Исследование связи инактивации Х-хромосомы с эмбриолетальностью у человека

Евдокимова, Виктория Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование связи инактивации Х-хромосомы с эмбриолетальностью у человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование связи инактивации Х-хромосомы с эмбриолетальностью у человека"

их'

На правах рукописи

/] 1 -к ¿Ж

ЕВДОКИМОВА Виктория Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ С ЭМБРИОЛЕТАЛЬНОСТЫО У ЧЕЛОВЕКА

03.00.15-Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2000

Диссертация выполнена в лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.А. Назаренко

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор В.В. Ляхович

кандидат биологических наук В.А.Степанов

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики

СО РАН (г. Новосибирск)

Защита диссертации состоится "_'\илшг_ 2000 года в_час._мин.

на заседании диссертационного совета К001.49.01 в НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН по адресу: 634050 г.Томск, набережная р.Ушайки, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г.Томск

Автореферат разослан "ХГ" ЛяЛ-О-А-Л 2000 года Ученый секретарь

диссертационного совета .

кандидат биологических наук Л.К.Крюкова

-УХ . Я/, О

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вопрос об избирательной гибели эмбрионов разного пола в связи с функционированием половых хромосом у человека уже давно обсуждается в литературе. Многими авторами было показано, что величина показателя «соотношение полов» у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, погибших до 20 недель беременности, уменьшается, с заметным преобладанием зародышей женского пола [Сагг, 1971; Hassold et al., 1980; Lin et al., 1985; Eiben et al., 1990; Назаренко, 1993]. Некоторые авторы считают это следствием контаминации долговременных культур эмбриональных фибробластов материнскими клетками [Griffin et al., 1997; Smith et al., 1998; Bell et al., 1999]. Однако, ряд работ, выполненных с использованием прямых цитогенетических методов анализа тканей спонтанных абортусов, свидетельствуют о неслучайности такого отклонения в соотношении полов [Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990].

Х-хромосома имеет особенно большое значение на самых ранних этапах эмбриогенеза. Дифференцировка тканей у самок млекопитающих связана с , переходом от биаллельной экспрессии большинства Х-сцепленных генов к моноаллельной в результате генетической инактивации одной из X-хромосом, обеспечивающей компенсацию дозы Х-сцепленных генов между полами [Monk, Harper, 1978; 1979]. Инактивация Х-хромосомы у видов с гетерогаметным полом происходит в раннем эмбриогенезе и, установившись однажды, неактивное состояние Х-хромосомы наследуется во всех последующих клеточных генерациях [Lyon, 1961]. Инактивация X-хромосомы связана с такими эпигенетическими механизмами контроля экспрессии генов как метилирование ДНК и геномный импринтинг. У сумчатых во всех тканях [Kaslow, Migeon, 1987], а у грызунов в экстраэмбриональных тканях [Takagi et al., 1982; Wake et al., 1976] обнаружена импринтированная инактивация отцовской Х-хромосомы, что связывают с необходимостью предпочтительной экспрессии материнских X-сцепленных генов для формирования плаценты и живорождения [Lyon, 1989]. Однако для человека не получено однозначных данных об избирательной экспрессии генов Х-хромосомы одного из родителей в тканях трофобласта. Имеются данные как о случайной инактивации X-хромосом во всех тканях у человека [Migeon et al., 1986; Migeon, 1994; Looijenga et al., 1999], так и об избирательной инактивации отцовской Х-

хромосомы в трофобласте [Migeon, Do, 1978; Ropers et al., 1978; Harrison 1989; Goto et al., 1997]. Учитывая функциональную значимость импринтированной инактивации Х-хромосомы в эмбриогенезе многих видов млекопитающих, не исключено, что однородительское наследование отцовской или материнской Х-хромосомы и/или предпочтительная инактивация Х-хромосомы одного из родителей могут вносить определенный вклад в раннюю эмбриональную летальность у человека.

Завершающим и важным в онтогенезе этапом процесса инактивации X-хромосомы является поддержание ее неактивного статуса в течение жизни индивида в последующих клеточных делениях, что, по мнению большинства исследователей, обеспечивается метилированием цитозина в специфичных сайтах ДНК. Поддержание статуса метилирования ДНК требуется для нормального эмбрионального развития мышей [Li et al., 1992]. Показано также, что аберрантное метилирование ДНК ассоциировано с большинством опухолей и аномалиями развития у человека [Yoder et al., 1996]. Основными сайтами метилирования ДНК являются CpG-последовательности. Метилирование ДНК в этих сайтах коррелирует с неактивным состоянием Х-сцепленных генов и стабилизирует неактивное состояние Х-хромосомы [Grant, Chapman, 1988; Gartier, Riggs, 1983]. Так как активное состояние обеих Х-хромосом не совместимо с нормальной дифференцировкой тканей [Monk, Harper, 1979], то гипометилирование ДНК второй Х-хромосомы может приводить к нарушению нормального развития организма. Таким образом, не исключено, что избирательная гибель эмбрионов женского пола на ранних этапах онтогенеза может быть ассоциирована с возможными нарушениями такого важного для нормального развития женских и отсутствующего у мужских зародышей процесса, как инактивация X-хромосомы.

Одним из Х-сцепленных генов с CpG-островком в области промотора является ген рецептора андрогенов человека (Androgen Receptor - AR), локализованный на длинном плече Х-хромосомы в районе Xqll-12 [Migeon et al., 1981; Brown et al., 1989]. Метилирование Hpall и Hhal сайтов, расположенных вблизи CAG-тракта гена, жестко коррелирует с неактивным состоянием Х-хромосомы, а высокий полиморфизм этого участка позволяет достаточно эффективно различать Х-хромосомы разного родительского происхождения [Allen et al., 1992]. В связи с этим, ген рецептора андрогенов представляет удобную модельную систему для оценки не только уровня метилирования ДНК, но и характера Х-инактивации (Избирательная,

асимметричная, равновероятная) при использовании метилчувствительной

ПЦР.

На основании вышеизложенного можно заключить, что исследование характера наследования, инактивации и статуса метилирования ДНК X-хромосом, т.е. процессов, связанных с эпигенетическим контролем экспрессии генов, у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, по-видимому, может прояснить причины эмбриолеталыюсти у человека.

Цель работы заключалась в исследовании связи эпигенепгческой инактивации Х-хромосом и молекулярного полиморфизма некоторых X-сцепленных локусов с селективной гибелью эмбрионов с кариотипом 46,XX у человека.

Задачи исследования:

1. Провести цитогенетическое обследование спонтанных абортусов первого триместра беременности и создать банк ДНК семей, имеющих спонтанно абортированные эмбрионы с кариотипом 46,XX.

2. Исследовать полиморфизм и оценить информативность локуса тринуклеотидных САв-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов у населения западно-сибирского региона России.

3. Изучить родительское происхождение Х-хромосом у спонтанно абортированных эмбрионов, с анализом однородительской дисомии по X-хромосоме.

4. Оценить характер Х-инактивации и, в частности, частоту асимметричной инактивации Х-хромосомы у спонтанных и медицинских абортусов с кариотипом 46,XX.

5. Исследовать статус метилирования САО-тракта гена рецептора андрогенов у индуцированных и спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX.

6. Изучить связь генетической вариабельности тринуклеотидных САО-повторов в первом экзоне гена рецептора андрогенов с эмбриолеталыюстью у человека.

Научная новизна

В работе впервые показано, что максимальный вклад в различия трех групп спонтанных абортусов (спонтанные абортусы с развитым эмбрионом, неразвивающиеся беременности и анэмбрионии) вносят трисомии аутосом,

триплоидия и кариотип 46,ХУ. Установлено, что у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом уменьшение показателя «соотношение полов» по мере нарастания тяжести нарушения развития эмбриона связано с постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46,ХУ относительно ожидаемой и не зависит от частоты эмбрионов с кариотипом 46,XX. Высказано предположение что, экспрессия генов материнской X-хромосомы у ХУ-зародышей обеспечивает более стабильное их развитие в раннем эмбриогенезе по сравнению с ХХ-эмбрионами, нормальное развитие которых сопряжено с механизмом компенсации дозы Х-сцепленных генов, что повышает вероятность его нарушения у зародышей женского пола. Показано, что у спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX по мере нарастания тяжести нарушения эмбрионального развития увеличивается доля зародышей с асимметричной инактивацией Х-хромосом. Не установлено существенного вклада однородительской дисомии по X-хромосоме в пренатальную гибель зародышей человека. Показано что, уровень метилирования ДНК Х-хромосом в тканях трофобласта не отличается у спонтанно погибших и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX. Впервые для популяции Западной Сибири охарактеризован полиморфизм локуса тринукпеотидных повторов первого экзона гена рецептора андрогенов и показана ассоциация генотипов, содержащих небольшое число САО-повторов, с эмбриональной летальностью.

Практическая значимость работы

Полученные в ходе настоящего исследования данные по молекулярному полиморфизму САО-повторов гена рецептора андрогенов можно использовать при медико-генетическом консультировании. Поскольку однородительское наследование Х-хромосом не вносит существенного вклада в раннюю эмбриональную гибель у человека, то нет необходимости его анализа при исследовании причин спонтанного прерывания беременности. Найденная ассоциация частоты генотипов локуса тринуклеотидных повторов гена рецептора андрогенов с минимальным числом САО-повторов с эмбриональной летальностью у человека требует дальнейшего выяснения характера данной взаимосвязи с целью выявления семей с высоким риском невынашивания беременности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уменьшение показателя «соотношение полов» у эмбрионов с нормальным кариотипом в ряду: спонтанные абортусы без выраженной задержки внутриутробного развития - неразвивающиеся беременности -анэмбрионии, связано с постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46,XY.

2. Однородительская дисомия по Х-хромосоме не вносит существенного вклада в раннюю эмбриональную летальность у человека.

3. Уровень метилирования ДНК Х-хромосом одинаков у спонтанных и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX.

4. Распределение аллелей локуса CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов у населения западно-сибирского региона России, в отличие от других исследованных популяций, характеризуется более узким спектром аллелей и смещением модального класса в сторону большего числа тринуклеотидных повторов.

5. У спонтанных абортусов первого триместра беременности с кариотипом 46,XX преобладают генотипы с небольшим числом CAG-повторов гена рецептора андрогенов по сравнению со здоровыми женщинами.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на IV итоговой конференции НИИ медицинской генетики СО РАМН (Томск, 1997), научных чтениях, посвященных 100-летию профессора В.П.Чехова (Томск, 1997), второй европейской конференции цитогенетиков (Вена, 1999), международном симпозиуме по инактивации Х-хромосомы у млекопитающих (Новосибирск, 1999).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов собственных исследований с обсуждением по разделам, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 125 страницах текста, содержит 9 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 185 источников, из них 20 отечественных и 165 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал настоящего исследования был получен в результате цитогенетического анализа 342 спонтанно абортированных эмбрионов 5-12 недель развития. Для оценки влияния хромосомной конституции на нарушение пренатального развития зародыша все обследованные эмбрионы были разделены по клиническим и морфологическим признакам (с учетом результатов ультразвукового обследования беременных женщин), на три группы: собственно спонтанные аборты без выраженной внутриутробной задержки развития (CA), неразвивающиеся беременности (НБ) и анэмбриошш (АЭ). Число эмбрионов в этих группах составило соответственно 100, 176 и 66. Кариотип 46,XX установлен у 126 спонтанно абортированных зародышей. Контрольная группа была сформирована по результатам цитогенетического анализа 79 индуцированных абортусов 5-12 недель развития, взятых у женщин, не имевших отягощенного акушерского анамнеза. Кариотип 46,XX установлен у 37 индуцированных абортусов.

Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из плодных оболочек и ворсин хориона эмбрионов с кариотипом 46,XX (70 спонтанных и 37 индуцированных абортусрв). Для 52 спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX была получена ДНК или обоих родителей (40) или только матери (12). Для индуцированных абортусов во всех случаях была получена ДНК только матери. Для исследования популяционного полиморфизма локуса CAG-повторов гена рецептора андрогенов использовали ДНК, выделенную из лимфоцитов периферической крови неродственных здоровых индивидов, русских, проживающих в г.Томске (106 мужчин и 106 женщин).

Сегрегацию Х-хромосом оценивали при помощи ПЦР с использованием набора ДНК-маркеров, содержащих мини- и микросателлитные повторы: DXS52 [Richards et al., 1991], AR [Mutter, Boynton, 1995], DXS8377, DXS6784, DXS1189, DXS1188, DXS1187, DXS981 [GDB Probe Detail], Проверку на возможное наличие Y-хромосомы у зародышей проводили с помощью ПЦР-анализа с использованием Y-специфичных праймеров Y1 и Y2 [Witt, Erickson, 1989]. Олигонуклеотидные праймеры для локусов DXS8377, DXS6784, DXSI189, DXS1188, DXS1187, DXS981, DXS52, Y1 и Y2 были синтезированы фосфитамидным методом группой синтеза нуклеиновых кислот НИИ* медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, под руководством к.б.н. А.И.Кутмина. Праймеры для локуса AR были

кинированы флуорохромом ТЕТ (Perkin Elmer, USA). Для оценки характера инактивации и степени метилирования Х-хромосом использовали подход, основанный на амплификации высокополиморфного локуса AR при использовании в качестве матрицы образцов нативной ДНК и ДНК, предварительно ферментативно расщеплешюй метилчувствителыгыми эндонуклеазами Hha I или Нра II [Allen et al., 1992]. Продукты ПЦР фракционировали с помощью гель-электрофореза в агарозных и денатурирующих полиакриламидных гелях различной концентрации с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия, а также при помощи капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 (Perkin Elmer). В качестве среды для электрофореза использовали специальный полимер указанной фирмы (POP 4). Размер продуктов ПЦР определяли автоматически, исходя из размеров внутреннего ДНК стандарта GS500 TAMRA, с использованием программного обеспечения для генетического анализатора GeneScan.

Частоты аллелей, соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга, наблюдаемую и ожидаемую гетерозиготность и их ошибки вычисляли общепринятыми методами [Ли, 1978]. Среднюю квадратичную разность между размерами аллелей (d2cp) в группах вычисляли как: d2cp=l/N-I(ai- щ)2, где N - число индивидов, а; и aj - размеры аллелей, представленных в генотипе [Coltman et al., 1998]. Статистический анализ данных проводили с помощью критерия yj с поправками Мантеля-Ханзеля и Иейтса, критерия «отношение шансов» [Флейс, 1989] и F-критерия Фишера, с использованием программ «GrafPAD InStat», Version 1.12а («GrafPAD Software», 1990) и "Statistics v.5.0".

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Цитогенетическпе нарушения в группах спонтанных абортусов

На первом этапе работы проведено цитогенетическое обследование зародышей, погибших в первом триместре беременности. Средний возраст матерей в трех исследованных группах абортусов (CA, НБ, АЭ) составил 25,5+0,5 лет. Средний срок беременности также достоверно не различался между группами и составил 8,5±0,5 недель развития. Во всех трех обследованных нами группах спонтанных абортусов были выявлены зародыши, как с аномальными, так и с нормальными кариотипами, однако

частота хромосомных мутаций различалась в выделенных выборках и составила 22,0% для СА, 48,3% - для НБ и 48,5% - для АЭ. Хромосомые нарушения во всех группах были представлены трисомиямн аутосом, триплоидией, тетраплоидией, моносомией X, транслокациями и смешанными типами мутаций. Статистический анализ таблицы сопряженности частот различных кариотипов с клинико-морфологическими группами спонтанных абортусов показал, что три выделенные клинические группы пренатально погибших эмбрионов достоверно различаются между собой (х2=35,03; с1Г=12; р<0,001). Максимальный вклад в различия между выборками вносили трисомии аутосом, триплоидии и кариотил 46,XV. Таким образом, различия между тремя клиническими группами, отличающимися по степени тяжести нарушения эмбрионального развития, определяются как разными частотами хромосомных нарушений, так и разной частотой нормального 46,ХУ кариотипа. Последний факт вызывает существенный интерес, поскольку может отражать особые генетические причины пренатальной гибели эмбрионов с нормальным кариотипом, связанные с их половой принадлежностью и/или с импринтингом X-хромосомы.

3.2. Соотношение полов при ранней эмбриональной летальности у

человека

Интегральным показателем, который отражает различия в жизнеспособности организмов разного пола, является соотношение полов (СП) - отношение числа особей мужского пола к числу особей женского пола. Факторы, определяющие величину СП, остаются до настоящего времени не установленными. Поскольку на СП может оказывать влияние такой артефакт, как контаминация длительных культур эмбриональных тканей материнскими клетками, у 70 эмбрионов кариотип 46,XX, определенный цитогенетически, был верифицирован с помощью ПЦР-анализа ряда полиморфных аутосомных, Х- и У-сцепленных ДНК-маркеров. СП у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом составило 0,77 для СА, 0,60 - для НБ и 0,31 - для АЭ. Этот показатель для АЭ достоверно отличался, как от теоретически ожидаемого (1:1), так и от такового у медицинских абортусов (МА), который составил 1,11 (р<0,05). Соотношение полов у НБ достоверно отличалось от МА (р<0,05). СА по этому показателю не имели достоверных отличий, как от теоретически ожидаемого значения,

так и от МА (р>0,05). Традиционный подход к анализу факторов, влияющих на формирование СП в разных клинико-морфологических группах у спонтанных абортусов без учета кариотипически аномальных зародышей, не дает возможности оценить вклад нормальных 46,ХУ и 46,XX кариотипов в исследуемый показатель. По-видимому, более объективная оценка такого вклада может быть получена только при статистическом анализе всей выборки спонтанных абортусов, как с нормальным кариотипом, так и с хромосомными аномалиями (рнс. 1).

60 50 40 30 20 10 0

МА

СА

НБ

я ■

- /- Щ

- II Мм*

АЭ

Е23 46,ХУ П46,ХХ □ хромосомные аномалии

Рис. 1. Распределение частот 46,XX, 46,ХУ и аномальных кариотипов в трех группах спонтанных и контрольной группе медицинских абортусов.

Оказалось, что частота зародышей с кариотипом 46,XX достоверно не различается как между клиническими группами спонтанных абортусов, так и от контрольной группы индуцированных медицинских абортусов (р>0,05), в то время как указанные группы эмбрионов существенно отличались по частоте нормального мужского хромосомного набора 46,ХУ (р<0,01). Анализируя соответствие ожидаемых частот эмбрионов с кариотипами 46,XX и 46,ХУ, с реально наблюдаемыми для данных выборок, нель. * «е отметить, что эти частоты достаточно близки для зародышей женского пола. В то же время, для эмбрионов с кариотипом 46,ХУ наблюдается иная тенденция. Если в группе СА наблюдаемая частота эмбрионов с кариотипом 46,ХУ превышает ожидаемую (в 1,5 раза), а в группе НБ меньше, но

сопоставима с ней, то в группе АЭ наблюдаемая частота значительно меньше ожидаемой (в 1,9 раза). Таким образом, отличия по показателю СП среди разных клинических групп спонтанных абортусов обусловлены не избытком погибших зародышей женского пола, а недостатком эмбрионов с кариотипом 46,ХУ в группах НБ и АЭ. Кроме того, попарные сравнения МА с СА, НБ и АЭ показывают, что шансы выживания и, соответственно, нормального развития значительно выше для ХУ-зародышей, чем для XX. При этом шансы возникновения нарушений эмбриогенеза у ХУ-зародышей достоверно уменьшаются в ряду: спонтанные абортусы с развитым эмбрионом - неразвивающиеся беременности - анэмбрионии. Так, в частности, шансы возникновения АЭ по сравнению с шансами возникновения НБ у зародышей с кариотипом 46,ХУ практически в 2 раза ниже, чем с кариотипом 46,XX, а по сравнению с шансами возникновения СА они ниже в 2,5 раза. Иными словами, зародыши с кариотипом 46,ХУ имеют более высокие шансы успешно пройти критические этапы раннего эмбриогенеза, по сравнению с зародышами женского пола.

Большая жизнеспособность эмбрионов с кариотипом 46,ХУ на ранних стадиях эмбрионального развития, вероятно, объясняет их недостаток в выборках спонтанных абортусов и является основной причиной достоверного отклонения показателя СП у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом от теоретически ожидаемого. Данные, полученные на основе комбинации результатов статистического анализа с использованием критериев х2 и «отношение шансов» при сравнительном цитогенетическом обследовании групп абортусов, различающихся по степени тяжести нарушений пренатального развития, позволяют по-новому подойти к оценке механизма формирования СП на ранних этапах эмбриогенеза человека. Женский • и мужской хромосомные наборы отличаются между собой только составом гоносом. Учитывая тот факт, что У-хромосома практически содержит только гены, регулирующие закладку и развитие гонад по мужскому типу, и не влияет на развитие других органов и тканей, очевидно, что полученные результаты по анализу СП могут отражать особенности экспрессии генов Х-хромосом разного родительского происхождения. Так, у мужчин экспрессируются гены единственной X-хромосомы, полученной от матери, а женский организм является химерным по экспрессии Х-сцепленных генов, полученных от обоих родителей. Полученные данные дают основание предположить, что в раннем эмбриогенезе человека Х-хромосома материнского происхождения может

играть более важную роль, по сравнению с отцовской, и что Х-сцепленные гены материнского происхождения возможно избирательно (импринтированно) экспресснруются на ранних этапах эмбриогенеза непосредственно перед выделением дифференцированных клеточных линий.

3.3. Исследование однороднтельского наследования Х-хромосом у спонтанных абортусов с карнотипом 46,XX

Около половины спонтанных абортусов при цитогенетическом исследовании не обнаруживают хромосомных аномалий, и причины их гибели остаются не выясненными. Однако хромосомный набор, не несущий численных или структурных перестроек хромосом, не всегда является сбалансированным, прежде всего, вследствие явления геномного импринтинга. Импринтированная экспрессия генов может быть нарушена вследствие ряда причин и, в частности, как в результате однороднтельского наследования, так и избирательной инактивации, когда преимущественно одна из родительских Х-хромосом гетерохроматизируется во всех клетках организма или ткани.

Для проверки возможного вклада однородительской дисомии X-хромосом в эмбриолеталыюсть у человека исследовали характер наследования Х-хромосом в 52 семьях со спонтанными абортусами с кариотипом 46,XX. Сегрегацию Х-хромосом в семьях анализировали с использованием ПЦР семи полиморфных Х-сцепленных локусов. Нормальным считалось наследование в случае, когда эмбрион с кариотипом 46,XX, гетерозиготный по исследуемому локусу, однозначно наследовал по одному аллелю от каждого родителя. Во всех случаях, исключая два неинформативных, по всем исследованным локусам было обнаружено биродительское наследование Х-хромосом. Этот результат позволяет говорить о том, что однородительское наследование Х-хромосом не вносит существенного вклада в гибель эмбрионов 4-12 недель развития.

Вопрос о вкладе однородительской дисомии по Х-хромосоме в эмбриональную летальность у человека, однако, нельзя считать решенным окончательно, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, мы исследовали только те эмбрионы, ткани которых успешно прошли длительное культивирование - процесс, который, несомненно, может являться существенным фактором селекции против клеток с опреде-

ленными генетическими нарушениями. Во-вторых, импринтированную инактивацию отцовской Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях млекопитающих связывают с необходимостью экспрессии материнских X-сцепленных генов для имплантации, формирования плаценты и живорождения [Lyon, 1989]. Таким образом, не исключено, что эмбрионы с отцовской однородительской дисомией по Х-хромосоме могут быть неспособны к имплантации вследствие отсутствия продуктов импринтированных генов материнской Х-хромосомы и элиминируются на более ранних этапах развития.

3.4. Характер инактивации Х-хромосом в экстраэмбриональных тканях

и ранняя эмбриональная гибель зародышей с кариотипом 46,XX

Избирательная инактивация одной из Х-хромосом у женщин во всех клетках может приводить к псевдооднородительской экспрессии генов X-хромосомы при наличии нормального 46,XX кариотипа. Для большинства видов млекопитающих в экстраэмбриональных тканях характерна импринтированная инактивация Х-хромосомы, полученной от отца. Однако вопрос о наличии избирательной инактивации Х-хромосомы у человека до сих пор не решен однозначно. В настоящее время выделяют три типа X-инакгивации: равновероятную, асимметричную и избирательную. При равновероятной инактивации каждая из Х-хромосом репрессирована приблизительно в половине клеток. Асимметричная инактивация характеризуется гетерохроматизацией одной из Х-хромосом более чем в 80% клеток. При инактивации одной из Х-хромосом более чем в 95% клеток принято говорить об избирательной ее репрессии.

При исследовании характера гетерохроматизации Х-хромосом у спонтанных и индуцированных абортусов было выявлено два тина инактивации - равновероятная и асимметричная (рис. 2).

У спонтанных и индуцированных абортусов асимметричная инактивация одной из Х-хромосом наблюдалась в 46,8% и 60,0%, а равновероятная - в 53,2% и в 40,0% случаев соответственно. Различия между спонтанными и индуцированными абортусами по частоте равновероятной и асимметричной инактивации Х-хромосом статистически недостоверны (р>0,05). Случаев избирательной инактивации одного из гомологов в обеих исследованных выборках не обнаружено. »Отсутствие различий по характеру инактивации

Рис. 2. Примеры капиллярного электрофореза продуктов метил-чувствительной ПЦР локуса AR, проведенного на генетическом анализаторе ABl PRISM 310 (Perkin Elmer).

Примечание: A - равновероятная инактивация гомологичных Х-хромосом у спонтанного абортуса А-857; Б - асимметричная инактивация одной из X-хромосом у спонтанного абортуса А-995. Цифры над пиками обозначают размер продуктов ПЦР (п.о.).

Х-хромосом между тотальной выборкой спонтанных абортусов и индуцированными абортусами может быть обусловлено двумя причинами: локальной (тканеспецифичной) импринтированной инактивацией X-хромосом и селекцией клеточных клонов вследствие коррекции трисомий у медицинских абортусов. Однако при сравнительном анализе групп спонтанных абортусов наблюдается некоторое отличие в распределении типов инактивации Х-хромосомы. Имеется тенденция к постепенному увеличению частоты зародышей с асимметричной Х-инактивацией в ряду: спонтанные абортусы без задержки развития эмбриона - неразвивающиеся беременности - анэмбрионии (рис. 3).

Таким образом, с усилением тяжести нарушения индивидуального развития зародыша отмечается постепенное увеличение доли погибших эмбрионов с асимметричной инактивацией Х-хромосомы (р<0,1).

42,9

27,8 - -

Спонтанные Неразвивающиеся Анэмбрионии

абортусы беременности

Рис. 3. Частота асимметричной инактивации гомологичных Х-хромосом в клетках зародышей с 46,ХХ-хромосомной конституцией в трех разных клинических группах спонтанных абортусов.

Хотя статистический анализ не обнаружил достоверных различий между медицинскими и спонтанными абортусами, но выявленная тенденция к увеличению частоты спонтанных абортусов с асимметричной инактивацией Х-хромосом и снижение показателя соотношения полов по мере усиления степени тяжести нарушения эмбрионального развития могут косвенно подтверждать наличие импринтированной экспрессии Х-сцепленных генов в эмбриональном периоде развития у человека.

3.5. Уровень метилирования Х-хромосом в эксграэмбриональпых тканях спонтанных и индуцированных абортусов

Разный характер экспрессии генов при разной природе Х-инактивации также может играть важную роль в определении судьбы клеток и путей их развития. Установление неактивного состояния одной из Х-хромосом связывают с началом процессов клеточной дифференцировки [Monk, Harper,

1979] и различия между плюрипотеитными и дифференцированными клетками относятся к структурно-функциональной организации генома, его модификации и к уровню экспрессии генов, что осуществляется метилированием ДНК в специфических сайтах [Razin, Cedar, 1994]. Метилирование CpG-островка первого экзона гена AR коррелирует с неактивным статусом гена и, следовательно, с неактивным статусом всей X-хромосомы [Allen et al., 1992]. При переваривании ДНК чувствительными к метилированию эндонуклеазами Нра II и Hha I остаются нативными только копии локуса AR, содержащие в этих сайтах метилированный цитозин. С помощью последующей ПЦР амплифицируются только метитилированные копии локуса AR. Экстраэмбриональные ткани зародышей часто гипометилированы, вследствие чего выход амплифицированного продукта очень низок. Поэтому при анализе уровня метилирования у абортусов было возможно оценить только два крайних варианта: наличие метальных групп в CpG-островке гена AR и его отсутствие.

Сравнительный анализ уровня метилирования Х-хромосом не показал достоверных отличий между спонтанными (у СА гипометилирован CAG-тракт гена AR у 33,5% эмбрионов, у НБ - у 31%, у АЭ - в 22%) и медицинскими абортусами (28%). Таким образом, вероятно, степень метилирования ДНК Х-хромосом не вносит существенного вклада в селективную гибелью 46,XX эмбрионов.

3.6. Полиморфизм тринуклеотидных CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов в популяции г.Томска

В ходе исследования у населения г.Томска было выявлено 12 аллельных вариантов локуса тринуклеотидных повторов в первом экзоне гена AR в диапазоне от 285 п.о. до 318 п.о., что соответствует 21-32 CAG-повторам. Распределение аллелей локуса AR в популяции г.Томска соответствует нормальному (рис. 4). Модальный класс представлен аллелем в 303 п.о. (27 копий CAG-повтора), с частотой 0,18.

В исследуемой популяции соблюдалось равновесие Харди-Вайнберга по локусу тринуклеотидных CAG-повторов гена AR. Сравнение наблюдаемых и теоретически ожидаемых частот гетерозиготных генотипов по данному локусу показало, что они совпадают и равны 0,88±0,03. Коэффициент индивидуализации PIC составил 0,87.

285 288 291 294 297 300 303 306 309 312 315 318

Размеры атлелей (п.о.)

Рис. 4. Диаграмма распределения частот аллелей САС-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов в популяции г.Томска.

3.7. Ассоциации между генетической вариабельностью трннуклеотидных САС-повторов Х-сцепленного гена рецептора андрогенов и ранней эмбриональной гибелью у человека

Проблема связи индивидуальной гетерозиготности организмов по различным генетическим локусам с приспособленностью индивидов представляет существенный интерес. Для разных генетических локусов существуют неоднозначные оценки такой зависимости. В литературе отсутствуют данные о связи уровня индивидуальной гетерозиготности по локусам, содержащим транслируемые в белки микросателлитные последовательности, с приспособленностью носителей различных сочетаний аллелей данных локусов.

На рис. 5 представлено распределение аллелей САС-повторов в первом экзоне гена рецептора андрогенов в группах здоровых женщин и спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX. У здоровых женщин распределение аллелей соответствовало нормальному с единственным модальным классом, содержащим 27 копий САО-повтора, с частотой 0,18. В то же время, у спонтанных абортусов распределение частот аллелей гена АЛ

было бимодальным. Один модальный класс соответствовал таковому у здоровых женщин, но с более низкой частотой, составившей 0,12, а другой был представлен аллелем с меньшим числом САО-повторов (21), с частотой 0,14.

Частота аллеля (%)

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Число САО-повторов

Рис. 5. Распределение аллелей САО-повторов гена АЛ в группах спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX (светлые столбики) и здоровых женщин (темные столбики).

В исследуемой популяции по аллелям локуса А11, содержащим разное число САО-повторов, соблюдалось равновесие Харди-Вайнберга и поэтому в следующем поколении не ожидалось существенных изменений частот аллелей данного локуса. Однако анализ показал, что здоровые женщины и пренатально погибшие зародыши с кариотипом 46,XX статистически достоверно отличаются по частотам аллелей гена АЯ (р<0,05). С целью более детального изучения этого вопроса все аллели локуса АЯ были подразделены на три класса: А - с малым (21-23), В - средним (24-28) и С -максимальным (29-32) числом САО-повторов. В таблице 1 приведены данные по распределению генотипов локуса АЛ у здоровых женщин, а также у спонтанных и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX.

Таблица 1

Частоты генотипов (в %) по локусу САв-повторов гена АЯ в группах здоровых женщин, индуцированных и спонтанных абортусов с кариотипом 4 6,XX

Генотип Спонтанные Индуцированные

абортусы Женщины абортусы

АА 24,0 1,9" 4,5'

АВ 22,2 18,6 18,0

АС 3,7 6,8 9,0

ВВ 31,5 45,1 54,5

ВС 9,3 22,5 9,0

СС 9,2 4,9 4,5

Примечание: описания генотипов приведены в тексте; **- р<0,001, *- р<0,05.

У спонтанных абортусов частота генотипа АА статистически достоверно преобладала по сравнению со здоровыми женщинами (Х2=17,4; (ЦЧ; р<0,001) и индуцированными абортусами (х2=3,89; с1£=1; р<0,05). По другим генотипам (АВ, АС, ВВ, ВС, СС) достоверных различий между исследованными выборками не обнаружено, несмотря на практически двукратное увеличение частот гетерозиготных генотипов ВС у здоровых женщин и АС у индуцированных абортусов, по сравнению с группой спонтанных абортусов. Не обнаружено каких-либо различий по частотам аллелей и генотипов между здоровыми женщинами и контрольной группой индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX.

Уровень индивидуальной гетерозиготности или молекулярной дисперсии можно отразить индексом квадратичной разности между размерами аллелей, представленными в генотипе [СоИшап е1 а1., 1998; Сои^оп ^ а1., 1998]. Показатели средней квадратичной разности между размерами аллелей у здоровых женщин и спонтанных абортусов составили 81,8±0,38 и 53,2±0,48 соответственно. Эти значения достоверно различались по Р-критерию Фишера (Р=1,54; р<0,05). Наблюдаемая гетерозиготность по локусу А11 составила 0,88+0,03 в группе здоровых женщин и 0,65±0,06 в группе спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX, различие между которыми также статистически достоверно (х2=7,18; сЦ=1; р<0,05). В то же время, средняя квадратичная разность между размерами аллелей локуса АЛ, вычисленная только для гетерозиготных женщин, составила 93,2+0,65 и

статистически не отличалась от аналогичного показателя у погибших зародышей - 81,2+1,06.

Сравнительный анализ распределения частот гомозиготных генотипов по числу CAG-повторов в гене AR обнаружил достоверные различия между здоровыми женщинами и спонтанными абортусами по числу гомозигот с меньшим числом повторов (х2=12,54; df=l; р<0,001). Таким образом, основной вклад в различие исследуемых групп по уровню средней гетерозиготности гена AR внесли АА гомозиготные генотипы, преобладавшие у спонтанных абортусов.

Экспрессия гена AR начинается во время эмбрионального периода развития зародыша. Уже на стадии органогенеза в развивающихся мужских и женских гениталиях, гипофизе, надпочечниках, почках, зачатках мускулов, Вольфовом протоке и его производных, молочных железах, гипоталамусе и зачатках нервной системы, обнаруживается мРНК этого гена [Crocoll et al., 1998; McAbee, DonCarlos, 1998; Young, Chang, 1998]. Длина CAG-повтора в этом локусе показывает обратную зависимость с его транскрипционной активностью [Giovannucci et al., 1997]. Все исследованные нами зародыши находились в эмбриональной стадии развития (средний возраст 8,5 недель) и, следовательно, экспрессия гена AR уже установилась. Учитывая обратную зависимость уровня экспрессии гена AR от размеров CAG-тракта [Giovannucci et al., 1997] можно предположить, что зародыши женского пола, содержащие аллели с небольшим числом CAG-повторов (21-23) и, следовательно, высокий уровень экспрессии гена AR, имеют больший риск элиминации в ходе пренатального развития. Причины такой селекции не ясны и требуют дальнейшего исследования.

ВЫВОДЫ

1. Три группы спонтанных абортусов с разной степенью нарушения эмбрионального развития (спонтанные абортусы с развитым эмбрионом без выраженной внутриутробной задержки развития, неразвивающиеся беременности и анэмбрионии) отличаются по частоте встречаемости зародышей с трисомиями аутосом, триплоидией и кариотипом 46,XY.

группами обусловлено постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46,ХУ относительно ожидаемой по мере нарастания тяжести нарушения развития эмбриона. Зародыши с кариотипом 46,ХУ обладали большими шансами иметь сформированный эмбрион, чем зародыши с кариотипом 46,XX.

3. Анализ сегрегации Х-хромосом в семьях со спонтанными абортами не выявил случаев однородительского наследования Х-хромосом у пренатально погибших эмбрионов женского пола. Эти данные свидетельствуют об отсутствии заметного вклада однородительской дисомии по Х-хромосоме в эмбриональную гибель у человека.

4. Степень метилирования САО-тракта Х-сцепленного гена рецептора андрогенов в тканях трофобласта одинакова у спонтанных и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX.

5. Доля эмбрионов женского пола с асимметричной инактивацией X-хромосом увеличивается в ряду: спонтанные абортусы с развитым эмбрионом без задержки внутриутробного развития - неразвивающиеся беременности - анэмбрионии (р<0,1).

6. В гене рецептора андрогенов у населения г.Томска выявляется 12 аллельных вариантов локуса тринуклеотидных САО-повторов, варьирующих в диапазоне от 21 до 32 копий. Распределение аллелей в популяции соответствует нормальному с модальным аллелем, содержащим 27 копий повтора и представленным с частотой 0,18. Популяция г.Томска, в отличие от других исследованных популяций, характеризуется более узким спектром аллелей и смещением более частого аллеля данного локуса в сторону большего числа повторов.

7. Распределение аллелей по числу САО-повторов в гене рецептора андрогенов у пренатально погибших зародышей с кариотипом 46,XX отличается от такового у здоровых взрослых женщин за счет преобладания у спонтанных абортусов аллелей с небольшим числом повторов. Уровень молекулярной дисперсии по этому локусу различается у здоровых женщин и абортусов женского пола за счет преобладания у спонтанных абортусов гомозигот с небольшим числом САО-повторов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Евдокимова В.Н., Назаренко С.А. Инактивация Х-хромосомы в онтогенезе млекопитающих и человека // Онтогенез, - 1997, №4, С. 245-261.

2. Евдокимова В.Н. Импринтинг Х-хромосомы в онтогенезе млекопитающих и человека. Генетика человека и патология. - Томск: ТГУ, 1997,№4, С.150-154.

3. Евдокимова В.Н., Карагеоргий Н.М., Никитина Т.В., Суханова Н.Н. Результаты цитогенетического обследования неразвивающихся беременностей // Материалы научных чтений, посвященных 100-летию проф. В .П.Чехова. - Томск: ТГУ, 1997, С. 150-152.

4. Евдокимова В.Н. К вопросу о роли Х-хромосомы в раннем эмбриогенезе у человека // Материалы научных чтений, посвященных 100-летию проф. В.П.Чехова. -Томск, 1997, С. 149-150.

5. Lebedev I.N., Evdokimova V.N., Nikitina T.V., Sukhanova N.N. Contribution of chromosomal constitution in first trimester abnormal human pregnancies // Cytogenet. Cell. Genet., - 1999, № 85, P. 113.

6. Evdokimova V.N., Lebedev I.N., Nikitina T.V., Sukhanova N.N. Sex ratio in abnonnal pregnancies of first trimester gestation in human // Cytogenet. Cell. Genet., - 1999, № 85, P. 147 - 148.

7. Evdokimova V.N. Search of possible association between an early embryonic lethality and functioning of X-chromosomes // International Symposium on X chromosome Inactivation in Mammals. - Novosibirsk, 1999, P. 72.

8. Евдокимова В.H., Путинцева Е.А. Полиморфизм числа тринуклеотидных повторов первого экзона гена рецептора андрогенов в популяции Западной Сибири. Современные медицинские технологии. -Новосибирск, 1999, С. 276-278.

9. Евдокимова В.Н., Тимошевский В.А., Масленников А.Б., Китайник Г.П., Назаренко С.А. Генетические синдромы «нечувствительности к андрогенам»: этиология и диагностика. Генетика человека и патология. -Томск: ТГУ, 2000, № 5, С. fià г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Евдокимова, Виктория Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Роль хромосомных аномалий в ранней эмбриональной гибели у человека.

1.2. Соотношение полов у спонтанных аборту сов первого триместра беременности.

1.3. Феномен инактивации Х-хромосомы.

1.3.1. Теория дозовой компенсации.

1.3.2. Механизм инактивации Х-хромосомы.

1.4. Инактивация Х-хромосомы в эмбриогенезе млекопитающих.

1.4.1. Инактивация Х-хромосомы в половых клетках.

1.4.2. Подготовка к гетерохроматизации Х-хромосомы на начальных этапах эмбрионального развития.

1.4.3. Установление неактивного статуса Х-хромосомы во время дифференцировки клеточных линий.

1.5. Геномный импринтинг.

1.5.1. Эволюционное происхождение геномного импринтинга.

1.5.2. Импринтинг и Х-хромосома.

1.6. Роль метилирования ДНК в онтогенезе млекопитающих.

1.7. Структура гена рецептора андрогенов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Структура и объем материала.

2.2. Культивирование эмбриональных фибробластов и получение препаратов метафазных хромосом.

2.3. Методы выделения ДНК.

2.4. Амплификация участков ДНК Х- и Y-хромосом с помощью полимеразной цепной реакции.

2.5. Методы статистической обработки.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Цитогенетические нарушения в группах спонтанных аборту сов.

3.2. Соотношение полов при ранней эмбриональной летальности у человека.

3.3. Исследование однородительского наследования Х-хромосом у спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX.

3.4. Характер инактивации Х-хромосом в экстраэмбриональных тканях и ранняя эмбриональная гибель зародышей с кариотипом 46,XX.

3.5. Уровень метилирования Х-хромосом в экстраэмбриональных тканях спонтанных и индуцированных абортусов.

3.6. Полиморфизм тринуклеотидных CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов в популяции г.Томска.

3.7. Ассоциация между генетической вариабельностью тринуклеотидных CAG-повторов Х-сцепленного гена рецептора андрогенов и ранней эмбриональной гибелью у человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование связи инактивации Х-хромосомы с эмбриолетальностью у человека"

Вопрос о селективном эффекте половой принадлежности на ранних этапах эмбрионального развития человека уже давно обсуждается в литературе. Многими авторами было показано, что соотношение полов у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом, погибших до 20 недель беременности, составляет около 0,8, с заметным преобладанием зародышей женского пола [Сагг, 1971; Hassold et al., 1980; Lin et al., 1985; Eiben et al., 1990]. Это соотношение существенно снижается у эмбрионов, абортированных в виде пустого зародышевого мешка, составляя около 0,5 [Назаренко, 1993]. Хотя этот факт интерпретируется некоторыми авторами как следствие контаминации долговременных культур эмбриональных фибробластов материнскими клетками, однако, ряд работ, в том числе и с использованием прямых цитогенетических методов анализа тканей спонтанных абортусов, свидетельствуют о не случайности такого сдвига соотношения полов [Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990]. Таким образом, результаты ряда исследований дают основание предполагать возможную связь между ранней эмбриональной гибелью и функционированием половых хромосом.

В цитогенетических исследованиях показано, что Х-хромосома имеет особенно большое значение на самых ранних этапах эмбриогенеза. Во-первых, нуллисомия по Х-хромосоме является одной из самых ранних эмбриональных леталей [Дыбан, 1977; 1988]. Во-вторых, переход с использования материнских мРНК на экспрессию генов эмбриона начинается с экспрессии X-сцепленных генов уже на стадии 4-х бластомеров, значительно опережая во времени экспрессию генов аутосом [Razin, Shemer, 1995]. В-третьих, дифференцировка тканей у самок млекопитающих связана с переходом от биаллельной экспрессии большинства Х-сцепленных генов к моноаллельной, в результате генетической инактивации одной из Х-хромосом, обеспечивающей компенсацию дозы Х-сцепленных генов между полами [Monk, Harper, 1978; 1979].

Инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих у видов с гетерогаметным полом происходит в раннем эмбриогенезе, и, установившись однажды, неактивное состояние Х-хромосомы наследуется во всех последующих клеточных генерациях [Lyon, 1961]. Процесс инактивации X-хромосомы включает в себя три этапа: инициация инактивации, распространение неактивного состояния хроматина на всю хромосому и поддержание неактивного статуса хромосомы во всех последующих клеточных делениях. Молекулярные механизмы, как отдельных этапов, так и в целом данного явления до сих пор остаются не до конца раскрытыми.

Современные представления связывают начало инактивации X-хромосомы с экспрессией уникального Х-сцепленного гена Xist (X inactivation specific transcript) [Brown, 1991]. Экспрессия этого гена в эмбриогенезе начинается очень рано - на стадии 4-х бластомеров [Kay et al., 1994], задолго до событий инактивации Х-хромосомы, которые происходят на стадии бластоцисты. Накопление продукта этого гена до какого-то критического значения является необходимым условием начала процесса инактивации X-хромосомы [Kay et al., 1993; Migeon, 1994]. Интересно отметить, что у грызунов самая ранняя экспрессия гена Xist на стадиях морулы и бластоцисты импринтирована вследствие специфичной экспрессии отцовского аллеля [Кау et al., 1993; 1994] и может быть причиной избирательной инактивации отцовской Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях грызунов [Kay et al., 1994; Zuccotti, Monk, 1995]. Импринтированный статус гена Xist теряется непосредственно перед гаструляцией, в результате деметилирования генома [Ariel et al., 1994], после чего в последующих выделяющихся дифференцированных эмбриональных клеточных линиях устанавливается случайная инактивация одной из родительских Х-хромосом [Lyon, 1994]. У человека экспрессия гена XIST на низком уровне детектируется уже на стадии одноклеточной зиготы как в женских зародышах для обоих гомологичных X-хромосом, так и в мужских эмбрионах для единственной материнской X-хромосомы [Daniels et al., 1997]. И только после дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и установления неактивного статуса одной из Х-хромосом детектируется высокий уровень экспрессии гена XIST на неактивной Х-хромосоме [Panning et al., 1997]. Импринтированную инактивацию Х-хромосомы у сумчатых во всех тканях [Kaslow, Migeon, 1987] и у грызунов в экстраэмбриональных тканях [Takagi et al., 1982; Wake et al., 1976] связывают с необходимостью предпочтительной экспрессии материнских Х-сцепленных генов для формирования плаценты и живорождения [Lyon, 1989]. Однако для человека не получено однозначных данных об избирательной экспрессии генов Х-хромосомы одного из родителей даже в тканях трофобласта. Одни авторы обнаруживают случайную инактивацию Х-хромосом во всех тканях у человека, включая и экстраэмбриональные [Migeon etal., 1986; Migeon, 1994; Looijenga et al., 1999]. В других работах показано наличие избирательной инактивации отцовской X-хромосомы в клетках цитотрофобласта [Migeon, Do, 1978; Ropers et al., 1978; Harrison 1989; Goto et al., 1997]. Учитывая функциональную значимость импринтированной инактивации Х-хромосом в эмбриогенезе для многих видов млекопитающих, не исключено, что однородительское наследование отцовской или материнской Х-хромосомы и/или предпочтительная инактивация Х-хромосомы одного из родителей могут вносить определенный вклад в раннюю эмбриональную гибель у человека. Это предположение требует экспериментальной проверки, что и было осуществлено в ходе данного исследования.

Завершающим и важным в онтогенезе этапом процесса инактивации X-хромосомы является поддержание ее неактивного статуса в течение жизни индивида в последующих клеточных делениях. Оно [Ohno, 1969; 1973] предположил, что инактивация Х-хромосомы поддерживается в результате уже имеющегося механизма контроля экспрессии генов. Таким эпигенетическим механизмом, по мнению большинства исследователей, является метилирование цитозина в пятом положении пиримидинового кольца в специфичных сайтах ДНК. Метилирование ДНК в основном ассоциировано со специфичной организацией хроматина. Такая конформация хроматина типична для нетранскрибируемой ДНК и характерна для генетически неактивных импринтированных локусов аутосом и большинства генов транскрипционно неактивной Х-хромосомы [Baylin, 1997]. Правильное поддержание статуса метилирования ДНК требуется для нормального эмбрионального развития мышей [Li et al., 1992]. Показано также, что аберрантное метилирование ДНК ассоциировано с большинством опухолей и аномалиями развития у человека [Yoder et al., 1996]. В клетках раковых опухолей ДНК гипометилирована по сравнению с клетками нормальных окружающих тканей. Кроме того, обработка клеток или животных деметилирующим агентом 5-аза-цитидином приводит к злокачественным новообразованиям in vitro и in vivo [Lengauer et al., 1997]. С другой стороны, гиперметилирование специфических последовательностей ДНК генов супрессоров опухолей приводит к их инактивации и возникновению рака [Baylin, 1997].

При старении тканей и клеточных культур происходит потеря метилированного цитозина, что связано с накоплением в геноме транзиций 5mC Т+С [Мазин, 1993а]. В течение онтогенеза из генома теряется почти весь метилированный цитозин [Мазин, 1993b]. В эмбриональных клетках и культурах клеточных линий скорость накопления подобных мутаций может быть на 1-2 порядка выше, чем в клетках взрослых особей [Мазин, 1993а]. Кроме того, известно, что активное состояние обеих Х-хромосом не совместимо с нормальной дифференцировкой тканей [Monk, Harper, 1979]. Так, дупликация активной Х-хромосомы с потерей неактивной Х- или Y-хромосомы приводит к злокачественному перерождению клеток [Dutrillaux et al., 1986; Wang et al., 1990]. Таким образом, не исключено, что избирательная гибель эмбрионов женского пола на ранних этапах онтогенеза может быть ассоциирована с возможными нарушениями такого важного для нормального развития женских и отсутствующего у мужских зародышей процесса, как инактивация Х-хромосомы, связанного с метилированием ДНК.

Основными сайтами метилирования ДНК являются CpG-последовательности. Около 2% этих последовательностей, называемых CpG-островками, ассоциировано со стартовыми транскрипционными сайтами более чем у половины известных генов человека [Baylin, 1997]. Метилирование ДНК в этих сайтах коррелирует с неактивным состоянием Х-сцепленных генов и стабилизирует неактивное состояние Х-хромосомы [Grant, Chapman, 1988; Gartler, Riggs, 1983]. Одним из таких генов, несущих CpG-островок в промоторном регионе, является Х-сцепленный ген рецептора андрогенов человека (AR), локализованный на длинном плече Х-хромосомы в районе Xqll-12 [Migeon et al., 1981; Brown et al., 1989]. В первом экзоне этого гена находятся CAG-повторы, кодирующие полиглутаминовый участок в транскрибируемом белке. Метилирование Hpall и Hhal сайтов, расположенных вблизи CAG-тракта гена, жестко коррелирует с неактивным состоянием X-хромосомы, а высокий полиморфизм этого участка позволяет достаточно эффективно различать Х-хромосомы разного родительского происхождения [Allen et al., 1992]. В связи с этим, ген рецептора андрогенов представляет удобную модельную систему для оценки не только уровня метилирования ДНК, но и характера Х-инактивации (избирательная, асимметричная, равновероятная) при использовании метилчувствительной количественной ПЦР [Allen et al., 1992].

Таким образом, исследование родительского происхождения, метилирования ДНК и характера инактивации Х-хромосом у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом может, по-видимому, прояснить влияние половой принадлежности на раннюю гибель эмбрионов человека.

Цель исследования: Исследование связи эпигенетического состояния Х-хромосом и молекулярного полиморфизма некоторых Х-сцепленных локусов с селективной гибелью эмбрионов с кариотипом 46,XX у человека.

Задачи исследования:

2. Исследовать полиморфизм и оценить информативность локуса тринуклеотидных CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов у населения западно-сибирского региона России.

5. Исследовать статус метилирования CAG-тракта гена AR у индуцированных и спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX.

6. Изучить связь генетической вариабельности тринуклеотидных CAG-повторов в первом экзоне гена рецептора андрогенов с эмбриолетальностью у человека.

Научная новизна: В работе впервые показано, что максимальный вклад в различия трех групп спонтанных абортусов (спонтанные абортусы с развитым эмбрионом, неразвивающиеся беременности и анэмбрионии) вносят трисомии аутосом, триплоидия и кариотип 46,XY. Установлено, что у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом уменьшение показателя «соотношение полов» по мере нарастания тяжести нарушения развития эмбриона связано с постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46,XY относительно ожидаемой и не зависит от частоты эмбрионов с кариотипом 46,XX. Высказано предположение что, экспрессия генов материнской Х-хромосомы у XY-зародышей обеспечивает более стабильное их развитие в раннем эмбриогенезе по сравнению с ХХ-эмбрионами, нормальное развитие которых сопряжено с механизмом компенсации дозы X-сцепленных генов, что повышает вероятность его нарушения у зародышей женского пола. Показано, что у спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX по мере нарастания тяжести нарушения эмбрионального развития увеличивается доля зародышей с асимметричной инактивацией Х-хромосом. Не установлено существенного вклада однородительской дисомии по Х-хромосоме в пренатальную гибель зародышей человека. Показано что, уровень метилирования ДНК Х-хромосом в тканях трофобласта не отличается у спонтанно погибших и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX. Впервые для популяции Западной Сибири охарактеризован полиморфизм локуса тринуклеотидных повторов первого экзона гена рецептора андрогенов и показана ассоциация генотипов, содержащих небольшое число CAG-повторов, с эмбриональной летальностью.

Практическая значимость: Полученные в ходе настоящего исследования данные по молекулярному полиморфизму CAG-повторов гена рецептора андрогенов можно использовать при медико-генетическом консультировании. Поскольку однородительское наследование Х-хромосом не вносит существенного вклада в раннюю эмбриональную гибель у человека, то нет необходимости его анализа при исследовании причин спонтанного прерывания беременности. Найденная ассоциация частоты генотипов локуса тринуклеотидных повторов гена рецептора андрогенов с минимальным числом CAG-повторов с эмбриональной легальностью у человека требует

13 дальнейшего выяснения характера данной взаимосвязи с целью выявления семей с высоким риском невынашивания беременности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уменьшение показателя «соотношение полов» среди эмбрионов с нормальным кариотипом в раду: спонтанные абортусы без выраженной задержки внутриутробного развития - неразвивающиеся беременности -анэм брионии, связано с постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46,XY.

3. Уровень метилирования ДНК Х-хромосом одинаков у спонтанных и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX.

5. У спонтанных абортусов первого триместра беременности с кариотипом 46,XX преобладают генотипы с небольшим числом CAG-повторов гена AR по сравнению со здоровыми женщинами.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Евдокимова, Виктория Николаевна

выводы

1. Три группы спонтанных абортусов с разной степенью нарушения эмбрионального развития (спонтанные абортусы с развитым эмбрионом без выраженной внутриутробной задержки развития, неразвивающиеся беременности и анэмбрионии) отличаются по частоте встречаемости зародышей с трисомиями по аутосомам, триплоидией и кариотипом 46,XY.

2. Соотношение полов у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом составило 0,77 для спонтанных абортусов с развитым эмбрионом без выраженной внутриутробной задержки развития, 0,60 - для неразвивающихся беременностей и 0,31 - для анэмбрионий. Отличие между группами обусловлено постепенным снижением доли зародышей с кариотипом 46,XY относительно ожидаемой по мере нарастания тяжести нарушения развития эмбриона. Зародыши с кариотипом 46,ХУ обладали большими шансами иметь сформированный эмбрион, чем зародыши с кариотипом 46,XX.

4. Степень метилирования CAG-тракта Х-сцепленного гена рецептора андрогенов в тканях трофобласта одинакова у спонтанных и индуцированных абортусов с кариотипом 46,XX.

106

6. В гене рецептора андрогенов у населения г.Томска выявляется 12 аллельных вариантов локуса тринуклеотидных CAG-повторов, варьирующих в диапазоне от 21 до 32 копий. Распределение аллелей в популяции соответствует нормальному с модальным аллелем, содержащим 27 копий повтора и представленным с частотой 0,18. Популяция г.Томска, в отличие от других исследованных популяций, характеризуется более узким спектром аллелей и смещением более частого аллеля данного локуса в сторону большего числа повторов.

7. Распределение аллелей по числу CAG-повторов в гене рецептора андрогенов у пренатально погибших зародышей с кариотипом 46,XX отличается от такового у здоровых взрослых женщин за счет преобладания у спонтанных абортусов аллелей с небольшим числом повторов. Уровень молекулярной дисперсии по этому локусу различается у здоровых женщин и абортусов женского пола за счет преобладания у спонтанных абортусов гомозигот с небольшим числом CAG-повторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основанием для выполнения настоящей работы послужил широко дискутируемый вопрос о возможной селективной гибели зародышей с кариотипом 46,XX в раннем периоде онтогенеза человека.

На первом этапе исследования был проведен цитогенетический анализ 342 спонтанных абортусов, подразделенных на три клинические группы по степени нарастания тяжести нарушения эмбрионального развития: собственно спонтанные аборты с развитым эмбрионом и без выраженной внутриутробной задержки развития (п=100), неразвивающиеся беременности (п=176) и анэмбрионии (п=66). Частота хромосомных мутаций в выделенных выборках составила 22%, 48,3% и 48,5% соответственно. Статистический анализ показал достоверные отличия между этими группами по частотам нормальных и аномальных кариотипов, наибольший вклад в которые внесли трисомии аутосом, триплоидии и кариотип 46,XY. Последний факт может отражать особые генетические причины пренатальной гибели эмбрионов с нормальным кариотипом, связанные с их половой принадлежностью и/или с импринтингом Х-хромосомы. Соотношение полов (СП=м/ж) у спонтанных абортусов с нормальным кариотипом составило 0,77 для спонтанных абортов с развитым эмбрионом, без выраженной внутриутробной задержки развития, 0,60 - для неразвивающихся беременностей и 0,31 - для анэмбрионий. Анализ ДНК зародышей и их родителей показал низкую вероятность материнской контаминации клеточных культур, как одного из возможных источников преобладания эмбрионов с 46,XX кариотипом у спонтанных абротусов. Неразвивающиеся беременности и анэмбрионии статистически достоверно отличались по показателю «соотношение полов» от контрольной группы медицинских абортусов (СП=1,11). Отличия по соотношению полов были обусловлены за счет постепенного снижения доли зародышей с кариотипом 46,XY относительно ожидаемой по мере усиления степени тяжести нарушения индивидуального развития эмбриона. Статистический показатель «отношение шансов» также свидетельствовал о том, что зародыши с кариотипом 46,ХУ обладали большими шансами иметь сформированный эмбрион, чем зародыши женского пола. Высказана гипотеза, что экспрессия генов материнской X-хромосомы у XY-зародышей обеспечивает более стабильное их развитие в раннем эмбриогенезе по сравнению с ХХ-эмбрионами. Иными словами, не исключена возможность того, что Х-хромосома несет некоторое количество генов, способных подвергаться импринтингу, и которые предпочтительно экспрессируются с материнской Х-хромосомы на эмбриональной стадии развития.

Сопоставление однородительского наследования хромосом или их участков с различными фенотипическими проявлениями этого события является инструментом в исследовании феномена геномного импринтинга на хромосомном уровне. Поэтому, исходя из предположения о функциональной значимости импринтированной инактивации Х-хромосом для процесса эмбрионального развития, мы предприняли поиск случаев однородительской дисомии у спонтанных абортусов. С этой целью был исследован ряд полиморфных микро- и минисателлитных локусов Х-хромосомы в 52 семьях со спонтанными абортусами с кариотипом 46,XX. Биродительское наследование Х-хромосом обнаружено у всех обследованных эмбрионов, что свидетельствует об отсутствии заметного вклада родительского происхождения Х-хромосом в гибель эмбрионов 4-12 недель развития.

Инактивация одного из гомологов Х-хромосомы в клетках нормальных женщин приводит к монолокусной экспрессии большинства Х-сцепленных генов. Следовательно, инактивация одной из Х-хромосом у женщин во всех клетках может приводить к псевдооднородительской экспрессии Х-хромосомы при наличии нормального 46,XX кариотипа. Для большинства видов млекопитающих в экстраэмбриональных тканях характерна импринтированная инактивация Х-хромосомы, полученной от отца. Наблюдается жесткая эволюционная тенденция к уменьшению пула клеток с импринтированной X-инактивацией - от целого организма к отдельным экстраэмбриональным тканям. При исследовании характера гетерохроматизации Х-хромосомы у спонтанных и индуцированных абортусов с помощью метилчувствительной ПЦР локуса AR выявили два типа ее инактивации. Равновероятная X-инактивация наблюдалась в 53,2% случаев у спонтанных и в 40,0% случаев у индуцированных абортусов. Асимметричная инактивация одной из X-хромосом, приводящая к репрессии одного из гомологов в более чем 80% клеток, наблюдалась в 46,8% и 60,0% случаев соответственно. Случаев избирательной инактивации одного из гомологов (в 100% клеток) в обеих исследованных выборках не обнаружено. Однако, при сравнительном анализе разных клинических групп спонтанных абортусов была установлена тенденция к постепенному увеличению частоты зародышей с асимметричной инактивацией одной из Х-хромосом в ряду: анэмбрионии - неразвивающиеся беременности - спонтанные абортусы без задержки развития эмбриона. Отсутствие различий в представленности типов репрессии Х-хромосом между тотальной выборкой спонтанных абортусов и индуцированными абортусами может отражать по крайней мере две особенности, связанные с инактивацией Х-хромосом: наличие импринтированной Х-инактивации в некоторых эмбриональных клеточных линиях и селекцию клеточных клонов вследствие коррекции трисомий.

Разный характер экспрессии генов при разной природе Х-инактивации также может играть важную роль в определении судьбы клеток и путей их развития. По современным представлениям установление Х-инактивации связывают с началом процессов клеточной дифференцировки. Биохимические и цитогенетические исследования ранних эмбрионов мышей и XX-тератокарциномных клеточных линий подтверждают, что две активные X-хромосомы не могут быть представленными в дифференцированных клетках. Различия между плюрипотентными и дифференцированными клетками относятся к структурно-функциональной организации генома, его модификации и к уровню экспрессии генов, что осуществляется уже известными механизмами регуляции (Ariel et al., 1994). К одному из таких механизмов можно причислить метилирование ДНК в специфических сайтах. Функциональная важность модификации ДНК в CpG-сайтах при геномном импринтинге продемонстрирована на примере импринтированных генов Xist (Kay et al, 1994; Zuccotti, Monk, 1994), H19, Igf-2, Igf-2r (Li et al., 1993) и X-сцепленных генах домашнего хозяйства (Cedar 1988; Riggs, Pfeifer, 1992). И хотя метилирование данных генов является вторичным событием (Razin, Cedar, 1994; Migeon, 1994), оно обеспечивает надежный механизм сохранения дифференциальной генной экспрессии, воздействуя в cis-положении на конформацию ДНК и изменяя ее доступность для фактора транскрипции, только для одного аллеля. Возможно, что нарушения в процессе X-инактивации на стадиях инициации и распространения ее вдоль хромосомы, также приводят к ранней эмбриональной гибели, так как уже отмечалось, что активный статус обеих Х-хромосом не совместим с нормальной дифференцировкой клеток. С этой точки зрения представляет интерес возможное нарушение механизма поддержания неактивного статуса второй X-хромосомы, который неоднозначно связывается с уровнем метилирования ДНК.

Существуют незначительное число работ о роли метилирования ДНК в эмбриональном развитии, выполненные на мышах. Показано, что рецессивная мутация в гене ДНК метилазы (ДНК МТаза) приводит к эмбриональной гибели животных примерно к 10 суткам беременности (Li et al., 1992). При меньшем дефиците метилирования ДНК могут возникать и другие нарушения пренатального развития, в частности нарушения дифференцировки клеток и множественные пороки развития. Изложенная гипотеза хорошо согласуется с известными фактами, говорящими о том, что при эмбриональной гибели до 20 недель беременности преобладают зародыши с кариотипом 46,XX, а на более поздних стадиях эта тенденция сменяется на противоположную - повышенную смертность плодов с кариотипом 46,XY (Eiben et al., 1990; Назаренко, 1993). Однако сравнительный анализ уровня метилирования Х-хромосом не показал достоверных отличий между спонтанными и медицинскими абортусами. Эти данные могут косвенно подтверждать результаты анализа по СП в различных клинических группах зародышей в том смысле, что различия между ними обусловлены не предпочтительной гибелью 46,XX эмбрионов вследствие нарушения процесса инактивации-реактивации Х-хромосом, а возможными нарушениями импринтированной экспрессии материнского гомолога.

Ген рецептора андрогенов является одним из представителей семейства генов, мутации которых приводят к болезням экспансии числа тринуклеотидных повторов. Увеличение числа CAG-повторов первого экзона этого гена свыше 40 копий определяет спино-бульбарную мышечную атрофию или болезнь Кеннеди [LaSpada et al., 1991]. Определение спектра и представленности аллельных вариантов CAG-тракта первого экзона гена рецептора андрогенов (локус AR) в разных популяциях необходимо как для целей популяционной генетики, так и для медико-генетического консультирования. В ходе работы был изучен полиморфизм тринуклеотидных CAG-повторов первого экзона гена рецептора андрогенов у жителей западносибирского региона России. Выявлены 12 аллельных вариантов, размер которых варьировал в диапазоне от 285 до 318 п.о., что соответствует 21-32 копиям С AG-мотива в данном локусе. Распределение аллелей в Томской популяции соответствовало нормальному. Не обнаружено достоверных различий по частотам аллелей между мужчинами и женщинами одного поколения. Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность по исследованному локусу была одинакова и составила 0,88±0,03. Показано, что у населения западно-сибирского региона России по сравнению с другими обследоваными популяциями спектр аллелей более узок и модальный аллель исследуемого локуса смещен в сторону большего числа повторов.

104

Кроме того, несомненный интерес представляло изучение ассоциаций генетической вариабельности локуса AR с ранней эмбриональной летальностью у человека, так как этот ген является одним из определяющих половую дифференцировку организма. При исследовании распределения аллелей с разным числом CAG-повторов в первом экзоне Х-сцепленного гена рецептора андрогенов (AR) у спонтанных абортусов с кариотипом 46,XX обнаружено увеличение частоты аллелей данного локуса с меньшим числом тринуклеотидных повторов, по сравнению со здоровыми взрослыми женщинами. С целью более детального анализа этого вопроса все аллели локуса AR были подразделены на три класса: А - с небольшим (21-23), В -средним (24-28) и С - максимальным (29-32) числом CAG-повторов. Обнаружены достоверные различия между выборками по частоте АА генотипов, которые преобладали у спонтанных абортусов. Обследованные группы различались также по средней квадратичной разности между размерами аллелей локуса AR, составившей 81,8±0,4 и 53,2±0,5 у здоровых женщин и абортусов соответственно. Учитывая данные об обратной зависимости между длиной CAG-тракта в гене AR и его транскрипционной активностью, можно предположить, что в пренатальном периоде онтогенеза человека может осуществляться отбор против зародышей женского пола, носителей генотипов с небольшим числом CAG-повторов в гене рецептора андрогенов и высокой транскрипционной активностью данного локуса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Евдокимова, Виктория Николаевна, Томск

1. Алтухов Ю.П. Аллозимная гетерозиготность, скорость полового созревания и продолжительность жизни // Генетика, -1998, Т. 34, № 7, С. 908919.

2. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М: Наука, 1983,279 с.

3. Асеев М.В, Скакун В.Н, Баранов B.C. Анализ аллельного полиморфизма четырех коротких тандемных повторов в популяции северозападного региона России // Генетика, -1995, Т. 31, № 6, С. 839-845.

4. Бочков Н.П., Кострова А.А. Соотношение полов у человека в эмбриональном периоде и среди новорожденных // ДАН СССР, -1971, Т. 200, № 4, С. 973 976.

5. Головачев Г.Д. Наследственность человека и внутриутробная гибель. -М.: Медицина, 1983, 152 с.

6. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. Ленинград: Наука, 1988, 228 с.

7. Дыбан А.П. Теоретические и прикладные аспекты экспериментальной тератологии // Онтогенез, -1977, Т. 8, № 6, С. 582 598.

8. Дыбан А.П, Баранов B.C. Цитогенетика развития млекопитающих. -М.: Наука, 1978, 216 с.

9. Кучер А.Н, Иванова О.Ф, Пузырев В.П, Цимбалюк И.В, Троценко Б.А. Генетико-демографическая характеристика современного сибирского города (на примере г. Томска) // Генетика, -1994, Т. 30, № 2, С. 276-281.

10. Ли Ч. Введение в популяционную генетику. М.: Мир, 1978, 555 с.

11. Мазин A.JI. Энзиматическое метилирование генов создает новую проблему для проектов секвенирования генома // III конференция «Геном человека 93», Черноголовка, 1993а, С. 50.

12. Мазин A.JI. Когда будет конец света? // III конференция «Геном человека 93», Черноголовка, 1993b, С. 51.

13. Назаренко С.А. Изменчивость хромосом и развитие человека. Томск: Издательство ТГУ, 1993, 200 с.

14. Назаренко С.А., Карагеоргий Н.М. Межтканевые различия С-полиморфных районов хромосом у эмбрионов человека: возможная роль метилирования ДНК // Генетика, -1995, Т. 31, № 11, С. 1578 1581.

15. Нестерова Т.Б., Закиян С.М. Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих // Генетика, -1994, Т. 30, № 3, С. 293 317.

16. Никитина Т.В. Исследование однородительской дисомии и микросателлитной нестабильности при ранней эмбриональной гибели человека. Автореф. дис. . канд. биол. наук, Томск, 1999, 24 с.

17. Паткин E.JI. Исследование структурного гетерохроматина на начальных стадиях развития зародышей мышей // Онтогенез, -1980, Т. 11, № 1, С. 49 55.

18. Семенова-Тян-Шанская А.Г., Паткин E.JI. Изучение на изолированных ядрах динамики изменений хромосом женских половых клеток у ранних зародышей человека // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии, -1982, Т. 2, №1, С. 51-56.

19. Флейс Дж. Статистические методы для изучения таблиц долей и пропорций. М: Финансы и статистика, 1989, 319 с.

20. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека. М.: Мир, 1990, Т. 3, 378с.

21. Alcalay М., Toniolo D. CpG-islands of the X chromosome are gene associated //NAR, -1988, Vol. 16, № 20. P. 9527 9543.

22. Ariel М., Cedar Н., McCarrey J. Developmental changes in methylation of spermatogenesis-specific genes include reprogramming in the epididymis // Nature Genet, -1994, Vol. 7, P. 59 63.

23. Ariel M., Robinson E., McCarrey J.R. et al. Gamete-specific methylation correlates with imprinting of the murine Xist gene // Nature Genet., 1995, Vol. 9, №3, P. 312 -315.

24. Armstrong S., Keohane A.M., Turner B.M. et al. Differential mechanisms of X-inactivation in the soma and germ-line // Eur. J. Hum. Genet., -1996, Vol. 4, Suppl. 1, P. 22.

25. Ballabio A, Willard H.F. Mammalian X chromosome inactivation and the XIST gene // Current Op. Genet. Develop., -1992, Vol. 2, P. 439 447.

26. Bartles I., Hansmann I., Eiben B. Excess of female in chromosomally normal spontaneous abortuses // Am. J. Hum. Genet., 1990, Vol. 35, № 2, P. 297 - 298.

27. Baylin, S. B. Tying it all together: epigenetics, genetics, cell cycle, and cancer// Science, -1997, Vol. 277, P. 1948-1949.

28. Be C., Velasquez P., Youlton R. Spontaneous abortion: cytogenetic study of 609 cases // Rev Med Chil., -1997, Vol. 125, № 3, P. 317 322.

29. Bell K.A., vanDeerlin P.G., Haddad B.R., Feinberg R.F. Cytogenetic diagnosis of «normal 46,XX» karyotypes in spontaneous abortions frequently may be misleading // Fertil.Steril, -1999, Vol.2, Р.334 341.

30. Boue J., Boue A., Lazar P. Retrospective and prospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions // Teratology, 1975, Vol. 12, P. 11-26.

31. Brajenovi-Mili В., Petrovi О., Krasevi M., Risti S., Kapovi M. Chromosomal anomalies in abnormal human pregnancies // Fetal Diagn Ther., -1998, Vol.13, № 3, P. 187-191.

32. Braude P.R. Time-dependent effects of -amanitin on blastocyst formation in the mouse // J. Embryol. Exp. Morphol., -1979, Vol. 52, P. 193 202.

33. Brown C.J, Ballabio A, Rupert J.L. et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exlusively from the inactive X chromosome //Nature, 1991a, Vol. 349, P. 38 44.

34. Brown C.J, Lafreniere R.G, Powers V. E. et al. Localization of the X inactivation centre on the human X chromosome in Xql3 // Nature, -1991b, Vol. 349, P. 82 84.

35. Brown C.J., Hendrich B.D., Rupert J.L. et al. The human XIST gene: analysis of a 17kb inactive X-specific RNA that contains conserved repeats and is highly localized within the nucleus // Cell, -1992, Vol. 71, P. 527 542.

36. Brown C.J., Willard H.F. The human X-inactivation centre is not required for maintenance of X-chromosome inactivation //Nature, -1994, Vol. 368, P. 154 -156.

37. Brown S.D.M. XIST and mapping of the X-chromosome inactivation centre // BioEssays, -1991, Vol. 13, P. 607 612.

38. Byrne J., Warburton D. Male excess among anatomically normal fetuses in spontaneous abortions // Am. J. Med. Genet., -1987, Vol. 26, № 3, P. 605 611.

39. Caiafa P., Attina M., Cacace F. et al. 5-methylcytosine in nucleosome subpopulations differently involved in gene expression // Biochem. Biophis. acta., -1986, Vol. 867, P. 195-200.

40. Carr D.H. Chromosome studies in selected spontaneous abortions. III. Early pregnancy loss // Obstet. Ginecol., -1971, Vol. 37, № 5, P. 570-574.

41. Carr D.H. Cytogenetics and the pathologist // Pathol. Annu., -1975, Vol. 10, P. 93 144.

42. Cattanach B.M., Beechey C.V. Autosomal and X-chromosome imprinting // Dev. Suppl., -1990, P. 63-72.

43. Cedar H. DNA methylation and gene activity // Cell, -1988, Vol. 53, P. 3 4.

44. Chang C., Saltzman A., Yeh S., Young W., Keller E., Lee H.J., Wang C., Mizokami A. Androgen receptor: an overview // Crit. Rev. Eukaryot. Gene. Expr., -1995, Vol. 5, №2, P. 97-125.

45. Clegg K.B., Piko L. RNA synthesis and cytoplasmic polyadenylation in the one-cell mouse embryo //Nature, -1982, Vol. 295, P. 342 345.

46. Coltman D.W., Bowen W.D., Wright J.M. Birth weight and neonatal survival of harbour seal pups are positively correlated with genetic variation measured by microsatellites // Proc. R. Soc. Lond. В Biol. Sci., -1998, Vol. 265, № 1398, P. 803-809.

47. Comings D.E. The rationale for an ordered arrangement of chromatin in the interphase nucleus // Am. J. Hum. Genet., -1968, Vol. 20, P. 440 460.

48. Coulson T.N., Pemberton J.M., Albon S.D., Beaumont M., Marshall T.C., Slate J., Guinness F.E., Clutton-Brock Т.Н. Microsatellites reveal heterosis in red deer // Proc. R. Soc. Lond. В Biol. Sci., -1998, Vol. 265, № 1395, P. 489-495.

49. Crocoll A., Zhu C.C., Cato A.C., Blum M. Expression of androgen receptor mRNA during mouse embryogenesis // Mech. Dev., -1998, Vol. 72, № 1-2, P. 175178.

50. Crouse H.V. The controlling element in sex chromosome behaviour in Sciara // Genetics, 1960, Vol. 45, P. 1429 - 1443.

51. Daniels, R.; Zuccotti, M.; Kinis, Т.; Serhal, P.; Monk, M. XIST expression in human oocytes and preimplantation embryos // Am. J. Hum. Genet, -1997, Vol. 61, P. 33-39.

52. Davies К. The essence of inactivity//Nature, -1991, Vol. 349, P. 15 16.

53. Deol M.S., Whitten W.K. X-chromosome inactivation: Does it occur at the same time in all cells of the embryo? // Nature. New. Biol., -1972, Vol. 240, P. 277 -278.

54. Dutrillaux В., Muleris M., Seureau M.G. Imbalance of sex chromosomes, with gain of early-replicating X, in human solid tumors // Int. J. Cancer., -1986, Vol. 38, №4, P. 475-479.

55. Edwards A., Hammond H.A., Jin L., Caskey C.T., Chakraborty R. Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups // Genomics, 1992, Vol. 12, P. 241 - 253.

56. Epstein C.J., Travis В., Tucher G. et al. The direct demonstation of an X chromosome dosage effect prior to inactivation Genetic mosaics and chimeras in mammals, Ed. Russel L.B. N.Y., L.: Plenum press, 1978, P. 261 - 267.

57. Flash G., Johnson M.H., Braude P.R. et al. The transition from maternal to embryonic control in the 2-cell mouse embryo // EMBO J., -1982, Vol. 1, P. 681 -686.

58. Fry M., Loeb L.A. The fragile X syndrome d(CGG)n nucleotide repeats from a stable tetrahelical structure // Proc. Natnl. Acad. Sci. USA., -1994, Vol. 91, P. 4950 4954.

59. Gardner R.L, Lyon M.F. X chromosome inactivation studies by injection of a single cell into mouse blastocyst //Nature, -1971, Vol. 231, P. 385 386.

60. Gartler S. Epigenetic defects and variable escape from gene silencing in ICF syndrome // International symposium on X chromosome inactivation in mammals, Novosibirsk, 1999, P. 47.

61. Gartler S.M, Riggs A.D. Mammalian X chromosome inactivation // Ann. Rev. Genet, -1983, Vol. 17, P. 185 190 .

62. Goldman M.A, Stokes K.R, Idzerda R.L. et al. A chiken transferring gene in transgenic mice escapes X-chromosome inactivation // Science, -1987, Vol. 236, P. 593 595.

63. Goto T, Wright E, Monk M. Paternal X-chromosome inactivation in human trophoblastic cells // Mol. Hum. Reprod, 1997, Vol. 3, № 1, P. 77 - 80.

64. Grant M, Zuccotti M, Monk M. X-chromosome activity and imprinting. -Sex chromosomes and sex-determining genes. Eds. Reed K.C, Graves J.A.M, Chur.: Harwood Acad. Pub, 1993, P. 245 260.

65. Grant S.G, Chapman V.M. Mechanisms of X chromosome regulation // Ann. Rev. Genet, -1988, Vol. 22, P. 199 233.

66. Griffin D.K, Millie E.A, Redline R.W, Hassold T.J, Zaragoza M.V. Cytogenetic analysis of spontaneous abortions: Comparison of techniques and assessment of the incidence of confined placental mosaicism // Am. J. Med. Genet, -1997, Vol. 72, P. 297-301.

67. Guerneri S, Bettio D, Simoni G. et al. Prevalence and distribution of chromosome abnormalities in a sample of first trimester internal abortion. // Hum. Reprod, 1987, Vol. 2, № 8, P. 735-739.

68. Haaf T, Ott G, Schmid M. Differential inhibition of sister chromatid condensation induced by 5-azadeoxycytidine in human chromosomes // Chromosoma, -1986, Vol. 94, P. 389 394.

69. Haaf Т., Ott G., Schmid M. Inhibition of condensation in the late-replicating X chromosome induced by 5-azadeoxycytidine in human lymphocyte cultures // Hum. Genet., -1988, Vol. 79, P. 18 23.

70. Hansmann M., Hackeloer B-J., Staudach A. Ultrasound diagnosis in obstetrics and gynecology. Berlin: Springer-Verlag, 1985, 495 p.

71. Harper M.I., Monk M. Evidence for translation of HPRT enzyme on maternal mRNA in early mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morphol., -1983, Vol. 74, P. 15-28.

72. Hassold Т., Chen N., Funchouser J. et al. A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions // Ann. Hum. Genet., -1980, Vol. 44, № 2, P. 151 178.

73. Hilfiker A., Yang Y., Hayes D.H., Beard C.A., Manning J.E., Lucchesi J.C. Dosage compensation in Drosophila: the X-chromosomal binding of MSL-1 and MLE is dependent on Sxl activity // EMBO J., 1994, Vol. 13, P. 3542 - 3550.

74. Hook E., Warburton D. The distribution of chromosomal genotypes associated with Turners syndrome: live birth prevaleance rates and genotypes associated with structural X abnormalities or mosaicism // Hum. Genet., -1983, Vol. 64, P. 24-27.

75. Hoshi N., Hanatani K., Kishida Т., Sagawa Т., Fujimoto S. Chromosomal analysis in 894 induced abortuses from women of advanced maternal age in relation to gestational weeks and fetal sex ratio II J. Obstet. Gynaecol. Res., -1997, Vol. 23, № 1,P. 1-7.

76. Jablonka E., Goitein R., Sperling K. et al. 5-aza-C-induced changes in the time of replication of the X chromosomes of Microtus agrestis are followed by non-random reversion to a late pattern of replication // Chromosoma, -1987, Vol. 95, P. 81-88.

77. Johns M.B. Jr., Paulus-Thomas J.E. Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol // Anal. Biochem., -1989, Vol. 180, № 2, P. 276 278.

78. Johnson M.N. The molecular and cellular basis of preimplantation mouse development // Biol. Rev., -1981, Vol. 56, P. 463 498.

79. Kaslow D.C, Migeon B.R. DNA methylation stabilizes X chromosome inactivation in eutherians, but not in marsupials: evidence for multi-step maintenance of mammalian X dosage compensation // Proc. Natnl. Acad. Sci. USA., -1987, Vol. 84, P. 6210-6214.

80. Kay G.F., Barton S.C., Surani M.A. et al. Imprinting and X chromosome counting mechanisms determine Xist expression in early mouse development // Cell, -1994, Vol. 77, № 5, P. 639 650.

81. Kay, G. F.; Penny, G. D.; Patel, D.; Ashworth, A.; Brockdorff, N.; Rastan, S. Expression of Xist during mouse development suggests a role in the initiation of X chromosome inactivation // Cell,- 1993, Vol. 72, P. 171-182.

82. Keshet I., Lieman Hurwitz J., Cedar H. DNA methylation affects the formation of active chromatin // Cell, -1986, Vol. 44, P. 535 543.

83. Kishida Т., Tamaki Y. Japanese population data on X-chromosomal STR locus HUMARA // Jpn. J. Legal. Med., -1997, Vol. 51, № 5, P. 376-379.

84. Knowland J., Graham C.F. RNA synthesis at the two-cell stage of mouse development // J. Embryol. Exp. Morphol., -1972, Vol. 27, P. 167 176.

85. Krumlauf R., Chapman V.M., Hammer R.E. et al. Differential expression of a-fetoprotein genes on the inactive X chromosome in extraembryonic and somatic tissues of a transgenic mouse line // Nature, -1986, Vol. 319, P. 224 226.

86. Kuhl D.P.A., Caskey C.T. Trinucleotide repeats and genome variation // Curr.Op.Genet.Dev., -1993, Vol. 3, P. 404-407.

87. E., Beard C., Jaenisch R. Role for DNA methylation in genomic imprinting // Nature, -1993, Vol. 366, P. 362 365.

88. Maeda Т., Ohno M., Matsunobu A., Yoshihara K., Yabe N. A cytogenetic survey of 14835 consecutive liveborns // Jinrui Idengaku Zasshi, -1991, Vol. 31, № 1,P. 117-129.

89. Magnuson Т., Epstein C.J. Genetic control of very early mammalian development // Biol. Rev., -1981, Vol. 56, P. 369 408.

90. Maniatis Т., Fritsch E.E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, 479p.

91. Mann J.R., Gadi J., Harbison M.L., Abbondanzo S.J., Stewart C.L. Androgenetic mouse embrionic stem cells are pluripotent and cause sceletal defects in chimeras: implications for genetic imprinting// Cell, 1990, Vol.62, P. 251 - 260.

92. Mann J.R., Lovell-Badge R. Two maternally derived X chromosomes contribute to parthenogenetic inviability // Development, -1988, Vol. 103, P. 129 -136.

93. McAbee M.D., DonCarlos L.L. Ontogeny of region-specific sex differences in androgen receptor messenger ribonucleic acid expression in the rat forebrain // Endocrinology, -1998, Vol. 139, № 4, P. 1738-1745.

94. McBurney M.W. X chromosome inactivation: a hypothesis // Bioessays, -1988, Vol. 9, P. 85 88.

95. McCarrey J.R., Dilworth D.D. Expression of Xist in mouse germ cells correlates with X-chromosome inactivation //Nature Genet., -1992, Vol. 2, P. 200 -203.

96. Merz E. Ultrasound in gynecology and obstetrics. -Stuttgart: Georg Thieme Verlag, 1991,343 р.

97. Migeon B.R, Schmidt M., Axelman J., Cullen C. Complete reactivation of X chromosomes from human chorionic villi with a switch to early DNA replication // Proc. Natal. Acad. Sci. USA., 1986, Vol. 83, P. 2182 - 2186.

98. Migeon B.R. X-chromosome inactivation: Molecular mechanisms and genetic consequences // Trends Genet., 1994, Vol. 10, P. 230 - 234.

99. Migeon B.R., Brown T.R., Axelman J., Migeon C.J. Studies of the locus for androgen receptor: localization on the human X and evidence for homology with the Tfm locus in the mouse // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, Vol. 78, P. 6339 -6343.

100. Migeon B.R, Do T.T. Studies of placenta in search of nonrandom X-inactivation // Amer. J. Hum. Genet, -1978, Vol. 30, A 132.

101. Monk M. Mammalian development. A practical approach. IRL Press, Oxford Washington DC, 1987, 410 p.

102. Monk M, Grant M. Preferntial X chromosome inactivation, DNA methylation and imprinting // Dev. Suppl, -1990, P. 55 62.

103. Monk M, Harper M.I. Sequential X chromosome inactivation coupled with cellular differentiation in early mouse embryos // Nature, -1979, Vol. 281, P. 311 -313.

104. Monk M, Harper M.I. X-chromosome activity in preimplantation mouse embryos from XX and XO mothers // J. Embryol. Exp. Morphol, -1978, Vol. 46, P. 53 64.

105. Morton N.E, Hassold Т.Е., Funkhouser J. et al. Cytogenetic surviellance of spontaneous abortions //Cytogenet. Cell. Genet,- 1982, Vol. 33, P. 232 239.

106. Mutter G.L, Boynton K.A. PCR bias in amplification of androgen receptor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies // NAR,- 1995, Vol. 23, №8, P. 1411-1418.

107. Newall A, Duthie S, Formstone E, Jonston C, Nesterova T, Brockdorff N. A targeted mutation in the Xist 5' region caused extreme non-random X inactivation // International symposium on X chromosome inactivation in mammals, Novosibirsk, 1999, P. 26.

108. Ohno S. Conservation of ancient linkage groups in evolution and some insigh into the genetic regulator mechanism of X-inactivation // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., -1973, Vol. 38, P. 155 164.

109. Ohno S. Evolution of sex chromosomes in mammals // Annu. Rev. Genet., -1969, Vol.3,P. 495 -524.

110. Ohno S. Life history of female germ cells in mammals // Second Intern. Conference on Congenital Malformations, The Intern. Med. Congress Ltd. N.Y., 1964, P. 36-40.

111. Ohno S. Sex chromosomes and sex linked genes. -Berlin. Springer Verlag,1967.

112. Okamoto I., Tan S-S., Takagi N. Random X-chromosome inactivation in androgenetic mouse embryos // International symposium on X chromosome inactivation in mammals, Novosibirsk, 1999, P. 85.

113. Page D. Zeroing in on the sex switch // Science, 1988, Vol. 239, P. 21 - 23.

114. Panning В., Dausman J., Jaenisch R. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization // Cell, -1997, Vol. 90, P. 907-916.

115. Paterson C.A., Brockdorff N., McDonald L.E., Kay G.F. Imprintig of XIST expression and X inactivation // International symposium on X chromosome inactivation in mammals, Novosibirsk, 1999, P. 22.

116. Penaherrera M.S. et al. X-chromosome inactivation studies in mosaic trisomies // Am. J. Hum. Genet., -1999, Vol. 65, № 4, A74.

117. Penrose L.S., Delhanty J.D.A. Triploid cell cultures from a macerates fetus // Lancet, -1961, Vol. 1, P. 1261-1263.

118. Pravtcheva D.D., Adra C.N., Ruddle F.N. Timing of paternal Pgk-1 expression in embryos of transgenic mice II Development, -1991, Vol. 111, Р. 1109 -1120.

119. Procter S.E., Watt J.L., Gray E.S. Cytogenetic analysis in 100 spontaneous abortions in North-East Scotland // Clin. Genet.,- 1986, Vol. 29, № 2, P. 101 103.

120. Quan F., Janas J., Toth-Fejel S.E., Johnson D.B., Wolford J.K., Popovich B.W. Uniparental disomy of the entire X chromosome in a female with Dushenne muscular dystrophy // Am. J. Hum. Genet., -1997, Vol. 60, P. 160 165.

121. Razin A, Cedar H. DNA methylation and genomic imprinting // Cell, -1994, Vol. 77, P. 473 476.

122. Razin A., Shemer R. DNA methylation in early development // Hum. Mol. Genet., -1995, Vol. 4, P. 1751 1755.

123. Richards B. Rapid PCR analysis of the Stl4 (DXS52) VNTR // NAR, 1991, Vol. 19, P. 1944.

124. Riggs A.D., Pfeifer G. P. X chromosome inactivation and cell memory // Trends Genet., -1992, Vol. 8, P. 169 174.

125. Ropers H-H., Wollf G., Hitzeroth H.W. Preferential X inactivation in human placenta membranes: in the paternal X inactive in early embryonic development of female mammals? // Hum. Genet., -1978, Vol. 43, P. 265-73.

126. Sartor O., Zheng Q. Determination of CAG repeat length in the androgen-receptor gene using frozen serum // Urology, -1997, Vol. 49, P. 301-304.

127. Schinzel A.A., Robinson W.P., Binkert F., Torresani Т., Werder E.A. Exclusively paternal X-chromosomes in a girl with short stature // Hum. Genet., -1993, Vol. 92, P. 175 178.

128. Schmid M., Haaf Т., Grunert D. 5-azacytidine-induced udercondensations in human chromosomes // Hum. Genet., -1984, Vol. 67, P. 257 263.

129. Schmid M., Ott G., Haaf T. et al. Evolutionary conservation of fragile sites inducad by 5-azadeoxycytidine in man, gorilla and chimpanzee // Hum. Genet., -1985, Vol. 71, P. 342-350.

130. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes // Lancet, -1971, Vol.2, P. 971-972.

131. Shaffer L.G., McCaskill C., Adkins K., Hassold T.J. Systematic search for uniparental disomy in early fetal losses: the results and a review of the literature // Am. J. Med. Genet., -1998, Vol. 79, P. 366 372.

132. Simoni G., Sirchia S. Confined plancental mosaicism // Prenatal Diagnosis, -1994, Vol. 14, P. 1185-1189.

133. Sleddens H.F.B.M., OostraB.A., Brinkmann A.O., Trapman J. Trinucleotide repeat polymorphism in the androgen receptor gene (AR) // NAR, -1991, Vol. 20, № 6. P. 1427.

134. Smith M., Creasy M.R., Clarke A., Upadhyaya M. Sex ratio and absence of uniparental disomy in spontaneous abortions with a normal karyotype // Clin.Genet., -1998, Vol. 4, P. 258 -261.

135. Takagi N. A glimpse at the murine X chromosome inactivation system through embryos with unusual genomic constitution // International symposium on X chromosome inactivation in mammals, Novosibirsk, 1999, P. 64-65.

136. Takagi N. Preferential inactivation of the paternally derived X chromosome in mice. Genetic mosaics and chimeras in mammals, Ed. Russel L.B. N.Y. L., Plenum press, 1978, P. 341 - 360.

137. Takagi N., Sasaki M. Preferential inactivation of the paternally derived X chromosome in the extraembryonic membranes of the mouse // Nature, 1975, Vol. 256, P. 640-641.

138. Takagi N., Sugawara O., Sasaki M. Regional and temporal changes in the pattern of X-chromosome replication during postimplantation development of the female mouse // Chromosoma, 1982, Vol. 85, P. 275 - 286.

139. Tam P.P.L., Williams E.A., Tan S-S. Expression of an X-linked HMG-lacZ transgene in mouse embryos: Implication of chromosomal imprinting and lineages-specific X-chromosome activity // Develop. Genet., -1994, Vol. 15, P. 491 503.

140. Tan S-S., Williams E.A., Tam P.P.L. X-chromosome inactivation occurs at different times in different tissues of the postimplantation mouse embryos // Nature Genet., -1993, Vol. 3, P. 170 174.

141. Vandeberg J.L. Developmental aspects of X chromosome inactivation in eutherian and metatherian mammals // J. Exp. Zool., 1983, Vol. 228, № 2, P. 271 -286.

142. Viegas-Pequignot E., Dutrillaux B. Segmentation of human chromosomes induced by 5-ACD (5-azcytidine) // Hum. Genet., -1976, Vol. 34, P. 247 254.

143. Wake N., Takagi N., Sasaki M. Non random inactivation of X chromosome in the rat yolk sac // Nature, 1976, Vol. 262, P. 580 - 581.

144. Wang N., Cedrone E., Skuse G.R., Insel R., Dry J. Two identical active X chromosome in human mammary carcinoma cells // Cancer Genet. Cytogenet., -1990, Vol. 46, № 2, P. 271-280.

145. Warburton D., Stein Z., Kline J. Chromosome abnormalities in spontaneous abortions. Data from New York city studies. Human embrionic and fetal death. -New York: Academic Press, 1980, P. 261 314.

146. Watkins W.S., Bamshad M., Jorde L.B. Population genetics of trinucleotide repeat polymorphisms // Hum.Mol.Genet., -1995, Vol. 4, № 9, P. 1485-1491.

147. Weber J.L., May P.E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction // Am.J.Hum.Genet., -1989, Vol. 44, P. 388-396.

148. Witt M., Erickson R.P. A rapid method for detection of Y-chromosomal DNA from dried blood specimens by the polymerase chain reaction // Hum. Genet.,-1989, Vol. 82, P. 271-274.

149. Wu H., Fassler R., Schnieke A. et al. An X-linked human collagen transgene escapes X inactivation in a subset of cells // Development, -1992, Vol. 116, P. 687 -695.

150. Yamamoto M., Ito Т., Watanabe G.I. Determination of prenatal sex ratio in man // Human Genetics, -1997, Vol. 36, № 3, P. 265 269.

151. Yoder, J. A.; Yen, R.-W. C.; Vertino, P. M.; Bestor, Т. H.; Baylin, S. B. New 5-prime regions of the murine and human genes for DNA (cytosine-5)-methyltransferase // J. Biol. Chem., -1996, Vol. 271, P. 31092-31097.

152. Young W.J., Chang C. Ontogeny and autoregulation of androgen receptor mRNA expression in the nervous system // Endocrine, -1998, Vol. 9, № 1, P. 79-88.

153. Zuccotti M., Monk M. Methylation of the mouse Xist gene in sperm and eggs correlates with imprinted Xist expression and paternal X-inactivation // Nature Genet., -1995, Vol. 9, P. 316 320.

Информация о работе

Евдокимова, Виктория Николаевна
кандидата биологических наук
Томск, 2000
ВАК 03.00.15

Диссертация

Исследование связи инактивации Х-хромосомы с эмбриолетальностью у человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы