Оптимизация производства вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой, на новом клеточном субстрате перевиваемой линии клеток Vero B.

Бархалёва, Оксана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация производства вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой, на новом клеточном субстрате перевиваемой линии клеток Vero B.
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация производства вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой, на новом клеточном субстрате перевиваемой линии клеток Vero B."

На правах рукописи Бархалёва Оксана Александровна

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ СУХОЙ, НА НОВОМ КЛЕТОЧНОМ СУБСТРАТЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК VERO В.

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003454139

Работа выполнена в ФГУН Государственном научно - исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор медицинских наук, профессор Воробьёва Мая Сергеевна Доктор медицинских наук, профессор Баринский Игорь Феликсович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук Иванова Валерия Тимофеевна Доктор медицинских наук, профессор Карпович Лидия Григорьевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт Вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Защита состоится « $ » 2008 года в 12 часов на заседании

диссертационного совета Д^ 001.020^01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте вирусологии им. Д.И. Ивановского Российской Академии Медицинских наук по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, дом 16; тел. (499) 190-30-40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан « 7 » ноября 2008 года.

Учёный секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы.

Среди вирусных инфекций - герпес-вирусные инфекции занимают одно из ведущих мест в патологии человека в силу повсеместного распространения, различных путей передачи инфекции, многообразия клинических проявлений заболевания, хронического латентного течения с периодическими рецидивами.

Свыше 90% людей земного шара инфицированы вирусом герпеса простого и до 20 % из них имеют те или иные клинические проявления инфекции.

В России число госпитализированных лиц с различными формами герпетической болезни превышает 2,5 млн. человек в год.

В США, где осуществляется обязательная регистрация больных герпетической инфекцией, зарегистрировано более 20 млн. человек с генитальным герпесом. В России число больных генитальным герпесом составляет около 8 млн. человек.

По данным ВОЗ, показатель смертности от герпетической инфекции (15,8%) находится на втором месте после гриппа (35,8%) среди показателей смертности от вирусных заболеваний.

По прогнозам Всемирного банка информации - проблема герпетической инфекции на ближайшее будущее определяется как «Глобальная проблема человечества», что требует всестороннего изучения заболевания и поиска наиболее эффективных методов профилактики и лечения этой инфекции.

Одним из путей лечения герпетической инфекции является вакцинотерапия. История развития направлений и подходов к разработке технологий создания вакцин против герпеса простого насчитывает более 50 лет.

Первая отечественная вакцина против герпеса простого была разработана в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН группой авторов под руководством профессоров А.К.Шубладзе и И.Ф.Баринского. Многолетние наблюдения по вакцинотерапии большого количества больных с различными формами рецидивирующей герпетической инфекции показали выраженную лечебную эффективность и безопасность применения такой вакцины. Данная вакцина была разработана и производится до настоящего времени при

использовании субстрата накопления вируса герпеса простого 1 и 2 типов -первичнотрипсинизированной культуры клеток куриного эмбриона.

Современный уровень развития биотехнологии и вирусологии с применением культур клеток различного происхождения для накопления вирусной биомассы создает благоприятные условия для оптимизации и стандартизации методов и условий производства вирусных вакцинных препаратов. В последние годы наиболее перспективными, удобными и экономичными для этой цели принято считать диплоидные или гетероплоидные линии клеток животных и человека. Данные культуры обладают целым рядом значительных преимуществ перед первично-трипсинизированными культурами клеток, могут быть аттестованы и стандартизованы.

ВОЗ среди различных линий клеток аттестована и рекомендована для производства вирусных вакцин - перевиваемая линия клеток почек африканской зеленой мартышки - линия клеток Vero.

В России, в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, в лаборатории клеточных культур (проф. Р.Я.Подчерняева) на основании культуры клеток Vero, был получен отечественный посевной банк перевиваемых клеток Vero В, который после аттестации Национальным органом контроля МИБП - ГИСК им. Л.А.Тарасевича рекомендован в РФ для производства вирусных вакцин.

Нами перевиваемая линия клеток Vero В была использована для оптимизации и разработки производства вакцины против вирусов герпеса простого 1 и 2 типов.

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы: научно обосновать, оптимизировать и стандартизовать технологию получения инактивированной культуралыюй вакцины против герпеса простого 1 и 2 типов при использовании нового субстрата -перевиваемой линии клеток Vero В, а так же разработать и аттестовать метод контроля специфической активности вакцины с применением иммуноферментного анализа (ИФА).

В соответствии с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить морфологические и репродуктивные особенности культуры клеток Vero В применительно к созданию условий репродуцирования вируса герпеса простого 1 и 2 типов;

2. Создать и аттестовать рабочий банк культуры клеток Vero В;

3. Провести адаптацию ВГП типа 1(штамм УС) и ВГП типа 2 (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В, изучить инфекционную активность и специфичность (подлинность) штаммов ВГП после адаптации к новому субстрату, создать банк и систему посевных серий (штаммовый запас, маточный вирус, посевной вирус) для воспроизводства на новом субстрате штаммов ВГП 1 и 2 типов, а так же определить возможность использования их при производстве вакцины;

4. Провести изучение инфекционной активности вирусов ВГП 1 и 2 типов в культуре клеток Vero В в сравнении с показателями инфекционной активности в первично-трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона;

5. Методоми ПЦР-амплификации и анализа нуклеотидных последовательностей определить отсутствие значимых изменений в геномах ВГП 1 и 2 типов после адаптации вирусов к перевиваемым клеткам Vero В;

6. Разработать и аттестовать для вакцины против герпеса простого систему требований и методов контроля качества, при этом модифицировать и аттестовать метод оценки показателя «Специфическая активность» вакцины с применением ИФА;

7. В клинических испытаниях при вакцинотерапии различных форм рецидивирующей герпетической инфекции в сравнении с вакциной «Герповакс» (на культуре клеток куриных эмбрионов) подтвердить хорошую переносимость, безопасность и лечебную эффективность вакцины «Витагерпавак», приготовленной на новом клеточном субстрате -перевиваемой линии клеток Vero В.

Научная новшиа.

Впервые показана возможность применения аттестованной Национальным органом контроля МИБП - ГИСК им. Л.А.Тарасевича перевиваемой линии клеток Vero В в условиях отечественного вакцинного производства.

Получен и аттестован в соответствии с международными требованиями к субстратам для приготовления вирусных вакцин - рабочий (производственный) банк перевиваемой линии клеток Vero В.

Проведена адаптация (путем последовательного пассирования) штаммов ВГП к культуре перевиваемых клеток Vero В без потери основных свойств вируса.

В шифрованных сравнительных клинических испытаниях подтверждена хорошая переносимость, безопасность и лечебная эффективность вакцины «Витагерпавак», приготовленной на новом клеточном субстрате - клетках Vero В, не уступающая таковой вакцине полученной на первично-трипсинизированных клетках куриного эмбриона.

Теоретическая значимость работы.

Научно обоснована возможность применения гетероплоидных клеток Vero В для производства вирусных вакцин без изменения основных свойств вируса. Впервые в РФ, совместно со специалистами НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, проведено молекулярно-генетическое изучение производственных штаммов вируса герпеса простого типов 1 и 2, адаптированных к перевиваемой линии клеток Vero В.

Экспериментально доказана целесообразность применения метода ИФА для оценки специфической активности и стандартности вакцины против герпеса простого.

В условиях клинического шифрованного опыта впервые показана безопасность, хорошая переносимость и лечебная эффективность вакцины против ВГП 1 и 2 типов «Витагерпавак», полученной на перевиваемой линии клеток Vero В, не уступающая таковой вакцине производимой на культуре первично-трипсинизированных клеток куриного эмбриона.

Практическая значимость работы.

Разработана и стандартизована технология производства вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой «Витагерпавак» на новом клеточном субстрате - перевиваемой линии клеток Vero В. На препарат оформлена и утверждена Росздравнадзором нормативная документация: Фармакопейная статья, Инструкция по применению. Получено Регистрационное удостоверение МЗ РФ, Аттестат производства. На предприятии - ЗАО «ФИРМА«ВИТАФАРМА» налажено серийное производство вакцины, к настоящему времени выпущено более 30 серий. Все разработки и результаты исследований, представленные в работе, послужили обоснованием для внедрения вакцины «Витагерпавак» в медицинскую практику.

Положения, выносимые на защиту.

1. Создание рабочего банка культуры клеток Vero В.

2. Адаптация производственных ВГП 1 и 2 типов (штамм УС) и (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В, характеристика основных свойств штаммов после адаптации.

3. Изучение штаммов ВГП 1 и 2 типов методами ПЦР-анализа и сиквенса -определение возможных изменений в геноме вируса после адаптации.

4. Модернизация технологии, получение и аттестация серий вакцины, разработка и применение метода ИФА для оценки специфической активности вакцины.

5. Оценка и подтверждение переносимости, безопасности и лечебной эффективности вакцины «Витагерпавак» по результатам сравнительных клинических испытаний отечественных вакцин против герпеса простого.

Апробация работы Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции по вакцинологии, Москва, 2006 г., на заседании Ученого совета ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва, 2008.

Материалы диссертационной работы отражены в 10 публикациях, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора в проведенных исследованиях: Исследования по получению рабочего банка клеток Vero В, по адаптации штаммов ВГП-1 и ВГП-2 к культуре клеток Vero В , разработке технологии получения герпетической вакцины и системы ее контроля, включая методику ИФА для оценки специфической активности вакцины, выполнены автором лично и самостоятельно.

Автор принимала участие совместно с сотрудниками НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН в проведении молекулярно-генетических исследований штаммов ВГП 1 и 2 типов до и после адаптации к клеткам VeroB.

Автор диссертационной работы принимала непосредственное участие в формировании Программы сравнительных клинических испытаний герпетических вакцин, сю были подготовлены и отконтролированы серии вакцины «Витагерпавак» для клинических испытаний, принимала непосредственное участие в анализе полученных клинических данных.

Структура и объём диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзора литературы и собственных исследований которые включают: материалы и методы, результаты исследований и обсуждения, выводы, список литературы, который включает 162 источника, из них 97 отечественных и 65 зарубежных авторов. Диссертация содержит 21 таблицу и 12 рисунков.

Материалы и методы. Штаммы вируса герпеса простого.

- ВГП типа 1 (штамм УС): (Шубладзе А.К., Баринский И.Ф., Фомина А.Н., и др.) Штамм адаптирован к первично трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона (ККЭ) на которой прошел 26 пассажей. Депонирован в качестве вакцинного штамма в музее вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (депонент № 1918). Инфекционная активность вируса при заражении культуры ККЭ - 5,0 lg ТЦД so/мл Типоспецифичность в реакции

нейтрализации (РН) с сыворотками кроликов, иммунизированных ВГП типа 1 (штамм УС) в культуре ККЭ: индекс нейтрализации - 3,5.

- ВГП типа 2 (штамм ВН): (Шубладзе А.К., Баринский И.Ф., Фомина А.Н., и др.) Штамм прошел 29 пассажей на первично трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона (ККЭ). Депонирован в качестве вакцинного штамма в музее вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (депонент № 1919). Инфекционная активность вируса при заражении культуры ККЭ - 4,0 lg ТЦД so/мл- Типоспецифичность в РН с сыворотками кроликов, иммунизированных ВГП типа 2 (штамм ВН): индекс нейтрализации - 3,0. Перевиваемая линия клеток Vero В (почка африканской зеленой мартышки).

Штамм линии клеток Vero В депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (депонент № 649 Д).

В работе были использованы стандартные питательные культуральные и бактериологические среды, эмбриональные сыворотки и растворы производства ООО «Биолот» г. Санкт-Петербург. Лабораторные животные.

Белые аутбредные крысы (самцы), массой 100-120 г, возраст 5-7 недель. Белые аутбредные мыши (самцы), массой 8-10 г, возраст 2-3 недели. Иммунные сыворотки.

- Типоспецифические кроличьи сыворотки - получены из НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН путем иммунизации кроликов ВГП 1 или 2 типов, сыворотки содержат антитела к ВГП 1 или 2 типов.

- Иммунные крысиные сыворотки - получены в результате 3-х кратной иммунизации инактивированной вакциной против вируса герпеса простого самцов белых крыс; использовали для определения специфической активности экспериментально-производственных серий вакцины против ВГП 1 и 2 типов: в РН в культуре клеток Vero В и методом ИФА, определяли показатель содержания специфических антител.

Диагностические нммунофермеитные тест-системы.

«ДС-ИФА-АНТИ-1,2-С» - тест-система иммуноферментная для выявления суммарных антител класса G к ВГП 1 и 2 типа, производства НПО "Диагностические системы" (иммуносорбент - планшет, сорбированный рекомбинантными антигенами ВГП 1 и 2 типов).

«BeKToBnr-IgG-стрип» - тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к ВГП 1 и 2 типов, производства ЗАО "Вектор Бест" (иммуносорбент - планшет, сорбированный - нативными вирусными антигенами ВГП 1 и 2 типов).

«ВектоВПГ-2-IgG» - тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к ВГП 2-го типа, производства ЗАО "Вектор Бест" (иммуносорбент - планшет, сорбированный рекомбинантным белком ВГП-2). Коньюгат.

- Коньюгат к IgG крысы, кроличий пероксидазный, ф. Sigma, Германия. Активность в ИФА (по сертификату) - 1:40000.

Вакцина «Герповакс» - герпетическая культуральная инактивированная сухая, производства НИИ вакцин и сывороток, г. Санкт- Петербург. Пациенты вакцинированные против ВГП.

Пациенты клиники кафедры кожных и венерических болезней Российского университета Дружбы народов. Общее количество 60 человек, из них: с диагнозом - герпетическая инфекция кожная форма в стадии ремиссии - 21 человек; с диагнозом - герпетическая инфекция генитальная форма в стадии ремиссии- 39 человек. Возраст пациентов от 23 до 54 лет.

Диагноз у пациентов был установлен по результатам клинического наблюдения в период от 6 мес. до 12 лет. Методы:

Культивирование перевиваемой линии клеток Vero В.

Проводили в стационарных условиях, на питательной среде Игла, с добавлением 8 % сыворотки эмбрионов коров. Снятие клеток со стекла -смесью - 0,02 % раствора версена с добавлением 0,1 мг/мл химопсина.

Посевная концентрация клеток - 100000 кл/мл. Частота пассирования - 2 раза в неделю. Инкубация при температуре 37+1 °С. Криоконсервирозание клеток Vero В.

Готовили суспензию клеток Vero В с концентрацией клеток 3,5x10б Среда для криоконсервирования - смесь: среда Игла - 70 %, сыворотка эмбрионов коров - 20 %, глицерин - 10 %. Суспензию клеток разливали по 1,25 мл в ампулы для криоконсервирования.

Охлаждение суспензии клеток в ампулах проводили со скоростью 1 °С в минуту до температуры минус 70 °С, затем ампулы погружали в жидкий азот. Пассирование ВПГ в культуре перевиваемых клеток Vero В.

На монослой клеток Vero В, вносили ВГП 1 или 2 типов с множественностью инфицирования 0,01 ТЦД 50/клетку, сорбцию вируса проводили в течение 30 минут при температуре 37+1 °С, после чего добавляли поддерживающую среду - среда Игла с 8 % сыворотки эмбрионов коров. Инкубацию проводили при температуре 37+1 °С. Цитодеструкцию клеток Vero В наблюдали через 18-24 часа для ВГП типа 1 и через 36-38 часов для ВГП типа 2. При деструкции 80 % и более клеточного монослоя, культуральную вируссодержащую жидкость в матрасах замораживали при температуре минус 40 °С.

Определение инфекционной активности ВГП.

Инфекционную активность ВГП 1 и 2 типов определяли методом титрования вируса, по его цитопатическому действию на клетки Vero В. Концентрацию вируса выражали в ТЦД sa/m Степень цитодеструкции клеток оценивали по 4-х крестовой шкале. При подсчёте титра учитывали ЦПД на 2 креста (++). Титр вируса подсчитывали по формуле Рида и Менча и выражали BlgTUZb/«*

Определение типоспецифичности ВГП штамм УС и штамм ВН.

Проводили реакцию вируснейтрализации ВГП в культуре перевиваемых клеток Vero В с типоспецифической кроличьей сывороткой. Учёт проводили по степени проявления цитодеструкции в клетках Vero В под действием ВГП штамм УС или штамм ВН по 4-х крестовой шкале. Учитывали ЦПД во

флаконах с нейтрализованным иммунными сыворотками вирусом и во флаконах с контрольными клетками Vero В - инфицированными ВГП. По разности титров ВГП в ТЦД 50/мл определяли индекс нейтрализации ВГП. Проведение иолимеразной цепной реакции.

Фрагменты гена UL30, кодирующие ДНК полимеразу ВГП 1 и 2 типов, апмлифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили в тонкостенных пробирках объемом 0,2 мл (Costar) на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия). Денатурацию проводили при температуре 95°С. Температура отжига праймера составляла 50-60°С. Процесс элонгации проходил при температуре 72°С. Детекция продуктов амплификации - электрофоретическим методом.

Электрофорез препаратов ДНК проводили в 1-2 % агарозном геле, с использованием агарозы NA фирмы Pharmacia, в 1х трис-ацетатном буфере (ТАЕ) следующего состава: 0.04М Трис-ацетат, 0,002М ЭДТА pH 8.0 с добавлением бромистого этидия (5 мкг/мп), при 5 В/см в течение 30 минут. Перед нанесением в гель к пробе добавляли 0,1 объем буфера, содержащего 50% глицерина и 0,1% бромфенолового синего. Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 или 360 нм. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.

Секвенирование проводили с помощью коммерческого набора BigDye Termination Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, США) согласно рекомендациям фирмы изготовителя. Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism® 3100 DNA sequencer (Applied Biosystem, США). Расшифрованную нуклеотидную последовательность анализировали с помощью пакета программ DNA Star. Метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Проводили по методике указанной в инструкции по применению на диагностические иммуноферментные тест-системы. Античеловеческий пероксидазный коньюгат заменяли на антикрысиный.

Учёт результатов ИФА - по показателю оптической плотности (ОП) проводили спектрофотометрически на приборе "Мультискан", при длине волны 450 нм.

Методы контроля вакцины против вируса герпеса простого.

Поводили по методикам изложенным в ГФ XI, в.1, МУК 4.1/4.2 588-96. Содержание бактериальных эндотоксинов (JIAJI - тест).

Количественное содержание бактериальных эндотоксинов в вакцине определяли при помощи гель-тромб теста. (Европейская фармакопея вып. 6, п. 2.6.14 бактериальные эндотоксины, ОФС 42-0002-00). Безопасность вакцины (отсутствие живого вируса).

Определяли методом двух последовательных пассажей на клетках Vero В вакцинного инактивированного деформалинизированного антигена ВГП типа 1 и типа 2, с последующим проведением двух последовательных пассажей на белых аутбредных мышах при внутримозговом введении в дозе 0,03 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 сут. Специфическая активность вакцины.

1) Определяли в РН по индексу нейтрализации ВГП 1 и 2 типов сыворотками крыс, иммунизированных вакциной «Витагерпавак» в культуре клеток Vero В.

2) По содержанию специфических антител (определяли титр антител методом ИФА) к ВГП 1 и 2 типов в сыворотках крыс иммунизированных вакциной «Витагерпавак».

Статистическая обработка полученных результатов.

Использовали методы вариационной статистики. Для определения достоверности различий между сравниваемыми величинами использовали t - критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение Получение рабочего банка клеток Vero В и его аттестация.

Рабочий банк клеток Vero В был получен из ампулы клеток посевного банка перевиваемых клеток Vero В НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН из лаборатории культур клеток (проф. Подчерняева Р.Я.).

Посевной банк клеток Vero В был аттестован ГИСК им. Л.А.Тарасевича (лаборатория трансфузионных инфекций и контаминантов зав. лаб. д.м.н. Шалунова Н.В.) и разрешен Комитетом МИБП МЗ РФ для использования при изготовлении вирусных вакцин в пределах 178-200 пассажей

На уровне 178 пассажа, нами была получена ампула клеток Vero В, проведена их реконсервация. В результате проведенных 7 последовательных пассажей (185 пассаж от исходного) нами был приготовлен рабочий (производственный) банк клеток Vero В.

Рабочий банк клеток Vero В был аттестован ГИСК им. Л.А.Тарасевича по показателям: культуральные свойства и морфология клеток Vero В, стерильность и отсутствие посторонних вирусов и микоплазм, после чего на рабочий банк клеток Vero В было получено разрешение от Комитета МИБП МЗ РФ для использования при изготовлении вирусных вакцин, в частности вакцины против герпеса простого, в пределах 185-200 пассажей. Адаптация ВГП X и 2 типов штамм ВН и штамм УС к культуре клеток Vero В, характеристика основных свойств штаммов после адаптации.

Для адаптации ВГП типа 1 (штамм УС) и ВГП типа 2 (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В было проведено 5 последовательных пассажей вируса на клетках Vero В, на каждом пассаже проверяли инфекционную активность вируса, (таблица 1)

Таблица 1

Инфекционная активность ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВН) в процессе адаптации к перевиваемой линии клеток Vero В.

№ пассажа Титры (ТЦЦ 5о/ш1)

Штамм УС Штамм ВН

I 3,7+0,02 3,5+ 0,03

II 5,7+0,02 4,5+ 0,16

III 6,3+ 0,03 5,7+ 0,02

IV 6,7+ 0,03 5,7+ 0,02

V 7,5+0,03 5,5+0,03

Примечание: Величина различий по Стьюденту не достоверна

На первом пассаже были получены низкие показатели инфекционной активности ВГП штамм УС и штамм ВН, для усиления активности вируса проводили последующие пассажи. На уровне 5 пассажа показатели инфекционной активности вируса возросли и составили для ВГП типа 1 (штамма УС) - 7,5 Ig ТЦД 5о/ш для ВГП типа 2 (штамма ВН) - 5,5 lg ТЦД 50/мл.

В дальнейшем была изучена типоспецифичность, адаптированного на протяжении 5 пассажей к клеткам Vero В, ВГП 1 и 2 типов. В реакции нейтрализации с типоспецифической кроличьей сывороткой были получены высокие показатели индексов нейтрализации ВГП для штамма ВН - 3,0, для штамма УС - 4,0.

Адаптация ВГП к перевиваемой линии клеток Vero В не изменила антигенных свойств вируса.

Полученные в виде культуральной жидкости ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВН) были розлиты во флаконы объемом 5,0 мл по 0,5 мл в каждый и лиофилизированы.

После лиофилизации была определена инфекционная активность ВГП (таблица 2). Лиофилизированный штаммовый запас ВГП хранится при температуре минус 70° С.

Таблица 2

Инфекционная активность ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВЫ) после лиофилизации (5 пассажей ВГП на перевиваемых клетках Vero В).

Ампула № Титры (ТЦЦ 50/мл)

ВГП типа - 1 (штамм УС) Среднее значение ВГП типа - 2 (штамм ВН) Среднее значение

№ 1 5,3 5,2+ 0,06 4,5 4,5+0,006

№2 5,0 4,5

№3 5,3 4,6

Примечание' Величина различий по Стъюденту не достоверна

Инфекционная активность ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВН) после лиофилизации несколько снизилась, однако была достаточной для проведения дальнейшей работы.

В процессе хранения штаммового запаса ВГП показатель инфекционной активности сохранялся в пределах исходных титров вируса (таблица 3).

Таблица 3

Стабильность штаммового запаса ВГП 1 (штамм УС) и ВГП 2 (штамм ВН) на разных сроках хранения.

Штаммы вируса Активность в ТЦД 50/мл после лиофилизации Активность в ТЦД 50/МЛ через 1 год хранения Активность в ТЦД 50/мл через 2 года хранения Активность в ТЦД 50/мл через 3 года хранения

УС 5,2+0,05 5,7+0,02 5,5+0,04 5,0+ 0,02

ВН 4,5+ 0,06 5,0+ 0,04 5,0+0,02 5,0+ 0,02

Примечание Величина различий на сроках хранения не достоверна Получение маточного и посевного запаса ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВН) на перевиваемой культуре клеток Vero В .

Согласно рекомендациям ВОЗ получение вирусной биомассы для вакцин должно быть основано на системе посевных линий.

Для этого из штаммового запаса получали магочный и посевной запас ВГП типа 1 (штамм УС) и ВГП типа 2 (штамм ВН).

Проводили последовательные пассажи ВГП типа 1 (штамм УС) и ВГП типа 2 (штамм ВН), на клетках Vero В. На каждом пассаже проверяли инфекционную активность, на уровне получения маточного и посевного запаса ВГП 1 и 2 типов определяли типоспецифичность (таблица 4).

Таблица 4

Инфекционная активность и типоспецифичность маточного и посевного запаса

ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВН) на перевиваемой культуре клеток Vero В.

ВГП Пассаж от Шт. УС Шт. ВН Типоспецифичность

штаммового

запаса Шт. УС Шт. ВН

Маточный I 5,0 4,5

запас II 6,5 6,0

III 6,5 5,5 3,0 3,5

Посевной IV 6,5 5,5 4,0 4,8

запас

При увеличении уровня пассажа вируса герпеса на клетках Vero В возрастала его активность.

Таким образом: Адаптация штаммов ВГП к культуре перевиваемых клеток Vero В была проведена с помощью пассирования ВГП на этой культуре клеток. На уровне 5-го пассажа на клетках Vero В был получен специфически активный штаммовый запас вирусов, стабильно сохранявший свою активность в течение нескольких лет. При дальнейшем пассированшш на клетках Vero В были получены маточный запас вирусов (на уровне 3-го пассажа) и посевной (1 пассаж от маточного запаса) с выраженной активностью и специфичностью. Изучение штаммов ВПГ 1 и 2 типов методами ПЦР-аналнза и сиквенса -определение возможных изменений в геноме вируса после адаптации.

Совместно с сотрудниками Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, лаборатория молекулярной биотехнологии, под руководством д.м.н., проф. М.М.Гараева, были исследованы варианты ВГП типа 1 (шт. УС) и

типа 2 (шт. ВН) которые прошли 22-26 пассажей на культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) - первичные штаммы и штаммы ВГП после адаптации к клеткам Vero В. Проводили исследования ПЦР анализом с последующим сиквенсом продуктов амплификации.

Из изучаемых штаммов вирусов была выделена ДНК и использована для амплификации фрагмента гена UL30, кодирующего вирусную полимеразу, с координатами 734 - 941 аминокислотный остаток для ВГП типа 1 и 760 - 890 для ВГП типа 2.

Анализ полученных последовательностей позволил отнести фрагменты генов полимеразы штамма УС к ВГП типа 1, а ВН к штамму ВГП типа 2. Сопоставление полученных последовательностей вирусов с последовательностями ВГП из базы данных GenBank позволил установить, что наиболее гомологичными для штамма УС является штамм ВГП-1 Ас№ АВ231455, (Suzuki,М., Kobayashi,N., Takahash¡,K et al., 2003), для штамма ВН -последовательность штамма ВГП-2, KN 53690 Ас№ AY038367, (Chibo,D., Mijch,A., Doherty,R. et al., 2002).

Необходимо отметить, что штаммы адаптированные к линии клеток Vero В имели меньше отличий от депонированных последовательностей референс - штаммов Ас№ АВ231455 Ас№ AY038367, чем исходные штаммы культивированные на ФЭК.

Сопоставление последовательностей штаммов ВГП УС/ФЭК и УС/VeroB позволило обнаружить 3 замены нуклеотидов, из которых 2 привели к замене аминокислот в позициях F737L, G928C. В случае штаммов ВГП ВН/ФЭК и BH/VeroB было отмечено 6 нуклеотидных замен из которых 2 были значимы и привели к замене аминокислот в позициях P765R, G855A. Высокий уровень значимых замен нуклеотидов, по-видимому, может быть связан с процессами адаптации вируса к клеткам Vero В.

Модернизация технологии, получение и аттестация серий вакцины,

применение ИФА для оценки специфической активности вакцины.

Для изготовления вакцины герпетической использовали перевиваемые клетки Vero В из рабочего банка, которые в результате пассирования (5-7 пассажей) накапливали, проводили контроль на стерильность и отсутствие микоплазм, перед внесением ВГП освобождали от БСА (бычьего сывороточного альбумина), а затем инфицировали ВГП штамм УС или штамм ВН (посевной запас). После проявления ЦПД вируса: для штамма УС - 18-24 часа, для штамма ВН - 36-38 часов, флаконы с вируссодержащсй жидкостью замораживали, затем оттаивали, определяли инфекционную активность ВГП 1 и 2 типов. Затем проводили инактивацию вируса формалином с последующей деформалинизацией. Полученный материал контролировали на отсутствие живого ВГП. Инактивированные антигенсодержащие культуральные жидкости объединяли, разливали во флаконы по 0,3 мл и лиофилизировали.

Таким образом, было приготовлено 19 серий вакцины герпетической «Витагерпавак», качество вакцины определяли в соответствии с требованиями проекта ФСП на эту вакцину.

В соответствии с требованиями ВОЗ к клеточным субстратам гетероплоидного происхождения, особое внимание уделяли содержанию ДНК субстрата (клеток Vero В) и содержанию БСА в готовом препарате. Проводили контроль серий вакцины по показателю «Специфическая активность»

Для большинства инфекций в основе которых лежит клеточный иммунитет, защитные уровни клеточных реакций при формировании поствакцинального иммунитета не установлены.

Поэтому активность вакцины герпетической определяли в опытах на животных по степени выработки специфических антител после трехкратной иммунизации антигенсодержащей вакциной белых крыс (для исследований была использована методика определения специфической активности вакцины герпетической «Герповакс» производства ФГУП СПбНИИВС).

Сыворотки крыс, иммунизированных вакциной «Витагерпавак», исследовали на наличие вирусспецифичсских антител в РН на клетках Vero В. Степень нейтрализации ВГП 1, (штамм УС) и ВГП 2, (штамм ВН) специфическими антителами содержащимися в сыворотках крыс иммунизированных вакциной выражали как ИН (таблица 5).

Таблица 5

Специфическая активность вакцины герпетической культуральной

инактивированной сухой "Витагерпавак".

Вакцина "Витагерпавак" Серия № Индекс нейтрализации

Специфическая активность для штамма УС Специфическая активность для штамма ВН

17 2,7 2,25

18 2,7 2,25

19 2,5 1,75

20 2,5 2,0

21 2,5 2,0

22 2,0 1,5

23 2,0 1,5

24 2,0 1,5

25 2,75 2,0

26 4,0 3,0

27 2,0 2,0

Средний показатель 2,5 1,98

Определение специфической активности вакцин герпетических методом ИФА

Проведены исследования по изучению возможности использования метода ИФА для определения концентрации антител к ВГП в сыворотках иммунизированных герпетической вакциной крыс.

Исследования проводили с использованием иммуноферментных тест-систем: «Векто ВПГ-^О-стрип», «Векто ВПГ-2-^С», «ДС-ИФА АНТИ ВПГ 1,2-С» . Для титрования крысиных сывороток в наборах тест-систем заменяли античеловеческий пероксидазный конъюгат на антикрысиный конъюгат.

В иммуноферментных тест-системах проводили шахматное титрование не иммунных (контрольных) и иммунных сывороток крыс и антикрысиного псроксидазного конъюгата в различных концентрациях для определения рабочей дозы конъюгата. (таблица 6)

Таблица 6

Определение оптимальной дозы коньюгата с использованием различных

иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВГП.

Тест- Разведения Разведения Контрольная Иммунные ОП

система а/крыс сывороток крыс. крысиные крит.

коньюгата сыворотка сыворотки вакцина

Витагерпавак

сер.26

Средний Средний

показатель показатель ОП

ОП

Векто 1:10000 1:100 0.122 1.697

ВИГ-Ig- 1:200 0.049 1.352 0,128

стрип 1:400 0 037 1.049

1:800 0.035 0.771

1:1600 0.029 0.509

1:3200 0.013 0.279

1:15000 1:100 0.055 0.912

1:200 0.033 0.737

1:400 0.022 0.618

1:800 0.019 0.448

1:1600 0.018 0.308

1:3200 0.014 0.197

1:20000 1:100 0.067 0.814

1:200 0.049 0.618

1:400 0.026 0.456

1:800 0.019 0.319

1:1600 0.017 0.197

1:3200 0.010 0.118

Векто 1:15000 1:100 0.011 0.464 0,280

ВПГ-2- 1:200 0.012 0.334

IgG 1:400 0 001 0.212

1:20000 1:100 0.011 0.417

1:200 0.012 0.270

1:400 0.001 0.163

Отработана рабочая доза антикрыснного коньюгата в разведении 1:15000-1:20000

Установлено, что наиболее чувствительной для выявления антител к вирусу герпеса простого в сыворотках крыс иммунизированных вакциной герпетической - является тест-система «ВектоВПГ-^С-стрип», содержащая в иммуносорбснте нативные вирусные антигены ВПГ-1 и ВПГ-2. Важно подчеркнуть, что для получения иммунорсорбента использованы другие штаммы ВПГ-1 или ВПГ-2.

В тест-системе "Векто ВПГ-2-^С' на основе рекомбинантного белка выявлены более низкие показатели ОП при титровании сывороток крыс иммунизированных вакциной герпетической. В тест-системе 'ДС-ИФА АНТИ ВПГ 1,2-С' на основе рекомбинантных белков ВГП 1 и 2 типов не выявлено динамики изменения ОП при титровании сыворотки крыс.

Определение методом ИФА концентрации антител (титр антител) к вирусу герпеса простого в сыворотках крыс иммунизированных различными сериями герпетических вакцин «Витагерпавак» и «Герповакс».

Использовали сыворотки крыс полученные при иммунизации различными сериями вакцины «Герповакс», «Витагерпавак». Исследование проводили с использованием тест-системы иммуноферментной «Векто ВПГ-^О-стрип» (таблица 7)

Таблица 7

Содержание антител к вирусу герпеса простого (сравнительный анализ вируснейтрализуютцих антител в РН и титров антител в ИФА) в

сыворотках крыс иммунизированных герпетическими вакцинами.

Вакцина № Специф. Специф. Титр сывороток

сер. актив. актив. и показатели ОП

вакцин вакцин. в ИФА

по ИН по ИН (ВектоВПГ-Ig G-

ВПГ-1 ВПГ-2 стрип)

(штамм УС) (штамм ВН)

«Витагрпавак» 25 2,75 2,0 1:400 (0,187)*

26 4,0 3,0 1:1600-1:3200 (0,186)*

27 2,0 2,0 1:400 (0,237)*

04 2,25 2,0 1:800 (0,130)***

05 2,5 2,0 1:1600 (0,207)***

06 2,0 2,5 1:1600 (0,233) ***

07 2,5 1,75 1:1600 (0,505)****

08 2,5 1,75 1:1600 (0,688)****

09 4,0 3,5 1:3200-1:6400 (0,530)****

«Герповакс» 85 2,0 1,5 1:400 (0,124)**

87 2,0 1,5 1:800 (0,140) **

88 2,0 2,0 1:400 (0,197)***

90 2,5 1,5 1:400 (0,190)***

* ОПкрит =0,180, разведение коньюгата ф. Sigma 1:20000 ** ОПкрит = 0,112, разведение коньюгата ф. Sigma 1:20000 *** ОПкрит = 0,123, разведение коньюгата ф. Sigma 1:15000

**** ОПкрит = 0,119, разведение коньюгата ф. Sigma 1:15000

При высоких показателях ИН - более 2,0 - для штамма УС и более 1,5 - для штамма ВН в ИФА определяли титр иммунных сывороток крыс - показатель

титра составляет ог 1:1600 до 1:6400, при ИН равном, установленным в соответствии с ФСП на вакцины - минимальным показателем 2,0 - для штамма УС и 1,5 - для штамма ВН - титр сывороток не превышает 1:400.

Показано, что значения титров специфических антител в ИФА сопоставимы с показателями ИН вируснейтрализующих антител, в то же время значения титров антител в ИФА позволяют более чётко дифференцировать различные серии герпетической вакцины по показателю «Специфическая активность».

Результаты сравнительных клинических испытаний отечественных вакцин против герпеса простого 1 и 2 типов.

Клинические испытания проводились в соответствии с «Программой Государственных клинических испытаний лекарственного препарата «Витагерпавак» вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой для внутрикожного введения», которая была разработана нами и согласована с ГИСК им. Л.А. Тарасевича, утверждена «Этическим комитетом» и Департаментом Государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ.

Целью исследований было в клинических условиях изучить и подтвердить переносимость, безопасность и эффективность вакцины «Витагерпавак» в сравнении с вакциной «Герповакс», при применении у больных с хронической рецидивирующей герпетической инфекцией в стадии ремиссии с целью профилактики рецидивов заболевания.

Испытания проводились на базе клиники кафедры кожных и венерических болезней Медицинского факультета Российского Университета Дружбы народов.

Критерии включения были определены нами в Программе клинических испытаний по следующим показателям:

1. Больные с достоверно установленным диагнозом хронической часто рецидивирующей герпетической инфекцией кожной или гениталыюй формами в стадии ремиссии, не ранее, чем через 5 дней после полного исчезновения клинических проявлений герпетической инфекции.

2. Длительность заболевания с момента установления диагноза не менее 6 мес.

3. Частота рецидивов - через 1-3 месяца.

4. Возраст - от 18 до 55 лет.

Таблица 8

Структура и характеристика продолжительности заболевания в группах больных герпетической инфекцией иммунизированных

вакцинами против ВГП типов 1 и 2.

Клинические формы и параметры заболевания Больные, получавшие препарат "Герповакс" (группа 1) Больные, получавшие препарат "Витагерпавак" (группа 2)

Генитальная форма 22 17

Кожная форма 8 13

Давность заболевания (в среднем) 3-7 лет 5-8 лет

Частота рецидивов в год (в среднем) 4-6 в год 4-5 в год

Продолжительность рецидива (в среднем) 7 сут 8 сут

Вакцины больным водили в соответствии с инструкциями по применению. Пациенты до начала вакцинации, в процессе прививок, через 10 дней и 6 мес. после завершения вакцинации находились под наблюдением врачей. В период проведения вакцинотерапии оценивали:

1. Субъективные жалобы больного (зуд, жжение, болевые ощущения в местах инъекций, недомогание, головная боль);

2. Объективные данные — признаки развития аллергических реакций (местные и температурные реакции);

3. Появление отклонений от нормы в функционировании внутренних органов и систем больного в результате возможного токсичного влияния препарата.

Результаты клинических наблюдений вносили в индивидуальную карту каждого больного.

Состояние пациентов оценивали по появлению общих и местных реакций на вакцинацию, по изменению интенсивности течения клинических признаков рецидивирующей герпетической инфекции, по частоте рецидивов, длительности ремиссий.

По завершению вакцинотерапии и клинических наблюдений было установлено, что внутрикожное введение вакцины "Витагерпавак", так же как и вакцины "Герповакс" не вызывало каких-либо выраженных общих или местных реакций. Больные переносили лечение хорошо, субъективных жалоб на выраженный зуд, жжение в местах инъекций, общее недомогание, головную боль после инъекций не предъявляли. Не было выявлено каких-либо реакций, которые можно было бы отнести к токсическим или неблагоприятным побочным эффектам.

После вакцинотерапии при дальнейшем наблюдении в период, равный 6 месяцам от начала вакцинации, у большинства пациентов отмечалось отсутствие клинических объективных и субъективных проявлений рецидивов герпетической инфекции: зуд, жжение, сгруппированные везикулы на эритематозном фоне.

По результатам сравнительного анализа исходных данных и результатов исследования, по частоте и характеру рецидивов у больных, длительности ремиссии, средней продолжительности предшествующих рецидивов у больных, принимавших участие в данном исследовании, было отмечено увеличение периода длительности ремиссии после вакцинации, а также уменьшении длительности рецидивов (таблица 9).

Таблица 9

Длительность ремиссии и динамика клинических показателей после вакцинации вакцинами "Герповакс" и "Витагерпавак".

Вакцина Длительность ремиссии > 6 мес. (% от общего количества больных в группе) Ремиссия >6 мес. кожная форма генитальная форма Длительность рецидива после вакцинотерапии

«Герповакс» 56% 4 (50%) 13 (59%) 3-4 дня

«Витагерпавак» 63% 8 (61%) 11 (64%) 2-3 дня

Пациенты с зарегистрированными эпизодами новых обострений на фоне вакцинации и после нее были выделены в отдельную группу, в которой изучали клинические характеристики новых рецидивов заболевания, (табл. 10)

Таблица 10

Рецидивы возникшие в группах на фоне вакцинации вакцинами «Герповакс» и «Витагерпавак» и после неё.

Вакцина Рецидивы заболеваения (% от общего количества больных в группе) Рецидивы Кожная форма Рецидивы Генитальная форма

«Герповакс» 44% 4 (50%) 9 (41%)

«Витагерпавак» 37% 5 (39%) 6 (36%)

Было отмечено, что обострения герпетической инфекции после вакцинации носили слабо выраженный, по сравнению с обычной клинической картиной характер, а именно: наблюдалось уменьшение средней продолжительности рецидива заболевания, значительное снижение или исчезновение субъективного симптомокомплекса (зуд, жжение, боль, лихорадка и т. д.), полная или частичная элиминация продромального периода.

Таким образом, разработанная нами вакцина «Витагерпавак» с использованием нового субстрата перевиваемой линии клеток Vero В прошла доклинические, клинические испытания, по всем показателям соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным препаратам, хорошо переносится больными и по своей специфической активности (иммуногенности) не уступает герпетической вакцине, производимой на первичнотрипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона.

На вакцину оформлена и утверждена Фармакопейная статья и на производстве ЗАО «ФИРМА»ВИТАФАРМА» начато её серийное производство.

ВЫВОДЫ:

1. Проведено изучение морфологических и репродуктивных особенностей перевиваемой линии клеток почек африканской зеленой мартышки Vero В, с целью определения возможностей накопления вирусной биомассы для производства культуралыгай герпетической вакцины. Впервые нами получен и аттестован Национальным органом контроля МИБП, ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, рабочий банк клеток Vero В для производства инактивированной вакцины против герпеса простого.

2. Проведена адаптация производственных штаммов вируса герпеса простого типа 1 (штамм УС) и типа 2 (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В. Показано, что вышеуказанные штаммы после 5 серийных пассажей в культуре клеток Vero В не изменили своих биологических свойств и специфичности, при этом получены значения титров инфекционной активности вируса (в ТЦЦ 50/„„) для адаптированных штаммов на 1,5 - 2,0 lg выше по сравнению с титрами при культивировании в культуре клеток куриного эмбриона.

3. Впервые, совместно, на базе лаборатории молекулярной биотехнологии ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского проведено сравнительное изучение методом ПЦР-амплификации и анализа нуклеотидных последовательностей ВГП типа 1 (штамм УС) и типа 2 (штамм ВН) до и после адаптации к перевиваемой линии клеток Vero В, полученные нуклеотидные последовательности депонированы в GenBank EU 939311.

Показано наличие нуклеотидных и аминокислотных замен, что возможно, отражается в более высокой инфекционной активности ВГП 1 и 2 типов в культуре клеток Vero В.

4. Разработана и аттестована система посевных серий ведения производственных штаммов, технология производства и контроля вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой на новом субстрате -перевиваемой линии клеток Vero В. При разработке системы контроля модифицирована и предложена методика оценки «Специфической активности» вакцины с применением ИФА.

5. В сравнительных шифрованных клинических испытаниях при вакцинотерапии различных форм рецидивирующего хронического герпеса была подтверждена хорошая переносимость, безопасность и эффективность вакцины герпетической полученной на клетках Vero В не уступающие таковым при вакцинотерапии герпетической культуральной инактивированной вакцине «Герповакс».

6. На основании комплекса проведенных исследований организовано производство вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой «Витагерпавак» на предприятии ЗАО «ФНРМА»ВИТАФАРМА», на вакцину утверждены: ФСП 42-0107-4707-03, Инструкция но применению, выдано Регистрационное удое говерение № 003193/01.

Список работ, опубликованных по теме диссерт ашш.

1) Баринский И.Ф., Лазаренко А А., Алимбарова Л Н., Бархалева O.A. Терапевтическая инактивированная формалином вакцина против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов как средство профилактики рецидивов заболевания при хронической герпетической инфекции.// Мат. Конгресса эпидемиология, микробиология, паразитология. Молдова 2003.

2) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. Вакцинотерапия герпесвирусных инфекций. Результаты клинических испытаний переносимости и эффективности применения лечебных вакцин отечественного производства против вируса герпеса простого. //Сибирский медицинский журнал. Т. 19 2/2004.

3) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Баринский И.Ф. Применение метода иммуноферментного анализа для оценки специфической активности вакцины против герпеса простого 1 и 2 типов. // Тезисы первой Всероссийской конференции по вакцинологии. Москва 2004.

4) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Хорошева Т.В. Сравнительные клинические испытания отечественных лечебных вакцин против вируса герпеса простого.// Эпидемиология и вакцинопрофилактика 2/2006.

5) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. Совершенствование метода оценки специфической активности инактивированной культуральной

вакцины против герпеса простогоУ/Тсчисы Всероссийской конференции по вакцинологии. Москва 2006.

6) Баринский И.Ф., Лазаренко A.A., Подчерняева Р.Я., Бархалева O.A., Зайцев A.B. Культура перевиваемых клеток почек африканской зеленой мартышки Vero В как субстрат для производства вакцины против вирусов герпеса 1 и 2 типов.//Материалы всероссийской научной конференции. Сочи-Адлер 2006.

7) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Баринский И.Ф. «Витагерпавак» - новая отечественная вакцина для профилактики рецидивов и лечения заболеваний, вызываемых вирусами герпеса простого.// Тезисы Всероссийской научной конференции. Санкт-Петербург 2008.

8) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Ладыженская И.П. Современные подходы лабораторной оценки специфической активности вакцин против вируса герпеса простого 1 и 2 типов. // Тезисы Всероссийской научной конференции. Санкт-Петербург 2008.

9) Бархалева O.A., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Подчерняева Р.Я., Баринский И.Ф. «Витагерпавак»- вакцина на перевиваемой линии клеток Vero В - препарат для профилактики рецидивов заболеваний вызываемых ВГП 1 и 2 типов Л Тезисы Всероссийской конференции по вакцинологии. Москва 2008.

10) Гафарова И.Э., Гараев М.М., Бархалева O.A., Воробьева М.С. Сравнительный анализ фрагментов гена UL30, кодирующего ДНК полимеразу у вариантов вируса герпеса простого (ВГП), адаптированных к клеткам Vero В и фибробластам эмбрионов кур. // Тезисы Всероссийской конференции по вакцинологии. Москва 2008.

Подписано в печать 06 11 2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1100 Тираж: ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бархалёва, Оксана Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Инфекции вызываемые вирусами герпеса простого.

1.2. Вакцины вирусные, профилактические и лечебные.

1.3.Стандартизация и методы контроля качества вирусных вакцин

Глава II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

3. Результаты исследования и обсуждение.

3.1. Получение рабочего банка клеток Vero В и его аттестация.

3.2. Восстановление культуры клеток Vero В после криоконсервации.

3.3. Адаптация ВГП типа 1 (штамм УС), ВГП типа 2 (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В, получение штамм, запаса.

3.4. Исследование нуклеотидной последовательности ВГП типа 1 (шт. УС) и типа 2 (шт. ВН) ПЦР анализом с последующим сиквенсом продуктов амплификации.

3.5. Получение маточного и посевного запаса ВГП типа 1 (шт. УС) и типа 2 (шт. ВН) на перевиваемой культуре клеток Vero В.

3.6. Разработка технологии получения и контроль вакцины против вируса герпеса на перевиваемой линии клеток Vero В.

3.6.1. Определение содержания ДНК клеточного субстрата в герпетической вакцине.

3.6.2. Изучение специфической активности вакцины «Витагерпавак».

3.6.3. Определение специфической активности вакцин герпетических методом ИФА.

3.7. Сравнительное лабораторное изучение вакцин герпетических, полученных на разных клеточных субстратах.

3.7.1. Биохимические показатели качества вакцин.

3.7.2. Специфическая активность вакцин.

3.7.3. Содержание бактериальных эндотоксинов.

3.8. Сравнительное клиническое изучение вакцин против вируса герпеса простого.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация производства вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой, на новом клеточном субстрате перевиваемой линии клеток Vero B."

Актуальность проблемы.

В последние годы в инфекционной патологии все большее значение приобретают заболевания, вызываемые вирусами герпеса простого (от греч. ЬегреБ — ползучий). Внимание, которое вирусологи и клиницисты проявляют к герпес-вирусным заболеваниям человека, связано с значительной ролью ВГП в патологии человека и социальной значимостью в современном мире. Среди вирусных инфекций герпес-вирусные инфекции занимают одно из ведущих мест в силу повсеместного распространения, различных путей передачи этих вирусов, многообразия клинических проявлений заболевания, хронического латентного течения с периодическими рецидивами инфекции (9, 12, 93).

Герпес-вирусные инфекции входят в число наиболее распространенных и плохо контролируемых инфекций человека. Вирусы герпеса могут длительно, без клинических проявлений, циркулировать в организме человека с нормальной иммунной системой, но у людей с нарушениями иммунитета могут вызывать тяжелые заболевания, иногда со смертельным исходом.(14)

Хроническая рецидивирующая герпетическая инфекция, обусловленная вирусами простого герпеса 1 и 2 типов - это пожизненная персистенция вируса, как правило, в нервных ганглиях с периодическими обострениями клинических проявлений с локализацией, постоянной для каждого больного (глаза, слизистая ротовой полости, гениталий, кожа).(1, 8, 14)

Свыше 90% людей земного шара инфицированы вирусом герпеса простого и до 20% из них имеют те или иные клинические проявления инфекции. В России число госпитализированных с различными формами герпетической болезни превышает 2,5 млн. человек в год. В США, где в отличие от нашей страны, осуществляется регистрация больных герпетической инфекцией, зарегистрировано 20 млн. человек с герпесом гениталий.(12, 14)

Сероэпидемиологические исследования показывают, что более 95% взрослого населения имеют антитела к вирусу герпеса простого 1 или 2 типов и выявляют стойкую тенденцию к росту числа инфицированных. Так, количество носителей только ВГП типа 2 за последние 10 лет увеличилось примерно на 30 % .

По данным ВОЗ, смертность от герпетической инфекции среди вирусных заболеваний находится на втором месте (15,8%) после гриппа (35,8%). Общее число больных генитальным герпесом в РФ составляет около 8 млн.(14)

Все более возрастающий интерес к проблеме простого герпеса (ПГ) связан с крайне выраженным полиморфизмом заболевания - от ограниченных поражений кожи, слизистых глаз до системных, генерализованных форм с вовлечением в вирусный процесс жизненно важных внутренних органов, а также развитием на фоне хронической персистенции ВГП бесплодия, не вынашивания плода, новообразований и т.д. (41).

Герпесвирусы персистируют в нервных клетках (ганглиях), нарушая деятельность как вегетативной, так и ЦНС. Среди энцефалитов вирусной этиологии менингоэнцефалит, обусловленный ВГП, занимает по частоте первое место в Европе, обуславливает высокую смертность (80%). (13, 34).

Таким образом герпес-вирусная инфекция создает комплекс проблем медицинского, психологического и социального характера.

В связи с этим в настоящее время все большее распространение получает термин "герпетическая болезнь", который как нельзя лучше отражает системный характер негативного действия ВГП на организм в целом.

По прогнозам Всемирного банка информации, проблема герпетической инфекции на ближайшее будущее определяется как "глобальная проблема человечества", что обусловливает необходимость всестороннего изучения герпетической инфекции и разработки эффективных методов профилактики и лечения разнообразных форм этой инфекции.

Одним из путей лечения этого заболевания является вакцинотерапия, история которой насчитывает более 50 лет. Эта история складывалась из самых различных направлений и подходов к разработке технологий создания и методов применения герпетических вакцин. Фактически, история развития методов культивирования тканей и клеток животных или человека отражалась на истории развития и совершенствования герпетических вакцин.

В России первая культуральная вакцина против герпеса простого 1 и 2 типов была разработана на первично-трипсинизированной культуре клеток куриного эмбриона в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН группой авторов под руководством профессора А.К.Шубладзе и профессора И.Ф.Баринского, ими же была разработана и оригинальная схема применения вакцины с использованием внутрикожного метода введения вакцины. Многолетние наблюдения при вакцинотерапии этим препаратом большого количества больных с различными формами рецидивирующей герпетической инфекции показали выраженную лечебную эффективность и безопасность применения этого препарата. (10, 45)

Современный уровень развития вирусологии и методологии создания и ведения культур клеток различного происхождения создает серьезные предпосылки оптимизации и стандартизации технологий получения вирусных вакцин, в том числе и вакцины против вируса герпеса простого, с использованием в качестве субстрата для накопления вируса диплоидных и гетероплоидных линий клеток животных и человека.

Данные клеточные культуры обладают значительными преимуществами перед первично-трипсинизированными культурами клеток животных и человека, т.к. могут быть тщательно изучены по всем параметрам и в первую очередь на отсутствие различных контаминирующих агентов, в том числе и онкогенных (18, 25, 26).

ВОЗ в процессе отбора и изучения различных гетероплоидных клеточных линий рекомендовала для производства вирусных вакцин - клетки Vero (культура клеток почек африканской зеленой мартышки).

В России эта линия клеток аттестована как перевиваемая линия клеток Vero В для производства вирусных вакцин, однако вакцина против герпеса простого 1 и 2 типов - «ВИТАГЕРПАВАК» является, первой для производства которой были использованы клетки Vero В.

В связи с этим, перед нами была поставлена цель: научно обосновать, оптимизировать и стандартизировать технологию получения инактивированной культуральной вакцины против герпеса простого 1 и 2 типов при использовании нового субстрата - перевиваемой линии клеток Vero В, а так же разработать метод контроля специфической активности вакцины с применением иммуноферментного анализа (ИФА). Для выполнения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:

2. Создать и аттестовать рабочий банк культуры клеток Vero В;

3. Провести адаптацию ВГП типа 1 (штамм УС) и ВГП типа 2 (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В, изучить инфекционную активность и специфичность (подлинность) штаммов ВГП после адаптации к новому субстрату, создать банк и систему посевных серий (штаммовый запас, маточный вирус, посевной вирус) для воспроизводства на новом субстрате штаммов ВГП 1 и 2 типов, а так же определить возможность использования их при производстве вакцины;

5. Методоми ГЩР-амплификации и анализа нуклеотидных последовательностей определить отсутствие значимых изменений в геномах ВГП 1 и 2 типов после адаптации вирусов к перевиваемым клеткам Vero В;

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

В шифрованных сравнительных клинических испытаниях подтверждена хорошая переносимость, безопасность и лечебная эффективность вакцины «Витагерпавак», приготовленной на новом клеточном субстрате - клетках Vero В, не уступающая таковой вакцине, полученной на первично-трипсинизированных клетках куриного эмбриона.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА.

Работа выполнена на базе ЗАО «ФИРМА«ВИТАФАРМА» и в лаборатории арбовирусных инфекций, риккетсиозов и ВИЧ-инфекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича при непосредственном участии автора диссертации: создание рабочего банка клеток Vero В, адаптация штаммов ВГП типа 1 (шт. УС) и типа 2 (шт. ВН) к культуре клеток Vero В, получение вирусной биомассы и серий вакцины. Формирование "Программы клинических испытаний", подготовка серий вакцины к клиническим испытаниям. Модификация метода определения специфической активности вакцины с использованием метода ИФА. Исследования нуклеотидной последовательности ВГП типа 1 шт. УС) и типа 2 (шт. ВН) ПЦР анализом с последующим сиквенсом продуктов амплификации, проводились совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под руководством д.б.н., профессора М.М.Гараева.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создание рабочего банка культуры клеток Vero В.

4. Модернизация технологии, получение и аттестация серий вакцины, ' разработка и применение метода ИФА для оценки специфической активности вакцины.

Публикации: По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объём диссертационной работы.

Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста. Состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы и собственных исследований которые включают разделы: материалы и методы и результаты исследований и обсуждение, выводов и указателя литературы, состоящего из 162 работ, из них 97 отечественных и 65 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Бархалёва, Оксана Александровна

ВЫВОДЫ:

1. Проведено изучение морфологических и репродуктивных особенностей перевиваемой линии клеток Vero В (культура клеток почек африканской зеленой мартышки) с целью определения возможностей накопления вирусной биомассы для производства культуральной герпетической вакцины. Впервые получен и аттестован Национальным органом контроля ГИСК им Л.А.Тарасевича рабочий банк клеток Vero В.

2. Впервые проведена адаптация производственных штаммов вируса герпеса простого типа 1 (штамм УС) и типа 2 (штамм ВН) к перевиваемой линии клеток Vero В.

Показано, что вышеуказанные штаммы после 5 серийных пассажей в культуре клеток Vero В не изменили своих биологических свойств и специфичности, при этом получены значения титров инфекционной активности вируса (в ТЦД so/мл) для адаптированных штаммов на 1,5 - 2,0 lg выше по сравнению с титрами при культивировании в культуре клеток куриного эмбриона.

Показано наличие нуклеотидных и аминокислотных замен, что возможно, отражается в антигенных различиях штаммов ВПГ типа 1 и ВПГ типа 2 и более высокой инфекционной активности в культуре клеток Vero В.

110 модифицирована и упрощена методика оценки «Специфической активности» вакцины с применением ИФА.

6. На основании комплекса проведенных исследований организовано производство вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой «Витагерпавак» на предприятии ЗАО «ФИРМА»ВИТАФАРМА», на вакцину утверждены: ФСП 42-0107-4707-03, Инструкция по применению, выдано Регистрационное удостоверение № 003193/01.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бархалёва, Оксана Александровна, Москва

1. Абазова Ф.И., Безух С.М., Борисенко К.К., и др. Неизвестная эпидемия: герпес (патогенез, диагностика, клиника, лечение). // Смоленск: Фармаграфикс. 1997.

2. Акимов Г.А., Лобзин B.C., Иовлев В.И. и др. Пояснично-крестцовые радикулоганглионевриты герпетической этиологии // В кн.: Актуальные вопросы невропатологии и нейрохирургии.- М.-1976.-С. 139-141

3. Акимов Г.А., Лобзин B.C., Михайленко A.A. Клинические синдромы герпетических поражений периферической нервной системы // В кн.: Периферическая нервная система. М.-1980.-вып.З.-С. 102-106

4. Алкеева А.Б. Особенности иммунных нарушений при рецидивирующей вирусной инфекции Herpes Simplex и сравнительная оценка эффективности различных методов терапии // Автореф. дисс. канд. мед. наук.-М.-1992.-26 С.

5. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Андреева О.Т. и др. Дислипедимия, повышенное содержание в клетках липидов при экспериментальной герпетической инфекции и их коррекция антивирусными химиопрепаратами // Вопр. вирусол. 1979.-№4- С.61-64.

6. Амосенко, Свиткин Ю.В., Попова В.Д. и др. Эффективная очистка препаратов полиомиелитных вакцин от субстратной ДНК. // Вопросы вирусологии 1991, №1, С.71-73.

7. Бабаянц A.A., Гутман Н.Р., Хесин Я.В. и др. Экспериментальная миокардиопатия, вызванная вирусом герпеса // Вопр. вирусол. 1979.-№4- С. 363-368.

8. Банченко Г.В., Терехова Н.В., Филоненко О.Ф. Вирусные заболевания слизистой оболочки полости рта (клиника, диагностика, лечение и профилактика) // Метод, реком. М. - 1986. - 12 С.

9. Баринский И.Ф. // Общая и частная вирусология. М. 01982. -Т.2. -с. 375-412.

10. Баринский И.Ф., Карпович Л.Г., Губанова Е.И. и др. Механизм лечебного эффекта герпетической поливакцины при хроническом офтальмогерпесе и герпесе гениталий.// Вопросы вирусологии. 2000,С.30-33.

11. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров A.A., Гребенюк Н.В. Герпес. Этиология, диагностика, лечение // М. 1986. - 272 С.

12. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных нейроинфекций // М. 1984. - 219 С.

13. Баринский И.Ф. Герпесвирусные инфекции иммунодефицитные заболевания XXI.// Сборник «Актуальные проблемы герпесвирусных инфекций», под редакц. Д.К.Львова и др., М.- 2004, - С. 5-7.

14. Белокриницкий Д.В., Карпович Л.Г., Баринский И.Ф. и др. Некоторые показатели иммунного статуса больных рецидивирующим герпесом при лечении герпетической вакциной // Вопр. вирусол. 1^87. - №2 -С. 229-233.

15. Бикбулатов P.M., Димидова С.А., Белкокина С.И. и др. Факторы гуморального иммунитета в патогенезе рецидивирующей хронической герпетической инфекции // Вопр. вирусол. 1982. №3.- С. 323-327.

16. Бочаров А.Ф., Кицак В.Я., Бочаров Е.Ф. и др. Вирус простого герпеса // Новосибирск. 1982. С. - 128-133.

17. Бочкова Н.Г., Погодина В.В., Левина Л.С.и др. Получение экспериментальных серий вакцин и диагоностикума японского энцефалита с использованием перевиваемой линии клеток почек эмбриона овцы 4184.// Биотехнология, 2003. №2.,С 54-58.

18. Виноградова Т.Ф., Земскова З.С., Мергембаев Х.С. Клинико-морфологические параллели при остром герпетическом стоматите у детей // Стоматология. 1975. №4. -С. 59-63.

19. Гаврилов В.И. Перививаемые клетки в вирусологии.//М., 1964,268 С.

20. Гайдамович С .Я. Общие сведения о лабораторной диагностике вирусных инфекций // Общая и частная вирусология под редакцией В.М.Жданова и С.Я.Гайдамович. М. - 1982. - Т.1. - С. 437-463.

21. Галегов Г.А. Биохимия вирусов и прогресс теории и практики химиотерапии вирусных инфекций // В кн.: Вопросы общей вирусологии. М. 1971. - ч.1. - С. 16-18.

22. Галегов Г.А., Кухарь Э.Б., Бикбулатов P.M. // Вопр. вирусол. 1970. -№3. - С.351-354.

23. Гранитов В.М. Герпесвирусная инфекция // Медицинская книга ., Н. Новгород, изд-во НГМА., 2001. 88 С.

24. Грачев В.П., Ханина М.К., Эльберт Л.Б., Миронова JI.JI. Гетероплоидная линия клеток почки зеленой мартышки как субстрат для размножения вируса клещевого энцефалита.// Вопросы вирусологии.- 1983, №4, С. 373-377.

25. Грачев В.П., Завальный М.А., Попова В.Д. и др. Линия клеток РАМТ как субстрат для размножения вакцинных штаммов вирусов // Вопр. вирусол. 1986. №6.-С. 718-723.

26. Гребенюк Н.В. Рецидивирующий генитальный герпес. Клиника, особенности иммунореактивности, лечение // Автореф. дисс. докт. мед. наук. -М.- 1983.-27 С.

27. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н. // В кн.: Методы культивирования клеток. Л. - 1987. - С. 250-257.

28. Данченко О.В., Гуртовой Б.А., Зайцева З.С. и др. Применение иммуноглобулина для профилактики внутриутробной инфекции у беременных с генитальным герпесом. // IV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». 1997. - 217 С.

29. Деконенко Е.П., Мальцева Н.Н., Вавилов С.Б. и др. Герпетический энцефалит: К линико-виру со логический аспект диагностики // Ж. невропат, и психиатр. 1989. - Т. 89, №8. - С. 31-36.

30. Джумиго П.А. Интерферонообразование и продукция специфических антител в процессе комбинированной терапии реафероном и антиоксидантами у больных простым рецидивирующим герпесом // Автореферат дисс. канд. мед. наук,- М. 1990. - 16 С .

31. Диагностика герпесвирусных инфекций человека: меморандум совещания ВОЗ // Бюлл. ВОЗ. 1991. Т.69, №3. - 206 С .

32. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний передаваемых половым путем. Метод, мат. Под ред. К.К.Борисенко. М.: Ассоциация САНАМ, - 1998.- 188 С.

33. Доконенко Е.П. Герпетические поражения нервной системы.//Материалы национальной конференции «Нейроинфекции». М. -2007,-С. 31-34.

34. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре. (Методы и применение в биотехнологии).//М., Спутник. 2000, С. 139-145.

35. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа // М. Высшая школа. - 1991. - 288 С .

36. Жданов В.М., Баринский И.Ф., Галегов Г.А. и др. Герпетическая патология и современные методы лечения герпетических поражений // Сов. мед. 1983. -№10.-С. 65-69.

37. Зазимко JT.A., Кузенкова A.B., Иванова И.А. и др. Антитела к вирусу простого герпеса, относящиеся к IgM, IgG и подклассам IgG, у лиц разного возраста // Вопросы вирусологии. 2000. - №6. - С.28-30.

38. Игнатьев Г. М., Стрельцова М.А., Агафонов А.П. и др. Изучение комбинированного применения иммуномодуляторов с вакцинными препаратами // Молек. биол. и мед.: Всес. шк.-семин., Jl.-Тез. Докл. 1990 -113 С.

39. Иммунологические методы (под редакцией Г.Фримеля) // М. 1987. -472 С.

40. Исакова В.А., Архипова Е.И., Исков Д.В. Герпесвирусные инфекции человека. // С-Петербург, СпецЛит, 2006, 14 С.

41. Казанцев А.П., Попова Н.И. Внутриутробные инфекционные заболевания детей и их профилактика // JL 1980. - С. 74-85.

42. Каламкарян A.A., Гребнюк В.Н. Вирусные дерматозы // В кн.: Кожные и венерические болезни. Руководство. М. -Медицина.-1995.-483 С.

43. Караулов М.П. Инфекции и иммунодефициты-приоритеты сегодня.//Практикующий врач.-1997.-№9-С.З-4.

44. Карпович Л.Г., Блоха В.В., Калашникова Т.В. и др. Показатели функциональной активности лимфоцитов больных кожно-генитальным герпесом в процессе лечения герпетической вакциной // Вопр. вирусол. -1986. №2. - С.200-205.

45. Каспаров A.A. Классификация герпетической болезни глаз // Вест, офтальм. 1972. - №2. - С. 63-67.

46. Каспаров A.A. Офтальмогерпес. М. Медицина, 1994. 223 С.

47. Киселева И.В., Александрова Г.И., Науменко З.С. и др. Культура клеток MDCK возможный субстрат для производства живой гриппозной вакцины.- Сборник «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», М.,1999, т. 1, 104 С.

48. Кищак В.Я. Вирус простого герпеса и канцерогенез.// Автореф. докт., дисс., М., 1984.

49. Коломиец Н.Д., Коломиец А.Г. и др. Изучение причинно-следственных отношений между невынашиванием беременности и герпетической инфекцией.//Минск.- Акушерство и гинекология. -1984. -№З.С. 62-64.

50. Коломиец А.Г., Малевич Ю.К. Коломиец Н.Д. и др. Вирус простого герпеса и его роль в патологии человека // Минск. 1986. - 262 С.

51. Коломиец А.Г., Вотяков В.И., Бикбулатов P.M. и др. Генерализованная герпетическая инфекция: Факты и концепция // Минск -1992.-351 С.

52. Косяков Н.П., Ровнова З.И. Противовирусный иммунитет // 1972. -М. 295 С.

53. Круглова А.И., Николаева Н.П., Нюхалова Ю.В. и др. Полиморфизм ДНК вируса простого герпеса типов 1 и 2 из лабораторных штаммов и клинического материала от пациентов с генитальным герпесом. // Вопросы вирусологии. 2004. №1. - С. 23-27.

54. Кудряшов Н.И., Озерова O.E., Львов Н.Д. и др. Тяжелые формы герпесвирусной инфекции у новорожденных // Педиатрия. 1990. - №1, - С. 38-43.

55. Кунгуров Н.В., Герасимова Н.М., Зудин А.Б., Кузовкина Т.В. Генитальный герпес. // Екатеринбург: Издательство Уральского университета. -2001.-7 С.

56. Лашкевич В.А. Пригодность перевиваемых клеточных линий для производства препаратов, вводимых людям. Сборник «Культивирование клеток животных и человека», Пущино, 1992, С. 88-89.

57. Лещинская Е.В., Мартыненко И.Н., Никулина В.Н. и др. Острые менингоэнцефалиты у детей, вызванные вирусом простого герпеса 1 типа // Ж. невропат, и психиатрии им. С.С.Корсакова 1981. - №4 - С 530-542.

58. Мавров И.И., Жигулин В.А., Шабалин А.Р. Проблемы генитальных поражений, вызванным вирусом простого герпеса. // 3111111. 1997. - №4. - С. 19-21.

59. Майданюк А.Г., Немцев Ю.В., Бондаренко Е.П. и др. Оптимизация условий получения инактивированной вакцины против гепатита А и ее характеристика.//Вопросы вирусологии, 1995, №5, С. 215-218.

60. Макарова О.П. Тенденции развития технологии культивирования животных клеток.// Сборник «Культивирование клеток животных и человека», Пущино,1992, С.90-96.

61. Максутова Э.Л., Семенова Т.Б. Неврологические нарушения при простом герпесе // Ж. Клин. мед. 1985. - №9. - С.62-66.

62. Марченко Л.А. Генитальная герпетическая инфекция у женщин (клиника, диагностика, лечение). // Афтореф. дисс. докт. мед. наук. 1997. -М.-32 С.

63. Машкиллейсон Л.Н. Инфекционные и паразитарные болезни кожи // М.- 1960. -С. 196-201.

64. Медуницын Н.В. // Вакцинология. М. «Триада X». 1999 . 272 С.

65. Миронова Л.Л., Попова В.Д., Конюшко О.И. и др. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике. // Биотехнология. 2000, (6), С.41-47.

66. Михайленко A.A. Вегетативные расстройства при герпетических заболеваниях нервной системы // В кн.: Патология вегетативной нервной системы. М. - 1976. - С. 208-209.

67. Михайленко A.A. Начальные проявления неврологических форм герпетических заболеваний // В кн.: 4-й Всерос. съезд невропатологов и психиатров. М. - 1980. - С. 438-440.

68. Муравьева Т.В. Значение иммуноглобулинов в оценке иммунологической реактивности больных с различным течением офтальмогерпеса // В кн.: Вирусные заболевания глаз. М. - 1977. - С. 14-18.

69. Мурзич A.B., Голубев М.А. Герпетическая инфекция. // ЮжноРоссийский мед. журнал. 1998. - №3. - С. 44-47.

70. Пак Н.В. Изучение интерфероногенных и противовирусных свойств бруцеллезной лечебной вакцины // Автореферат, дисс. канд.мед. наук. Алма-Ата. - 1989. - 24 С.

71. Панов А.Г., Зинченко А.П. Рассеянный склероз и рассеянный энцефаломиелит, вызванный вирусом простого герпеса // В кн.: Некоторые актуальные вопросы невропат. Курск. - 1967. - С.40-43.

72. Перадзе Т.В., Халонец П. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. // М. Медицина. - 1985. - 301 С.

73. Подчерняева Р.Я., Хижнякова Т.М., Михайлова Г.Р. и др. Линия клеток Vero В для проготовления медико-биологических препаратов. //Вопросы вирусологии.-1996.- №4,- С. 183-185.

74. Посевая Т.А., Цукерман Б.Г., Шуваева Н.И. и др. Роль герпетической инфекции при эпителиальных дисплазиях шейки матки и опыт их лечения противогерпетическими препаратами. // Вопросы вирусологии. 1991. - №1. -С. 78-80.

75. Потекаев Н.С., Константинова A.B., Самгин М.А. Язвенная форма рецидивирующего герпеса с исходом в герпетический сепсис // ВД и В. -1971. №4.-С. 34-38.

76. Потекаев Н.С., Самгин М.А. Особенности клиники и течения простого рецидивирующего герпеса // Ж. Сов. мед. 1983. - №6 - С. 79-82.

77. Потекаев Н.С., Самгин М.А., Баринский И.Ф. Современная терапия рецидивирующего герпеса // Ж. Клин. мед. 1982. - №12 - С. 78-81.

78. Потекаев H.H., Хашиева Ф.Н., Кравченко A.B. Особенности клинического течения простого и опоясывающего герпеса у ВРИ -инфицированных лиц.// Российский журнал кожных и венерических болезней. Приложение герпес. 2006 №1. С. 40-42.

79. Профилактика герпесвирусных болезней и борьба с ними // Бюлл. ВОЗ. 1985. - Т. 63, № 2. - С. 1-16.

80. Самгин М.А. Клинические особенности и иммунологическая терапия рецидивирующего герпеса // Автореф. дисс. канд. мед. наук. М. -1969.-15 С.

81. Самгин М.А., Халдин A.A., Зуев A.B. Клинический полиморфизм дерматологического синдрома герпетической болезни.// Российский журнал кожных и венерических болезни. Приложение герпес. 2006. №1, С.60-66.

82. Скрипкин Ю.К., Мордовцев В.Н. Кожные и венерические болезни (руководство для врачей) // М. Медицина. - 1999. - Т.1 - С.443-451.

83. Скрипкин Ю.К., Хамаганова A.B., Богданов Н.С. К вопросу терапии вирусных заболеваний кожи отечественными противовирусными препаратами // ВдиВ. 1976. - №9. - С.11-14.

84. Сухих Г.Т., Ванько J1.B., Кулаков В.И. Иммунитет и генитальный герпес // Н.-Новгород М. - 1997. - 221 С.

85. Сухубаевская Л.П. Усовершенствование способов получения клеточной и вирусной биомассы в целях разработки тканевых инактивированных гриппозных вакцин.// Сборник «Вирусы человека и животных» Рига, 1981, С 53-54.

86. Таточенко В.К., Озерцковский Н.А.Иммунопрофилактика. /М., 2001.-С.44-45.

87. Тихонова Л.И. О состоянии заболеваемости болезнями, передаваемыми половым путем (по итогам 1996 г.), и мерах по их предупреждению в России // Заболевания передаваемые половым путем. -1997.-№4.-С.22-26.

88. Хапчаев Ю.Х. Разработка методов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных для производства вирусных вакцин. Автореферат, д.б.н., Москва 2003, С.13-19.

89. Хахалин Л.Н., Соловьева Е.В. Герпесвирусные заболевания человека. // Клин. фрам. и тер. 1998. - С. 72-76.

90. Хороших Е.М. Оптимизация условий культивирования линий клеток различного происхождения для репродукции производственных штаммов вирусов. Автореферат, дисс. к.б.н., 1991, Томск.

91. Шульженко А.Е. Герпетические инфекции человека: перспективы диагностики и противовирусной терапии. // Российский журнал кожных и венерических болезней . 2006. №1. С. 51-56.

92. Цукер М.Б. Менингиты и менингоэнцефалиты у детей // М.-1975-344 С.

93. Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Мандрыкина Н.Е. Генодиагоностика герпесвирусных инфекций.// Мат. Национальной конференции «Нейроинфекции». М.- 2007. С.161-163.

94. Эльберт Л.Б., Ворович М.Ф., Тимофеев А.В. Сравнительный анализ тестов in vivo и in vitro количественной оценки иммуногенности вакцины клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии - 1998, №5, С.236-238.

95. Эльберт Л.Б., Терлецкая Е.Н, Тимофеев А.В. и др. Очистка препаратов вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК. Вопросы вирусологии , 1990, №3, С.219-223.

96. Abzyd M.J., Beam А.С., Gyorkos Е.А. et al. Viral pneumonia in the first month of life //Periat. Infec.Dis.J. 1990.- Vol. 9, N 12.- P. 881-885.

97. Allen W.P., Rapp F. // J. Infect.Dis. 1982.- Vol. 10.- P.413-421.

98. Amortegui A.J., Macpherson T.A., Havger J.H. A cluster of neonatal herpes simplex infections without mucocutaneus manifestations // Pediatrics.-1984.-Vol. 73, N2,-P. 194-198.

99. Arditi M., Shulman S.T., Lanqman C.B. et al. Probable herpes simplex vims type 1-related acute parotitis, nephritis and erythema multiforme // Pediat.Infec.Dis.J.- 1988.- Vol.7, N 6.- P.427-429.

100. Baglin T.P., Gray J.J., Marcus R.E. et al. Antibiotic resistant fever associated with herpes simplex vims infection in neutropenic patients with haematological malignancy// J.Clin.Pathol.- 1989.- Vol.42, N 12.- P.1255-1258.

101. Barile F., Angarano G., Monno L. et al. Ulcero-necrotic herpes simplex in a male patient affected by AIDS // Ann.Ital.Dermatol.Clin.e sper.- 1988.- Vol.42, N 3.- P.263-268.

102. Becker T.M., Blount J.H., Guinan M.E. Genital herpes infection in privat practice in USA 1966 to 1981 //JAMA.- 1985.-Vol. 253, N 11,-P. 1601-1603.

103. Brookes J.L., Haywood S., GreenG. Adjustment to the psychological ans social sequelae of recurrent genital herpes simplex infection // Genitourin Med.-1993,- Vol.69, N5.- P.384-387.

104. Brown Z.A., Benedetti J; Ashley R. et al. Neonatal herpes simplex vims in relation to asymptomatic maternal infection at the time of labor // N.Engl. J.Med.-1991.- Vol.324, N 18.- P.1247-1252.

105. Dundarov S., Andonov P., Bakalov B. et al. Antiherpes vaccines // 9 Int.Congress of inf.& Parasit.Dis.- Munich, Juli.- 1986.- P. 115-121.

106. Dundarov S., Andonov P., Bakalov B. et al. Diagnostics and treatment of herpes virus diseases in Bulgaria // Probl.Infect.Parasit Dis.- 1983.- N 10.- P.70-73.

107. Fackelmann K.A. Herpesvirus may boost AIDS expession // Sci.News.-1989,- Vol.135, N 4.-P.55.

108. Frams B., Nahony J.B., Balachandian N. et al. Identification and typing of herpes virus by enzyme immunoassay with monoclonal antibodies // J.Clin.Microbiol.- 1984.- Vol.20, N 2.- P.162-166.

109. Furrer H., Meister F., Malinverni R. Herpes-simplex-Virus-Type-2-Pneumonitis bei einem AIDS-Patienten // Schweiz.med. Wochenschr.- 1989.-B.119,N 37.-S.1275-1278.

110. Gaffey V.J., Ben-Ezra J.M. Weisse L.M. Herpes simplex Lymphadenitis // Amer.J.Clin.Pathol.- 1991.- Vol.95, N 5.- P.709-714.

111. Glezen W.P. Acute respiratory lesions of university students with special reference to the etiologic role of herpesvirus hominis // Am.J.Epid.- 1975.-Vol.101.- P.ll 1-121.

112. Goetmann S., Decazes J.M. Aciclovir et ganciclovir propriétés et indications actuelles // Pathol.Biol.- 1989.- Vol.37, N 9.- P. 1003-1004.

113. Goldmeier D., Johnson A., Byrne M. et al. Psychosocial implications of recurrent genital herpes simplex virus infection // Genitourin.Med.- 1988.- Vol.64, N 5.- P.327-330.

114. Guemot C. Herpes et grossesse. EZISA cherche-moi des HSV-2 // J.Int.med.- 1992,- N 232,- P.21-23.

115. Hayashi M., Takeyama K., Takeyama J. et al. Severe herpes simplex virus hepatitis following autologous bone marrow transplantation // Jap.J.Clin.Oncol.-1991.- Vol.21, N 5.- P.372-376.

116. Hilfenhaus J., Moser H., Herrmann A. et al. Herpes simplex virus subunit vaccine: characterization of the virus strain used and testing of the vaccine // Develop. Biol. Stand.- 1982.- Vol.52.- P.321-331.

117. Hirata Т., Sekitani Т., Okinaka Y. et al. Serovirological study of vestibular neuronitis. // Acta oto-laryngol. Suppl.- 1989.- N 468.- P.371-373.

118. Hubbell C., Dominguez R., Kohl S. Neonatal herpes simplex pneumonitis // Rev.Infec.Dis.- 1988.- Vol.10, N 2,- P.431-438.

119. Hubl R.N., Peck F.B. // International Conference on vaccines Against ViraliLand Rickettsial Diseases of Man, 5 : Proceedings. Pull. N 147.- Washington. -1967.- P.266-275.

120. Jensenius M., Myrvang В., Storvold G. Seros meningitt assosiert til primaer genital herpesinfeksjon. // Tidsskr. Nor. Laegeforen.- 1997.- Vol.117, N 16.- P. 2316-2318.

121. Kavalclova L., Dundarov S., Andonov P. et al. Preparation and study on antiherpes vaccines 1 and 2 type free of DNA // Acta Virol.-1986.-Vol.30.-P.402-410.

122. Kitagawa K. Therapy of herpes simplex with heat inactivated herpes-virus hominis type 1 and 2 // Z. Hautkaukh.- 1973,- Vol.48.- S. 533-535.

123. Koid J., Yanagita N., Hondo R. et al. Serological and clinical study of herpes simplex virus infection in patients with sudden deafness. // Acta otolaryngol. Suppl.- 1988,-N456.-P.21-26.

124. Kuzushima K. Climical manifestations of primary herpes simplex virus type 1 infection in a closed community // Nagoya J.Med.Sci.- 1991.- Vol.53. N 4,- P.4.

125. Landry M.L., Mayo D.R., Hsiung C.D. The need for a rapid and accurate diagnosis//Pharmac.ther.- 1983.- Vol.18.- P.107-132.

126. Leprince E., Durous E., Franccois Y. et al. Ileo-colite herpetique a virus Herpes simplex de type 2 // Gastroenterol.Clin.Biol.- 1993.- Vol.17, N 11,- P.855-858.

127. Libikova H., Pogady J., Weidermann V. et al. Попытка определения герпетических антител в спинномозговой жидкости у лиц с сенильной деменцией и умственным недоразвитием // Acta virol. 1975.- Vol.19, N 6.-Р.493-495.

128. Lipson S.M., Schutzbann T.E., Szabok. Evaluation of three immunofluorescence assays for culture confirmation and typing of herpes simplex virus // J.Clin.Microbiol.- 1987.- Vol.7, N 2,- P.391-394

129. MacNab J.M. Association of the herpes genus with carcinogenesis and specifically herpes simplex virus type-2 with the tumourigenesis // European conference on Herpes viruses and genital pathology. 1996. - Paris.-P. 24.

130. Mancini J., Charbol B., Liver M.O., Pinsard N. Aspects evoluties des encephalitis herpetigues: a propes dix observations // Sem.hop.Paris.- 1991.-Vol.67,N 25.-P.l 139-1145.

131. Meignier B. // Herpesviruses.- N-York, 1985.- Vol.4- P.265-296.

132. Miller J.D., Ross C.A. Encephalitis: a four year survey. Lancer, 1968, v.l, N 7551, p.1121-1126.

133. Mindel A. Coutaneous herpes simplex infection: Symp.Herpesvirus Infec. // Scand.J.Infec.Dis.- 1991.- N 80, Suppl.- P.47-52.

134. Minick P., Fabricant C., Fabricant J. et al. Atheroarteriosclerosis induced by infection with herpes virus // Amer.J.Path.- 1979.- Vol.96, N 3.- p.673-684.

135. Nasemann N., Wassilew S.W. Vaccination for Herpes Simplex Genitalis // Brit.J.vener.Dis. 1975.- Vol.55, N 2.-P.121-122.

136. Notlcins A.L., Bankowski K.A., Barons et al. Workshop on the treatment and prevention of herpes simplex virus infection // J.Jnfect.Dis. -1973. Vol. 127, N 1 .P. 117-119.

137. Overall J.C. Herpes simplex virus infection of the fetus and newborn // Pediatr. Ann.- 1994,- Vol.23, N 3.- P.131-136.

138. Price R.W., Walz A., Wohlenberg Ch. et al. Latent Infection of Sensory Ganglia With Herpes Simplex Virus //Science.- 1975.-Vol. 188, N4191.-P.938-940.

139. Reeves W.C. et al. Risk of reccurence after first episodes of genital herpes: relation to HSV type and antibody response // N.Engl.J.Med.- 1981.- Vol.305.-P.315-319.

140. Ross C.A.C., Stevenson J. Herpes simplex meningoencephalitis // Lancer. -1961.-Vol.2.-P. 682-685.

141. R.Patel, Boselli F., Cairo I. et al. Негативное влияние рецидивирующего генитального герпеса с точки зрения пициента. // Российский журнал кожных и венерических болезней. Приложение герпес. 2006, №1, С.66-72.

142. Ruelle С. Laboratory au service de la chinigue. Herpes genital // Techn.Biol. 1981. - Vol.7, N 3. - P. 135-139.

143. Sahjos S., Munor N., Boseh F. et al. Sexually transmitted agens and cervical neoplasia in Colombia and Spain. // Int. J.Cancer. -1994. -Vol. 56, Nl.-P. 358-363.

144. Samarai A.M.A1., Shareef A.A., Kinghorn G.R. Seguential genital infections with herpes simplex virus types 1 and 2 // Genitourin.Med. 1988. - Vol. 65, N 1. -P. 39-41.

145. Schlesinger J. Tebas P., Buller R.S. et al. Herpes simplex virus type 2 meningitis in the absence of genital lesion // Clin.Infect.Dic. 1995. -V. 20, N 4. -P. 842-848.

146. Schmidt O.W., Fife K.H., Corey L. Reinfection in an uncommon occurrence in patients with symptomatic recurrent genital herpes // J.Infec.Dis. 1984. - Vol.149. N4.-P. 645-646.

147. Scriba M. Animal studies on the efficacy of vaccination against recurrent herpes // Med. Microbiol, and Immunol. 1982. - Vol.171. - P. 33-42.

148. Slichtova V., Kutinova L., Vonka V. Immunogenicity of subviral herpes simplex virus type I preparation. Protection of mice against intradermal challenge with type I and type 2 viruses // Arch. Virol. 1980. - Vol. 66. - P. 207-214.

149. Soltz-Szots J., Fanta D. Therapeutic Aspects of Herpes Genitalis. // Brit.J.Vener.Dis. 1979. - Vol. 55, N 2. - P. 123-124.

150. Spruance S.L., Hamill M.L., Höge W.S. Acyclovir prevents reactivation of herpes simplex labialis in skiers // JAMA.- 1988.- Vol.260, N 11.- P. 1597-1599.

151. Steuhl K.P., Zierhut M. Infectionen des Auges mit Herpes simplex-viren // Z.prakt.Augenheilk.- 1989.- B.10, N 3.- S.l 17-126.

152. Studd M., McCance D.J., Lehner T. Detection of HSV-1 DNA in patients with Behcent's syndrome and in patients with recurrent oral ulcers by the polymerase chain reaction // J.Med.Microbiol.- 1991. Vol.34, N 1.- P.39-43.

153. Sundmacher R., Althaus Chr. Die Herpes-simplex-virus Infectionen des Menschlichen Auges // Hautnah: Dermatologie. 1990.- B.6, N 3.- S.61-62.

154. Teler A., Bernal A., Ory F. de et al. Meningitis limfocitaria. Estudio virologica // Inferm.infec. y microbiol.clin.- 1989. Vol.7, N 2.- P.77-82.

155. Tomlinson A.H., Esiri M.M. Herpes simplex encephalitis: Immunological demonstration of spread of virus via olfactory pathways in mice // J.Neurol.Sei.-1983.- Vol.60, N 3.- P.473-484.

156. Trembay M., Gornitsky M., Wainberg M.A. Active replication of humanimmunodeficiency virus type 1 by peripheral blood mononuclear cells following coincubation with herpes viruses // J.Med.Virol.- 1989,- Vol.29, N 2.-P.109-114.

157. Visser M.R. Vercelotti G.M. Herpes simplex virus and atherosclerosis European Heart Journal.- 1993.- N 14.- P.39-42.

158. Wassilew S.W. Kombinierte Chemotherapie die Herpes-simplex-Infectionen der Haut // Z.Hautkr.- 1979.- B.54, N16.- S.726-731.

159. Выражаю благодарность руководству ЗАО «ФИРМА»ВИТАФАРМА» за предоставленную возможность выполнения научно-исследовательских работ связанных с темой диссертации.

Информация о работе

Бархалёва, Оксана Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Оптимизация производства вакцины герпетической культуральной инактивированной сухой, на новом клеточном субстрате перевиваемой линии клеток Vero B. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы