СОЗДАНИЕ АТТЕСТОВАННЫХ КОЛЛЕКЦИЙ И БАНКОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

Колоколыдова, Тамара Дмитриевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
СОЗДАНИЕ АТТЕСТОВАННЫХ КОЛЛЕКЦИЙ И БАНКОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ АТТЕСТОВАННЫХ КОЛЛЕКЦИЙ И БАНКОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ"

На правах рукописи

КОЛОКОЛЬЦОВА Тамара Дмитриевна

СОЗДАНИЕ АТТЕСТОВАННЫХ КОЛЛЕКЦИЙ И БАНКОВ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТОВ, ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА - 2О07

Работа выполнена в Государстве ином научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» и ФГУН Государственном научно-исследовательском институте стандартизации н контроля медицинских иммунобиологических препаратов имени Л.А. Тарасевича

Научный консультант:

Доктор медицинских наук

Шалу нова Н.В.

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

Дьяконов Л Л. Никитина З.К. Какнаков В.Т.

Ведущая организация;

Научно-исследовательский институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится « 40 » сентября 2007 г. в 1400 на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу; 117216, г. Москва, ул. Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу; 11721 б, г. Москва, ул. Грина, 7.

Автореферат разослан « июня 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 006.070.01 доктор фармацевтических наук — /у А.И. Громакова

РГАУ-МСХА----

имени К.А. Тимирязева ЧНБ имени И-И, Жслонова Фонд научный литературы

ОБЩАЯ V A Рл 1'~ГГ1>"0ТП1ГЛ %

Актуальность проблемы

Прогресс современной биотехнология в значительной степени обусловлен применением культивируемых m vitro клеток различного происхождения. Развитие метода позволило получать не только перспективные линии клеток животных, широко использовать их в научных исследованиях, но и создавать на их основе новые современные и уникальные технологии производства препаратов. Число линий клеток животных постоянно растет, часто клетки внешне трудноразличимы. Наличие нескольких линий клеток в лаборатории, особенно, занимающейся получением собственных культур, создает предпосылки контаминации клеток не только посторонними микроорганизмами, но и клетками других линий. Использование клеток с отсутствием идентификационных характеристик ставит под сомнение адекватность получаемых результатов. Эти данные подчеркивают чрезвычайную важность и актуальность создания специализированных коллекций и аттестации поступающих и вновь получаемых культур клеток, используемых в научных или прикладных исследованиях.

Современные технологии позволяют производить достаточно большие количества продукта в клетках. Культуры клеток получили распространение в разработке современных биотехнологий производства профилактических или диагностических препаратов. Общепризнанно применение клеток для получения генно-инженерных препаратов. Как оказалось, именно правильное гликозилирование и полноценная «сборка» полипептида эритропозтнна сделали культуру клеток животных наиболее перспективной для производства генно-инженерного ЭПО с высокой специфической активностью in v/vo. И, хотя, полученные разными группами исследователей генно-инженерные штаммы клеток секретируют достаточно высокий уровень рекомбинантного гормона, создание новых более эффективных продуцентов человеческого ЭПО, пригодных для производства препарата, представляется актуальным.

Одним из ведущих направлений современной биотехнологии становится использование клеток доя заместительной и органоспецифической терапии у больных с органной недостаточностью, при повреждении кожных покровов, метаболических нарушениях и нейродегенеративных процессах. Применение клеток в клинике в настоящее время ограничено отсутствием аттестованного клеточного материала, что предопределяет актуальность разработки Методических указаний по аттестации клеток, технологии

выделения уникальных по свойствам клеток, а также получения новых перспективных штаммов клеток, пригодных для научных и медицинских исследований.

Известно, что объективность результатов и качество биопрепаратов, получаемых с использованием культур клеток, в большей степени зависит от происхождения культуры клеток, ее соответствия паспортным характеристикам и безопасности. Основой стабильного производства безопасного препарата должка быть стандартизованная и аттестованная культура клеток. Система создания двухъярусного банка клеток, при котором создаются посевной и рабочий банки клеток, является необходимым условием для обеспечения продолжительного производства продукта. Аттестация банков клеток в соответствии с современными требованиями ВОЗ, принимая во внимание контроль биологической безопасности клеток, и сохранение их функциональных свойств при длительном культивировании, обеспечит стабильность и безопасность производства получаемого продукта.

Таким образом, создание системы контроля клеток, основанной на получении паспортизованных коллекций и аттестованных банков клеток, пригодных для научных исследований, разработки новых технологий, производства препаратов и лечения, является актуальным и позволит обеспечить гарантии качества, стабильности и безопасности клеток.

Цель исследования

создание системы аттестации культур клеток, пригодных для научных исследований и производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики и лечения.

Задачи исследования

• Создать коллекцию культур клеток для проведения вирусологических и биотехнологических исследований, и охарактеризовать их в соответствии с современными требованиями.

• Изучить условия получения новых культур клеток различного происхождения, перспективных для проведения научных исследований или производства препаратов.

• Создать и аттестовать в соответствии с современными требованиями посевные и рабочие банки культур клеток, пригодных для разработки новых технологий и производства препаратов дяя иммунопрофилактики, диагностики и лечения.

• Изучить характеристики генно-инженерных штаммов клеток-продуцентов рекомбинантного эрнтропоэтина человека, создать и

аттестовать банки клеток наиболее перспективного иггамма клеток-продуцентов рчЭПО.

• Получить и аттестовать банки культур диплоидных фибробластов человека, изучить условия культивирования, транспортировки и трансплантации клеток, пригодных для научных исследований и создания препаратов для заместительной терапии.

• Изучить условия получения, культивирования и дифференцировки аттестованных клеток для исследований или медицинского применения, учитывая влияние условий выделения, криоконсервации, культивирования и дифференцпровки стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов.

• Разработать Методические указания по контролю первичных культур клеток, используемых для проведения научных исследований или использования в регенеративной медицине, с учетом современных требований и методов контроля.

Научная новизна полученных результатов

Создана и аттестована одна из крупнейших в России специализированная коллекция культур клеток человека и животных, пригодных для вирусологических и биотехнологических исследований. Культуры клеток аттестованы в соответствии с современными требованиями, паспорта клеток изданы в виде 4 томов каталога.

Впервые в каталогах представлен иллюстративный материал по морфологии клеток, живых и окрашенных после фиксации, метафазные пластины и раскладки дифференциально-окрашенных хромосом с выделением маркерных и хромосом с редкими перестройками, гистограммы распределения числа хромосом. Представлены схемы электрофоретнческой подвижности изоферментов ГбФДГ и ЛДГ, созданные на основании результатов исследования каждой линии клеток позвоночных, а также изоферментов МДГ и ИЦДГ, дополнительно, для культивируемых клеток и клеток исходных видов насекомых.

Впервые отработаны условия выделения и культивирования клеток чешуекрылых насекомых и получены 4 новые линии клеток чешуекрылых насекомых, основных вредителей сельского и лесного хозяйства. Показано, что новые культуры клеток чувствительны к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза И могут быть использованы для проведения фундаментальных исследований и наработки энтомопатогенных препаратов.

Результаты сравнительных исследований, показавших наибольшие преимущества клеток СНО-рЕ в качестве продуцента рчЭПО по сравнению с другими генно-инженерно конструированными культурами клеток СНО-23 и СНО-972, представляют научную значимость и могут быть учтены при созданий новых продуцентов, перспективных для промышленного производства рекомбинантных препаратов. Рекомбинантный эрнтропоэтин, продуцируемый впервые созданными генно-инженерными клетками, по физико-химическим свойствам соответствует природному аналогу, обладает специфической активностью по стимуляции эритропоэза и может быть использован для создания новых лекарственных форм препарата.

Впервые разработаны Методические указания «Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации» с учетом современных методов контроля безопасности клеток. Установлено, что для получения жизнеспособных стволовых и малодифференцированных клеток из разных тканей и органов, высокоперспекшвных для исследований или трансплантации, важным является время доставки органа, выбор методов выделения, условий культивирования и криоконсервацин клеток.

Создание банков, впервые полученных культур малодифференцированных клеток, криоконсервированных и аттестованных в соответствии с новыми Методическими указаниями, позволяет иметь достаточные запасы аттестованного клеточного материала для проведения фундаментальных исследований и заместительной терапии.

Впервые полученные новые штаммы диплоидных фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 обладают стабильными свойствами, безопасны и перспективны для научных исследований и разработки новых технологий получения биопрепаратов.

Впервые предлагаются способы выращивания фибробластов на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях, что позволяет увеличивать количество клеток, транспортировать н поддерживать функциональноактивные клетки на ранах различной этиологии. Способ транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет сохранять жизнеспособность клеток в течение 5 и более дней, что актуально при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях.

Впервые создана технология получения препарата «Клеточные культуры диплоидные для заместительной терапии», высокоэффективного для лечения ожоговых и других рак. Система создания аттестованных посевных и рабочих банков фибробластов человека, впервые примененная к штаммам клеток для терапии ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2, позволяет обеспечивать

стабильными по свойствам и безопасными по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клетками научные исследования и практическое применение при аллотрансплантаци и или заместительной терапии.

Предлагаемый подход к созданию и использованию клеток из аттестованных и сохраняемых банков позволяет решать проблему дефицита донорского материала, актуальную в экстренных и чрезвычайных ситуациях.

Научная новизна и приоритет разработок диссертации защищены 11 патентами и авторскими свидетельствами: Кг 2004126518; № 1808010; № 2004126519; Ха 1808009; №2182830; № 2152206, № 2140288; № 97108266; № 2142820; № 2189223; \УО 2004/035028 А1.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований создана и аттестована одна из крупнейших в России специализированная коллекция, включающая более 120 линий и сублиний диплоидных и гетероплоидных культур клеток человека и животных. Аттестованные в соответствии с современными требованиями культуры клеток могут быть использованы для проведения научных исследований, создания новых биотехнологий производства препаратов для иммунопрофилактики, лечения или диагностики.

Созданные и аттестованные 7 посевных и рабочих банков линий клеток МДСК, 293, 4647 и Л-68 практически пригодны в качестве субстратов для производства вакцинных, диагностических и лечебных препаратов.

Созданные и аттестованные банки генно-инженерно конструированных клеток СНО-рЕ, характеризующихся стабильностью, безвредностью и обладающих достаточно высокой продуктивной активностью рекомбинантного ЭПО человека, стали основой для создания технологий получения новых лекарственных форм препарата.

Посевные и рабочие банки диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 161 и ФЭЧ-16-2, аттестованные в соответствии с современными требованиями ВОЗ, пригодны для научных исследований, создания новых технологий и являются основой получения стабильного препарата для заместительной терапии. Разработана технология получения препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии» для лечения ожоговых и других ран.

Технология культивирования и доставки фибробластов в геле, на подложках или микроносителях позволяет применять клетки в разных условиях с учетом дальности и длительности доставки до больного и лечения ран разной этиологии.

Подобранные в результате проведенных исследований условия выделения малодифференшгроваиных клеток, а также система создания аттестованных банков первичных культур клеток могут служить основой получения безопасных клеток для научных исследований и регенеративной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Создание посевных и рабочих банков клеток, аттестованных в соответствии с современными требованиями ВОЗ, позволяет обеспечивать научные и экспериментально-производственные исследования стабильными и безопасными культурами клеток.

• Стабильность характеристик и безопасность по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток линий МДСК, JI-68 и 4647 из посевных и рабочих банков позволяет использовать их в производстве препаратов для лечения, диагностики и иммунопрофилактики.

• Изменчивость кариотипа при длительном культивировании трансформированной аденовирусом 5 типа линии клеток 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволяют рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата «Канцеролизин».

• Стабильность культур альных, морфологических свойств, характеристик кариотипа и сохранение высокого уровня продукции рчЭПО клетками СНО-рЕ при длительном их пассировании in vitro, а также независимость продуктивности клеток от наличия селективных добавок в питательной среде, по крайней мере, в течение 5-8 пассажей, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее пригодной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.

• Технология производства диплоидных фнбробластов человека из аттестованных и криосохраняемых банков клеток позволяет обеспечивать стандартными и безопасными клетками при лечении больных с глубокими и обширными ожогами, в том числе и при чрезвычайных ситуациях,

• Для получения жизнеспособных клеток из разных тканей и органов человека и животных, содержащих высокоперспективные стволовые и прогениторные клетки, необходим индивидуальный выбор способа выделения малодифференцированных клеток, условий культивирования и криоконсервации клеток.

Внедрение результатов исследования в практику

Культуры клеток из аттестованной коллекции используются как при проведении научно-исследовательских работ в вирусологии, так и в разработках новых технологий производства препаратов для лечения, иммунопрофилактики или диагностики. Коллекция обеспечивает аттестованными культурами клеток не только подразделения ГНЦ ВБ «Вектор», но и научные и медицинские учреждения Сибири и Дальнего Востока. Каталоги культур клеток изданы и доступны для потенциальных пользователей клеток.

Новые линии клеток насекомых, высокочувствительные к видоспецифичным вирусам ядерного полиэдроза, были использованы при разработке новых технологий получения энтомопатогенных бакуло вирусных препаратов, пригодных для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства. Экспериментальные серии вирусов ядерного полиэдроза хлопковой совки Heliothis armígera, полученные на культуре клеток МБ-ХС-685, показали высокую эффективность при лабораторных испытаниях препарата на гусеницах.

Клетки из аттестованных посевных и рабочих банков используются в научных исследованиях и разработках новых вакцин против гриппа (клетки МДСК), против кори (клетки JI-68) и производстве коммерческой вакцины прошв гепатита А (клетки 4647). Культура клеток 293 является субстратом для производства препарата «Канцеролизин», обладающего противоопухолевой активностью, прошедшего к настоящему моменту этап доклинических испытаний и рекомендованного для проведения ограниченных клинических испытаний. Культура клеток СНО-рЕ имеет практическое значение как стабильный продуцент рекомбинантного эритропоэтина человека и используется в исследованиях по разработке новых технологий получения таблетированной формы лекарственного препарата для регуляции эритропоэза. Произведены экспериментальные серии препарата и начаты доклинические исследования.

Впервые разработанные способы получения новых линий клеток, штаммов- продуцентов или штаммов клеток, пригодных для заместительной терапии, а также способы получения новых форм препаратов для иммунопрофилактики и лечения защищены 11 патентами на изобретение.

Культуры диплоидных фибробластов человека, охарактеризованные в соответствии с современными требованиями, используются при определении специфической активности субстанции и готовых препаратов рекомбинантного и нтерферона-альфа-2 человека; кроме того, клетки могут

быть использованы как для проведения научных исследований в вирусологии или биотехнологии, так и создания новых технологий производства препаратов для иммунопрофилактики, диагностики или лечения.

Вновь полученные и заложенные на хранение в виде аттестованных банков клеток культуры диплоидных клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 показали хорошие заживляющие свойства при лечении ран. Основные результаты этих исследований легли в основу разработки новой технологии получения препарата «Культуры клеток диплоидные для заместительной терапии», производимого в виде суспензии клеток, в геле или в монослое на подложках. Разработаны Регламент производства, ФСП и Инструкция по применению.

Результаты, полученные при выполнении настоящих исследований, вошли в научные отчеты по темам, выполняемым по Программе Центра, опубликованы в 60 научных трудах.

Результаты исследования используются с учебной целью на кафедрах биотехнологии и военно-полевой и экстремальной медицины Новосибирской государственной медицинской академии, на кафедре фундаментальной медицины медицинского факультета Новосибирского государственного университета, кафедре трансплантологии Санкт - Петербургского медицинского государственного университета.

Апробация диссертационного материала.

Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на научных конференциях: Всесоюзная научная конференция «Энтомопатогенные вирусы и их роль в защите растений» (Новосибирск, 1988); Всероссийская конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1995 и 2001); 41 и 42 Congresses of ETCS (European Tissue Culture Society) (Verona Italy, 1993; Brno, Czech Republic, 1996); X International Congress of Virology (Jerusalem, Israel, 1996); XIV, XV, XVI, XVil, XVIII Meetings of the ESACT (European Society Animal Cell Technology) (Villamoura Portugal, 1996; Tour, France 1997; Lugano, Switzerland, 1999; Tylosand, Sweden 2001; Granada-Spain 2003); I и II Международные симпозиумы "Новые методы лечения ожоговых ран" (Тула, 1996; Саратов, 1998); Региональная научно-практическая конференция СО РАМН «Фундаментальные аспекты медицины катастроф Сибири» (Новосибирск,

1998); Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва,

1999); Научно-практическая конференция «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии» (Омск, 2000); International Meeting "Bioartificial organs III" (Davos, Switzerland, 2000); Научно-практическая конференция "ЗДРАВЭКСПО-СИБИРЬ-2001 " «Инновации в охране здоровья людей»

(Новосибирск, 2001); X, XI, XII, XIII Международная научная Конференция «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Гурзуф, 2002., 2003, 2004, 2005); International Congress ofVirology: "The World of Microbes" (Paris, 2002); "IX International Symposium on Biomedical Science and Technology" (Antalya, Turkey, 2002); II Международный Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ - 2003» (Москва, 2003); Всероссийская конференция «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2003); III Российский Конгресс по патофизиологии «Дисрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004); III Всероссийский съезд по трансплантологии и искусственным органам, (Москва, 2005); The 5ft International Conference "High medical technologies in XXI Century" (Bentdorm, Spain, 2006).

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ГИСК им. JI.A. Тарасевича (протокол № 5 от 03 апреля 2007 г.), на секции «Биомедицинские технологии» Ученого Совета ВИЛАР РАСХН (протокол № 1 от 17 апреля 2007 г.) и рекомендована к защите.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано более 60 научных работ, в том числе 25 в изданиях, рекомендованных ВАК, И — авторские свидетельства и патенты, 1 - Методические указания.

Проведенные исследования выполнены под руководством и при непосредственном участии автора в институте молекулярной биологии НПО»Вектор», НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор» и ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Работа проводилась при участии сотрудников института Цитологии и генетики СО РАН, НИИ Фармакологии СО РАМН (академик РАМН Гольдберг Е.Д., чл.корр. РАМН Дыгай A.M.), НИИ Биологии гена РАН (чл.корр. РАН Корочкин Л.И., к.б.н. Ревищин A3.), ГНЦ ВБ «Вектор» (д.б.и. Рябчикова Е.И., к.х.н. Беловой Н.В., Юрченко Н.Д., Шумаковой О.В., Колокольцовой O.A.), Новосибирской государственной медицинской академии (чл.корр. РАМН Ефремов A.B., д.м.н. Колосов Н.Г.), НИИ ортопедии СО РАМН (д.м.н., проф. Зайдман А.И.). В связи с этим приношу большую благодарность моим коллегам из указанных подразделений.

Искренне признательна за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту д.м.н. ШалуновоЙ Н.В., а также директору ГИСК им. Л.А. Тарасевича академику РАМН Н.В. Медуницыну. и заместителю директора профессору д.м.н. Бектимирову Т. А.

Выражаю глубокую благодарность моим коллегам за критические замечания и помощь при обсуждении и оформлении диссертационной работы моим коллегам д.м.н. Воробьевой М.С., д.м.н. Игнатьеву И.М., д.б.н. Трошковой Г.П., д.м.н. Никифорову С.Б,

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела материалы и методы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения. Работа изложена на страницах, иллюстрирована 7 таблицами и 47 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 370 источников (135 отечественных и 235 зарубежных).

Связь выполненной работы с планом научных исследований

Работа выполнена в рамках ряда научно-исследовательских работ и научно-технических программ в ГНЦ ВБ «Вектор» (1977-2005 г.), при участии ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Исследования были поддержаны проектами МНТЦ №133 и 840, (рук. Нечаева Е.А.), PDG № 1911 и Jfe 1858 (рук. Колокольцова Т.Д.); программой НИР ГНЦ ВБ «Вектор» 2000-2002 года по темам «Разработка нового противоопухолевого препарата на основе мутантных штаммов аденовируса» (рук. Сергеев А.Н), «Создание таблетированной формы рекомбинантного эрнтропоэтина человека для перорального применения» и «Разработка условий получения образцов «искусственной кожи» при лечении ожоговых и других ран» (рук Колокольцова Т.Д.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток. В работе использовали первичные, диплоидные и гетероплоидные культуры клеток человека и животных, поступавшие в коллекцию из разных источников и получаемые нами в результате проводимых исследований. Культивирование клеток млекопитающих проводили в питательных средах (Игла MEM, RPMI 1640, DMEM, 199 среда и др.) с добавлением 10% FBS или СКРС в монослое или суспензии в соответствии с паспортными характеристиками клеток при температуре 37°С. Для снятия клеток со стекла применяли 0,25%-ный раствор трипсина и 0,02%-ный раствор версена в соотношении 1:1,

Культуры клеток насекомых выращивали при температуре 28°С. Клетки чешуекрылых и колорадского жука культивировали в питательной среде Грейса, обогащенной 10% FBS, клетки комаров - в питательной среде с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбуминз на растворе Хэнкса с добавлением 0,075 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сахарозы, 4 г/л глюкозы и

7-10% СКРС или 10-15% FBS для клеток Aedes albopictus и Aedes pseudoscutellaris.

Уриоконсервапия клеток, Для замораживания клеток использовали питательную среду для культивирования с добавлением 10% сыворотки крови животных и 10% криопротекггора (глицерин, ДМСО). Клетки разливали по ампулам в объеме 1 мл, запаивали и маркировали. Температуру ампул снижали со скоростью 1°С в минуту до температуры минус 25°С, после чего ампулы помещали в криохранилище с жидким азотом для длительного криосохранения клеток. Жизнеспособность определяли путем подсчета неокрашенных клеток после размораживания клеток и окрашивания 0,04%-ным раствором трипанового синего.

Морфологический анализ. Клетки исследовали под инвертированным микроскопом и фотографировали без дополнительной фиксации или окрашивания. Для получения окрашенных препаратов клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали и окрашивали 0,01%-ным раствором акридинового оранжевого либо гематоксилин О эозином. Электронно-микроскопический анализ проводили после фиксации клеток. Срезы готовили на микротоме Reichert-Jung. Окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты клеток исследовали под микроскопом JEM 100S или Hitachi при ускоряющем напряжении 80 или 75 кВ, соответственно.

Контроль контаминации бактериями и микоплазмами проводили методами микробиологического высева на селективную среду, гистохимического анализа (окраска флюорохромами Hoechst 33258, Dapi или оливомицином) согласно методам [Chen T.R., 1977, Михайлова Г.Р., НовохатскиЙ Ф.С., Родова М.А., 1981], элекгронно-микроскопически и методом ПЦР-анализа. Отсутствие посторонних вирусов подтверждали методами электронной микроскопии клеток, культивированием на чувствительных культурах клеток с последующим контролем с помощью реакции гемадсорбции и гемагглютвнации, на куриных эмбрионах и лабораторных животных (мышах-сосунках, взрослых мышах, морских свинках и кроликах) в соответствии с регламентирующими документами [МУК 42-28-10-89,1989].

ридовую идентичность клеток подтверждали методами электрофоретической подвижности изофермектов и кариологического анализа. Анализ электрофоретической подвижности изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ проводили в вертикальном блоке полиакриамидного геля. Гомогенаты культур клеток готовили по O'Brien S.J., Shannon Y.E., Gall M.N., 1980. Кариологический анализ. Препараты хромосом культур клеток готовили общепринятым методом [Moorchead Р, et al. 1960]. В культуральную жидкость на 2-4 сутки после пересева клеток вводили колхицин на 2 часа (для

клеток теплокровных) или на 4-5 часов (для клеток насекомых). Гипотонию проводили в 0,56%-ном растворе КС! в течение 30 минут при температурах 37°С или 28°С, соответственно. Анализ хромосом проводили на фиксированных препаратах клеток в метафазе, используя методы дифференциального окрашивания (С, G и Q) и окраску азур - эозином [Moorchead Р., 1960; Motara МА, Rai KS, 1977]. Для рутинного анализа и определения кривой распределения числа хромосом исследовали не менее 50 метафаз. Число полиплоидных клеток определяли при анализе 1000 метафазных пластин диплоидных культур клеток на разных пассажных уровнях.

Аттестацию банков клеток культур клеток проводили согласно Методическим указаниям, утвержденным ГИСК им, J1.A. Тарасевича [МУК 42-28-10-89,1989] и современным требованям ВОЗ [World Health Organization Technical Report, 1998].

Определение количества р^ЭПр в пробах осуществляли методом непрямого иммуноферментного анализа. Чистоту и молекулярную массу очищенных образцов рчЭПО определяли методом вертикального электрофореза в ГТААГ. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэмли [Остерман Л.А., 1981]. Гель окрашивали красителем Coomassie Brilllant Blue R-250. Для количественной оценки содержания рчЭПО и определения процентного содержания примесных белков проводили сканирование влажного геля при помощи лазерного денситометра.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием критерия Стьюдента и методом двухфакторното дисперсионного анализа [Ашмарип И.П., Воробьев И.А, 1962].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание и аттестация специализированной коллекции культур клеток Основой успешного развития вирусологических и биотехнологических работ с использованием культивируемых клеток является наличие коллекций культур клеток, охарактеризованных на современном методическом уровне в соответствии с общепринятыми требованиями (паспортом) и заложенных на хранение в количестве, позволяющем длительное время обеспечивать стандартными клетками развивающиеся направления исследований. Поэтому при создании Всесоюзного Института Молекулярной биологии (1974г.), главной задачей которого было проведение исследований в области вирусологии и биотехнологии, становится очевидной актуальность создания специализированной коллекции культур клеток человека и животных.

Формирование коллекции культур клеток человека и животных. За время формирования коллекции с 1978 года поступило более 300 культур

клеток млекопитающих из разных институтов страны и компании «Flow». Начиная с 1981 года, проводились работы по формированию коллекции клеток насекомых. Всего в коллекцию поступило 26 линий и сублиний клеток насекомых из разных институтов России, Украины и из Saint Chnstol (Франция). Помимо известных линий клеток, поступивших извне, коллекция пополнялась за счет вновь получаемых нами первичных, диплоидных и гетероплоидных культур клеток человека, животных и насекомых, полученных в рамках данного исследования.

Получение культур диплоидных фибробластов человека. Для выделения фибробластов было исследовано более 50 образцов ткани, полученных от взрослого человека или 8-20 недельных плодов человека, абортированных по медицинским показаниям. Суспензию клеток получали методами механической и ферментативной дезагрегации [Юрченко Н.Д. и др., 1997]. Данные по количеству ампул с фибробластами человека, полученных из разных тканей и заложенных для хранения на ранних пассажах культивирования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Данные по количеству ампул с фибробластами человека, полученных из

Название культуры клеток Количество ампул

Первичная заморозка (№ пассажа) Повторная заморозка (то пассажа)

КОЖНО-МЫ ШЕЧНАЯ ТКАНЬ

ФЭЧ-10 108 (6) 200 (12)

ФЭЧ-14 50 Г5) -

ФЭЧ-16-2 33 (6) 217(12)

ДКЧ 12(5) 100(13)

ДК-5 10(5) 100(13)

ДК-7 17(5) 100(10)

ДК-13 6(4) 100(12)

ДК-14 7(6) 100(11)

ДК-16 37 (7) -

ЛЕГКОЕ ЭМБРИОНА ЧЕЛОВЕКА

ДК-39 34(4) 100(12)

ДК-5 8 90(3) 90(7)

ДК-66 12(2) 300 (4)

ФЭЧ-16-1 30(6) 205(12)

Л-68 60(12) 210(12)

ФИБРОБЛАСТЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА

ФЧК-5 20(11) -

ФЧК-6 20(6) 20(19)

ФЧК-7 10(11) -

ФЧК-15 20(10) 13(15)

Проведенные исследования показали, что клетки, выделенные от ожоговых больных, как правило, были маложизнеспособны, число их практически не увеличивалось. При дальнейшем культивировании клетки быстро старели, что в комплексе делало их непригодными для ауто- или аллотрансплантации и, тем более, для получения больших запасов клеток дня создания на их основе технологий получения препаратов.

В противоположность этому, эмбриональные или фетальные фнбробласты обладали лучшими культуральными характеристиками, имели достаточно высокую пролиферативную активность, равную 2,0-3,5. Через 2 суток клетки формировали равномерный плотный монослой. В результате было получено и заложено на хранение на разных пассажных уровнях 18 штаммов диплоидных культур фибробластов в количестве от 5 до 200 ампул (см. Таблицу 1).

Культуры фибробластов в дальнейшем контролировали на отсутствие контаминантов и характеризовали в соответствии с современными требованиями. Аттестованные культуры клеток вошли в состав коллекции и использовались в научных исследованиях.

Анализ паспортных характеристик штаммов клеток показал стабильность и наибольшую перспективность использования в дальнейших исследованиях и технологиях трех штаммов диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, полученных нами из тканей легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека. Культуры клеток ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 были запатентованы как наиболее перспективные для применения в заместительной терапии [Патент № 2004126518,2004],

Получение первичных и перевиваемых культур плеток насекомых. Для получения первичных культур клеток использовали куколки, эмбрионы или 1-3 дневные личинки хлопковой, озимой и капустной совки, капустной металловидки, непарного шелкопряда и озимой совки. Поскольку поверхность яиц, куколок, гусениц и взрослых насекомых обильно загрязнена посторонними микроорганизмами, то в первую очередь были проведены исследования по подбору условий их стерилизации. При получении новых линий клеток из эмбрионов, личинок или куколок насекомых стерилизацию их поверхности проводили разными методами, включая обработку растворами 40-70% этилового спирта или 1,0-6,0% перекисью водорода, согласно опубликованным данным [Kitanuira S.1977, Hsu S,H., Liu S.Y., Cross J Л. 1972]. Способ обработки насекомых 0,5%-ным водным раствором Йода, примененный нами впервые, оказался одним из оптимальных способов стерилизации яиц и куколок для последующего получения первичных культур клеток чешуекрылых насекомых, свободных от контаминантов [Колокольцова Т.Д., Царева А.А, 1995].

Результаты более чем 200 экспериментов по выделению первичных клеток показали, что наилучшим источником для получения культуры клеток являются ткани яичников куколок и взрослых насекомых. По нашим данным в 48% случаях посева клеток из тканей яичников наблюдались активная миграция и деление клеток, причем около 20 культур клеток удалось культивировать в течение 1-4 пассажей in vitro. Далее клетки, как правило, погибали и лишь некоторые из них после длительного периода покоя, возобновляли свой рост in vitro. Опыт многих исследователей показал, что такой период для клеток насекомых составлял от б до 10 месяцев [Knudson D.L., Lescott Т., Tinsley T.W., 1980; Quiott J.M., 1979].

Мигрировали и делились в культуре, как правило, круглые клетки разного размера, иногда формировали шарообразные структуры. И довольно частое образование везикулярных структур в первичных культурах клеток может служите подтверждением того, что именно стволовые и малодифференцированные клетки формировали структуры, похожие на бласгулы, что совпадает с данными литературы [Bolivar J„ et al., 2006; Yuzo Niki et.al., 2006]

Наибольший интерес представляет культура клеток яичников хлопковой совки ХС-3, которая достаточно активно начала делиться через 1,5 месяца и к концу 2-х лет культивирования прошла более 60 пассажей. На ранних пассажах культура отличалась полиморфизмом, позднее морфология и культуральные свойства клеток стабилизировались (см. Рис. 1), что совпадает с данными других авторов [Sudeep A.B., et.al., 2002]. Аналогичным способом были получены культуры клеток озимой совки AgrothU segetum -ОзС-72 (МБ-ОзС5-688) и ОзС-73 (МБ-ОзС4-788), а позднее культура клеток капустной совки Mamestra brassicae (МБ-КС-23).

Рис. 1. Морфология культуры клеток МБ ХС-685 на 1-м (а) и 45-м (б) пассажах. Ув,х40об.

В результате длительных исследований по поддержанию первичных клеток in vitro, нами Ьпервые в стране были получены 4 новых линии клеток

МБ ХС 685, МБ ОзС-72, МБ ОзС-73 и МБ КС-23, выделенные из яичников куколок хлопковой, озимой и капустной совок. Клетки отличались стабильными культурально-морфологическимн свойствами и способностью к продукции видоспецифичных вирусов ядерного полиэдроза, что легло в основу создания новых технологий получения энтомопатогенных препаратов и разработки биологических средств защиты растений от вредителей и болезней.

Паспортизация и идентификация культур клеток, поступивших в коллекцию. Новые линии клеток, поступающие в коллекцию, культивировали в отдельном боксе не более 10 пассажей. В этот период проводили контроль контаминации и осуществляли первичную заморозку культуры клеток в виде 5-15 ампул. На основании результатов предварительного контроля контаминации и значимости культуры принималось решение о сохранении культуры клеток в коллекции, деконтаминации ее от микоплазм, либо уничтожении. В дальнейшем клетки исследовали и проводили повторную закладку клеток на хранение при температуре жидкого азота в количестве не менее 30 ампул.

Контроль контаминации. Известно, что наибольшую опасность при работе с культурами клеток представляют линии, загрязненные микроорганизмами. Если контаминация бактериями или грибами проявляет себя сразу, то много опаснее представляются клетки, загрязненные мнкоплазмамн. Микоплазмы существенно искажают результаты исследований и особенно опасны при использовании контаминированных клеток в производстве препаратов [Lincoln et al,, 1998; UphofF, C.C,, H.G. Drexler, 2002].

Результаты исследования линий клеток, поступивших из разных институтов страны и из-за рубежа, показали достаточно высокую частоту контаминации клеток посторонними микроорганизмами, и более всего микоплазмамн (см. Рис .2 А).

Рис.2. Микоплазмы в культуре клеток СПЭВ, До и после декоитаминации (А и Б). Окраска оливомицином. Ув.х90об,

До 80% культур клеток, поступивших в коллекцию до 1985 года, были контаминированы микоплазмами. Чаще всего эти культуры клеток поступали из неспециализированных лабораторий, где этому не придавали особого значения или не проводили контроля контаминации. Снижение числа контаминирован ных культур клеток, поступивших позднее, обусловлено, прежде всего, появлением простых и удобных в применении методов контроля культур клеток с помощью ДНК-интеркалирующих флюорохромов.

Сравнение разных методов очистки культур клеток показали малую эффективность применения только антибиотиков, более того, подтвердило их токсичность. Обработка клеток методом термошока или прогрева клеток при температуре 41°С в течение 6-8 часов в сочетании с невысокими дозами антибиотиков позволила деконтами пировать ряд значимых линий клеток от ми ко плазм или значительно снизить их содержание (Рис 2Б).

Отсутствие вирусной и других видов контаминации подтверждено электронно-микроскопически. Практически все культуры клеток млекопитающих, а также линии и сублинии клеток чешуекрылых были свободны от контаминации вирусами. В клетках комаров (Mos 20А, Аа, А. albopictus и А. pseudoscutellaris) обнаружена контаминация вирусом денсонуклеоза, что совпадает с ранее описанным [Сутугина Л.П. с соавт., 1983]. Показано, что полученные нами новые культур диплоидных фибробластов и клетки новых линий насекомых свободны от контаминантов.

Идентификация линий клеток. Одним из важных параметров безопасной работы с культурами клеток, получения адекватных и стабильных результатов, сопоставимых с данными других авторов, является подтверждение соответствия виду или линии используемых клеток. Идентификацию клеток проводили методами анализа кариотипа клеток и изоферментного состава. Анализ кариотипа ряда клеток млекопитающих показал наличие маркерных хромосом, характерных клеткам HeLa, что позволило выделить эти линии клеток, как дериваты HeLa. Остальные культуры клеток имели характеристики, сходные с ранее описанными [Графодатский A.C., Раджабли С.И, 1988]. Полученные данные по кариотипу исследуемых линий клеток в виде микрофото хромосом метафазиой пластинки, раскладки дифференциально окрашенных хромосом и гистограммы распределения числа хромосом представлены в паспортных характеристиках линий клеток и опубликованы в Каталогах коллекции. Данные иэоферментного анализа Г6ФДГ и ЛДГ клеток человека и животных соответствовали виду.

В связи с отсутствием характеристик кариотипа и изоферментного состава исследуемых видов насекомых для идентификации поступивших линий клеток проводили анализ кариотипа и изоферментного состава

культивируемых клеток и клеток исходных насекомых. Как показано на рис. 3, клетки колорадского жука, полученные из гемолимфы, имели 36 убывающих по величине двуплечих хромосом и одну пару акроцентриков среднего размера. В клетках линий жука КЖ-1 и КЖ-2 обнаружено более 100 мелких голоцентрических хромосом, характерных для чешуекрылых. Клетки комаров имели от б до 24 метацентрических хромосом (см. Рис. 4), что соответствует ранее описанным данным [Kurtti T.J., Munderloh U.G., 1984].

Ь *

* *

.St

* * % fr »

г Л ^ "

Рис. 3. Кариотип клеток колорадского жука Ьерипо1агБа с1есетПпеа1а (А), культуры клеток КЖ-1(Б) и линии клеток БСЕдЫЗЗ (В).

Анализ морфолопш клеток КЖ-1, КЖ-2, дубового шелкопряда МСАр-1 и ряда других линий клеток показали удивительное сходство. Морфология клеток комаров различалась, что подтверждает различие линий клеток. Электрофоретическая подвижность изоферментов ГбФДГ, ЛДГ, СОД, ИЦДГ и МДГ клеток и исходных насекомых показали соответствие клеткам непарного шелкопряда.

1 . ' • t г

А Б В Г

Рис. 4. Метафазные пластинки разных линий клеток комаров:

А) А. aegypti; Б) MOS 20А; В)А. pseudoscutellaris; Г) А. albopictus.

Результаты исследования морфологии, кариотипа и изоферментного состава клеток насекомых показали сходство характеристик 11 линий и

сублиний клеток насекомых, имевших разное видовое происхождение по названию, с клетками непарного шелкопряда линии SCLd-135. Характеристики 10 линий и сублиний клеток, включая 4 новых линий клеток, подтвердили видовое соответствие.

Таким образом, результаты, полученные при исследовании клеток насекомых, показали, что контаминация клетками других линий продолжает оставаться распространенным явлением как при попытке получения новых линий клеток, так и при длительном пассировании уже имеющихся. Вышеизложенное свидетельствует об обязательном контроле карнотипа и изоферментного состава культивируемых клеток и подчеркивает необходимость использования клеток, охарактеризованных в соответствии с современными требованиями паспорта, из аттестованных коллекций культур клеток.

В результате проведенных исследований сформирована и охарактеризована в соответствии с современными требованиями одна из крупнейших коллекция культур клеток животных, специализированная для проведения вирусологических и биотехнологических работ. Коллекция включает более 120 линий и сублиний клеток животных, в том числе более 40 линий и сублиний клеток человека, около 20 культур клеток обезьян и 30 линий клеток насекомых. Культуры клеток заложены на хранение при температуре жидкого азота в количестве не менее 30 ампул. Паспорта культур клеток оформлены и изданы для широкого использования в виде 4 томов Каталога культур клеток.

Создание и аттестация банков культур клеток, пригодных для научных исследований, производства вакцин и других препаратов

Создание и аттестация посевных и рабочих банков клеток. Прогресс в области вирусологии и биотехнологии в значительной степени обусловлен пригодностью культивируемых in vitro клеток для исследования или наработки вирусов или биопрепаратов. Создание посевного и рабочего банков перспективных культур клеток, их аттестация в соответствии с современными требованиями позволит обеспечить производство достаточным запасом стабильных и безопасных по своим свойствам клеток.

В результате исследований создано 3 посевных и 4 рабочих банка линий клеток МДСК, 293, 4647 и Л-68, наиболее перспективных для производства вакцинных, диагностических и лечебных препаратов. Данные по количеству ампул и жизнеспособности клеток в посевных и рабочих банках культур клеток представлены в таблице 2. Как видно из таблицы посевные и рабочие банки клеток представляли запас не менее 200 ампул с

клетками, содержащими от 4 до 9 млн. клеток. Жизнеспособность клеток после восстановления составляла от 80 до 97%.

Таблица 2

Данные по посевным и рабочим банкам культур клеток

Название культуры слеток (номер пассажа) Номер банка клеток Количестве ампул Количеств о клеток в ампуле Доля живых клеток после разморозки (%)

4647 (108 п) ПЕК .N22112 257 5,5x10е 79-85

4647(112 п) РБК №2113 231 4x106 83-90

МДСК (39 п) ПБК №2094 209 8x10е 93-97

МДСК (41 п) РБК №2095 242 9x10s 94-96

293(15 п.) ПБК №2110 240 6x10* 80-85

293 (17 п.) РБК№2П1 241 5х106 83-85

Л-68 (22 п) РБК №1907 227 4x106 90

Аттестация показала отсутствие контаминантов, стабильность и соответствие морфологических и культуральных характеристик клеток из посевных и рабочих банков. Изучение кариотипа клеток линии МДСК на 47 и 86 пассажах показало соответствие кариотипу собаки вида Can is famtliaris, 2п=78, модальный класс составлял 85 хромосом (98% клеток). Клетки характеризовались присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, по некоторым аутосомам отмечена трисомия (пары 29, 30 и 38). Отмечена стабильность кариотипа клеток на разных пассажах (47 и 87 п).

Анализ G-окрашеняых метафазных хромосом культуры клеток J1-63 на 16 и 33 пассажах подтвердил соответствие нормальному кариотипу человека 2п=4б, XX. По отсутствию хромосомных нарушений и низкому числу поли -и гиперплоидных клеток (не более 2%) кариотип JI-68 стабилен и соответствует требованиям Комитета экспертов ВОЗ, предъявляемым к диплоидным клеткам [World Health Organization Technical Report Series, 1998).

Кариотип культуры клеток 293 на уровне 18 и 38 пассажей характеризовался изменчивостью распределения числа хромосом в клетках

на разных пассажных уровнях, кроме того, выявлены вариации в числе аутосом и маркерных хромосом, что свидетельствует о неустойчивости кариотипа клеток (Рис. 5), По структуре дифференциально-окрашенных хромосом клетки линии 293 соответствуют клеткам человеческого происхождения.

Л1

' III

i' s

I i

t»

8 9 10 11

éA * « fi£ £

11 H ts 1B IT 1» « » Í *

20 г«

) t Г

S '

m2 mi m4 ro® mn

Wtfr) Wrt Hrf

жт

){(iff' \\i JI

ж n/m ' r №

VJt ft 1» Ul \t

1Э i« ia ia it it

Ш( «til щ II

90 si aa x

^ Г rcfI

n-ro mil mta

Рис. 5. G-о крашенные хромосомы клеток линии 293 с разным числом хромосом: А) 2п=27; Б) 2п=72.

Кариотип клеток культуры 4647 представлял производную от нормального кариотипа зеленой мартышки, 2п=60 и характеризовался гетерогенностью по числу хромосом (Рис.6). Распределение числа хромосом в клетках на 108 пассаже варьировало от 17 до 120, модальное число 60 хромосом. На 128 пассаже число хромосом наблюдалось от 52 до 136 на клетку. Модальный класс выражен нечетко. Доля полиплоидных клеток на 10S пассаже составляла 20%, к 128 пассажу число пшерплоидных клеток возрастало до 79%.

Однако, в отличие от кулыуры 293, в клетках почки зеленой мартышки 4647 наблюдалась стабильность реконструкции кариотипа. Клетки характеризовались присутствием нормальных (не перестроенных) аутосом, отмечена трисомия пары С2. Одна из X хромосом перестроена. Маркерные хромосомы образованы в результате разнообразных транслокаций участков хромосом. Маркерных хромосом 6: МЗ - включает материал хромосомы С5; Ml, М2, М4, М5 и Мб трудно идентифицировать. Состав нормальных и маркерных хромосом клеток на 128 пассаже не отличался от такового клеток на 108 пассаже, что свидетельствует о стабильности кариотипа.

Известно, что клетки при культивировании in vitro могут генетически трансформироваться, инфицироваться онковирусами, индуцировать активность

эндогенных онковирусов и, таким образом, приобретать туморогешше свойства. Такие изменения клеток значительным образом нарушают безопасность получаемого продукта, в том числе и вакцины. В связи с этим, обязательным этапом изучения безопасности аттестуемых культур клеток является контроль онкогенности клеток [Серия технических докладов ВОЗ, 1987].

" I 1 " "V Г п

ег 64 ео в4 ее юг юв 112 121 1эв чн«||й промоем * тип«

Рис. б. Распределение числа хромосом в клетках 4647 на 108 (А) и 128 пассажах (Б).

Отсутствие эндогенных онковирусов в клепках линий 4647, МДСК, 293 и Л-68, культивированных до максимально рекомендуемых пассажных уровней использования для производства, подтверждено по низкому уровню активности обратной транскришазы, близкому к значению отрицательного контроля. Исследования туморогенности клеток методом гетерогрансплантации в экспериментах на иммуносупрессивных мышах показали отсутствие туморогеных потенций клеток из аттестуемых посевных и рабочих банков. Все животные через 20 дней наблюдения после введения клеток оставались живыми, опухолевидных образований в органах не выявлено.

Отсутствие посторонних вирусов также было подтверждено в контроле на чувствительных культурах клеток и лабораторных животных, используя мышей-сосунков не старше 24 ч (20 голов), мышей массой 15-20 г (10 голов), морских свинок массой 300-350 г (5гсяов) и кроликов массой 2,5-3, кг (5 голов). Отсуствяе изменений в органах и тканях экспериментальных животных подтвердило данные предыдущего анализа и позволяет утверждать, что

аттестуемые линии клеток 4647, МДСК, 293 и Л-68 безопасны в пределах исследуемых уровней пассажа (в среднем 20).

Таким образом, создано 3 посевных н 4 рабочих банка клеток, наиболее перспективных для производства профилактических, диагностических и лечебных препаратов. Аттестация банков клеток показала безопасность клеток по отсутствию бактериальной, микоплазменной и вирусной контаминации, отсутствию онкогенных потенций, по крайней мере, в течение 20 последовательных пассажей культивирования in vitro. Стабильность культур альных, морфологических и продуктивных свойств подтвердили постоянство характеристик исследуемых клеток. Стабильность кариотипа доказана только для линий клеток МДСК, 4647 я JI-6S.

Пригодность линий клеток для производства препаратов. Вакцина против гриппа в настоящее время в России производится на куриных эмбрионах. Отсутствие безлейкозных куриных хозяйств делает такое производство небезопасным и подчеркивает актуальность разработки новых технологий с использованием культивируемых клеток. Показано, что аттестованная нами культура клеток МДСК высокочувствительна к холодоадалти рованн ым реассортантным штаммам вирусов гриппа A/47/Shandon/93/l (HIN1), A/47/Johannesburg/94/2 (H3N2) или B/60/Petersbuig/95/20 (Нечаева Е.А. и др., 2001; Nechaeva Е.А. et.al, 2002]. В свете изложенного высокая чувствительность клеток МДСК к вирусам гриппа и созданные нами достаточные запасы аттестованных клеток делает культуру высокоперспективной для проведения научных исследований, диагностики и промышленного получения гриппозной вакцины.

Аналогичная ситуация складывается с производством вакцины против кори, где в качестве субстрата используются первичные фибробласты эмбрионов японских перепелов. Использование первичных клеток, отличающихся генетической неоднородностью популяции, может приводить к нестандартности получаемого препарата. Показано, что вирус кори JI-16 в достаточно высоких титрах размножается в клетках Л-68 [Царева А.А., 1991; Нечаева Е,А. и др, 2001]. Замена первичных клеток перепелов на аттестованные нами клетки человека Л-68 имеет значительное преимущество (Nechaeva E.A.etal, 2002).

Создание аттестованных банков культуры клеток 293 позволило приготовить производственный штамм Adel2 аденовируса, перспективный в качестве вирусного противоопухолевого препарата [Сергеев А.Н. и др., 2003, Вдовиченко Г.В. и др. 2005]. На основе мутантного варианта аденовируса, культивированного в клетках 293, был разработан препарат «Канцеролдаин», пригодный для терапии онкозаболеваний [Vdovichenko G.V et aL, 2005], к приготовлены экспериментальные серии препарата, пригодные для проведения доклинических и клинических испытаний [Вдовиченко Г.В., и др.2005].

Аттестованные в ходе выполнения настоящей работы банки культуры клеток 4647 в настоящее время используются ЗАО «Вектор-БиАльгам» для производстве вакцины против гепатита А (ФСП 42-0168047806, 2006). Согласно данным литературы, культура клеток 4647 высокочувствительна к различным вирусам (Аксенова ТА. и др., 1985; Миронова ЛЛ. и др., 1990; Грачев В.П и др. 1990, Миронова Л.П., Хапчаев Ю.Х., 1995, Медуницын Н.В. и др. 2002), что определяет высокую перспективность применения клеток аттестованной нами культуры для диагностики или производства МИБП.

Ученый Совет ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитет МИБП, на основании представленных данных по исследованию клеток и данных собственного контроля выдал заключения о соответствии современным требованиям культур клеток 4647, МДСК, Л-68 из посевных и рабочих банков клеток и разрешил использовать их для разработки новых технологий и производства МИБП. В связи с актуальностью разработки и высокой эффективностью препарата «Канцер олизнн» в терапии раковых заболеваний, но не достаточной стабильностью кариотнпа, разрешено использовать клетки линии 293 для производства противоракового препарата. Применение клеток линии 293 в производстве профилактических препаратов может быть разрешено, возможно, после проведения дополнительных исследований.

Исследование клеток-продуцентов рекомбннантиого эритропоэтина

человека

Высокая потребность и коммерческая значимость рекомбннантного ЭПО подчеркивают актуальность и целесообразность проведения исследований по получению новых штаммов-продуцентов, изучению стабильности их продуктивных свойств и безопасности, а также разработке новых лекарственных форм препарата.

Три штамма клеток СНО-рЕ, СНО-972 и СНО-23, продуцирующие рчЭПО, были созданы в институте Молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" с использованием двух разных векторов интегративного типа, а позднее переданы нам для исследования и разработки новых технологий получения препаратов рчЭПО.

Сравнительные исследования рекомбинантных культур клеток показали частичное сходство свойств штаммов клеток СНО-972 и СНО-23, отражающее общность генетических конструкций и линий клеток-реципиентов, используемых для создания данных штаммов; а также полное различие в размерах, типах роста и морфологии клеток этих штаммов с клетками СНО-рЕ.

Анализ показал достаточно высокие культуральные и продуктивные свойства клеток СНО-рЕ и СНО-972, что стало основанием для патентования новых штаммов клеток СНО-рЕ и СНО-972, как перспективных для получения

рекомбинантного препарата рчЭПО [Патент РФ 97108266, 1997; Патент Ки 2070931, 1996]. Однако пересчет продукции ЭПО на определенное число клеток (удельная продуктивность на 1 млн. клеток) показал несомненные преимущества культуры клеток СНО-рЕ, как продуцента рчЭПО (Рис.7).

Рис. 7. Удельная продуктивность рекомбиыантных культур клеток (мкг/106кл/72 часа).

При выборе технологически перспективного штамма клеток важным является стабильность встроенной генно-инженерной конструкции в зависимости от условий культивирования и наличия или отсутствия селективного давления. Контроль продуктивности клеток в питательной среде с селективными добавками (MTX для клеток СНО-23 и СНО-972 или ГАТ для клеток СНО-рЕ) или без них показал стабильность сохранения высоких продуктивных свойств клеток СНО-рЕ в течение 37 пассажей в селективной среде и не менее 8 пассажей без селективного давления (Рис. 8). II, таким образом, подтвердил стабильность амплифицировапното состояния гена, в отличие от клеток СНО-972 и СНО-23, более зависящих от состава среды.

Число пассажей

Рис. 8. Уровень продукции рчЭПО клетками линии СНО-рЕ, выращиваемой на среде с ГАТ или без селективного давления, Ед/мл по ИФА.

Стабильность культуральных, морфологических свойств, характеристик кар нота па и сохранение достаточно высокого уровня продукции рчЭПО клетками СНО-рЕ при длительном их пассировании in vitro, а также независимость продуктавностн клеток от наличия селективных добавок в среде, по крайней мере, в течение 5-8 пассажей, делают культуру клеток СНО-рЕ наиболее перспективной для наработки препарата, регулирующего эритропоэз.

Анализ субстанции рч?ЦО. Согласно данным элекгрофореграммы хромато графически очищенных концентратов эритропоэтина, молекулярная масса образцов рчЭПО находилась в пределах значений 35-37 кД (см. Рис. 9), что соответствует молекулярной массе природного эритропоэтина (36 кД). Денситограмма геля показала, что содержание мономера рчЭПО в редуцирующих и нередуцнрующих условиях составляет не менее 95% для всех очищенных образцов._

кД 12 3 4

95,0 67,0 45$ 29,0 21,0 12,0 64 ВИшд

Рис. 9. Электрофореграмма очищенных образцов рчЭПО, полученного на разных культурах клеток: 1-стандарты молекулярных масс (kD), 2- СНО-рЕ; 3- СНО-972,4 - СНО-23. Окраска Commassie Brilliant Blue R-250.

Специфическую' активность образцов рчЭПСС полученных на разных культурах клеток, исследовали ^пог' гемоЦ^улиру^щим свойствам или влиянию препарата на рост числа эритроидгшх'колоюш в экспериментах in vitro. Результаты показали, что препараты, полученные на культурах клеток СНО-рЕ и СНО-972, обладали шлониестнмулнрующеЗ активностью. Рост числа эритрондных колоний, вырастающих 'ч-из' 0,1 млн мышиных миелокарноцитов, был прямопропорцпоналея увеличению концентрации препарата в диапазоне от 0,5 до 3 Ед/мл.

Сравнительный анализ специфической активности рчЭПО, полученного в культурах клеток СНО-рЕ, и коммерческого препарата

«Recormon» {"Boehringer Mannheim"), проведенный на культуре непрнлипающих миелокарноцнтов, показал близость кривых доза - эффект в диапазоне концентраций от 0,5 до 10 Ед/мл. Как видно из таблицы 3, при использовании равных концентраций гормона ко лониестиму лиру тощий эффект рчЭПО, продуцируемого клетками линии СНО-рЕ, в некоторых случаях даже превышал таковой зарубежного аналога.

Таким образом, контроль физико-химических свойств субстанции рчЭПО, получаемой на всех трех культурах клеток, показал соответствие природному аналогу эритропоэтина человека по молекулярной массе, иммунореактивности и специфической активности по стимуляции эритропоэза в экспериментах in vivo и in vitro.

Учитывая полученные данные и перспективность клеток СНО-рЕ как продуцента для производства рчЭПО, были созданы и аттестованы 2 рабочих банка клеток СНО-рЕ в количестве более 300 ампул. Контроль клеток показал отсутствие контаминантов, туморогеиных потенций, стабильность Культурально-морфологических и продуктивных свойств.

Таблица 3

Зависимость роста числа эритроидных колоний, выросших из 10J непрнлипающих миелокариоцитов, от разных концентраций рчЭПО (Х+ ш )

Концентрация ЭПО (ED/мл) Субстанция рчЭПО (ГНЦ В Б «Вектор») Recormon (Швеция) для в/в, п/к введения

0 12,50*1,95 12,50+1,95

0,5 18,75+1,25 20,00+1,48

1,0 22,3+1,01 25,10+0,76

1,5 22,50+1,78 27,50+2,75

4,0 22,15+2,15 25,82+2,55

8,0 28,45+2,15 25,35+0,85

60,0 8,92+2,10* 21,58+2,30*

90,0 17,50+2,95 14^8+1,32

Примечание: * - различия между параметрами существенны с вероятностью Р>0,95.

Получение аттестованных в соответствии с современными требованиями 2-х рабочих банков культуры клеток СНО-рЕ, создало основу для разработки новой технологии производства лекарственного препарата. Стабильность

свойств клеток из банков, неизменность кариотипа и их безопасность по отсутствию коптам и нанто в, включая эндогенные онковирусы, позволит получать безопасный препарат для лечения нарушений кроветворения.

Результаты предварительных исследований показали возможность создания новой таблетированной формы рчЭПО для перорального применения [Патенты РФ № 2182830 и № 2152206]. Эритросшмулирующая активность таблетированной формы препарата в экспериментах на животных оказалась сравнимой с инъекционной (Гольдберг Е.Д. и др., 2000).

Получение, культивирование н аттестация клеток, пригодных для научных исследовании н заместительной терапии

Одним из перспективных направлений современной биотехнологии является создание новых способов и технологий получения клеток для регенеративной медицины. Рассматриваются возможности конструирования тканей или всего органа с использованием биодеградируемых материалов со стволовыми или дифференцированными клетками. В связи с этим изучение условий получения, культивирования, дифференцировки, аттестации и применения клеток, полученных из разных тканей и органов, представляется актуальным, научно и практически значимым.

Выделение, культивирование и исследование первичных культур клеток из разных тканей и органов. Для получения первичных и диплоидных культур клеток разных тканей и органов использовали ткани эмбриона, взрослого человека или лабораторных животных. Забор эмбрионального материала осуществляли строго после медицинского аборта с соблюдением правил этики, закона об охране здоровья граждан и информированным согласием донора. Ткани и органы животных забирали соблюдая биоэтические нормы.

Клетки выделяли с использованием ферментов трипсина, коллазы, коллагеназы, протеазы или механическим измельчением ткани, криоконсервировали, используя разные криопротекторы

(диметилсульфоксид, СКРС, FBS, альбумин сыворотки крови человека). Суспензию клеток или мелкие кусочки тканей разливали по ампулам и замораживали в виде первичных банков клеток. Затем восстанавливали ампулу и изучали жизнеспособность клеток, наличие контаминантов, возможность культивирования in vitro и состав клеток по уровню дифференцировки. В случае выявления контаминации клетки уничтожали.

Результаты исследований показали возможность получения уникальных культур клеток из разных тканей и органов человека и животных. Однако получение жизнеспособных клеток в значительной степени зависело от времени и условий доставки органов, способа выделения клеток, условий их культивирования и криоконсервацин.

Для выделения эндотелиоцнтов, миокардиоцитов, спинного мозга, мышечной или хрящевой ткани важным являлись не только выбор фермента, его концентрации, но температура и время его воздействия. Клетки печени или головного мозга лучше сохраняли жизнеспособность без применения ферментов для диссоциации, а выделением их в виде небольших конгломератов или групп клеток путем механического продавливая ня тканей через мелкоячеистый материал.

Использование аттестованного альбумина сыворотки крови человека в среду для криоконсервации клеток человека, вместо сыворотки крови животных, позволяло хорошо сохранять первичные клетки человека при температуре жидкого азота и исключить вероятность передачи посторонних агентов через сыворотку крови животных.

Изучение условий культивирования показало, что клетки спинного мозга человека, хондроциты, миокардиобласты или эндотелиоциты лучше всего росли в питательной среде ДМЕМ/Р12 или RPM1 1640 с добавлением сыворотки крови плодов коровы в количестве 10% - 20%. При выращивании, хондроцитов в данных условиях их число увеличивалось через 3 суток в 2-3 раза. Пересевая через 3-4 дня, клетки хрящевой ткани удавалось поддерживать in vitro в течение 4 и более пассажей. Использование других сред (Игла MEM, ДМЕМ) или других сывороток (СКРС, свиная сыворотка) приводило к гибели клеток уже на 1-3 пассаже.

Аналогичные результаты получены и с другими типами клеток. Вместе с тем отмечено, что лучший рост клеток, выделенных из тканей сердца, эндотелия сосудов или мышечной, наблюдался на поверхности, покрытой желатином. Культура клеток, выделенных из миокарда желудочков, была представлена смесью разных типов клеток с преобладанием крупных многоядерных полигональных клеток. После культивирования клеток в течение 20 и более дней исчезали мелкие и крупные многоядерные клетки, но оставались крупные полигональные клетки.

Первичные культуры клеток более всего ценны присутствием стволовых или малодифференцированных клеток. Выявление нестина в первичных клетках головного мозга плода человека с помощью меченых антител подтвердило присутствие нейралькых стволовых или прогениторных клеток. Анализ клеток после культивирования in vitro в течение 1 пассажа показал наличие как нестинпозитивных нейральных стволовых клеток, окрашенных флюорохромом taxes red stain, так и ранних нейробластов, меченных антителами на JJ-III тубулин.

При культивировании нейральные клетки головного мозга делились и мигрировали из кусочков ткани, иногда формировали шарообразные структуры, возможно, нейробластулы. Активного роста клеток мозговой

ткани или клеток печени достичь не удалось и, впоследствии, наблюдалась гибель клеток, иногда замещение фибробластоподобными клетками. Из литературы известно, что при выращивании в среде с добавлением сыворотки крови часть клеток эмбрионального мозга плода человека дифференцируется по нейрональному типу [ГГолтавцева P.A. и др., 2001].

Ультраструктурное исследование хондрошгтов показало, что в ходе I-Ш пассажей возрастало содержание дифференцированных элементов с признаками активной синтезирующей активности и накоплением большого количество синтезированного материала. На Ш пассаже в клетках наблюдалось появление вторичных лизосом, содержащих фрагменты мембран, гранулы секрета и участки цитоплазмы. Структура клеток IV пассажа свидетельствовала о процессах затухания жизнедеятельности культивируемых хондробластов.

При световой микроскопии в культуре первичных хондробластов выделялись 3 типа клеток, отличавшихся размерами и количеством цитоплазмы (см. Рис. 10А). Анализ клеток на 2-3 пассаже, окрашенных альциановым синим, показал большое количество суммарных гликозаминогликанов, характерных для дифференцированных хондроцнтов гиалинового хряща межпозвонковых дисков, в цитоплазме всех трех типов клеток.

Рис. 10. Первичная культура фетальных хондробластов человека. А) Темной стрелкой обозначены клетки первого типа, двойной стрелкой -клетки 2 типа, светлой стрелкой - клетки 3 типа. Окрашено гематоксилин-эозином. Ув. х200. Б) Реакция на гликоген в клетках разных типов. ШИК-реакцня. Ув. х200.

Гистохимическая реакция выявила в составе суммарных гликозаминогликанов гранулы хондроитинсульфата и керзтансульфата, локализовавшиеся на периферии клеток всех трех типов. В межклеточном веществе отмечалась положительная реакция на коллаген II типа. Отмечено высокое содержание гликогена, особенно, в клетках 2 типа (Рис. 10Б). Полученные данные подтверждают присутствие малодифференцированных

клеток гиалинового хряща в первичной культуре и разной степени их дифференцировки в процессе культивирования in vitro.

Таким образом, проведенные исследования позволили определить условия выделения, сохранения и культивирования клеток из разных тканей и органов, перспективных для проведения научных исследований или практического применения. Результаты показали, что клетки головного мозга н гепатоциты лучше сохраняли жизнеспособность при выделении и хранении их в виде групп или конгломератов клеток, в то время как клетки других тканей и органов выделяли в виде суспензии отдельных клеток. Использование альбумина сыворотки крови человека позволяло сохранять первичные клетки человека при температуре жидкого азота и исключать вероятности передачи посторонних агентов через сыворотку крови животных. При культивировании первичных культур клеток в среде без добавления специальных факторов стволовые и прогениторные клетки в культуре дифференцируются в течение 1 -4 пассажей.

Создание и аттестация банков культур клеток, пригодных для научных исследований или получения препаратов для терапии. Создание и аттестация банков первичных культур клеток. Для получения достаточного количества стволовых и малодифференцированных клеток, пригодных для научных исследований или практического применения создавали банки первичных клеток, как уже отмечалось выше. В результате было приготовлено 10 банков первичных культур клеток из разных тканей и органов человека и животных, включавших по 30-200 ампул с клетками.

При создании банка, например, клеток СКМ-30 из тканей головного мозга фетуса человека 20 недель было получено 190 ампул по 1,0х108 клеток в каждой. Однако жизнеспособность нейральных клеток оказалась низкой и составила 25%. Низкая доля живых клеток обусловлена высокой скоростью гибели нейральных клеток тканей головного мозга при доставке материала, длительности манипуляций, связанных с выделением, розливом клеток по ампулам и временем заморозки клеток. При ускорении процесса доставки материала, уменьшении количества ампул процедура создания банка ускорялась и позволяла получать суспензию клеток с долей живых не менее 50%.

При создании банка клеток печени плода человека СКП-30 получено 70 ампул по 1,0x10е клеток в каждой. Число живых клеток составляло 50%, что -также свидетельствует о чувствительности клеток печени к влиянию временных и других факторов. Клетки других типов оказались более устойчивыми и, например, выделенные из мышечной ткани (банк СКМц-30, СКМц-16) имели жизнеспособность на уровне 80% и более. Полученные результаты совпадают с данными, описанными ранее, и подтверждают

быструю гибель нейральных и нейрональных клеток головного мозга в процессе их выделения.

В настоящее время в России существуют Методические указания, касающиеся аттестации перевиваемых клеточных линий- субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов, соответствующие требованиям ВОЗ и разработанные ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1989 году [РД 42 28-10-89, 1989]. Для контроля клеток, пригодных, для заместительной терапии, таких требований не было.

Опираясь на приобретенный нами опыт при создании и аттестации банков первичных культур клеток разных тканей и органов, были разработаны совместно с сотрудниками ГИСК им. Л «А. Тарасевича новые Методические указания «Аттестация первичных или диплоидных культур клеток, пригодных для трансплантации». Новые требования включают, главным образом, контроль безопасности клеток, пригодных для научных или экспериментальных исследований и создания препаратов для регенеративной медицины. В новые требования введены контроли клеток с использованием современных методов ИФА- и ПЦР-анализов для исключения таких контаминантов, как вирус иммунодефицита человека, гепатиты, туберкулез, хламидии, микоплазмы, цитомегаловирусы и вирусы герпеса человека.

Учитывая требования новых Методических указаний, были проведены контроли первичных банков клеток и оформлены паспорта. По результатам проведенных исследований и по количеству ампул (не менее 100) были отобраны по 2 банка клеток головного мозга (СКМ-30 и СКМ-33) и ф стальной печени человека (СКП-30, СКП-33) и представлены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Впервые созданные и аттестованные банки первичных и малодифференцированных клеток эмбриональной печени или нейральных клеток мозга человека не содержат контаминантов и могут быть использованы для проведения научных исследований или создания препаратов для заместительной терапии.

Создание посевных и рабочих банков культур диплоидных фыбробластов человека и их аттестация. Известно, что фибробласты продуцируют важные элементы: коллаген, эластин, полисахариды, факторы роста и другие факторы, необходимые для формирования полностью функциональной структуры кожи (Крихели Э. и др., 2004), Фибробласты обладают сильным стимулирующим действием на адгезию и пролиферацию кератипоцитов, продуцируя гормоны и факторы роста, при этом сами активно пролиферируют (Саркисов Д. С. и др. 1996). Именно эти свойства клеток и позволяют получать хорошие ранозаживляющие эффекты после трансплантации клеток на раны различной этиологии.

Возможность культивирования фетальных или эмбриональных фибробластов человека, сохраняющих стабильные свойства в течение десятков пассажей in vitro, подчеркивает перспективность наработки большого количества стандартных по биологическим свойствам клеток, создания на их основе аттестованных банков клеток, пригодных для научных исследований или разработки новых технологий производства препаратов дня заместительной терапии.

Как отмечалось ранее, культуры фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ-16-2, полученные из тканей легкого или кожно-мышечной ткани эмбриона человека, представлялись наиболее перспективными. Клетки восстанавливали из ампул, замороженных на б пассаже, и культивировали в питательной среде до 10-11 пассажа. Из собранного на одном пассажном уровне урожая клетки разливали в ампулы и замораживали при температуре жидкого азота. Так были приготовлены посевные банки клеток легкого ФЭЧ 16-1(ПБК № 1952) и кожно-мышечной ткани ФЭЧ 16-2 (ПБК №1948) в количестве 204 и 312 ампул, соответственно. Рабочие банки фибробластов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 создавали из 1 ампулы посевных банков клеток после культивирования до 15-19 пассажа. Таким образом были созданы банки клеток ФЭЧ 16-1 (РБК № 1957, РБК №2137) и ФЭЧ 16-2 (РБК № 1953, РБК №1958 и РБК 2138).

В результате было заложено на хранение 7 посевных и рабочих банков эмбриональных фибробластов человека, содержащих по 200-250 ампул с (1,0-1.5)х106 клеток в каждой. Банки клеток аттестовали в соответствии с современными требованиями ВОЗ [РД 42-28-10-89,1989]. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляла не менее 85% во всех случаях. Фибробласты сохраняли культуральные и морфологические характеристики, оставались субстратзависимыми, форм1тровали монослой, который был представлен однотипными фибробластоподобными клетками с четко выраженной поточностью расположения.

Клетки имели диплоидный набор хромосом, соответствующий нормальному кариотипу человека, 2n=46, XX (см. Рис.11). Основной набор состоял из хромосом с 1-й по 23-ю пару. Модальный класс четко выражен. Маркерные хромосомы не обнаружены. При просмотре 1000 клеток на 14, 30 и 33 пассажах отмечено отсутствие структурных перестроек и гиперплоидных клеток, полиплоидные клетки встречались в 0,4-3% случаев, число диплоидных клеток на 11 и 30 пассажах составляло не ниже 94,5%. Полученные данные свидетельствуют о стабильности кариотипа клеток и соответствии современным требованиям [РД 42-28-10-89,1989].

а? Ц I г х* 3 ï» le 4 и 5

н в 11 7 и 8 9 и 10 ** n ** ffw 12

д& 13 ùft И «б 13 A * Я* IS Ï: 17 18

о* I» Ï8 30 Я AÂ 22 ss X I

Рис. 11. Кариотип культуры клеток ФЭЧ 16-1,15 пассаж. G-окраска.

Электрофоретический анализ изоферментов Г6ФДГ и ЛДГ показал видовое соответствие клеткам человека. Отсутствие контаминантов подтверждено методами высева на набор селективных сред, окрашиванием флюорохромом, высевом на чувствительные культуры клеток, на куриных эмбрионах и лабораторных животных. Отсутствие онкогенных потенций показано по отсутствию опухолевых образований у иммуносупрессивных животных через месяц после введения клеток. Отсутствие эндогенных онковирусов показано по низкому уровню активности обратной транскриптазы в исследуемых клетках.

Таким образом, в результате проведенных исследований создано 7 посевных и рабочих банков фиброб ластов человека, обладающих стабильными культур альнымн, морфологическими свойствами и неизменным кариотипом при культивировании клеток, по крайней мере, до 35 пассажа. Безопасность клеток подтверждена по отсутствию контаминантов и туморогенных свойств клеток. Аттестованные клетки соответствуют современным требованиям и могут быть использованы для научных исследований и практического применения в регенеративной медицине.

Выбор условий культивирования, транспортировки и поддержания клеток на ране. Одним из перспективных направлений практического применения фибробластов представляется лечение ран различной этиологии [Саркнсов Д.С. и др., 1991, 1995; Смирнов C.B., 1994]. Фибробласты субстратзависимы, легко снимаются с помощью трипсина и могут быть трансплантированы на рану в виде суспензии. Однако жидкая консистенция суспензии клеток не способна удерживаться на ране, стекает в повязку, приводит к гибели клеток и, таким образом, снижает их эффективность. В связи с вышеизложенным были проведены исследования по пригодности

разных материалов в качестве подложки для выращивания клеток, переноса и поддержания на ране.

В результате проведенных исследований были подобраны условия переноса клеток на специально обработанной целлофановой пленке, на микроносителях или в геле, способы запатентованы [Патенты № 2142820, № 2189223]. Выращенные на прозрачной пленке клетки легко переносились на ровные ожоговые поверхности, рана при этом хорошо просматривалась. Клетки на микроносителях или в геле позволяли переносить клетки на глубокие и неровные раны.

Данные изучения множества других подложек в виде губки или прозрачной многослойной пленки с использованием природных компонентов показали наилучшие результаты при использовании экспериментальных образцов коллагена и хитозана, сшитых глутаровым альдегидом с добавлением альгината натрия, глутаровой кислоты, а также антисептика фурагина и анестетика аннлокаина. В отличие от многих других указанные образцы не токсичны и клетки не только прикреплялись к ним, но и равномерно заселяли их, морфология клеток не менялась (см. Рис.12).

Рис.12. Монослой фибробластов на пленке из хитозана, сшитого с коллагеном глутаровым альдегидом. Ув. х20об.

Возможность приготовления субстрата в виде геля, губки или многослойной пленки, не токсичность н пригодность для выращивания и поддержания клеток делают данный материал наиболее перспективным для трансплантации клеток на раны различной глубины и формы. Разработанные условия выращивания клеток, транспортировки и удобства трансплантации в геле или на специальных пленках имеют несомненное практическое значение и могут быть использованы в регенеративной медицине.

Ограниченные исследования по применению клеток на пленках, в геле или на микроносителях в ситуациях по жизненным показаниям показали высокую эффективность применения аттестованных фибробластов для лечения обширных и глубоких ожоговых ран; больных диабетом с длительно

незаживающими трофическими язвами, больных с отморожениями конечностей или длительно незаживающими дефектами костной ткани [Ефремов А.В. и др., 1995; 1999; Юрченко Н.Д. и др., 2000, Колосов Н.Г. и др.,' 2005]. Применение клеток приводило к повышению эффективности сопутствующей терапии и ускорению сроков заживления ран, по сравнению с традиционными методами лечения [Колосов Н.Г. 1999; Колосов Н.Г. и др., 2005].- Использование аттестованных клеток позволяло исключить вероятность переноса инфекции и туморогенность препарата.

Уникальность и преимущества предлагаемого метода подчеркивается возможностью использования клеток из аттестованных банков при определенных показаниях: дефицит донорских ресурсов при обширных и глубоких ожогах, у больных с поливалентной аллергией, а также у лиц пожилого и старческого возраста, при показаниях не позволяющих осуществлять аутодермопласта ку, в детской комбустиологии и в случаях с инфицированными больными (гепатиты, ВИЧ) без дополнительной травмы больного и создания дополнительных ран.

Создание аттестованных банков клеток и подбор условий для выращивания и транспортировки клеток легло в основу создания новой технологии получения стандартного, высокоэффективного и безопасного препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии». Разработка и внедрение технологии применения клеток человека, заранее аттестованных и заложенных на хранение в ампулах в достаточном количестве, позволит обеспечивать стандартным клеточным материалом тяжело обожженных и больных при чрезвычайных ситуациях.

Использование нового метода в практической медицине позволит уменьшить процент смертности ожоговых больных, уменьшить хирургическое вмешательство, сократить размеры донорских участков, уменьшить сроки госпитализации и получить лучшие косметические эффекты. Полученные результаты исследований легли в основу разработки нормативной документации: Фармакопейной статьи предприятия, Регламента производства, Инструкции по применению. Новые штаммы клеток ФЭЧ — 16-1 и ФЭЧ-16-2 запатентованы, как пригодные для заместительной терапии.

ВЫВОДЫ

1. Создана и охарактеризована в соответствии с современными требованиями одна из крупнейших в России специализированная коллекция культур клеток человека и животных, включающая более 120 линий и сублиний клеток животных, в том числе более 40 культур клеток человека, около 20 культур клеток обезьян и 30 линий клеток насекомых. Паспортные характеристики клеток оформлены и изданы в виде 4 томов каталога.

2. Изучены условия получения новых культур клеток различного происхождения. Впервые получено 18 штаммов диплоидных культур клеток человека и 4 новые линии клеток насекомых, пригодных для проведения научных исследований и производства препаратов.

3. Изучение морфологии, кариотипа и электрофоретнческой подвижности изоферментов одиннадцати линий и сублиний клеток насекомых, имевших разное видовое происхождение по названию, показало сходство паспортных характеристик с клетками непарного шелкопряда линии SCLd-135. Полученные данные подтверждают высокую вероятность контаминации клетками других линий, что возможно как при получении новых линий, так и при одновременном культивировании нескольких линий клеток в лаборатории.

4. Получены и аттестованы в соответствии с современными требованиями ВОЗ 7 посевных и рабочих банков гетероплоидных культур клеток 4647, МДСК, 293 и диплоидного штамма клеток Л-68. Стабильные по свойствам и безопасные по отсутствию контаминантов и туморогенных потенций в течение не менее 20 пассажей культивирования in vitro линии клеток МДСК, 4647 и Л-68 пригодны для разработки новых технологий и производства вакцин против кори, гриппа, гепатита А, и других МИБП. Изменчивость кариотипа трансформированной аденовирусом 5 типа линии клеток 293 из посевного и рабочего банков, но стабильность других характеристик и высокая продуктивная активность клеток позволяют рекомендовать культуру 293 для производства противоракового препарата «Канцеролизнн».

5. Сравнительный анализ рекомбинантных клеток-продуцентов рчЭПО показал наибольшую перспективность культуры СНО-рЕ, отличающейся стабильно высокими продуктивными и культуральными свойствами, для производства рекомбинантного препарата, по сравнению с другими продуцентами СНО-972 и СНО-23. Клетки СНО-рЕ, заложенные в виде аттестованных в соответствии с современными требованиями рабочих банков, являются основой для организации стабильного производства препаратов рекомбинантного ЭПО человека.

6. Выделенные и хроматографнчески очищенные образцы субстанции рчЭПО, полученные на трех рекомбинантных культурах клеток, показали высокую степень чистоты и отсутствие посторонних примесей, а также соответствие природному аналогу по молекулярной массе, иммунореактивности и специфической активности по влиянию на эритропоэз в экспериментах in vitro и in vivo на лабораторных животных.

7. Создана технология получения стандартного, высокоэффективного и безопасного препарата «Культуры клеток диплоидные человека для заместительной терапии» с использованием штаммов диплоидных фибробластов человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 из аттестованных посевных и рабочих банков. Разработаны и утверждены ФСП, Регламент производства и Инструкция по применению.

8. Экспериментально обоснованы способы выращивания фибробластов1 на специальных пленках, пористых подложках или микрононосителях для трансплантации клеток на раны различной этиологии. Впервые примененная методика транспортировки клеток в геле или на микроносителях позволяет доставлять материал на большие расстояния, сохранять жизнеспособный материал в течение 5 дней, что может иметь значение при доставке клеток в дальние районы и при чрезвычайных ситуациях,

9. Изучение условий выделения клеток из разных тканей и органов показало зависимость сохранения жизнеспособности клеток от времени доставки органа, условий диспергирования и кри окон сер вации. Показано присутствие стволовых и малодифференцированных клеток в первичных культурах и быстрая их дифференциация при культивирован ни in vitro.

10. Разработаны Методические указания по контролю клеток, пригодных для научных исследований или трансплантации. Для получения достаточных количеств аттестованных малодифференцированных клеток, выделенных из разных тканей и органов, впервые созданы банки первичных клеток, заложенных на хранение при температуре жидкого азота. Созданные, таким образом, 4 банка клеток печени и нейральных клеток головного мозга плода человека, аттестованные в соответствии с новыми Методическими указаниями, могут быть использованы для научных исследований или создания стандартных и безопасных препаратов для заместительной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Идентификация линий клеток насекомых /Колокольпова Т.Д. Царева A.A., Немцов Ю.В., Исаенко A.A., Бочкова Т.Г. // Вопросы вирусологии. -1987. -т.32. - № 1. - С. 87-95.

2. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева АЛ., Исаенко A.A., Немцов Ю.В, Колокольпова Т.Д.. Юрченко Ю.А., Рубцова Н.В., Машукова СЛ., Решетникова Г.Ф., Киц И.В., Дмитриева Е.В., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О., Махова Н.М.. И Депонирован в ВИНИТИ, - Деп. № 865-В88, - М.,1988. - т. 1. - С. 1-186.

3. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева A.A., Исаенко A.A., Немцов Ю.В, Колокольцова Т.Д.. Юрченко Ю.А., Решетникова Г.Ф., Юрченко Н.Д., Махова Н.М., Рубцова Н.В., Урманова М.А., Машукова С.И., Дмитриева ЕЗ., Гетмаиова Т.Н., Чешенко И.О., Киц И.В. .// Депонирован в ВИНИТИ, - Деп. № 866-В88, - М., 1988. - т. 2. -С. 1-150.

4. Каталог перевиваемых культур клеток. Царева A.A., Исаенко A.A., Немцов Ю.В, Колоколыюва Т.Д.. Юрченко Ю.А., Решетникова Г.Ф., Рубцова Н.В., Махова Н.М., Машукова С.И., Гетманова Т.Н., Чешенко И.О. // Депонирован в ВИНИТИ, Деп. Na 867-В88, - М., 1988. - т.З, - С. 1110.

5. Каталог перевиваемых культур клеток / Царева A.A., Исаенко A.A., Колокольцова Т.Д.. Немцов Ю.В, Хромых Т.И., Рубцова Н.В., Юрченко Ю.А., Рябчикова Е.И., Ткачев В.К.. // Депонирован в ВИНИТИ. - Деп. № 869-В88, - М., 1988. - т. 4. - с. 1-141.

6. Штамм перевиваемых клеток эмбрионов Agrothis segetum (Schiff) Для культивирования бакуловирусов / Колокольцова Т.Д., Герасимова Н.Г., Царева A.A. // Патент (СССР) Да 1808009 ФЗ, С12 N5/00, Ф01 № 63/00, опубл. в БИ 13,1993г.

7. Колокольцова Т.Д.. Царева A.A. Штамм перевиваемых клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (Hubn), продуцент вирусов ядерного лолиэдроза // Патент (СССР) № 1808010 ФЗ. - БИ. -

1993. -№13.

8. Колокольцова Т.Д.. ЦареваА.А. Выбор источника получения первичных культур клеток чешуекрылых насекомых // Цитология, - 1994. -Xs4.-C.6-7.

9. Колокольцова Т.Д, Герасимова Н.Г. Получение новой линии клеток яичников куколок капустной совки Mamestra brassicae L. // Цитология. —

1994.-№4.-С. 9-10.

10. Лечение глубоких ожогов кожей, выращенной в искусственных условиях / Ефремов А.В, Юрченко Н.Д. Колосов Н.Г., Колокольцова Т.Д.. Нечаева Е.А. // Сб."Актуальные вопросы развития военно-медицинской службы СибВО на современном этапе". - Новосибирск, 1995. - С. 1 б-17.

11. Колоколыюва Т.Д.. Царева A.A. Морфологический и кариологкческий анализ первичных и перевиваемых культур клеток чешуекрылых насекомых // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 2. - С. 91-95.

12. Колокольцова Т.Д.. Герасимова Н.Г., Царева A.A., Получение первичных культур клеток чешуекрылых насекомых Н Вопросы вирусологии. -1995. - № 2. - С. 89-91.

13. Колокольцова Т.Д. Герасимова Н.Г., Царева A.A. Новая линия клеток яичников куколок хлопковой совки Heliothis armigera (HUBN) // Вопросы вирусологии. - 1995. - № 3. - С. 135-138.

14. Колокольцова Т.Д.. Царева A.A. Методические основы получения первичных культур клеток насекомыхУ/Вопросы вирусологии. — 1995. - Хг З.-С. 89-91.

15. Выяснение оптимального способа получения культур клеток кожи / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д.. Колосов Н.Г., Нечаева Е.А. // Цитология.-199б. - т. 38. - № 2. - С. 262-263.

16. Development of production technology of new live measles vaccine based on human embryo lung diploid cell culture L-68 / Nechaeva E.A., Kolokoltsova T.D.. Yurchenko N.D., Kitz I.V., Jilina N.V., Sandakhchiev L.S, // Proceedings of ESACT Meeting: "Animal Cell Culture Technology. From Vaccine to

■ Genetic Medicine" / Ed, by M.J. Carrondo etal. - Dordrecht//Boston/London: Kluwer Academic Publishers, 1997.-P. 159-164.

17. Выбор оптимальных условий получения суспензии жизнеспособных клеток кожи человека / Юрченко Н.Д. Колоколыюва Т.Д. Колосов Н.Г, Шумакова О.В., Нечаева Е.А. // Биотехнология,- 1997. - № 11-12. - С. 3747.

18. Способ получения живой коревой вакцины / Сандахчиев Л.С., Царева А.А., Нечаева Е.А., Попов В.Ф., Шалунова Н.В. Колоколыюва Т.Д. и др. // Патент РФ № 2112545. - БИ. - 1997. - № 12.

19. Перспективы использования аттестованных фетальных фибробластов человека при лечении ран различной этиологии / Колоколыюва Т.Д^ Юрченко Н.Д., Колосов Н.Г., Шумакова О.В., Нечаева Е.А. // Вестник РАМН;-1998.- № 3. - С. 32-35. .

20. Разработка технологии производства живой коревой вакцины на основе культуры клеток легкого эмбриона человека Л-68 / Нечаева Е.А., Колоколыюва Т.Д.. Киц И.В., Жилина Н.В., Сенькина Т.Ю., Усова СЛ., Азаёв М.Ш. // Вестник РАМН. - 1998. - № З.-С. 29-32.

21. New technology of production recombinant human erythropoietin for peroral administration / Kolokoltsova T.D.. Kostina N.E., Nechaeva E.A., Yurchenko N.D., Shumakova O.V., Rizikov A.B., Varacsin N.A., Rjabicheva T.G. // Proceedings of ESACT Meeting: "New Developments and New Application in Animal Cell Technology" / Ed. by Otto Wilhelm Merten, P. Peirin and B. Griffits. — Netherlands.: Kluwer Academic Publishers, 1998. - P. 463-467.

22. Cultivation of skin cells suitable for recoveiy of of burn wound / Kolokoltsova T.D.. Yurchenko NX>., Kolosov N.G., Khristo S.A., Shumakova O.V // Proceedings of ESACT Meeting: "New Developments and New Application in Animal Cell Technology"1 / Ed. by Otto Wilhelm Merten, P. Penin and B. Griffits. - Netherlands: Kluwer Acad. Pub., 1998. - P. 673-675.

23. Study of Leningrad-16 vaccine strain of measles virus reproduction in cell substrate perspective for biotechnology / Nechaeva E.A, Kolokoltsova T.D.. Getmanova T.N, Senkina T.Y, Yurchenko N.D. // Proceedings of ESACT Meeting: «New developments and new applications in cell technology »У eds. O.-W. Merten et al. - Netherlands: Kluwer Acad. Pub., 1998. - P. 577-579.

24. Морфогенез и репродукция вируса кори в диплоидных клетках человека, перспективных для производства иммунобиологических препаратов / Гетманова ТЛ., Нечаева Е.А., Сенькина Т.Ю., КолокольЦ°ва Т.Д.. Юрченко Н.Д., Шумакова О.В. // Биотехнология.-1998, - № 4,- С. 4450.

25. Первый опыт применения культуры аллофибробластов при ожогах / Христо С.А., Колоколыюва Т.Д.. Юрченко Н.Д., Юдаев И.П // Сб: «Новые методы диагностик», лечения заболеваний и управления в медицине».-Новосибирск, 1998. - С. 183-184.

26. Применение аттестованных фибробластов в Ожоговом Центре ! Ефремов А.В., Колосов Н.Г., Колокольцова Т.Д., Юрченко Н.Д., Христо С.А., Юдаев HJO., Нечаева Е.А // Сб.:«Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине». - Новосибирск, 1999. - С. 132-134.

27. Comparative study of the cell cultures perspective for rubella virus production / Getmanova T.N., Chepumov A.A., Machova N.M., Nechaeva, EU, Kolokoltsova T.D. // Proceedings of ESACT Meeting: «Animal cell technology: products from cells, cells as products» / A. Bernard (eds.). - Kluwer Acad. Pub.: Switzerland, 1999. - P. 475-477.

28. Creation and maintenance of certified banks of cells suitable for production of healing and immunological preparations / Kolokoltsova T.D.. Yurchenko N.D., Nechaeva E.A, Isaenko A.A., Shumakova O.V., Getmanova T.N // Proceedings of ESACT Meeting: «Animal cell technology : products from cells, cells as products» / A. Bernard (eds.). - Switzerland,: KJuwer Acad. Pub., 1999.-P. 505-507.

29. Способ получения живой коревой вакцины / Сандахчиев Л.С., Нечаева ЕЛ., Вараксин Н.Г., Колокольпова Т.Д. и др // Патент РФ № 2140288. -БИ.-1999. 10.

30. Рекомбинантная плазмидная ДНК рКЕР-9, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНОрЕ-9 - продуцент эритропоэтина человека / Урманова MA., Щелкунов СЛ., Поздняков С.Г., Колокольцова Т.Д. и др, // Патент РФ № 97108266. - БИ-1999.-№ 1.

31. Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, способ его получения и способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии / Юрченко Н.Д., Колокольцова Т.Д.. Колосов Н.Г. и др. //Патент РФ № 2142820, - БИ. - 1999. -№ 35.

32. Создание аттестованных банков фибробластов человека, пригодных для лечения ран различной этиологии / Юрченко Н.Д„ Колокольцова Т.Д.. Щумакова О.В., Нечаева Е.А,, Христо С.А. // Сб. «Клинические аспекты клеточной и тканевой терапии». - Омск, 2000. - С. 182-184.

33. Гсмостимулирующие свойства таблетиро ванной формы рекомбинантного эритропоэтина человека в эксперименте / Годдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Колокольцова Т.Д., Костина Н.Е., Мннакова MJO., Нечаева Е.А.. Поженько Н., Сандахчиев Л.С., Симанина Е.В., Хлусов И.А. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. -т.63.-Ла5.-С. 37-40.

34. Гетманова Т.Н., Нечаева Е.А,. Колокольпова Т.Д. Особенности морфологии и формирования симпластов в культурах клеток, зараженных вирусом кори // Вопросы вирусологии.- 2000,- Ш 5.- С. 34-37.

35. Таблетированная форма рекомбинантного человеческого эритропоэтина для перорального применения и способ его получения / Сандахчиев Л.С., 1С°локольцова Т.Д.. Костина Н.Е., и др. // Патент РФ № 2152206. — БИ. —2000.-№ 10.

36. The comparative study of cultural and productive characteristics of different recombinant cell lines producing human erythropoietin / Kolokoltsova O., Schumakova O., Belova N., Nechaeva E., Kolokoltsova T. // Proceedings of

ESACT Meeting: "Animal cell Technology: From target to Market", / Ed. Lindner E., Chatzissavidou N.. Lullau E, - New York/Boston/London: Kluver Academic Publishers, 2001,- P. 75-78.

37. Таблети рованная форма рекомбинантного человеческого эртропоэтина / Сандахчиев Л.С, Колокольцова Т,Д,, Вараксин Н. И др. // Патент РФ №2182830. - БИ. - 2002. - № 15.

38. Approaches to development of microencapsulated form of the live measles vaccine / Nechaeva EA, Varaksin N, Ryabicheva T, Smolina M, Kolokoltsova T. Vilesov A, Aksenova N, Stankevich R, Isidorov R, // Ann N Y Acad. Sci. -

2001.-№944.-P. 180-186.

39. Средство для лечения глубоких кожных дефектов / Юрченко Н.Д., Коддкольцова Т.Д.. Шумакова О-В, и др. // Патент РФ Ла 2189223. - БИ. -

2002.-№9.

40. Kim I., Kolokoltsova Т. The production and storage of nucleus-containing cells from umbilical blood // Proceedings of the II Moscow International Congress "BIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of Development".-Moscow, Russia, 2003.-P. 121-124.

41. Vdovichenko G.V, Kolokoltsova T.D. The development of the method for ' production of cardiac cells and vascular endothelium // Proceedings of the II

• '"Moscow International Congress "BIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of Development". - Moscow, Russia, 2003. - P. 127-133.

42. Bolgova O.P., Radaeva I.F., Kolokoltsova T.D. The selection of conditions for production and cultivation of spinal cord cells // Proceedings of the II Moscow International Congress "BIOTECHNOLOGY: State of the art and prospects of Development". - Moscow, Russia, 2003. - P. 134-135.

43. Cell-based therapy of chronic degenerative diseases of the central nervous system / Pankratov YV, Ivanov AI, Kolokoltsova TP, Nechayeva YA, Radayeva IF, Korochkin LI, Revischtn AV, Naumov SA, Khlusovi IA, Autenshlus AL // Adv Exp Med Biol. - 2003. - № 534. P. 97-105.

44. Структурно-функциональный анализ гена рибосомного белка L31 человека / Воронина ЕЛ., Колокольцова Т.Д.. Нечаева Е.А.,. Филипенко М.Л // Мол. Биол. - 2003. - т. 37. - № 3. - С. 425-435.

. 45. Вдовиченко Г.В., Колокольцова Т.Д., Фатюхина О.Е Выбор субстрата для культивирования клеток сердца и эндотелия сосудов // Успехи современного естествознания. — 2004,- № 6, -т. 1. -С. 133-134.

46. Создание банка ядросодержащих клеток из пуповинной крови /Ким И.И., Хлусов И.А., Костина Г.А., Крлокольцова Т.Д.. Иванов А.И., Болгова О.П. // Успехи современного естествознания. — 2004,- № 6.- т. 1,-С. 135-136.

47. Method for producing the microcapsulated form of live viral vaccine / Sandakhchiev L.S., Nechaeva E.A., Varacsin N.A., Kolokoltsova T.D. eLal. // Международный патент WO 2004/035028 Al, - 29 Апрель 2004.

48. Проблемы аттестации культур клеток, пригодных для заместительной терапии / Колокольцова Т.Д., Костина Г.А., Нечаева Е.А., Радаева И.Ф, Шалунова Н.В. Н Успехи современного естествознания. — 2004. - т.1.- № б.-С. 127-128.

49. Подходы к созданию нового метода контроля состояния "жизнеспособности клеток и тканей с применением лазерно-

индуцированной флюоресценции / Фатюхина О. £., Колокольцова Т.Д^ Трошкова Г.П,, Вдовиченко Г.В., Маслов H.A., Малов А.Н. // Успехи современного естествознания,- 2004, - № 6,- т. 1,- С. 139-140.

50. Зайдман AJví., Сахаров A.B., Колокольцова Т.Д. Культура хондробластов как потенциальный источник для тканевой инженерии при повреждениях и заболеваниях позвоночника // Хирургия позвоночника,-2004. 4. -С.115-121.

51. Nechaeva Е.А., Mazurkova К., Kolokoltsova T. New Technology for production of live influenza vaccine // Bioprocess International. - 2004. -v.2. -J&3.-P. 52-55.

52. Опыт применения культивированных аллофибробластов при лечении ран различной этиологии / Колосов Н.Г., Ефремов A.B., Колокольцова Т.Д.. Евланова Е.А., Шалунова Н.В. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. — 2005. - №3,- С. 57-59.

53. Культура хондробластов человека - как возможный донорский материал для коррекции нарушений хрящевой ткани / Зайдман А.М., Сахаров А. В., Корель A.B., Ким И., Колокольцова Т. Л. // Вестник трансплантологии и искусственных органов.- 2005. -№ З.-С. 59-61.

54. Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK. для производства гриппозной вакцины / Радаева И.Ф., Колокольцова Т.Д.. Нечаева ЕА, Мазуркова H.A., Ильина Т.В., Гетманов« Т.Н., Балтуева Л.С., Графодатский A.C., Гендон Ю. 3., Петручук Е.М. // Вопросы вирусологии.-2005,-№2.-С. 43-46.

55. Аттестация перевиваемой культуры клеток 293, используемой для культивирования антирахового лечебного препарата «Канцеролизин» / Радаева И.Ф, Вдовиченко Г.В., Сергеев A.A., Колокольцова Т.Д., Нечаева EJV, Сергее А.Н., Терновой В.А., Нетесов C.B. // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - т. 50. - Ks 5-6. - С. 7-10.

56. Дальнейшее совершенствование (МДСК) живой холодадаптированной гриппозной вакцины: культивирование вакцинных штаммов в производственных ферментерах / Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б„ Нечаева Е.А., Мазуркова H.A., Радаева И.Ф., Колокольцова Т.Д. // Вопросы вирусологии. - 2005. - т. 50. -Jfe 2. - С. 4-9.

57. Development of cell culture (MDCK) live cotd-adapted (CA) attenuated influenza vaccine / Ghendon YZ, Markushin SG, Akopova П, Koptiacva IB, Nechaeva EA, Mazurkova LA, Radaeva IF. Kolokoltsova TP. // Vaccine. -2005 Sep 7. - v. 23. - Xa 38. - P. 4678-84.

58. Доклинические исследования противоракового лечебного препарата "Канцеролизин" на основе мутантного штамма аденовируса 5-го типа / Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев A.A., Ким И.И., Фатюхина O.E., Шишкина Л.Н., Богрянцсва МЛ., Плясунов И.В., Святченко В.А., Киселев H.H., Колокольцова Т.Д.. Рябчикова Е.И., Сергеев А.Н., Нетесов C.B. //Вопросы вирусологии. - 2006,- т. 51. - № 6. - С. 39-42.

59. Колокольцова Т.Д.. Шалунова Н.В., Петручук Е.М. К вопросу о контроле безопасности культур клеток , пригодных для заместительной терапии // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 8-12.

60. Создание банков перевиваемой культуры клеток 293 для производства антиракового лечебного препарата «Канцеролизин» / Вдовиченко Г.В.,

Рздаева И.Ф., Сергеев A.A., Колокольпова Т.Д.. Нечаева Е.А., и др. // Биотехнология. - 2006. - № 1, - С. 62-65.

61. Влияние имплантации клеток печени эмбриона человека на течение экспериментального токсического гепатита / Хлусов И.А., Наумов С.А., Нечаева ЕА» Колокольцова Т.Д.. Хлусова MJO., Никифоров С.Б., АнтиповС.А., Некрасова A.M. П Биопрепараты. — 2006. - Jvs 2. - С. 17-21.

62. Евланова Е.А., Крлоколыгова Т.Д.. Еремеев A.B. Выбор подложек, пригодных для культивирования и переноса клеток на раны различной этиологии // Биопрепараты. - 2006. - № 2. - С. 33-36.

63. Штамм диплоидных клеток человека для заместительной терапии (его варианты) / Колокольцова ТЛ. Нечаева ЕЛ., Костина Г.А,.и др. // Патент РФ№ 2004126518 А61 КЗ 5/54. - Опубл. 2006.

64. Композиция на основе клеточных культур для лечения дефектов костной ткани при повреждениях воспалительной этиологии / Колокольцова Т.Д.. Болгова О.П., Радаева И.Ф., и др. И Патент РФ Ks 2004126519 C12N5/00. - Опубл. 2006.

65. Получение аттестованных фибробластов человека, пригодных для научных и медицинских исследований И Колокольцова Т.Д.. Юрченко Н.Д., Нечаева Е.А., Радаева И.Ф, Шалунова Н.В., Петручук Е.М., Бердникова З.Е., Колосов НХ. Н Биотехнология. — 2007.- Na 1. - С. 58-64.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РВ5- сыворотка крови плодов коровы БСА - бычий сывороточный альбумин ВОЗ- Всемирная Организация Здравоохранения ФСП- фармакопейная статья предприятия Г6ФДГ -глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа ГАТ — гипоксантин, тимидин, аминоптернн ИФА — иммуноферментный анализ ИЦДГ- изоцнтратдегадрогеназа ЛДГ- лактатдегидрогеназа МДГ- малатдегидрогеназа

МИБП - медицинские иммунобиологические препараты

МТХ-метатрексат

ПЕК- посевной банк клеток

ПЦР-метод полимеразно-цепной реакции

РБК-рабочий банк клеток

рчЭПО- рекомбинантный эритропоэтин человека СКРС- сыворотка крови крупного рогатого скота ЦПД- цитопато генное действие ЭПО - эритропоэтин

Подписано в печать 30,05.2007 г. Исполнено 01.06.2007 Печать трафаретная.

Заказ № 550 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 www.autoreferat.ru

Информация о работе