Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм ядрышкообразующих районов хромосом у медицинских и спонтанных абортусов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм ядрышкообразующих районов хромосом у медицинских и спонтанных абортусов"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫ Я НАУЧНЫЙ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК: 576.113: 576. 316: 591

КАРТА1НЕВА ОЛЬГА ГЕОРГИЕВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ЯДГЫПКООБРАЗШПИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ У МЕДИЦИНСКИХ И СПОНТАННЫХ АЕОРТУСОВ (03.00.15 - Генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики НИИ медицшйгкой генетики Томского научного центра АМН СССР

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат .биологических наук С. А. Назаренко

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук 11 А. Ляпунова кандидат биологических наук С. Г. Ворсанова.

ВЕДУЩЕЕ ■ УЧРЕЖДЕНИЕ - Институт общей генетики им. И И. Вавилова

АН СССР

Защита диссертации состоится // 1992 г. в час.

на заседании специализированного Совета (Д 001.16.01) Всесоюзного научного медико-генетического центра АШ СССР по адресу: 115478 Москва, у л, Москворечье, д. 1.

С диссертацией шало .познакомиться в библиотеке Центра Автореферат разослан "С^ " У 1Э9^г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор медицинских наук

Л. Ф. Курило

ОБИДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом у человека представлены вторичными перетяжками коротких плеч 10 акро-дантрических хромосом генома, в которых локализованы риОосомкые гены. В настоящее время не вызывает сомнения, что окрашивание серебром ЯОР метафазных хромосом является достоверным критерием активного состояния рибосомных генов в предшествующей интерфазе не только в соматических клетках (Miller et al.1976, Schwarzacher et al., 1983) но и в эмбриогенезе млекопитающих (Дыбани др., 1989; Зацепина и др., 1989).

С появлением А^-окраски функциональный полиморфизм ЯОР хромосом стал предметом всестороннего изучения (Goodpasture, 1976; Miller et al. , 1979; Mikelsaar et al., 1979; Захаров и др. , 1981; Созанский, 1983). Ляпунова с соавт. (1988) для определения относительного числа активных копий рибосомных генов всей совокупности ЯОР генома человека предложили критерий суммы баллов Ag-окраски всех 10 ЯОР данного индивида [£(+)] и определили норму реакции этого признака в популяции.здоровых людей. Начато исследование связи медду количеством активных копий рибосомных генов и адаптивными способностями индивида (Викторов и др. , 1990; Матукявичюте, 1990; Назаренко и др., 1990). В последнее время появился ряд работ, посвященных изучению вариантов ЯОР у родителей, имеющих спонтанные аборты (Hassold et al. , 1987; Shaham, 1986) и детей с синдромом Дауна (Murty, 1987; Еголина, 1990). Однако до сих пор остается открытым вопрос, какое количество активных копий рибосомных генов необходимо для жизнедеятельности клеток, организма и гсаковы механизмы регуляции этой активности. Сравнительно недавно было высказано . предположение, что необходимое для жизнеспособности !слетки число активных рибосомных генов возникает при комбинировании ЯОР хромосом родителей с разным количеством копий этих генов, а основным механизмом, поддерживающим оптимальное число копий генов рРНК, является отбор, действующей на уровне зиготы или на ранних этапах змбрио-

нального развития (Ляпунова и др., 1988, 1989). В этой связи представляется актуальным изучение активности ЯОР хромосом в клеймах чеч-ловека в пренаташюм периоде онтогенеза при нормальном и патологическом развития зародыша. В литературе отсутствуют1 данные 1 по опенке состояния ЯОР хромосом г, эмбриональном периоде развития человека и значении вариабельности ЯОР в развитии эмбриона. На эмбриональном материале не иссладозан тага© вопрос о функциональной активности рибосомных генов в клетках с хромосомным дисбалансом. Изучение этих вопросов необходимо для выяснения' роли функционального .полиморфизма ЯОР хромосом в пренатальном периоде онтогенеза человека. ,

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение полиморфизма ЯОР хромосом эмбриональных фибробластов при нормальном и патологическом развитии вародква.

Основные задачи работы: 1). оценить вариабельность активности ЯОР хромосом фабробластов У индуцированных абортусоь; 2) исследовать активность ркСосомиых генов в фибробластах спонтанных абортусоь с нормальным и аномальным кариотипаш!; 3) провести сравнительный анализ активности ЯОР хромосом у медицинских и спонтанных абортусов с нормальным каркотипом для выявления возможной селективной ценности функционального полиыэрфиэщ хромосом.

Научная понизив. В работе вкараш кеслздоваяа функциональная активность яор хромосом -кул^-квируемых фибробластов - медицинских и спонтанных абортусов. Обнару/.ено достоверное повышение активности рибосомных генов в группе спонтанных абортусов с нормальным карно-тиьом по сравнению с индуцированными абортусамн. При исследовании активности ЯО? хромосом в фибробластах спонтанных абортусов с аномальным кариотипом показано, что активность рибосомных генов, за исключением эмбрионов с -трнплоидией, существенно не изменяется при разных типах хромосомных аберраций. С помовд>ы экстраполяции значений параметров функциональной активности яор в группе спонтанных абортусов с аномальным кариотипом к нормальному кариотипу установлено, что активность рибосомных генов в фибробластах с аберрантным карнотитом ■вшье таковой у медицинских абортусов и сходна с активностью ЯОР хромосом в фибробластах спонтанных абортусов с нормальным кариотипом. Впервые проведено изучение активности ЯОР хромосом эмбриональных фибробластов в процессе длительного культивирования

клеток.

Практическая ценность. Полученные в работе данные по активности ЯОР хромосом в культивируемых in vitro фибробластах медицинских и спонтанных абортусов необходимы в качестве основы для дальнейшего выяснения генетических механизмов пренатальногс отбора у человека. Эти результаты могут быть использованы при выборе методологии исследования активности рибосомных генов в норме и патологии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доло-?.йны и обсуждены на I конференции НИИ медицинской генетики ТНЦ АМН СССР, Томск (1969); на III национальном конгрессе по м&дицинск: л биологии и генетике в Варне, Болгария (1990); па II Всесоюзном съезде медицинских генетиков, Алма-Ата (1990); на меетабораторном семинаре во Всесоюзном Научном медико-генетическом центре АМН СССР, Москва (1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения , обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований с обсуждением по разделам, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 140 страницах текста, содержит '23 таблицы и б рисунков. Список литературы включает 200 источников, из них 54 отечественных и 145 зарубежных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Функциональная активность ЯОР хромосом фибробластов, как медицинских, так и спонтанных абортусов с нормальным кариотипсм существенно не изменяется в процессе их длительного культивирования.

2. Активность рибосомных генов у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом достоверно выше по сравнению с индуцированными абортусами.

3. Функциональная активность ЯОР хромосом фибробластов спонтанных абортусов с аномальным кариотипом превышает активность рибо-л сомных генов фибробластов медицинских абортусов. Медду спонтанными абортусами с аномальным и нормальным кариотипом нет статистически значимых различий в активности ЯОР хромосом.

4. Повышение активности рибосомных генов у спонтанных абортусов происходит за счет увеличения средней активности ЯОГ всех акро-центрических хромосом.

Материал и методы исследования

Объектом исследования служили препараты метафаэных хромосом эмбриональных фибробластов от 50 медицинских (контрольная группа) и 70 спонтанных абортуеов с нормальным кариотипом (опытная группа), а также 26 спонтанных абортуеов с аномальным кариотипом. Медицинс-'кие абортуеы были взяты от женщин, не имевших отягощенного акушерского анамнеза. Возраст женщин данной групппы варьировал от 18 до 44 лет и в среднем составил 27,21+0,95 дет. Возраст медицинских эмбрионов находился в интервале от 7 до 12 недель.

Спонтанно абортированные эмбрионы человека первых 5-20 недель беременности получали без выбора из гинекологического отделения родильного дома N 2 г. Томска в течении 1986-1990 г. г. Всего было получено 402 спонтанных абортуса, из которых 190 были успешно культивированы с приготовлением препаратов хромосом, пригодных для онтогенетического исследования. Возраст яэквдн, от которых был подуче.': абортивный материал, варьировал от 17 до 39 лет и составил в среднем 25,97+0,64. года для спонтанных абортуеов с нормальным кариотипом и 25,73+1,11 лет - для спонтанных абортуеов с хромосомными аберрациям;«.

Кожно-мышешше фрагменты эмбриона или абиотические оболочш: культивировали в среде Игла с добавлением глюташка, других незаменимых аминокислот, антибиотиков, 10% пуповинной.сыворотки человека и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Культивирование эмбриональных фибробдастов медицинских и спонтанных абортуеов проводили параллельно в идентичных условиях (на одних и тех жз партиях сред и сывороток).

Препараты метафазных хромосом для цитогенетического анализа получали как из клеток, выращиваемых непосредственно на предметны;: стеклах, так и после снятия клеток С подложки и раскапывания клеточной суспензии. Первым способом было получено 64,ОХ хромосомны:; препаратов контрольной группы и 68,6% - опытной группы абортуеов. Препараты метафазных хромосом фибробласгов медицинских и спонтанных • абортуеов получали одновременно одним из вышеуказанных способов.

Выявление дранскршционно активных ЯОР на метафазных хромосо-

мах проводили с использованием метода селективной окраски ядрышко-вьгх организаторов раствором азотнокислого серебра (ag-окраска) по методике Хоуэлла и Блэка (Howell, Black, 1980). Для анализа отбирали метафазные пластинки с завершенной Ag-окраской (Созанский, 1983). От калщого эмбриона анализировали не менее 10 метафазных пластинок.

Хромосомы идентифицировали с ломопхью G-окраски, используя модифицированный метод Самнера (Samner et al. , 1971). В тех случаях, когда Ag-окрашивание маскировало 5-полосы на хромосомах, зарисовывали все акроцентрические хромосомы метафазных пластинок и проводили оценку интенсивности Ag-окрашквания ЯОР. Затем серебро удаляли 1% раствором феррицианида кадия, препарат для выявления 8-полос окрашивали красителем Гимза и идентифицировали ранее зарисованные хромосомы. Количество медицинских и спонтанных абортусов с нормальным и аномальным кариотипами с идентифицированными акроцентричес-кими хромосомами составило 42, 54 и 23 соответственно.

Активность ЯОР оценивали по следующим параметрам: 1) критерию суммарной функциональной активности всех 10 ЯОР -£(+); 2) числу Ag-положительных ЯОР на клетку - NAg(+); 3) ассоциативному индексу (АИ) - проценту клеток с ассоциациями акроцентрических хромосом; 4) числу ассоциаций хромосом на метафазную пластинку - Ас/МП; 5) числу хромосом в ассоциации - Хр/Ас; 6) средней активности ЯОР в каждой из 5 пар акроцентрических хромосом. Активность ЯОР оценивали полуколичественно с учетом интенсивности серебрения отдельных акроцентрических хромосом по. 5-балльной системе (0 - отсутствие окраски, 1 - слабая, 2 - средняя> 3 - сильная л 4 - очень сильная окраска ЯОР хромосом - размеры Ag-блока значительно превущают толкушу хрома-тид). От каждого эмбриона анализировали не менее 10 метафазных пластинок. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета статистических программ "СТАТГРАФ" на ПЭВМ совместимой о IBM PC XT. Методы статистического анализа определяли, исходя из структуры полученных данных.

Результаты исследования и их обсуздение

I. Анализ изменчивости функциональной активности ядрышкообра-зуюших районов хромосом в процессе культивирования эмбриональных фибробластов человека. Оценка вариабельности активности ЯОР хромо-

сом эмбриональных фибробластов в процессе культивирования. необходима для выбора методологии изучения экспрессии рибосомных генов у нормальных и аномальных эмбрионов. В литературе нет работ, посвященных данному вопросу.

С целью • изучения влияния процесса длительного культивирования клеток на активность ЯОР эмбриональных фибробластов, были получены первичные культуры от 10 медицинских и 8 спонтанных абортусов. В дальнейшем эти культуры анализировали в среднем череэ четыре пассажа (на 1-4, 5-8, 9-12, 13-16, 17-20) на протяжении двадцати пассажей..

Изучение суммарной активности ЯОР хромосом на геном показало, что в процессе культивирования ока варьировала от 17,4 до £2,1 балла у медицинских и от 17,4 до 22,9 балла у спонтанных абортусов. Не установлено какой-либо зависимости суммарной активности ЯОР хромосом от номера пассажа (коэффициент корреляции составил 0,04 и 0,21 соответственно для первой и второй групп абортусов; Р>0,05). Суммарная активность ядрышковых организаторов . большинства клеточных культур медицинских абортусов в процесса культивирования колебалась незначительно и только 2 из 43 проанализированных пассажей (4,6%) достоверно отличались по данному показателю от других пассажей соответствующих культур. Тек не менее, суммарная активность ЯОР хромосом отличающихся пассажей статистически значимо не отклоняется от средней суммарной активности ЯОР хромосом этих культур. У спонтанных аборуусов аналогичная закономерность выявлена в 6,97. пассажей.

Число активных, окрашивающихся серебром ЯОР на клетку у разных эмбрионов'варьировало от 7 до 10. В процессе культивирования медицинских абортусов количество функционирующих ЯОР на клетку в большинстве случаев испытывало незначительные колебания на разных пас-сахвх, но 4,6% пассажй статистически значимо отличалось как от среднего значения данного показателя для всей культуры, так и от других пассажй.соответствующих клеточных культур. Только 2,3% пассажей у медицинских и 3,4% пассажей у спонтанных абортусов статистически значимо не отличались по количеству активных ЯОР на клетку от средних значений и достоверно отличались от других пассажей данных культур.

Таким образом, проведенный анализ функциональной активности. ЯОР хромосом фибробластов на протяжении двадцати пассажей не пика-

зал направленных изменений межлеточной вариабельности суммарной активности ЯОР. Все это позволяет сделать вывод о том, что уровень функциональной активности генов рРНИ фибробластов в процессе длительного культивирования клеток существенно не изменяется.

2, Вариабельность суммарной активности ЯОР у медицинских и спонтанных абортусов с нормальным кариотипом при анализе 10 клеток на эмбрион. Наиболее информативной характеристикой уровня активности ЯОР хромосом метки, индивида, популяции в настоящее время является критерий суммы баллов Аз-окраски всех 10 ЯОР данного индивида. Адекватный анализ функциональной активности ЯОР предполагает знание степени межклеточной и межиндивидуальной изменчивости изучаемого параметра транскрипционной активности рибосомных генов в зависимости от количества проанализированных клеток.

Двухфакторньй дисперсионный анализ случайной вчборки 37 медицинских и 49 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом показал, что межклеточная изменчивость суммарной активности ЯОР при анализе 10 клехок на эмбрион как у медицинских (Р-О.ЗЭ). так и у спонтанных абортусов (Г-1,7?) статистически незначима по сравнению с межиндивидуальной вариабельностью данного признака (Р-23,53 и 10,20 соответственно). Эти результаты позволяют считать, что анализ 10 мета-фазных пластинок является достаточным для изучения активности рибосомных генов в эмбриональных фибробластах человека, так как отвечает необходимым для этого требованиям: вариабельность изучаемого признака между клеткг-ми одного индивида мала; различия между индивидами статистически значимы; данные, полученные на 10 клетках, не противоречат результатам, полученным при исследован™ 20 клеток на индивида (Ляпунова и др., 1989).

3. Частота хромосомных зномалий у спонтанных и медицинских абортусов. Цитогенетическое исследование 190 спонтанных абортусов Томской популяции 5-20 недель беременности показало, что 149 (78,4%) абортусов имели нормальный, а 41 (21,6%) - аномальный кари-отип. В нашем материале среди спонтанных абортусов с нормальным ка-* риотипом не обнаруайно абортусов, фенотип которых был представлен целым зародышевым мешков с эмбрионом. В основном (67,8%) эту группу составили целые эмбрионы или фрагменты эмбрионов. Это характерно для абортусов обоих полов. Споитаные абортусы с аномальным кариотипом, наоборот, чаше (69,7%) были представлены целым или разрушенным

зародышевым мешком без сформированного эмбриона. В этом случае абортусы женского пола составили 76,21, а эмбрионы.мужского пола -в 58,3%..

Медицинские абортусы в 96,1% случаев были представлены эмбрионом (целым или разрушенным), а плодные оболочки и.хориок составили всего 3,8%. Частота хромосомных аномалий, обнаруженная при кариоло-гтескт исследовании 50 медицинских абортусов, составила 4,0%.

4. Активность ядрышкообразукицих районов хромосом фибробластов медицинских абортусов. Активность рибосомных генов была изучена у 50 эмбрионов с нормальным кариотипом. Возраст абортусов варьировал от 7 до 12 недель и в среднем составил 9,7+1,6 недель. Средний пассаж культивируемых клеток медицинских абортусов равнялся 4,6+0,4.

Суммарная активность ЯОР на геном у медицинских абортусов варьирует- от 15,6 до 28,4 баллов, со средней 20,25+0,31. Количество активных ЯОР на клетку в группе медицинских абортусов изменяется от 7,0 до 9,9 и в среднем составляет 8,71+0,10, ассоциативный индекс - 37,51+3,24, число ассоциаций на клетку с ассоциацией - 1,03+0,06 и число хромосом в одной ассоциации - 2,09+0,2. Следует отметить, что в основной части медицинских абортусов суммарная активность ЯОР на геном находится в пределах от 16,7 до 23,3 баллов, т.е. близка к таковой в постнатальный период онтогенеза (Ляпунова и др. 1989). В . то же время средняя активность ЯОР на геном у эмбриональных фибробластов (20,25) выше, по сравнению с лимфоцитами взрослых индивидов (19,4). Это, вероятно, обусловлено тем, что эмбриональные фйброб-ласты являются слабо дифференцированными, интенсивно делящимися клетками, в которых высока потребность в продуктах транскрипции рибосомных генов. Не исключено также и влияние возрастного фактора на снижение активности ЯОР хромосом (Назаренко и др., 1991). Сравнительный анализ активности ЯОР у плодов мужского и женского иолов не выявил достоверных отличий между полами ни по одному иэ рассмотренных параметров.

Для оценки состояния ЯОР каждой пары хромосом были взяты два показателя: степень активности ЯОР в одной хромосоме и частота Аг-окрашенных ЯОР каждой индивидуальной пара Наиболее активные ЯОР имеют хромосомы 21 и 13, а наименее активные - 15 и 14. Различие между хромосомши 15 и 21, 15 и 13 статистически достоверно (1-2,20 и 2,11 соответственно; п- 82; Р< 0,05). Хромосомы 21 и 13 обнаружи-

- и -

вают наиболее высокую частоту Ак-положительных ЯОР, а хромосом 16 - самую низкую частоту выявляемости ЯОР. Частота Ад-окрашивания ЯОР, хромосомы 16 достоверно ниже хромосомы 21 (Р<0,05). Частота ветре. чаемости очень крупных блоков серебра в ядрышкообразующих районах хромосом, обозначаемых нами как балл 4 была незначительной и составила всего б,б1+0,86£ от всей совокупности проанализированных хромосом. Двойных ЯОР в исследованной группе медицинских абортусов не обнаружено.

Б. Полиморфизм ядрышкообразуюших районов хромосом фибробластов у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом. Анализ функциональной активности ЯОР был проведен на хромосомных препаратах, полученных из фибробластов 70 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом. Возраст эмбрионов варьировал от 5 до 16, со средней 10,6+3,7 недель. Средний пассаж культивируемых фибробластов составил 5,6+0,4. ..Суммарная активность ЯОР хромосом в рассматриваемой группе эмбрионов варьировала от 18,10 до 26,60 балла и составила в среднем ■ 21,33+0,22 балла, В группе спонтанных абортусов число активных ЯОР на клетку . варьировало от 7,2 до 10,0 и в среднем составило 8,99+0,08; ассоциативный индекс - 42,58+2,79; число ассоциаций на клетку с ассоциациями - 1,21+0,04 и число хромосом в одной ассоциации - 2,07+0,01.

Сравнительное исследование экспрессии рибосомных генов у пло-дой мужского и кенекого пола не показало статистически значимых различий между ними. ■

Для тою, чтобы выяснить зависимость функциональной активности ЯОР хромосом эмбрионов от степени огягощенности акушерского анамнеза матери было проведено сравнительное изучение экспрессии рибосомных генов У 27 спонтанных абортусов при спорадических случа ях невынашивания беременности и у 36 спонтанных абортусов, полученных от изншйй с привычным невынашиванием. Установлено, что суммарная активность ЯОР хромосом в первом Случае составила 21,42+0,37 балла, а во втором - 21,17+0,29 (Р>0,05). Таким образом, активность рибосомных генов эмбрионов не связана с характером невынашивания беременности матерй.

Для Цитогенетического исследования у спонтанных абортусов использовали кояно-мышечные фрагменты, а при отсутствии эмбриона или его мацерации - эстразмбриоиальяые ткани зародышевых мешков. Поэто-

му, учитывая возможное' влияние разного тканевого происхождения фиб-

роблаегов на активность рнбосомных генов, был проведен сравнительный анализ активности ЯОР в культивируемых фибробластах, происходивших как из зародышей, так и иа зародышевых мешков. Этот анализ проводился по показателю суммарной активности ЯОР.на геном вследетали его большей информативности (табл. 1).

Как видно из табл. 1 активность ЯОР в клетках акстразмбриона-льных тканей выше, чем в фиброблаотах, полученных из тканей зародышей. Однако, эти различия не являются статистически достоверными (ио.бб; П-27; Р-0,34 и ^0,87; п-63; Р-0,34 соответственно для обоих полов). Следовательно, тканевое происхождение фибробластов не оказывает существенного влияния на активкоо-гь ЯОР : у спонтанных абортусов.

Таблица 1 ■

Суммарная активность ЯОР иа геном у спонтанных абортусов разного пола в фибробдастан различного тканевого происхождения

1 | Тип • ■ 1 Шл | 1 1 | Оушарная актив- (

( ткани зыОриона | Чиодо ( ность ШР |

1 I ( ( X ± ггО 1 1 1

1 (Эмбриональная, Мук. 24 1 1 | 20,74 + 0,31 . I

)кожно-мышечная йен. 20 | .21,44 + 0,43 |

1 1 Ыуи. + Язв. 44 | 21,10 + 0,26 |

г ¡Экстраэмбрио- Муж.- Б 1 | 1 21,54 + 1,32 |

¡нальная, плод- Кен. 16 1.21,67+0,48 |

ные оболочки 1 Муж. + Кен. 21 | 21,64+0,44 ( 1 : _ )

В группе ояо?гранныя абортусов нз обнаружено статистически значимых различий по активности рибосомных генов.мэзду отдельными хромосомами. Частота встречаемости ЯОР Хромосом, оцениваемых в.4 балла, была невелика и составила всего 5,96+0,70% от всех проанализированных хромосом. Нз. было обнаружено и двойных ЯО? в. изученной

группе эмбрионов.

б- Активность ЯОР хромосом в группе спонтанных абортусов с аномальным [сариотипом. Анализ литературы позволяет считать, что хромосомны» аберрации могут изменять различные свойства самих клеток, включая их морфологические, физиологические и метаболические особенности (Boue et al., 1068, Кулиев, 1976). Рибосомная РНК составляет до 80% РНК клетки. Поэтому выяснение связи хромосомного дисбаланса эмбриона с функциональной активностью рибосомных генов представляет больной интерес. С этой целью была' последовала активность пдрышкообразущих районов хромосом у 26 спонтанных абортусов с аномальным кариотилом. Возраст эмбрионов варьировал от б до 20 недель и в среднем составил 9,4+0,8 недели. Средний пассаж культивируемых фибробластоа составил 3,5+0,4. Для цитогенетического изучения были взяты в основном экстраэмбриональные ткани: плодные оболочки (92,41) и хорион (3,8%); кожно-мышечные фрагменты составили 3,8%. .

Активность ядрышкообразуюздх районов хромосом исоледовали в клетках с разными тппаш хромосомных аномалий (табл. 2). Приведенные данные свидетельствуют о том, что в фибробластах эмбрионов с аномальным кариотипом суммарная активность ЯОР на геном варьирует от 19,2 до 24,7 баллов. Активность ЯОР хромосом у абортусов с трип-лоидным кариотипом значительно выше по сравнению с эмбрионами с иными типами хромосомных аномалий и составляет 34,36+1,98 балла. Сравнительный статистический анализ показал, что суммарная активность ЯОР на геном и количество активных ЯОР на ¡слетку у эмбрионов с триплоидией достоверно выше (Р<0,001), чем у абортусов с другими типами хромосомных нарушений.

Суммарная активность рибосомных генов у спонтанных абортусов с трисомией по 21 хромосоме составила 24,65 балла, что статистически достоверно выше, чем у спонтанных абортусов с аномальным кариотипом, не имеющих дополнительную акроцентрическую хромосому (t=2,4; п-9; Р-0,04). Наши результаты по активности ЯОР у пренатально погибших плодов с синдромом Дауна согласуется о литературными данными о повышенной активности ЯОР у выживших больных о этим синдромом (Murthy, 1987; Wegrter et al., 1980; Еголина и др., 1990).

Анализ ассоциативной способности акроцентрических хромосом в фибробластах с трисомией хромосом 21, 22, 14 и 15 показал, что про-

цент клеток с ассоциациями акроцентркческих хромосом составил 52,85 +10,1?, среднее число ассоциаций на клетку с ассоциацией -1,26+0,23, а количество хромосом в ассоциации - 2,08+0,03. Эти показатели близки к таковым при других типах хромосомных аберраций (табл. 2). .

■ Да настоящего времени нет однозначного ответа о влияний дополнительных коаиий рибосомкья генов на фенотип индивидов. Одни авторы считает, что повышение количества Ag-положительных ЯОР ведет к аномалиям кариотипа (Guanti et al,, ' 1976), к патологии гаметогенеза (¡.'artin-Lucas et al., 1986) и повторным выкидышам (Perer-Castillo et al., 1985). Другие исследователи показали, что риск рождения детей с -аномальным кариотилом у носителей бисателлитной дополнительной хромосомы невелик (Steinbach et al., ' 1983). Наш данные по активности -ЯОР, полученные непосредственно на абортивном материале показали, что в большинстве случаев появление дополнительных ЯОР увеличивает суммарную активность рибосомных генов, поскольку дополнительные. копии данных генов являются транскрипционно активными. Тип хромосомной аберрации, за исключением триплоидий, не влияет на активность ЯОР хромосом у абортусов.

. Степень активности ЯОР хромосом 13, 14, 16, 21, 22, так же как и частота акроцентрических хромосом, несушцх Ав-окрашенные ЯОР, статистически достоверно не отличаются между отдельны;,ш хромосомами. Только у одного абортуса была обнаружена во всех изученных Iслетках хромосома, несушая двойные ЯОР. Процент хромосом с- ЯОР, оцениваемых .в 4 балла, составил 7,44+1,04.

7. Сравнительный анализ функциональной активности ЯОР- хромосом в группах медицинских и спонтанных абортусов с нормальным кариоти-пом. Б литературе высказывались предположения о' ссязи некоторых вариантов ЯОР и, в частности, двойных ЯОР с нерасхоэденйем хромосом и гибелью плода (Jackson-Cook et al., 1985; Shaham et al., 1986) не нашедшие, однако, подтверждения в других работах (Hessok) et al., 1S87; Ковалева, Новикова, 1989). Относительно недавно бьцга высказано предположение о существовании у человека еиготического или раннего эмбрионального отбора, обеспечивающего поддержание необходимого для нормального развития особи числа копий рибосомных генов пу-icM комбинирования ядрышкообразующих хромосом с раэнш содержанием числа генов рРНК в ЯОР (Ляпунова и др., 1988). Для исследования се-

Таблица 2

йфактеристика активности ЯОР крокет* фибрсб^аигоэ з группе споитанных абортусов с аномальным карко.млом

Тип аномалии

-1-

Ауто-| 21 сонная | 16 трисо-| 22 мня | 14 с лиш-| 15 ней | ' 2 хромо-| 8 сомой )1б,8

Число

Дитогенетические показатели (X + т)

~г

~г

Е(+) I NAB(+)| АИ

4-

24.65+1,49|9,41+0(27|60,00+7,07 21,03+1,06 i 8,81+0,29134,43+8,85

Ас/МП | Хр/Ас

4 4 1 1 1 1 1 1

1,48+0,1312,04+0,04 1,48+0,2412,07+0,04

24,7 1 9,2 | 80 | 1,75 2,14

19,2 1 8,4 | 50 | 1,2 2,17

20,5 ! 10,0 | 0 I 0 ' 0

21,1 1 9,3 1 33,3 | 1,67 2,0

22,7 . 1 9,4 | 44,4 | 1,0 3,0

21,5 1 9,2 | 60,0 | 1,33 2,0

----,__-,-

22,33+0,70|9,24+0,19|46,11+5,98

Всего:

14

1,34+0,1312,15+0,07

Х-моносо-мия

4

I

22,48+0,33|9,43+0,28|57,35+6,71

•1,17+0,0912,06+0,06

Триплоидия | б __1_

34,36+1,98Ц4.4+0,65)71,22+14,4|1,69+0,35|2,18+0,Об j_ ~ i_i_t__j_i_

Структурные перестройки хромосом

Транйлока- | 1

ция 1/10 | 1 | 23,2 i 9,6 50.0 1.0 2,2 I

4б,Х, Yqs | 1 1 22,3 9, б 50,0 1.8 2Д. I

46,XX, |

t( 15; 16) | 1 | 23,0 с 9,0 50,0 1,33 2,0 . |

всего j 3 ^22,83+0,27 j ~~ 9,40+0,20 50,00+0,00 1,38+0,23 2,17¿0,03|

Медицинские |

абортусы | 50 (20,25+0.31 3,71+0,10 37,61+3;24 1,08+0.06 2.09+0.021

* - Р« 0,001; ** - Р< 0,004; *** - Р< 0,05

лективной роли меюшдивидуапьного полиморфизма функциональной активности рибооомньи генов было проведено сравнительное изучение активности ЯО? у спонтанных и медицинских абортусов с формальным кариотипом. Достоверных различий между контрольной и опытной группами абортусов как по возрасту, так и по среднему пассажу культивирования клеток не выявлено (Р>0,05), -

На рис. 1 представлены результаты сравнительного исследования полиморфизма ЯОР хромосом в двух группах абортусов по критерию сум-

Рис. 1. Распределение суммарной функциональной активности ри-босомных генов у спонтанных (¡ЩОТрная ЛИНИЯ) и медицинских (Ш0;~ ■ИВая ЛИНИЯ 0 абортусов. По оси абсцисс - суммарная активность ЯОР в баллах; по оси ординат - количество абортусов в X.

маркой функциональной активности всех 10 ЯОР. Видно, что распределение суммарной активности ЯОР на геном в группах медицинских и

спонтанно ^сортированных эмбрионов лекит в сходных пределах и имеет несколько еольаай размах у медицинских абортусов - от 15,6 до 28,4 балла. Однако распределение исследуемого показателя в опытной группе эмбрионов смещено правее относительно распределения суммарной активности ЯОР индуцированных абортусов. Суммарная активность ЯОР на геном у спонтанных абортусов составила 21,38+0,32 балла, а у медицинских - 20,25+0,31. Это различие статистически достоверно (из,оа. п-118; Р-0,003). Различие мевду исследуемыми группами наблюдается тают и по числу активных ЯОР на клетку - 8,99+0,08 и 8,71 +0,10 для опытной и контрольной групп соответственно (1-2,.25; п-118; Р-0,03). По другим изученным показателям - ассоциативному индексу, числу ассоциаций хромосом на метафазную пластинку и числу хромосом в ассоциации различий мезду ними не обнаругюно.

• На рис. 2 представлены данные по активности отдельных акроцен-трических хромосом в двух исследованных группах абортусов. В группе медицинских эмбрионов четко проявляется межхромосомный полиморфизм. В группе спонтанных абортусов по всем акроцентрическим хромосома!,! происходит возрастание активности ЯОР до определенного уровня, при котором нет статистически значимых различий по степени активности отдельных ЯОР. Хромосомы 16 и 14, обладающие в контрольной группе -умбрнонов наименьшей активностью ЯОР, обнаруживают в опытной группе наиболее сильное и статистически значимое повышение экспрессии ри-босомных генов 23 и 2,00 соответственно; п-94; Р<0,05). Средняя активность ЯОР на хромосому, в группе спонтанных абортусов (2,14 +0,03) достоверно выше таковой у медицинских абортусов (1,88+0,04; Р<0,05).

Сравнительный анализ показал, что у спонтанно абортированных эмбрионов обоих полов отмечается увеличение.транскрипционной активности рибосомных генов по сравнению с индуцированными абортусами, однако это различие статистически значимо только для эмбрионов менового пола (1-3,20; п-55; Р-0,002) и не достигает границы статистической значимости у абортусов мужского пола (1-1,31; п-61; Р-0,19). '

Сравнительное исследование экспрессии рибосомных генов фиброб-ластов разного тканевого происхождения в данных группах эмбрионов показало, что активность ЯОР у медицинских абортусов достоверно нигде активности ЯОР спонтанно абортированных эмбрионов как для фиб-

ЕИ 13 • ИЗ 14 ^ 15 Ш 21 ЁЭ 82 '

Рис. 2, Степень активности ЯОР отдельных акроцектрических хромосом у медицинских (А) и спонтанных (В) абортусов. По оси абсцисс указаны акроцентрические хромосомы (13, 14, 16, 21 и 22): по оси ординат - средняя активность ЯОР (в баллах).

робластов, происходивших из кожно-мышечных фрагментов (1-2,07; п»92; Р<0,05), так и для фибробластов плодных оболочек (1-2,38; п-69; Р<0,05). Это различие обусловлено в основном за счет статистически достоверного повышения активности ЯОР в эмбриональных и зкс-траэмбриональных тканях эмбрионов женского пола (Ъ-2,68; п-35; Р<0,05 и 1-2,73; п-34; Р<0,01 соответственно), а не мужского (Ь-0,73; п-55; Р-0,47 И 1-0,85; п-33; Р-0,40 соответственно).

8. Сравнительный анализ активности ЯОР хромосом в группах медицинских и спонтанных абортусов с аномальным и нормальным кариоти-пами. Известно, что хромосомный дисбаланс влечет за собой реорганизацию всего генома, ватрагиваадую множество функций генетического • аппарата (Монахова, 1990). Для того, чтобы определить, происходит

ли изменение активности рибосомных генов в аберрантных клетках был проведен сравнительный анализ функциональной активности ЯОР хромосом фибробластов в группах медицинских и спонтанных абортусов с нормальным и аномальным кариотипом.

Сравнительный анализ активности ЯОР • хромосом у абортусов с трисомиями аутосом, Х-моносомией, триплоидией, структурными перестройками, и медицинскими эмбрионами, показал повышение уровня активности рибосомных генов во всех группах спонтанных абортусов с хромосомным дисбалансом. Статистически значимое увеличение функциональной активности ЯОР хромосом отмечается для спонтанных абортусов с триплоидкым кариотипом по трем параметрам: суммарной активности ЯОР на геном (Р<<0,001), среднему числу Ад-положительных ЯОР на клетку (Р<<0,001), ассоциатквновному индексу (Р<0,004). Спонтанные абортусы с кариотипом 45,X отличаются от медицинских абортусов только по числу активных ЯОР на клетку (Р<0,05) (табл. 2). Спонтанные абортусы с трисомией акроцентрических хромосом статистически достоверно отличаются от медицинских эмбрионов по Двум параметрам:, суммарной активности ЯОР на геном (Р<0,001) и числу активных ЯОР на клетку (Р<0,01).

Спонтанно абортированные эмбрионы с трисомией по акроцентри-ческим хромосомам и триплоидией составляют существенную часть всех изученных спонтанных абортусов. Поэтому для сравнительной оценки степени экспрессии рибосомных генов клеток с дисбалансом ЯОР-несу-щих хромосом и клеток с отсутствием этого дисбаланса была проведена коррекция значений параметров функциональной активности ЯОР в клетках с аномальным кариотипом к нормальному кариотипу, в расчете на 10 акроцентрических хромосом путем вычитания средней активности ЯОР одной дополнительной акроцентрической хромосомы. Средняя суммарная^ активность ЯОР на геном и количество активных ЯОР на клетку у спонтанных абортусов составили 21,84+0,47 и 9,10+0,14 соответственно и статистически достоверно превышают Значения соответствующих показателей у медицинских абортусов (Ь-2,00; п-74; Р-0,05; И 1-2,33; п-74; Р-0,02; соответственно). Ассоциативный индекс у спонтанно абортированных эмбрионов тага» статистически значимо отличается от аналогичного показателя у индуцированных абортусов (1>2,80; п-74; Р-0,007). • По двум другим параметрам, характеризующим ассоциативную активность акроцентрических хромосом, достоверных различий между

- 20 -

рассматриваемыми группами абортусов не выявлена.

Сравнительный аналиа активности ЯОР хромосом фибробластов спо^ втанньс: абортусов о нормальным и аномальным кариотипами не выявил между ними статистически Бначимых различий' ни по одному из иссдедо-1 ванных параметров. Наш данные по ассоциативной способности акро-центрических хромосом не подтверждают предположения некоторых авторов (Jackson-Cook et al., 1Q85; Robinson et al., 1977; Новикова, 1937) о повышенной ассоциативной способности акроцентрических хромосом у эмбрионов с трисомиями и влиянием этой способности на процесс. нерасхоидения хромосом у родителей.

Рис. 3. Распределение догсазагеля суммарной активности ЮР на геном в фибробластах спонтанных и медицинских абортусов. 1 - медицинские эмбрионы, 2 - спонтанные абортусы с нормальным кариотипом, 3 - спонтанные абортусы с аномальным кариотипом (пересчет на диплоидный карютип). Ш оси абсцисс - суммарная активность ЯОР в баллах; по оси ординат - количество абортусов в X.

На рис. 3 представлено распределение суммарной активности рн-

босомных генов в фибробластах трех исследованных групп абортусов. Видно, что фибробласты от спонтанных абортусов с хромосомным дисбалансом очень сходны с фиброблагтами от спонтанных абортусов с нормальным кариотилом как по абсолютным значениям изученного показателя, так и по характеру его распределения. Эти распределения смещены в сторону более, высоких значений относительно распределения суммарной активности' . ЯОР хромосом медицинских абортусов. Это увеличение функциональной активности рибосомных генов обусловлено одновременным повышением среднего числа активных ЯОР на клетку и возрастанием активности ЯОР по веем акроцентрическим хромосомам. Широкий размах варьирования активности ЯОР хромосом, выявленный нами при изучении функционирования рибосомных генов в эмбриональных фибробластах, как медицинских, так и спонтанных абортусов, свидетельствует о болызих потенциальных синтетических возможностях рибосомных генов, организованных по типу мультигенов.

Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что активность ЯОР хромосом в фибробластах спонтанных абортусов, как с нормальным, так и аномальным кариотипом статистически достоверно превышает таковую в фибробластах медицинских абортусов.

Механизмы повышения транскрипционной активности ЯОР хромосом в -фибробластах спонтанных абортусов не ясны. Повышенная активность рибосомных генов у спонтанных абортусов по сравнению с медицинскими абортусами может быть обусловлена: 1) увеличением скорости транскрипций pPffit на матричных рДНН без изменения количества последних за счет повышения активности и эффективности связывания FHK-полиме-ра?ы I (Сароа et al, 1988); 2) подключением дополнительных цистра-нов рДЕЕ, ранее инактивированных. Одним иг возможных механизмов, участвующем а этом процессе может быть деметилиров&ниэ рибосомных гёнов (Tantravahi et. al. ,1981; Ferraro, Prantera, 1988; Барановская и др. 1990); 3) гиперрепликацией рДНК (Магакян и др., 1991); 4) комбинированием ЯОР родительских хромосом, в результате чего в вкготу попадают преимущественно акроцентрические хромосомы, несущие Bb'co-J кокопийныэ варианты ' ЯОР.

Как сказывается на жизнеспособности клеток, организма в целом усиление транскрипционной активности рибосомных генов? Шжно предположить два объяснения обнаруженного феномена

Во-первых, возможно, что повышение функциональной активности

ЯОР у спонтанных абортусов является адаптивной реакцией генома фибробластов и способствует сохранению их жизнеспособности, что проявляется в способности к длительному росту в культуре. Наши исследования функциональной активности ЯОР хромосом эмбриональных фибробластов в процессе длительного культивирования клеток не выявили существенных изменений активности рибосомных генов ии у индуцированных абортусов, нй у спонтанно абортированных эмбрионов с нормальным кариотилом. Ранее рядом авторов (Boue et al., 1975; Кулиев, 1976), отмечалась выраженная пролиферативная способность фибробластов с аномальным кариотипом в период активного роста. Собственные данные показывает, что в фибробластах с хромосомными аберрациями уровень активности ЯОР в целом выше, чем в диплоидных фибробластах медицинских-абортусов, и характер хромосомной аномалии не.оказывает влияние на активность ЯОР хромосом. В наших исследованиях не было обнаружено эмбрионов, у которых показатель суммарной активности ЯОР на геном был ниже 15 баллов у индуцированных и ниже 17 баллов у спонтанных абортусов. Возможно, что фибробласты, у которых суммарная активность ЯОР на геном низке 17 баллов более чувствительны к действию тератогенных факторов в критические периоды эмбриогенеза и погибают на ранних этапах развития зародыша. Таким образом, можно предположить, что обнаруженное повышение функциональной активности ^ ЯОР хромосом фибробластов спонтанно абортированных абортусов как с нормальным, так и аномальным кариотипом по сравнению с фиброблаета-ми медицинских абортусов может являться одним из звеньев в адаптивной реакции клеток при действии неблагоприятных, средовых и генетических факторов. В этой связи представляют интерес данные, полученные ЛИ Барановской с соавт. (1991), по выявлению активных и "молчащих" копий рибосомных генов в геноме человека Они полагают, что наличие резервных неактивных копий рибосомных генов может быть важным фактором в поддержании гомеостаза клетки и адаптивных способностей организма.

Альтернативное объяснение обнаруженного явления может заключатся в том, что повышенная активность рибосомных генов является одной из причин гибели зародышей. Полученные результаты показывают существование полового диморфизма связи между повышенной активностью рибосомных генов и пренатальной смертностью -у человека. Если у эмбрионов мужского пола такой связи не обнаруживается, то у эмб-

рйонов женского пола она выражена достаточно ясно. Поскольку активность рибосомных генов в женском организме, по видимому, в значительной степени включена в полигенные системы, детерминирукжце .жизненно в&тю количественные морфофизиологичеекие признаки, а в мугмжом организме это включение вырадано существенно слабее (Наза-ренко с соавт. , 1990), то следует ожидать и разную интенсивность отбора .организмов разного пола в случае отклонения от оптимального для гяюнедеятельности клеток числа активно транскрибируемых копий рибосомных генов. У венских организмов эта интенсивность отбора должна быть сильнее, а у мужских - слабее, что, возможно, и находит свое подтверждение в результатах настоящего исследования.

Наблюдаемое в нашем материале повышение активности рибосомных генов у спонтанных абортусов по всем акроцентрическим хромосомам с исчезновением межхоомосомных различий по степени активности отдельных ЯОР, существующих в контрольной группе эмбрионов, может указывать на справедливость обоих предположений. Решение этого Еопроса требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

Впервые с использованием метода Act-окраски хромосом проведена оценка функциональной активности рибосомных генов в культивируемых in vitro фибробластах медицинских и спонтанных абортусов с нормальным и аномальным кариотипом.

1. ОЗнарудано достоверное повышение суммарной активности рибосомных генов в фибробластах спонтанно абортированных эмбрионов с нормальным кариотипом по сравнению с фибробласташ медицинских абортусов. Повышение активности ЯОР более выравэно у абортусов кенского пола, по сравнению с мукским.

2. Показано, что спонтанные абортусы с аномальным кариотипом, после корректировки значений средней активности ЯОР и приведения ее к нормальному кариотипу, имеют повышенную активность ЯОР по сравнению с индуцированными абортусаш. Швду спонтанными абортусаш с аномальным и нормальны),! кариотипом нет статистически значимых раз--личий в активности HOF хромосом..

.3. Повышение активности рибосомных генов у спонтанных, абортусов происходит за счет увеличения средней аетивности ЯОР всех акро-

центрических хромосом. ' Дополнительные акроцентрические хромосома у абортусов с трисомиями и триплоидией имеют транскрипционно активные ЯОР.

4. На активность рибосомных генов в фибробластах спонтанных абортусов не оказывает влияние характер невынашивания беременности у матери (спорадическое или привычное), тканевое происхождение фиб-робластов (эмбриональные или зкстраэмбриональные), тип хромосомной аберрации.

5. У эмбрионов с трисомиями не выявлено повыиекной ассоциативной способности акроцентрических хромосом. Не отмечено и вклада двойных ПОР в эмбриональную гибель плодов.

6. Показано, что на протяжении двадцати пассажей уровень активности ЯОР хромосом фибробластов как в группе индуцированных абортусов, так и в группе спонтанных абортусов с нормальным карио-типом существенно не изменяется.

Список работ, опубликованных па теме диссертации

1. Карташева O.P. Активность ядрышксобразуюшх районов хромосом в раннем эмбриогенезе человека//Материалы. I конф. НШМГ ТНЦ АМН СССР. Томск. 1989. С. 14-15.

2. Mazarenko S. А. , Kartasheva 0. 6. Nucleolus organizer region variants in man and prenatal select ion//Abstracts XVI Inter. Congress of Genetics. Toronto. 1988. V. 30. suppl. 1. P. 74.

3. Карташева О. Г, Активность ядрышкообразущих районов хромосом и эмбриональная гибель у человека//Тез. докл. III Национ. конгресс по мед. биологии и генетике. Варна. 1990. С. 43.

4. Наэаренко С. А. , КарагеоргиД Е Я , Карташева О. Г. Структурно-Яункциональный полиморфизм хромосом и пренатальный отбор у .человека //Тез. дом. II Есееоюзн. съезд мед. генетиков. Алма-Ата. 1990. С. 313-314.

5. Наэаренко O.A., . Карташева 0. Г. Сравнительный анализ активности ядрышкообраеуювдх районов хромосом у спонтанных и медицинских е£юртусов//Генетика. 1991. Т. 27.- N 6. С. 1095-1103.

с^г'