при 37 С. Средой роста служила Среда ГЛАХИ (смссь 0,5% раствора гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса и Среды Игла в равных объемах) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС). Использовали антибиотики: пенициллин - 100 ед/мл и стрептомицин - 100 мкг/мл или канамицин - 100 мкг/мл. После формирования плотного монослоя приступали к субкультивированию. Клетки от стекла отделялись смесью 0,25% раствора

трипсина и 0,02% раствора версена в равных объемах. При пассировании клеток попользовали среду ГЛАХИ с 0,3% гидролизата лактальбумина с добавлением" 10% СКРС. Число популяционных удвоений определяли по формуле:

п = 3,32 (IgN - IgNo), где п - число популяционных удвоений, N - число клеток в дочерней популяции, No - число клеток в родительской (Хейфлик, 1973). Период генерации (время удвоения популяции) определяли по кривым роста. Морфологию клеток изучали в нативных культурах и на фиксированных: препаратах, окрашенных эозином и гематоксилином.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии осуществляли по общепринятой методике, включающей фиксацию клеток 2,5-3% раствором глютарового альдегида и 1-2% раствором. 0s04,контрастирование проводили цитратом свинца и раствором уранилацетата. Окрашенные препараты исследовали в электронном микроскопе "ЗЕМ - 100" при ускоряющем напряжении 80 кв и инструментальном увеличении 3000 - 20000 X.

Препараты митотнческих хромосом готовили по методу Moorhead et а!. (1960). В качестве гипотонического раствора служил 0,65% KCL Рутинную окраску хромосомных препаратов проводили азур-эозином.

Для хранения клетки замораживали в жидком азоте по методу, используемому в лаборатории (Миронова Л.Л. и др., 1973). В качестве криопротектора применяли глицерин в 10% концентрации. Концентрация клеток в конечном объеме составляла (2-6)х10^ в мл. При восстановлении с помощью окраски трипановым синим определяли число жизнеспособных клеток по отношению к замороженным, принимая последние за 100%.

Определяли чувствительность клеток к заражению вирусами бешенства, штамм Внуково - 32, кори, штамм ЭШЧ, б штаммам вируса энцефалита и 8 штаммам вируса японского энцефалита, чумы плотоядных, штамм Рокборн, и Коксаки В-типы Bl, В2, ВЗ, В5 и Вб. Учет проводили по ЦПЭ и бляшкообразопанию.

Разделение цзоферментов глгокозо-6-фосфатдепгдрогеназы (Г-6-ФДГ) и лактатдегидрогепазы (ЛДГ) проводили методом электрофореза в вертекалыюм блоке полиакриламщшого геля ( Царева А.А. и др., 1975).

Контроль клеток на присутствие посторонних вирусов, микробиологическую стерильность и туморогепность проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ (WHO, 1974, 1983, 1988).

Цейтраферную микрокиносъемку осуществляли на микроскопе МБИ-13 при фазовокоитрастном объективе 60 х. Использовали кинопленку типа А-2. Интервал между кадрами составлял 30-90 секунд.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение первичных культур и субкультур При трипсинизации 254 пар почек эмбрионов овец и новорожденных ягнят практически изо всех были получены первичные культуры. Они редко подвергались спонтанной дегенерации, 'по свидетельствует, по-видимому, о редкой коцтаминациии почек этих животных эндогенными вирусами, обладающими цитопатогенным действием, результате применения щадящего способа трипсинизации, предусматривающего чередование контакта ткани с раствором фермента и питательной средой, из 5 пар почек последнего завоза было получено более 1000 1,5-литровых матрасных колб ( Таблица 1,)

¡Таблица 1. Выход клеток при трипсинизации почек новорожденных ягнят и эмбрионов овец.

Ко Вес пары Колличеетво Выход клеток Колличеетво 1,5-

культуры почек (г) клеток(млн) на 1 г ткани литровых

(млн) матрасных колб

26* 15 1 824 121 38

41* 17 2 432 143 40

91 29 3 800 131 42

374 18 8 600 477 211

474 23 9 064 394 210

574 26 2 504 96 35

* - почки эмбрионов овец.

Плотный монослон формировался на 5-7 сутки и состоял из различных по морфологии клеток : присутствовали как эпителиоидные, так и фибробластоиодобпые клетки. После формирования монослоя проводили первое субкулътивирование. Далее культуры перевивали по четкому графику два раза в неделю с кратностью рассева 1:2. Использовали среды только отечественного производства и СКРС. К 5-7 пассажу доля фибробластов уменьшалась и в большинстве культур оставались лишь эпителиоидные клетки. Из полученных субкультур и линий клеток ио культуральным свойствам для дальнейшего подробного изучения и аттестации в соответствии с требованиями ВОЗ были выбраны три линии - 41, 91, 574.

Характеристика линий диплоидных клеток почек эмбриона овцы 41 и новорожденных ягнят 91 и 574 В жизненном цикле этих культур можно выделить три фазы: становление, активный рост, старение. Затем наступала гибель. Длительность каждой фазы имела индивидуальный характер для различных культур. (Таблица 2),

Таблица 2. Длительность фаз жизни трех линий диплоидных клеток эмбрионов овец и новорожденных ягнят

Культура Время формирования монослоя (сутки) Фазы Гибель (пассаж)

I II пассажи III

41 5 1-9 10-52 53-67 73

91 7 1-8 9-45 46-53 63

574 7 1-11 12-96 97-103 107

Эти фазы жизненного цикла ранее отмечены дня линий диплоидных клеток человека и животных (На^тШск, МоогЬеас!, 1961, Анджапаридзе О.Г. и др., 1973). Продолжительность каждой из трех фаз была сходной для всех линий, за исключением линии 574, которая имела более длительную фазу активного роста - 84 пассажа и укорочепную третью фазу - 10 пассажей. Все культуры обладали ограниченным сроком жизни вне организма. В течение первых двух фаз культуры легко перевивались с кратностью рассева 1:3, 1:2. В фазе старения она снижалась до 1:1, реже - 1:2. В начале фазы активного роста большая кратность рассева обусловлена, возможно, наличием фибробластоподобпых клеток.

При сокращении интервалов между перевивками до 3 суток однородность клеточной популяции достигалась на уровне 4-5 пассажей и, наоборот, при увеличении интервалов между перевиваниями до 5 суток однородной по составу популяция клеток становилась на уровне 11 пассажа.

При восстановлении криоконсервированных клеток, пробывших в жидком азоте о г 2 месяцев до 11 лет, их жизнеспособность приближалась к 90% и не зависела от уровня пассажа и длительности пребывания при сверхнизкой температуре. Восстановленные клетки сохраняли морфологию, кариотип и чувствительность к вирусам, свойственные исходным культурам. Высокая

жизнеспособность после криоконсервации была характерна также и для первичных культур, которые сохраняли в течение 7-8 лет.

В процессе формироания мояоелоя у диплоидных линий также можно было выделить три периода: лаг-период, период активного роста (логарифмический) и стационарный (Рисунки 1,2,3). На протяжении логарифмического периода митотяческий индекс для всех зрех культур находился на одном уровне и составлял около (0,9 - 1,2)+ 0,3. Наступление стационарного периода происходило на четвертые сутки. При полностью сформированном монослое митотически делящиеся клетки составляли 0,18+0,05%. большинство клеток прекращало деление и переходило в стадию покоя в результате контактного торможения.

Морфологическая характеристика При изучении линий 41,91 и 574 в световом микроскопе в фазе активного роста культуры были представлены монослоем однородных полигональных эпителиоидных клеток с овальными ядрами, содержавшими преимущественно мелкие ядрышки. Цитохимическими методами установлено нормальное содержание и локализация нуклеиновых кислот. В цитоплазме клеток выявлены небольшие скопления гликогена и мелкие глыбки кислой и щелочной фосфатаз. При изучении клеток линий 41,91 и 574 в электронном микроскопе выявлено сравнительно крупное овшшгое ядро с несколькими ядрышками, с округлыми зонами меньшей члектроннооптической плотности. Цитоплазма богата органе ллами: митохондриями с хорошо выраженными кристами; аппарат Гольджя хорошо развит, выражен гранулярный эндоплазматический ретикулум. В основном веществе цитоплазмы много свободно лежащих рибосом, встречаются крупные цени полисом. В клетках наблюдались лизосомы,

и

Рисунки 1-3. Динамика размножения клеток линий 91, 574

множество мультиретикуляриых телец, часто с плотным зернистым содержимым. Фагов, вирусных частиц и микроплазм не обнаружено.

Кариологический анализ Обследовано по 1000 метафазных пластинок на каждом десятом уровне пассажей для линий диплоидных клеток 41,91, 574. Кариотип представлен 27 парами хромосом, из них 3 пары крупные метацентрики, 23 пары - различного размера акроцентрические хромосомы. Половые хромосомы самца'. X -хромосома - крупный акроцентрик, Y - хромосома - крошечный метацентрик,в кариотипе самки имеются две Х- хромосомы. Этот набор соответствует хромосомному набору ovis arics.

Предварительно были определены количественные патогенетические характеристики для трех первичпых культур, из которых в дальнейшем были получены исследуемые лшши диплоидных клеток. Для каждой первичной культуры было просчитано также по 1000 метафазных пластинок. (Таблица 3).

Таблица 3. Данные криологического анализа трех первичных культур и полученных из них линий диплоидных _клеток 41,91,574._

№ культуры Поли-: Гипер- Гиперпло-: Дипло- Раз- Про-

пассаж плоид- пяоид- идные : идные рывы белы

ные пые

41(ХУ)

первичная 16 15 71 898 - -

10 пассаж 9 2 27 960 - -

20 пассаж 4 4 45 947 - -

30 пассаж 5 5 45 945 1 1 ■

40 пассаж 12 2 59 927 2 -

91(ХУ)

первичная 7 8 44 947 - -

10 пассаж 7 - 39 945 • - -

20 пассаж 4 1 45 950 - -

30 пассаж 17 2 39 942 - -

40 пассаж 17 - 53 930 - -

574(ХХ)

первичная 11 16 59 912 - 2

10 пассаж 14 1 27 958 - -

20 пассаж 19 1 43 937 1 -

30 пассаж 24 - 40 936 - -

( 40 пассаж 22 3 55 920 - -

Уровни полиплоидии был» сходными у первичных н пассируемых клеток (не превышали 24/1000) однако, к 40 пассажу число полиплоидов увеличилось в 2 раза. Различия в числе гипер- и гипоплоидпых клеток недостоверны. Клетки с пробелами и разрывами хромосом встречались редко (2/1000- з первичных культурах и 3/1000- в пассируемых клетках). Клетки всех обследованных линий в основном сохраняли диплоидный карио гип.

Изоферментная характеристика клеток линий 41,91 и 574 Исследовали клетки линий 41 - 32 пассаж, 91 - 34 пассаж, 574 - 42 пассаж. В качестве контролен были взяты клетки Hela и эритроциты барана. На электрофоре1раммах у исследованных клеток было 5 полос, соответствующих изоферментам лактатдегидрогеназы, н 2 полосы - изоэнзнмам глгокозо-6-фосфатдегидрогеназы. Электрофорегическая подвижность этих изознзпмов соответствовала таковой для эритроцитов барана. В результате этого исследования показано, что длительное пассирование не привело к контаминации наших линий клетками каких-либо других культур.

Изучение чувствительности линий диплоидных клеток почек эмбрионов овец и новорожденных ягнят к заражению различными вирусами В первых двух пассажах культур титры вируса бешенства, штамм Внуково-32, были меньше 2,0 ig ЛД50/мл. Максимальный титр 6,5Ig ЛД50/мл был зарегистрирован при заражении клеток линии 91 на уровне 5-го пассажа. На уровне 6-го пассажа этих же клеток было проведено три сбора вируссодержащей жидкости (на 4, 7 и 9 сутки). Титры были 6,3; 6,5; 5,1 соответственно. Для культуры 574 титр вируса также достигал 6,51§ЛД50/мл.

При этом индекс иммуногенности был равен 4,5 и не отличался от такового для

вируса, реплнцпрованного в клетках почек сирийских хомяков (ПСХ).

Динамика накопления вируса бешенства изучена при заражении 14

различных культур клеток почек новорожденных ягнят 1-7 пассажей.

Одновременно проводили адаптацию вируса к этим клеточным системам на

протяжении четырех последовательных пассажей. Вирусосодержащие

жидкости собирали на 4, 7, 9 и 10 сутки. Титры варьировали от 4,4 до

7,01&ДЛ50/мл на 4-е и 7-е сутки сбора для 4-го пассажа вируса.

При инфицировании монослоя клеток линии 91 вирусом кори, штамм

ЭШЧ, со множественностью заражения 0,1-0,01 ТЦД50/клетку титр вируса

составил 5,371иТДЦ50/мл.

При заражении вирусом чумы плотоядных, штамм Рокборн, титр был

5,О^БОЕ/мл.

Титр вируса клещевого энцефалита, штамм Софыш, доегшал 8,5 ^БОЕ/мл.

Коксаки В1 - 7,0; В2 - 5,71§ЛД50/мл.

В клетках линии 374 размножался вакцинный штамм Д-17 вируса желтой лихорадки с титром 4,11 ^БОЕ/мл и вирус японского энцефалита, штамм Пекин-1, с титрами 8,0-8,61£ЛД50/мл.

Результаты обследования линий 41, 91 и 574 на наличие обратной транскриптазы Линии 41, 9!, 574 обследованы на 42, 46 и 63 уровнях пассажей

3

соответственно. Показано, что включение в клетки (Н ) ТТФ в ДНК не превышает, а если превышает, то незначительно, уровень включения метки при 0° С , что свидетельствует ■ об отсутствии обратной транскриптазы в обследованных линиях.

Результаты обследования линий 41,91, 574 на безопасность по данным ОБК Клетки на безопасность обследовали на уровнях 10, 20, 30 и 40 пассажей. При введении культуральных жидкостей в первичные культуры клеток почек зеленых мартышек и в культуру линии диплоидных клеток эмбриона человека не обнаружено вирусов-контаминантов.

Реакция гемадсорбции клеток с эритроцитами человека, морской свинки, барана и птиц была отрицательной. Грибы, микоплазмы, бактерии также не обнаружены.

При введении клеток исследуемых линий кроликам, морским свинкам, взрослым и новорожденным белым мышам и курным эмбрионам посторонние агенты не выявлены. Тесты на туморогенность тоже были отрицательными. • Конгроль клеток овец на агент скрепи При аттестации культур клеток эмбрионов овец и новорожденных ягнят, в дополнение к требованиям ВОЗ, необходимо было ввести контроль на отсутствие агента скрепи. Для этого четырем группам хомяков (по 12 животных в каждой группе) весом 100 грамм подкожно вводили 4 млн клеток проверяемых линий в 0,2 мл физиологического раствора. Одной группе животных вводили интактные клетки, другой - клетки, разрушенные трехкратным замораживанием-оттаиванием. В качестве положительного контроля служили хомяки, которым вводили 0,2 мл 20% суспензии клеток мозга хомяка, больного скрепи (штамм СотрНш). Отрицательным контролем была группа интактных хомяков той же партии. За животными наблюдали 1,5 года. Все контрольные животные погибли через 5-6 месяцев. Сначала у них

нарушалась координация движений, шерсть становилась тусклой, взъерошенной, затем развивались парезы задних конечностей, наступал паралич и гибель. В опыте все животные остались здоровы.

Для гистологического исследования брали окрашенные препараты срезов головного н спинного мозга. На препаратах из мозга животных положительного контроля наблюдался епонгиоз больших полушарий и мозжечка, а также гибель клеток Пуркинье. Гистологическая картина, наблюдаемая на препаратах, приготовленных из мозга животных, которым вводили клетки линий 41, 91, 574 не отличалась от таковой препаратов срезов головного мозга интактньгх животных. Поскольку животные из обеих групп опыта в течение 1,5 лет оставались здоровыми и при гистологическом обследовании не обнаружено характерных для скрепи поражений, было сделано заключение, об отсутствии агента скрепи в клетках пиний 41, 91 и 574.

Получение и характеристика линий гетероплоидных клеток почек эмбриона овцы 4184 Линия 4184 установлена из отвивкн линии диплоидных клеток 41, которая подвергалась многократному криоконсервпрованию и восстановлению с краткими периодами пассирования. Вероятно, за это время не успевало произойти восстановление повреждении хромосом, в результате чего линия стала гетероплоядной.

При восстановлении клеток линии 41 на уровне 21 пассажа была получена культура с высокой полиферативной активностью. Для выращивания использовали среду ГАЛАХИ рН 7,0 с добавлением 1% СКРС. Перевивки проводили дважды в неделю с кратностью рассева 1:10. Так продолжалось до 46

пассажа. Затем рост культуры замедлился и кратность рассева уменьшили до

1:4, а содержание сыворотки увеличили до 5%. Всего проведено 128 пассажей

(срок наблюдения). Время удвоения популяции на уровне 41 пассажа - 48 часов,

а на уровне 90 - 96 часов. (Рисунок 4).

Рисунок 4. Динамика размножения клеток линии 4184 на разных уровнях пассажей.

Клетки хорошо растут как при стационарном так и при роллерном культнвирования. В одном 1,5-литровом матрасе количество клеток достигало 90 млн. Клетки линии 4184 растут на различных микроносителях. Были

использованы Цитодекс 3,МНЦ-3 и МНЦ-4. При концентрации микроносителя

з Л

9,2 х 10 частиц/мл и посадочной дозе (4,6-6,4) х 10 клеток/мл плотный

монослой на поверхности частиц образовывался на 3 сутки.

Морфологическая характеристика линии 4184

При изучении культуры 32 и 104 пассажей в световом микроскопе отмечено, что плотный монослой состоят из мелких эпителиоидпых клеток с четко выраженными границами. Ядра клеток округлые и овальные с крупными глыбками хроматина. В ядрах клеток увеличено, по сравнению с клетками исходной линии 41, число ядрышек. 1-3% клеток содержат крупные ядра, встречаются двуядерные клетки. Цитоплазма хорошо окрашивается, содержит глыбкн кислой и щелочной фосфатаз, гликогена. Контактная иншбиция выражена, однако при сформированном монослое митотически делящиеся клетки составляют (0,34+0,04)%, что почти вдвое превышает этот показатель для линии 41. Цитохимическими методами установлена обычная локализация нуклеиновых кислот,- но реакции на РНК и ДНК протекают более интенсивно, чем у клеток линии 41. Ни на одном из исследованных пассажей не обнаружено морфологических признаков контаминации клеток: внутриядерных и цитоплазматических включений, округления клеток, образования симпластов.

При электронномпкроскопическом изучении линии 4184 показано, что большинство клеток монослоя представлено эпитслиоидными клетками округлой формы с крупным ядром, имеющим одно или несколько ядрышек, равномерно распределенный эухроматин и тонкую полоску

пристеночнорасположенного гетсрохроматина. В цитоплазме выявляли митохондрии с хорошо развитыми кристами и средней или повышенной плотности матриксом, умеренно развитый комплекс Гольджи. Хорошо развиты канальцы зернистой эндоплазматической сети, отмечено значительное количество свободных и мембраносвязанных рибосом и полисом. В некоторых

клетках наблюдали скопления микрофиламептоп. Обращало на себя внимание наличие в цитоплазме мультивезикудярных телец, пероксисомоподобных образований, аутофагичесхих вакуолей и липидных включений. Хорошо представлены опушенные ямки и везикулы, а также шшоцитозпые пузырьки. Клетки сохраняли специфические морфологические признаки эпителиальных клеток, такие как полярность, наличие микроворсинок на апикальной поверхности, наличие плотных контактов, дссмосом и терминальной сети. Не отмечено фагов, вирусных частиц и микоплазм.

Кариологический анализ Проанализированно 400 мегафазных пластинок на уровнях 22, 33, 43, 90 пассажей (по 100 на каждом). (Таблица 4).

Таблица 4. Сравнительные результаты кариологического анализа линии гетероплондных клеток 4184 и исходной линии _диплоидных клеток 41 (в %%)__

Дипло- Полипло- Гипер- Гнпо- Раз- Про-

Линия Пассаж идные идные плоид- плоид- рывы белы

ные ные

4184 22 89,0 1 8 2 - -

33 92,0 1 4 3 - -

43 90,0 2 4 4 - -

90 87,0 3 2 5 - -

41 10 96,0 0,9 0,2 2,7 - -

20 94,7 0,4 0,4 4,5 2,0 -

30 94,5 0,5 0,5 4,5 1,0 1,0

I 40 92,7 1,2 0,2 5,9 - -

Количество клеток с диплоидным набором хромосом для линии 4184 достаточно высокое, оно колебалось от 87% до 82%, а для линии 41 колебания составили от 93% до 96%. Уровень полиплоидии для клеток линии 4184 значительно выше, чем для линии диплоидных клеток 41 и составлял 0,4-1,2%. Число гиперплоидных клеток у линии 4184 в 8-40 разпревышает таковое у линии 41. Маркерная хромосома представлена малым метацентрнком и присутствует у 6% клеток.

Контроль линии 4184 па видоснецифичность При электрофорезе в вертикальном блоке иолиакриламидного геля выявлено две полосы изофермеитов Г-6-ФДГ и пять полос изоферментов ЛДГ с электрофоретичсской подвижностью, аналогичой для ферментов эритроцитов барана, взятых в качестве контроля.

Контроль линии 4184 на отсутствие контаминантов При обследовании клеток :шнии4184 на посторонние контаминанты (бактерии, грибы, микоплазмы) посевом в чувствительные питательные среды были получены отрицательные результаты на уровнях 28, 30, 31, 36, 39, 42, 57, 64, 68, 72, 78, 84, 86, 92 пассажей. Окраска клеток флюорохромом Хехст 33258 на уровнях 54 и 86 пассажей не показала наличия микроплазм.

При исследовании культуральных жидкостей и самих клеток на уровнях 37 и 100 пассажей в первичной культуре клеток почек зеленых мартышек, в двух линиях диплоидных клеток эмбриона человека и первичной культуре клеток почек кролика, а также в реакции гемадсорбции с эритроцитами человека, обезьяны, морской свинки и птиц вирусы-контаминанты не выявлены. На тех же уровнях пассажей не выявлены посторонние агенты в опытах на взрослых и новорожденных белых мышах, кроликах, морских евннках, куриных эмбрионах.

Контроль линии 4184 на онкогенность Контроль онкогенности проводили с использованием иммунодепресировашшх мышей линии СВА на 37 и 100 пассажах клеток. По окончании опыта при гистологическом обследовании не отмечали возникновения опухолей. У контрольных мышей, которым вводили клетки

Hela, опухоли образовывались.

При обследовании линии 4184 на уропнях 54 и 98 пассажей на наличие обратной транскриптазы, последняя не обнаружена.

Контроль линии 4184 на присутствие агента скрепи Контроль проводили на 23 и 79 пассажах клеток по методике, приведенной на стр. 16. Клинические наблюдения за животными и результаты гистологических обследований позволяют предположить, что клетки линии 4184 не содержат агента скрепи как и исходная линия диплоидных клеток 41. Чувствительность клеток линии 4184 к заражению вирусами Линия 4184 чувствительна к заражению зирусами бешенства, кори, клешевого и японского энцефалитов, чумы плотоядных, вирусами группы Коксаки В(Таблица 5).

Таблица 5. Чувствительность клеток линии 4! 84 к вирусам

Штаммы Уровень пас- Тшр вируса в lg

вирусов сажа клеток ТПД50/мл ЛД50/мл

Коксаки В1 72 • 7,70

В2 72 7,35

ВЗ 72 6,17

В5 72 6,33

В6 72 6,20

Корь- ЭШЧ 107 5,53

4vMa плото- 4,15

ядных - Рокборн 107

Бешенство -

Внуково-32 60 5,0

С целью получения диагностикумов была изучена репродуктивная активность 8 штаммов вируса японского энцефалита и б штаммов вируса клещевого энцефалита*. Наиболее высокие показатели были получены при использовании штамма Яп-47 (японский энцефалит) п Ярославль-90 (клещевой

энцефалит) При изучении динамики накопления инфекционного вируса и антигена М-47 урожай достигал 8-9^ БОЕ/мл, а тигры гсмагпиотинина варьировали от 1:512 до 1:1024. Следует отметить, что стандартный вакцинный штамм Пекин-1 проявляя в 4-8 раз более низкую антигенную активность. Из высокоактивной антигенной массы вируса ЯЭ, штамм М-47, приготовлен ииактивированный ультразвуком культуралыгай днагностикум ЯЭ для постановки РТГА. 1

При изучении чувствительности культуры 4! 84 к вирусу клешсвсго

7

энцефалита, штамм Яр-90, урожай инфекционного вируса достигал ! ,75x1 0 -9

1,25х 10 БОЕ/мл, а титры ГА составляли ! :16 - 1:64.

Сохранение клеток линии 4184 в жидком азоте Процент жизнеспособных клеток после восстановления составлял 93,0+1,7% (при окрашивании трипановым синим). Жизнеспособность клеток не зависела от уровня пассажа. После восстановления культуры сохраняли свои морфологические и биологические свойства, в том числе и чувствительность к вирусам.

Банк посевных клеток линии 4184 представлен 215 ампулами, содержащими по б млн клеток 45 пассажа. Кроме того имеется запас клеток на разных уровнях пассажей в количестве около 1,2 млрд.

ВЫВОДЫ

1. Первичные культуры получены пз 254 пар почек новорожденных ягнят и эмбрионов овец, 145 из них пропассированы в течение разного времени и дали начало субкультурам и перевиваемым линиям.

2. Впервые установлены количественные цикл епетические парамерты первичных культур клеток овец. Показано, что эта система имеет высокий процент диплоидных клеток. Их число варьирует о г 898 до 947 на 1000, полиплоидов - ог 7 до 16, гипсрплоидоп - от 8 до 16, разрывов не наблюдали.

3. Установлены и изучены 3 перевиваемые линии клеток : 41, 91 и 574, которые аттестованы в качестве диплоидных. В фазе активного роста число диплоидных клеток превышало 90%.

4. В процессе пассирований, чередующихся с криоконсервацией, получена линия гетероплоидных клеток 4184, обладающая высокой пролиферативной активностью. Она поликлональнд, уровень полиплоидии варьирует от 1 до 3%, процент диплоидных клеток колеблется ог 87 до 92. У 6% клеток имеется маркерная хромосома.

5. Предложен метод контроля культур клеток, полученных из тканей овец, на отсутствие агента скрепи. Он включает введение животным исследуемого и заведомо инфекционного материалов, клиническое наблюдение за опытными и контрольными животными с последующим гистологическим заключением.

6. Клетки линий 41, 91, 574 и 4184 не контаминированы грибами, бактериями, мик.-оплазмами, вирусами и другими клетками, не содержат обратной транскрипгазы, не вызывают опухолей у иммунодепрессированных мышей. Агент скрепи не обнаружен. »•

7. В клетках лшшй 41, 91, 574 и 4184 активно репродуцируются вирусы бешенства, клещевого и японского энцефалитов, кори, чумы плотоядных, Коксакн В.

Работы,опубликованные по теме диссертации

1. Бочкова Н.Г., Конюшко О.И., Левина Л.С., Миронова Л.Л., Погодина В.В. - И: чувствительности линий гетероплоидных клеток 4184 к вирусам японского и клен энцефалитов./Цитология, 1994, т.36, Л«6, с. 547.

2. Конюшко О.И. Предварительные цитогенетические параметры клеток первичн культур почек эмбрионов овец / II Всесоюзное совещание " Культивирование клс] животных и человека ".Тез. докл., Пущино, 1995, с. 32.

3. Конюшко О.И. Кариологичесюте характеристики трех линий диплоидных клет( эмбрионов и новорожденных овец / III Всесоюзное совещание "Культивирование животных и человека ". Тез. докл., Пущино, 1990, с. 107-108.

4. Конюшко О.И., Миронова Л.Л. Культивирование перевиваемых клсточных лш средах, изготовленных из отечественных, ингредиентов / Цитология, т. 36, № 6, с. i

5. Кошошко О.И., Миронова Л .Л., Дьяконов Л.П. Метод контроля клеточных суб на присутствие агента скрепи / Бюлл. ВНИИЭВ, Вып. 77 ( Прионные и ретровирус инфекции животных), М. 1996, с.31-33.

6. Кошошко О.И., Гардашьян A.M., Тюфанов A.B., Миронова Л.Л., Дьяконов Л.Г Контроль культур клеток овец на наличие возбудителя скрепи // Ветеринария, 199» с. 27-29.

7. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Бочкова Н.Г., Попова В.Д. Линия 4184 - субсгр биотехнологии / Тезисы международной конференции " Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии ", М., 1996, с. 43

8. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Алпатова Г.А., Т}офанов A.B., Соболев С.Г. Кс безопасности линий диплоидных клеток почек эмбрионов овец и новорожденных; Ветеринария, 1994, № 10, с. 24-26.

9. Кошошко О.И., Миронова Л.Л., Попова В.Д., Кармышсва В.Я., Алпатова Г.А., С.Г. Патент РФ № 1559700, 1993.

10. Малыгина И.Г., Конюшко О.И., Хапчаев Ю.Х., Орлова Т.М., Миронова Л.Л. ( длительного хранения клеток животных в жидком азоте / II Всесоюзная конферсни Криобиология и криомедицина ", Тез. докл.,Харьков, 1984, с.172.

1Миронова Л .Л., Кошошко О.И. Применение ростовых факторов сыворотки да культивирования различных видов клеток I III Всесоюзное совещание " Культивнр клеток животных и человека ", Тез., докл., Пущино, 1990, с. 120-121. 12. Миронова Л .Л., Конюшко О.И., Попова В.Д., Алпатова Г.А., Аксенова Т.А., С И.В. Линии диплоидных клеток почек овец - перспективный субстрат для биотехж

»союзное совещание " Культивирование клеток животных и человека ", Тез. докл., ино, 1990, с. 119-120.

[иронова Л.Л., Игудин Л.И., Конюнгко О.И., Баранова Г.П., Преображенская Н.К., icjd.coh Н.В., Маркман Г. А. Культивирование различных видов клеток на геяышх средах с сыворотками, обработанными полгогапенгликолем / Материалы >юзного симпозиума, посвященного 60 - летаю Тбилисского НИИВС, Тбилисси, 1984, Í-388.

[иронова Л.Л., Лисенков Л.Н., Кошошко О.И., Хапчаев Ю.Х., Игудин Л.И., ельсон Н.В., Паснасва Л.А-. Изучение ростовых свойств сыворотки крутого гого скота в зависимости от ее состава и способа обработки I Сб. трудов НИИВС им. Мечникова " Стандарты, штаммы и методы контроля бактерийных, и вирусных фатов ", М„ 1984, с. 101-105.