Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культуры клеток щитовидной железы и кишечника свиньи и их использование в вирусологии и биотехнологии

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Культуры клеток щитовидной железы и кишечника свиньи и их использование в вирусологии и биотехнологии"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ЭРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРКИ кмепн ЯЛ".КОВАЛЕНКО

ВСЕСОЮЗНОЙ РДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК шш ВЛ. ЛЕШША

На правам рукоппея

ГАЛЬНБЕК ТАТЬЯНА ВАЛЕРЬЕВНА

КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И КИШЕЧНИКА СВИНЬИ И КХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

(08.00.06 — вирусология)

Автор е ф арат диссертации на соискание ученей степени кандидата биологические наук

¿2 ¿'-¿Г-/; г,

Москва — 1091

Раб6та выполнена во Всесоюзном ордена Ленина научно-иселе довательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Г валенко-

Научный руководитель - заслуженный деятель науки РСФСР,

доктор биологических наук, професс Л.П.Дьяконов

Официальные оппоненты-

1. Б.Г.Орлянкин - доктор ветеринарных наук

2. Н.Ы.Пухова - кандидат биологических наук

Ведущее учреждение -

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени государстве* научно-контрольный институт ветеринарных препаратов.

Зшцита диссертации состоится " " ¿р^/рОЛ^ 1992 I в /V часов на заседании Специализированного совета Д 020.2£ по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наух при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки,'ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться .в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан

3/6 (^АК-сс&^Я 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарок наук

Зг.Г.Терешкоз

>

..• ■vi J I.; ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Культуры клеток представляют удобный объект- для решения ряда теоретических проблем, связанных с изучением метаболизма клеток, с исследованием цитофизиологических и цитогенетических характеристик, малигнизации клеток, разработки методов клеточной биотехнологии (Сергеев В.А., 1976; Дьяконов Л.П., 1978, 1983, 1985, 1990; Мамаева С.Е. и др., 1983, 1984; Пина-еа Г.П. и др., 1983; Еахарев В.Н. и др., 1990; Hull H.N. et.al., 1976; Ambeai-Iinp Lobato ot.al., . 1967 И другие).

Развитие современной вирусологии в значительной мере определяется наличием эффективных клеточных систем, позволяющих проводить эксперименты и осуществлять диагностику и биопроизводство с максимальным выходом продукции (вирусные антигены, биологически активные вещества). Поэтому остается актуальной задача выведения новых клеточных культур, чувствительных к вирусам - возбудителям болезней сельскохозяйственных животных.

Применительно к вирусам, выделяемым от свиней, нажно получить новые культуры клеток, использование которых позволило бы наряду с накоплением достаточного количества биомассы вирусов создать условия для максимального сохранения их антигенных и им-муногенных свойств. Это в частности относится к коронавирусу -возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), который по данным ряда авторов (Прйтулин II.И. с соавт., 1977; Непоклонов Е.А. с с<~авт., 1084; V/i11га к.II., 1967). при культивировании на первичных культурах и субкультурах почки плода свиньи, перевиваемой линии клеток СПЭВ, сохраняя антигенные свойства, в значительной мере теряот иммуногенность.

Литературные данные свидетельствуют о чувствительности пер-

вичных культур клеток щитовидной железы поросят к коронавирусу (ТГС), парво- и энтеровирусам свиней (Лабутинс с соавт., 1976;. Dulac G.C. et.al., 1975; Mengallng W.I., 1978).

^ . Для изучения энтеропатогенных вирусов сельскохозяйственных животных лучшие результаты можно ожидать при использовании культур клзток, полученных из ткани наиболее поражаемой При инфекционном процессе, такой, например, как ткань кишечника. Несмотр! на это культуры клеток из ткани кишечника недостаточно широко применяются в вирусологической практике, что связано главным образом с трудностями, которые возникают при получении и кулЬтйви- . ровании клеток кишечника ин витро и обусловлено особенностями строения и физиологии энтероцитов (Жданова Л.Г., Грубер K.M., -1965; Baues B.S., Sutanto 2., ' 1982; Wilson U.U. .Hohrnan A.Vf., 1974). .

Представляет научный и практический интерес получение культур клеток (первичных, диплоидных, перевиваемых) из ткани щитовидной железы и ткани кишечника и изучение их Культурально-мор-фологических свойств и чувствительности к вирусам - возбудителям болезьей свиней.

Цель работы.. Разработать методы получения Первичных культур, субкультур, диплоидных штаммов и постоянных линий клеток, обладающих высокой чувствительностью из ткани щитовидной железы свиньи и кишечника плода гвтъи.

В связи с этим в задачи исследований входило:

- отработать методы получения первичных культур и субкультур клеток из ткаки щитовидной железы и кишечника плода свиньи, а так же взрослого животного и изучить их культурально-морфологические свойства; •

- получить диплоидный'штамм клеток и постоянную клеточную

линий из ткани щитовидной гелезы свиньи, изучить их биологические свойства;

- определить возможность культивирования клеток щитовидной железы и кишечника на питательных средах, приготовленных на основе гидролизатов мышечных белков (ФГМ-С) и сывороточных белков молока (ГСЕМ);

- изучить чувствительность новых культур клеток к возбудителям вирусных заболеваний свиней и других видов сельскохозяйственных животных;

- изучить продукцию клетками щитовидной железы свиньи гор- , монов тироксина и трийодтиронина.

Научная новизна. Разработаны метода получения первичных культур и субкультур клеток из ткани щитовидной железы плода свиньи и взрослого животного с преобладанием клеток зпителиоподоб-ного типа. Получены диплоидный штамм (ШС-ВИЭВ) и постоянная линия клеток щитовидной железы свиньи (ЩС), изучены их культурально- -морфологические свойства, кариотип, ультраструктура. Разработаны методы получения первичных культур и субкультур клеток из ткани кишечника эмбриона .свиньи (КХ) и поросят гнотобиотов. Установлена высокая чувствительность первично-трипсинизироваяных культур клеток и субкультур КХ, ЩЖС, диплоидного штамма (ШС-ВИЭВ) и постоянной линии клеток щитовидной железы свиньи (ЩС) к корснавиру-су - возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита свиней, парвови-русу свиней и вирусу герпеса лошадей I типа. Клетки щитовидной железы свиньи ин витро продуцируют тиреоидныа гормоны - тироксин и трийодтиронин.

Практическая значимость работы. Новые культуры клеток щитовидной железы свиньи (первичные, субкультуры, диплоидный штамм ЩС-ВИЭВ и постоянная клеточная линия), & также первичные культуры

и субкультуры из ткани кишечника эмбриона свиньи и поросят гно-тобиотов рекомендованы и широко используются в научных и диагностических лабораториях страны для проведения вирусологических исследований, диагностики вирусных инфекций животных и получения вирусных антигенов;

Разработаны методические рекомендации по использованию указанных клеточных культур. Рекомендации утверждены отделением ветеринарии ВАСХНИЛ. !

Культура клеток щитовидной железы рекомендуется для использования в биотехнологии.

. Получено авторское свидетельство на изобретение "Диплоидный штамм эпителиопоДобных клеток щитовидной железы свиньи, используемый для культивирования вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней" » 1347446, 1987 г.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:

- Вс.:союз1!ой научной конференции "Культуры клеток в ветеринарии", Москва, 1983 г.;

- Всесоюзной конференции, посвященной "Теоретическим и практическим проблемам гнотобиологии", Москва, 1984 г.;

- Третьем Всесоюзном совещании "Культивирование клеток живот ных и человека", Путцино, 1990 г.;

- Ученом совете ВГОВ 30 ноября 1990 г.;

г- Межлабораторном совещании Р>ИЭВ 30 октября 1991 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в б работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора-литературы,

;обственных исследований,'обсуждения, выводов и практических предложений. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 39 рисунками. Спи-зок литературы включает 250 источников. Приложение на 3-х страницах.

"2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа проводилась в лаборатории экспериментальной технологии культур клеток и питательных сред в 1984-199I гг.

В опытах по получению первичнотрипсинизированных культур {леток использовали органы плодов свиньи, поросят и взрослых жи-зотных (10-12 мес.). Эмбрионы и органы получали на Московском 1ясокомбинатв, в хозяйствах московской области, лаборатории гно-хбиологии ВИЭВ, лаборатории экспериментальных моделей АМН СССР.

Дезагрегацию ткани проводили 0,1-0,4% раствором трипсина [фирм "Дифко", "Ферак"), раствором трипсина с 0,02$ версеном при зазличной концентрации и pH. Продолжительность дезагрегации нахо-;илась в зависимости от возраста животного, концентрации диспэр-"ентов и температурного режима. Культивирование и субкультивиро-1ание культур клеток щитовидной железы и кишечника проводили с ¡спользованием питательных сред .и растворов: 0,5% гидролизата [актальбумина на растворе Хенкса, среды Игла, 199, на основе фер-[ентативного гидролизата мышечных белков (ФГМ-С), на основе гидро-[изата сывороточных белков молока (0,3-0,5% ГСЕМ), 0,02$ раство->а версена, сыворотки крови крупного рогатого скота, телят, пупо-;ины человека. Цитологические исследования, электронную микроско-:ию, криогенизацию проводили согласно методикам, описанным Дьяко-ювым Л.П. с соавт (1980, 1985, 1988). Цитологические препараты 1иксир0вали в одной из фиксирующих смесей: раствире Еуэна, мети-овом спирте,-фиксаторе Карнуа. Скрашивали - гематоксилин-эозином

или азур-эозином по Романовскому-Гимза.

Для электронной микроскопии материал в виде клеточной cycnei зии и в монослое фиксировали 5% глютаровым альдегидом, дофиксиро-вали 1,33% раствором четырехокиси осмия. Обезвоживание проводили в спиртах нарастающих концентраций, а затем ацетоне. После этого материал проводили через смесь эпон-араадит. УльтратоЧкие срезы получали на'ультратоме 1KB (Швеция). Контрастирование ультраюн-

иих срезов проводили уранил-ацетатом и цитратом свинца. Препарат! *

просматривали в'электронном микроскопе ihj-ioob в лаборатории

• биофизики ВИЭВ при напряжении ВСЫи инструментальном'увеличении . 8-50 тыс. • •

Для глубокого замораживания клеток в качестве криопротекто-ра использовали диметилсульфоксйд (ДЖО) и глицерин марки "Динамитный".

Хромосомные препараты получали по методу Moorhead et.ai. (I960) с небольшими модификациями.

Чувствительность клеток к вирусам определяли на базе лабораторий эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней сви- ' ! ней и отдела вирусологии совместно со старшим научным сотрудником Непоклоновым Е»А., научными сотрудниками Федоровой Е.С., Ко-шелевой Л.В., аспирантом Будуловнм Н.Р. Для заражения культур клеток использовали! вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней i вакцинный штамм "ТМ'", штамм "ВГС-ВИЭВ", парвовирус свиней штамм* "И-82", штаммы вируса герпеса лошадей-I (возбудитель ринопневмо-нии лошадей).

Гормонпродуцирующую активность тиреоцитов определяли мето-

• дом радиоиммунного анализа на базе НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ СССР, совместно с профессором-Блюмкиным В.Н.

и научным сотрудником Илинбцкиы В.В. Полученные результату исследований обрабатывали методом математической статистики СЛакин Г.<5., 1980).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Получение культуры клеток из ткани щитовидной железы

Предварительные опыты показали, что ткань щитовидной железы плохо дезагрегируется и поэтому необходимо было выяснить различные условия дезагрегации ткани: температурный- режим, время дезагрегации, концентрацию трипсина и др.

В экспериментах по дезагрегации ткани щитовидной железы плода свиньи (3-3,5-месячного развития) применяли раствор трипсина рН 7,4-7,5 в концентрации 0,25%, смесь 0',25$ раствора трипсина и 0,2% раствора версена в отношении 2:1 и 1:1. Инкубация при 37°С продолжалась 30-40 мин, затем дезагрегацию ткани проводили на магнитной мешалке 20, 30, 40, 60 мин.(таблица I).

Таблица I

Выход клеток при дезагрегации ткани щитовидной железы плода свиньи (п=5)

<Гыс.кл/мл!Трипсин 0,25% ¡Трипсин 0,25% 'Трипсин 0.25% 4 !___¡Версен 0,02% 2:1 'Версен Q.02% Irl

! Всего !Кивых!Жизне+Всего!Кивь1х!Жизне4-Всег j ¡Живых !Жизне-. ! ! !спосо+ ! ! способ I !спосо-Время де-\ ! I ¡бносп! ! ¡бностъ! ! !бность-

иремя де-\ ! i ¡она загрегации\|_[_! %

1 ! %

20 мин 175,4 87,7 50 105,8 84,2 79,6 92,3 69,6 76,¿

30 мин 245,7 111,2 45,3 192,4 149,3 77,6 103,5 75,4 73,1

40 мин 297,3 125,3 42,5 263,1 200,4 76,2 106,6 77,8 71,4

60 мин 345,8 136,9 39,6 315,6 244,4 71,2 115,4 80,9 70,0

Из данных таблицы следует, что применение 0,25% раствора трипсина приводило к более высокому•выходу клеток (175,4-345,8 тыс.

клеток/мл), но жизнеспособность была низкой (39,6-50%). Применение смеси растворов 0,25% трипсина с.,0,02% версена в соотношении 2:1 давало меньший выход количества клеток (105-315 тыс.кл/мл), но жизнеспособность клеток увеличивалась до 77,9-79,6$. При дезагрегации по третьему варианту выход количества клеток был более низким, а жизнеспособность составляла 70-76%.

Наиболее оптимальные результаты получены при продолжительности одного цикла трипсинизации 40-60 минут и воздействии смеси растворов 0,25% трипсина и 0,025 версена в соотношении 2:1. Выход клеток составлял 263-315 тыс.клеток/ыл, а лмзнеспос обнос ть клеток была в пределах 71,2-76,-2%.

Для ткани щитовидной железы взрослой свиньи наиболее эффективное диспергирование получали 0,25-0,35% раствором трипсина при температуре 30-32°С и длительности воздействия 60-90 минут. Выход клеток составлял 452-600 тыс.кл/мл с жизнеспособностью 68,3-70,1%.

Учитывая длительность дезагрегации и невозможность завершения трипсинизации до "истощения" ткани в течение рабочего дня был применен "холодный" метод длительного диспергирования ткани на магнитной мешалке при температуре 4-6°С и экспозиции 16-18 часов. Результаты исследований показали, что T¿KOft метод может быть использован, однако выход жизнеспособных клеток был примерно на 40% ниже, чем в случаях применения "теплого" метода дезагрегации (+30-32°С).

' В опытах по определению эффективности ростовых свойств питательных сред для культивирования первичнотрипсинизированных клеток щитовидной железы свиньи использовали следующие питательные среды: 0,5% гидролизат лактальбумина (ГЛА), 0,3% ФШ-С, 199,.Игла, 0,5% гидролизат сывороточных белков молока (ГСБМ),-а также смесь

ро гд того

сред 0, К И-199 (1:1). К средам добавляли сыворотку крови крупного

скота (нативная без консерванта) в количестве 10-15%. Посевная концентрация составляла 300-350 тыс.кл/мл. Смену среда проводили через 48-72 часа (таблица 2).

Таблица 2

•

Эффективность культивирования первичной культуры клеток щитовидной железы свиньи на различных питательных средах (п=з)

Питательные I

Результат

среды ¡Сроки формирова-1Формирование мо-1Индекс пролифера-_ния монослоя !нослоя %_!ции_• ■

ГЛА ФГМ-С ГСБМ 199 . Игла ГЛА*199

5 сутки

4 сутки

5 сутки 5 сутки 5 сутки 4 сутки

95-100 .100 95-1.00 10095-100 100

0,83+0,11 0,98+0,13 0,66+0,1 0,87+0,14 0,88+0,2 1,08+0,2

Монослой формировался на 4-5 сутки культивирования независимо от применяемых питательных сред. Полученные данные свидетельствуют о том, что ¿се испытанные питательные среды могут быть использованы для выращивания первичных культур клеток щитовидной* железы. •

При выращивании первичной культуры клеток Щ1КС в условиях роллера оптимальные результаты получены при посевной концентрации клеток 500-6С0 тыс./мл. Индекс пролиферации Клеток в роллер-ной культуре составлял 2,0-2,5. При стационарном культивировании 1,08-1,2. Сравнительные исследования по культивированию первично-трипсинизированных клеток щитовидной железы свиньи на сыворотке крови крупного рогатого скота, фетальной сыворотке, сыворотке крови пуповины человека показали, что все испытуемое сыворотки

могут быть использованы для выращивания первичных культур клеток ЩНС, однако наиболее активный рост наблюдали при выращивании клеток с добавлением сыворотки крови'пуповины человека и фетальной сыворотки крупного рогатого скота.

2.2.2. Получёние диплоидного штамма культуры клеток щитовидной железы свиньи (ЩС-ВИЭВ) • с • ...

Одной.из главных задач нашей работы было выведение диплоидного "штамма клеток щитовидной железы свиньи. Для выведения втам-ма использовали первичные культуры с преобладанием клеток эпите-лиоподобного типа. В процессе субкультивирования применен ряд приемов, позволяющих осуществить селекцию клеток желаемогъ типа: применяли метод разряженных посевов, использовали неодинаковую адгезивную способность клеток разного типаул^юдолжительность воздействия на монослой диспергирующих растворов. Положительный результат получен при пересеве клеток с низким коэффициентом (1:1) до 8 пассажа. Начиная с 8 по II пассажи, коэффициент пересева составлял 1:2-1:2,5. При этом монослой формировался на 3-4 сутки культивирования на среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота или телят при посевной концентрации 70-80 тыс.клеток/мл , для флаконов, 100-150 тыс.клеток для пробирок и 260-320 тыс.кло-ток/мл для культивирования в условиях роллера.

С цёльв разработки, применительно к широкой практике, метода

I

культивирования нам предстояло изучить возможность выращивания диплоидной культуры клеток щитовидной железы свиньи на различных питательных средах с использованием гиДролизатных основ.

Для этих целей применяли питательные среды: среду на основе. ГСБМ (0,5% раствор), среду на основе ФГМ-С (производства Покров- . ского биоэавода), среду 199 с добавкой 20% - 0,5% ереды ГЛА или 5%-го гемогидролизата. К средам добавляли 1С—15а сыворотки крови

крупного рогатого.скота или плода коровы. Установлено, что после короткой адаптации (3-4 пассажа) клетки формируют моноглой в те же сроки, что и на синтетической питательной среде 199.

Важным критерием оценки пригодности культуры клеток для вирусологических исследований является способность длительного переживания на бессывороточной питательной среде. В качестве поддерживающих применяли среды: 199, 0,5% ГЛА, Игла с 0,С6% ФГМ-С, 5% гемогидролизат. На средах 0,5% ГЛА и 5% гемогидролизата культура клеток без признаков дегенерации в условиях термостата сохранялась 3 суток, на среде 199 - 5' суток, на среде 1?гла с 0,06% ФГМ-С культура клеток без признаков дегенерации 9 суток.

При изучении адгезивных свойств культуры клеток ЩС на уровнях 17 и 32 пассажей выявлено, что через 1,5 часа прикрепилось 32-45% от посеянных клеток, через 3 часа - 80-87%, а через 6 часов - 86-94,5%.

Изучение динамики роста клеток ЩС в 1сультуре показало, что монослой с максимальной плотностью клеток образуется на 4-5 сутки культивирования,и плотность клеток в монослое составляет

г: р г: р

2,7x10 кл/см для культуры клеток 17 пассажа и 1,5x10 кл/см для 107 пассажа. В течение первых суток культивирования отмечается формирование монослоя на 20-3®, а на 2-3 сутки до 70-9®. Наибольшая пролиферативная активность наблюдалась на 4-5 сутки (5,3-7,2), после чего она снижалась.

Определение к.итогичзского индекса показало, что на уровне 14-2С пассажей наибольшая митотическая активность отмечалась в первые сутки культивирования (21,2-22,6%о), а на более высоких пассатах 135-76) - на 2 сутки (22-25%о), на 4 суши культивирования наблюдалось снижение ыитотическоЯ активности до 4,2-6,4%о на 14 и 20 пассатах и до 5,(.-8,3% на 36 и 76 пассажах (табл.3).

Таблица 3

Динамика изменения митотического индекса в процессе длительного культивирования диплоидного штамма ЩС „

■Время куль-! М.И. %

тивирования! ! Пйссаж , • !. I ( • 2 I 3 I • 4

1 ! ! ! ! 1 !

14 пас 22;6 12,4 12,2 6,4

20 лас ' ,¿1*2 12,2 12,1 4,2

36 пас • 18,2 25,0 8,6 . 5,0

76. пас 20,1 22,4 15,2 8,3 '■

Дальнейшим этапом работы было определение модального класса * хромосом.

В работе использовали культуру клеток на уровне 10, 36, 74, 92 пассажей.

, > Проведенные цитогенетические исследования позволили выявить, что модальный класс хромосом (2п=зв) в клетках культуры Ир-ВИЭВ был диплоидным и составлял на 10 пассаже 9Ей, на 36 пассаже .- 92$, на 74 - 62&.На 92-94 пассажах число диплоидных метафазных пласТи- * нок резко снизилось до 22%.

На приведённой гистограмме показано, что разброс числа хромосом в клетках культуры ЩС на 36 пассаже колебался от 34 до 44,, на 74 пассаже от 36 до 57, на 92 пассаже от 22 до 601 Вероятно в процессе культивирования произошла спонтанная трансформация и культура клеток ЩС стала псевдодиплоидной с большим разбросом числа хромосом, при этом модальный класс- хромосом 2п=38 составлял 22%.

Активный рост- клеток в культуре с коэффициентом пересева

%

клеша ¡с

т--

JО-

60-

40-

го-

I

1

'/о

кпе/пос

60-

4Т-

30-

Л> ¿6 38 хомуесПо, 36 ЗИ •¿г7 ¿73* кмЛесябц

ХроАгаса/гб хрвлосо/у

кле/тсв Л <■/»«»«'

РисЛ.Йнтеррал изменчивости Рис.2. Интервал изменчивости числа

числа хромосом ? культуре кле-- хромосом в культур^ клеток ЦС 74

ток ЩС 36 пассажа

пассажа.

/о метос

2.5-

20-

/5-

/о-

5-

шШт,

ш-

V,

р^шж

г</ гэ^эе 33зг3* ¿-о ¿г

I

Л

1

К/З&'Ч'ОСОГГ

• гис.З. Интервал изменчигости числа хромосом г культуре ,меток ЩС 92 пассаяа.

1:3-1:6 указывает на то, что диплоидный штамм клеток ЩС к 92 пассажу превратился в постоянную клеточную линию без существенных изменений морфологии клеток.

4 2.2.3'. Цитоыорфологическая и электронношкросийпическая •характеристика культур клеток щитовидной железы

Анализ цитологических препаратов показал, что культуры клеток щитовидной железы эмбриона свиньи и щитовидной келезы свиньи в основном эпителиспбдобного типа. Ядра крупные овальной или округлой формы, содержат.1-3 ядрышка. Цитоплазма неоднородна, в большинстве клеток содержатся вакуоли различного размера. Отмечено наличие клеток, имеющих 2 ядра. Наблюдается формирование структур, напоминающих- "фолликулы" ткани щитовидной железы. При субкультивировании степень вакуолизации снижается, увеличивается размер ядрышек. Сохраняется неоднородная плотность■монослоя и "фолликулярносгь". Встречаются отдельные крупные клетки, окруженные более мелкими. Появляются округлые или гантелевндаые структуры, содержащие вещество, окрашенное гематоксшшн-оозином в розовый цвет, ограниченные плотной оболочкой. Форма зпителибподоб-ннх клеток различая: округлые, цилиндрические и полигональные. Размеры клеток также различны.

Они формируют равномерный, сплошной монослой клеток с округлым,. ядрами с напластованием клеток, в которых ядра более уплотнены. Клетки.формирующие "фолликулярные структуры", цилиндрической или округлой формы, они более интенсивно окрашены, равнсмер-ны, однотипны. Ядра содержат 1-2, резе 3 ядрышка. При дальнейшем культивировании на 15-49 пассажах сохраняется структура фодлику-лоподобных образований и все характерные типы клеток. На 94 пассаже отмечается, что по сформированному монослою образуются напластования клеток в виде сеткл. По фону сформированного из крупных

клеток монослоя располагаются мелкие клетки полигональной формы, отделенные друг, от друга светлым пространством.

При электронной микроскопии ультратонких срезов монослоя клеток диплоидной культуры щитовидной железы выявлено в основном два типа зпителиоподобных клеток, имеющих полигональную или цилиндрическую форму. Ядро клетки расположено, как правило, в центральной юзифи, имеет округлую или лопастную форму и-занимает до 50% или более процентов площади цитоплазмы клетки. Цитоплазма в основном "омогенная с множеством .относительно равномерно расположенных или I виде скоплений рибосом. Митохондрии как правило недостаточно юнтрастны.

Межклеточные соединения представлены щелевыми контактами, од-1агсо по краям клеток видны типичные плотные контакты, напоминающе десмосомы. Цитопяазматическая мембрана клеток типичная и на ольпгем протяжении не тлеет значительных выступов или ворсинок, ' дкако на отдельных участках можно наблюдать выступы в виде псев-оподий Или цилиндрических микроворсинок. Характерной особенностью екоторггх клеток лвляется наличие расширенных канальцев эндоплаз-атической сети со светлым неконтрастируемым содержанием. На от-эльных препаратах можно наблюдать по периферии клетки множество , эзикулярных .структур, которые вероятно содержат секрет. Эти.струн-г-ры как бы отпочковываются от периферии клетки в виде отдельных 'эьгрьков или ворсинок, содержал^« подобные пузырьки. Ядерный мамке имеет более электронносветлый фон, по сравнению с цитоплаз->й. По фону ядерного матрикса хорошо, различаются ядршжи - I или реже больше и более темные участки ядра около ядерной мембраны.

2.2.4. Определение чувствительности культуры клеток щитовидной железы свиньи к вирусам

Одним из важных этапов нашей работы было определение чувстви-льности полученных культур клеток щитовидной железы к вирусам.

Культуры клеток: первичные, субкультуры, диплоидная и перевиваемая проверены на чувствительность к коронавирусу - возбудителю TTC, парвовирусу свиней, вирусу герпеса рошадей Ï,

В результате проведенных исследований устеновлэно, что культуры клеток l!p3 и ЩС являются чувствительными системами для куль-

ч ' ,

тивирования вируса трансмиссирного гастроэнтерита свиней: ЦДЦ проявлялось через 48-72 часа. Т^тр вируса при заражении культур клеток щитовидной железы был на 0,5-1,0 lg вше, чем при заражении культур клеток СПЭВ и ГОС. При культивировании культуры клеток ЩС в условиях роллера накопление вируса увеличивалось на 0,8-1,2 lg в сравнении со стационарным культивированием.

Таблица 4

Накопление вируса TTC штамм "ТЩ" в чувствительных культурах (п=3)

"Sri ПЭС { СПЭВ | W ■'{'■* I pQ^p

вистов : 5,7+0,57 5,3+0,53 5,8+0,4' 6,8+0,3 '7,5+0,57 иЩ^/ил

Цитопатогенное действие характеризовалось разрыхлением mohq-слоя, нарушением его целостности. Клетки приобретали округлую ■ форьу или сморщивались. Через 48 часов монослой клеток был значительно нарушен. За счет отторжения клеток от стекла образовались пустоты - "окна". К 72 часу на поверхности стекла оставалось небольшое количество клеток округлой формы, расположенных изолированно друг от. друга с патологически измененными ядрами. Серийное пассирование вируса ТГС в культуре клеток щитовидной железы не сопровождается снижением иммуногенных свойств вируса (Непоклонов Е. А., 1984; Федорова Е.С., 1988).

Подученная нами первичная культура клеток, субкультура, перевиваемая линия BJC являются чувствительными система«! для культивирования парвовируса свиней (ш™.И—82). Гемагглютинирулцая активность пулов вируса, полученных в культуре клеток ЩС, достигала 1:512-1:1024. Титр ГА сохранялся в серии пассажей (5) штамма И-82 в культуре ЩС.

Титр вируса герпеса лошади I после адаптации (4-5 пассажей) на культуре клеток ЩС возрастал на 2-3 log и достигал 4,0-5,0 1СгЩД5о/мл. Цитопатогенчые штаммы в первых двух пассажах разрушали монослой клеток на 70-80%.на 4-5 сутки. В последующем цитопа-тогенное действие проявлялось до 48 часов. <

Полученные данные свидетельствуют о том, что культуры клеток щитовидной железы свиньи (первичная, субкультура, перевиваемая ■линия) обладают достаточно высокой чувствительностью к корона-вирусу TTC, парвовирус.у свиней, герпес вирусу лошадей I.

2.2.5. Определение продукции тире'оидных гормонов клетками щитовидной железы свиньи

В пробах культуральных жидкостей из культур клеток щитовидной железы свиньи (первичной, субкультуры, перевиваемой) методом радиоиммунного анализа было определено содержание*тиреоидных гор-г монов - тироксина (Т-4), трийодтиронина (Т-3). Результаты определения представлены на таблице 5.

Как.свидетельствуют данные табл.5, во всех исследуемых пробах жидкостей, полученных из первичной культуры, субкультуры, перепиваемой линии клеток щитовидной железа,регистрируется продукция гормонов, в высоких концентрациях. '

Культура клеток ЩС-ВИЗВ, ЩС хранится в криобанке В'ЛЭЗ ео Всесоюзной коллекции клеточных культур (ВСКК, СХЙ,'ВАСХНИЛ).

Таблица 5

Содержание тиреоидных'гормонов в культуралькой жидкости клеток щитовидной железы свиньи

Культу*__Первичная____!,

кле!на среде с!на бессыво!-'сывороткой!роточной !

_________Субкультуры_____!

гормоны!____ .[с^В6___'____I____I _____!____ -

I

1

_!__ Перевиваемая__

с !на следе !на бессы-!е сьшсрот+вороточ-!кой !ной среде

2,9-3,5 2,9-3,4 2,8-3,5 ■ 1,5-2,7 3,4-6,3

7~3, 2,15-8,82 0-0,93 0-1,16 0-1,4

ГОТОЛЬI л

Т~4 . 36,2-364,3 309,Т-<400 30,3-100,37,0-62,7 88,9-297,7 102,5-220,7 73,6-<400 63,7-99,6 <400 толь/л

оэ

2.2.6. Получение культур клеток из ткани'кишечника плодов свиньи и поросят-гнотобиотов

Для ткани кишечника плодов свиньи и поросят-гнотобиотов необходим более щадящий способ трипеинизации.' Достаточно высокий выход жизнеспособных клеток был получен при дезагрегации ткани смесью растворов трипсина, версена, Хенкса в равных соотношениях. Применение дезагрегирующих растворов с пониженны* содержанием трипсина и длительности дезагрегации 5-10 мин обеспечивает выход 50-705? жизнеспособных клеток из ткани кишечника плодов свиньи и поросят-гнотобиотов. При использований эмбрионов свиней разных сроков развития (1,5-3,5-месячного) замечено, что целесообразно использовать для дезагрегации и культивирования Клеток ткань кишечника плодов на более поздних сроках эмбрионального развития (2,5-3,5 месяцев).

При использовании среды.ГЛА с Игла в равном соотношении с .. добавлением 1о% сыворотки крови крупного рогатого скота клетки активно растут и на 5-6 день культивирования формируют мбнослой.

Для получения субкультур клеток кишечника плодов свиньи и поросят-гнотобиотов использовали культуры клеток с кскфлюэнтным монослоем. %льтивирование проводили на смеси сред 0,5% гидроли-•зата лактальбумина и среды 199 или Игла (1:1) с 15$ сыворотки крупного рогатого скота и 10% кондиционированной среды. На цитологических препаратах первично-трипсинизйрованные клетки кишечника плодов свиньи и поросят гнотобйотов морфологически не имели заметных отличий. Они представлены клетками эпителисподобного и фибробластоподобного типа. Эпителиоподобные клетки полигональной формы, ядра крупные округлой или овальной формы. Количество ядрышек от I до 3-х. Ядерный матрикс- имеет крупносетчатую структуру,, цитоплазма с мелкой вакуолизацией. Фибробластоподобнне клетки

имеют форму веретена, удлиненное ядро. Средний.митотическиЯ индекс в культуре КЭС на 3-й сутки культивирования был равен 12,5-15%о, на пятые сутки культивирогания - &-8%о.

При выращивании первичной и субкультуры культуры клеток на различных питательных средах - 0,5% ГЛА, 199, Игла, а также различных их комбинация с добавкой инсулина, глютамина при одинаковых условиях культивирования в смеси сред 0,5% ГЛА и 199 в равных отношениях с добавлением глютамина формировался более плотный мо-•нослой. Добавление инсулина на оказывало стимулирующего действия на пролиферацию клеток кишечника.

Сохранение жизнеспособности порвнчно-трнпсиниЕированных клеток и субкультур после глубокого замораживания ранее не было изучено. Результаты проведенных нами исследований позволили определить оптимальный состав криозащитнсй среды для клеток K3Ç и КПГ. В качестве криопротекторов использовали ДЬЕО и глицерин. Установ-

ч

лено, что • для культуры клеток кишечника предпочтительнее использовать глицерин-(марки "Динамитный "•) и крнозацмтную среду в составе: питательная среда 10%, сыворотка крови 80%, криопротек-тор 10%.

Изучена чувствительность культур КЭС, КПГ к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней, Цитопатьгенное действие вирусе. TTC (ш.аым "ТМС") на культуре клеток КЭС, КПГ, ППГ, ПЭС проявлялась с I пассажа, а штамма ВГС-ВИЭВ со второго. Оно характеризовалось увеличением размеров клеток, а затем их округлением. К 72 часам после внесения вируса клетки сморщились и отторгались от стекла.

Полученные нами данные показывают, что культуры клеток и" ткани кишечника эмбрионов свиней й поросят-гнотсбиотов мен ут быть использованы в качестве клеточной модели для выращивания корона-сируса - возбудителя ТГС.

. выводи

1. Разработаны методы, позволяющие получать первичные культуры и субкультуры с преобладанием клеток эпителиоподобного типа из ткани щитовидной железы плодов свиньи и взрослой свиньи.

2. Получена новая диплоидная культура клеток щитовидной железы свиньи эпителиоподобного типа (ЩС-ВИЭВ) и постоянная клеточная линия (ЩС). Изучены их культурально-морфологические свойства. В процессе культивирования клеток ин витро в клеточном пласте формируются структуры, напоминающие естественные фолликулы щитовидной железы. Электронномикроскопически на ультратонких Срезах в культуре ЩС-ВИЭВ установлены'два типа зпителиоподобных клеток -цилиндрические и полигональные.

3. Модальный класс хромосом (2п»зв) в культуре клеток ЩС-ВИЭВ на уровне 74 пассажа составляет 62%, разброс числа хромосом от 36 до 57. Для постоянной клеточной линии ЩС характерен больший разброс хромосом - от 22 до 6С\ Ка уровне 94 пассажа чис- , ло метафазных пластинок с диплоидным набором хромосом (2п*30) составляет 22%,

4. Культуры1 клеток щитовидной железы активно размножаются в синтетической питательной среде 199, а также в питательных средах, на основе 0,5% гидролизата сывороточных белков молока (ГСБН) и ферментативном гидрслизате мышечных белков (ФГМ-С). Индекс пролиферации диплоидного штамма и постоянной клеточной линии достигает 4,5-5,0.

5. Первичная культура, субкультура диплоидный штамм ЩС-ВИЭВ

и постоянная клеточная линия высокочувствительны к вирусам сельское хозяйственных животных и используются в вирусологии. Титр вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней в культурах достигает 6,57,5 ^г'ГЦЦс^/мл, вируса ринопневмонии лошадей 4,0-4,5 З.^'ЩЦэд/мл;,

ЛТ2

титр геыагглютининов парвозируса свиней 1:512-1:1024. . ■ Вирус траксшссизного гастроэнтерита свиней, выращенный-в культуре щитовидной железы свиньи, сохраняет, антигенные и иммуно-'тенные свойства. " . > '

6. Отработан режим криогенизации диплоидного штамма и посто-'янной -линии клеток щитовидной железы свиньи. Культуры депонированы в криобанке ВИЭВ Всесоюзной коллекции клеточных культур (ВСКК,' СХЖ, ВАСХНИЛ).

'< 7. Пзрвичная культура, субкультура, диплоидный штамм и постоянная клеточная линия щитовидной железы свиньи в процессе куль-тивироЕьния продуцируют в питательна среду гормоны щитовидной железы тироксин (63,7 до <400 нмоль/л) и трийодтиронин (1,0 до 8,5 нмоль/л). ' ,

8. Первичные культуры и субкультуры из ткани кишечника плодов свиньи и поросят гнотобиотов перспективны для вирусологических исследований.

практические падлошия \ . ''

1. В результате проведенных исследований разработаны методы получения первичных культур и субкультур из ткани щитовидной железы, кишечника эмбрионов свиньи, которые рекомендованы для использования в вирусологических исследованиях и биопроизводстве вирус-вакцин.

2. "Методические рекомендации по культивированию первичных культур, субкультур и органных культур из ткани кишечника плодов ;

крупного рогатого скота и свиней". М., 1984 , 8ч.

3. "Методические рекомендации по получению и культивированию клеток из щитовидной железы и других органов свиньи". М., 1985,18с.

4. Авторское свидетельство на изобретение "Диплоидный штамм эпителиог.одобных клеток щитовидной железы свиньи, используемый '

для культивирования вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней",

»1347446, 1987. :

5. Культуры клеток щитовидной железы свиньи могут быть использованы в биотехнологии для производства гормонов тироксина и

трийодтиронина.

ПУБЛИКАЦИИ

1. ГЬлолобова М.Т., Лобунцова Д.В., Гальнбек -Т.В., Плешакова Г.Ю. йгат культивирования клеток кишечника эмбрионов животных. Бюллетень ВИЭВ, - М., 1983. - Выпуск 49. - С.18-20.

2. Федорова Е,С., Непоклонов. Е.А., Гальнбек Т.В. Культуральнне свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней. Бюллетень ВЙЭВ, - М., 1985, Вып.60. - С.29-32.

3. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В. Культивирование клеток кишечника поросят гнотобиотов и плодов свиньи. В кн.: Теоретические и практические-проблемы гнотобиологии, - М., 1986. - С.91-93.

4. Еудулов Н*Р., Гальнбек Т.В., Гакташев Ш.С. Чувствительность диплоидной культуры клеток щитовидной железы свиньи к вирусу герпеса лошадой I. Труды ВИЭВ. - М., 1987, - т.64, - С.34-35.

5. Гальнбек Т.В* Культура клеток щитовидной железы свиньи для вирусологических целей и биотехнологии. В кн.: Культиьйрование клеток животных и человека. Тезисы докладов, - Пущино, 1990, ~ С.84.

6. Строкина Г.М., Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.З., Федотов A.B., Простяков А.П. Конструирование питательных сред для культиви-

. рования клеток животных на основе гидролизатов белков сыворотки молока. В кн.: Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток-. Тезисы докладов, - Новосибирск, 1991, - С.12.