Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и неактивной X-хромосоме у обыкновенных полевок

Дементьева, Елена Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и неактивной X-хромосоме у обыкновенных полевок
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и неактивной X-хромосоме у обыкновенных полевок"

□ОЭ49413Б

На правах рукописи

Дементьева Елена Вячеславовна

СТАТУС ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА НА АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМЕ У ОБЫКНОВЕННЫХ

ПОЛЕВОК

Генетика-03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

2 5 МАР 2010

003494136

Работа выполнена в Учреждения Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАК, в лаборатории эпигенетики развития, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Закиян С.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор - Кикнадзе И.И.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Лебедев И.Н.

НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск

Ведущее учреждение: Институт биологии гена, г. Москва

Защита состоится «34» г. на утреннем заседании

диссертационного совета по зашите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090. г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан «i.C»> 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Дозовая компенсация генов половых хромосом является одной из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем современной биологии. Необходимость дозовой компенсации ьозникает у организмов, половые хромосомы которых значительно отличаются по морфологии и генетическому содержанию. Специализация половых хромосом у самцов млекопитающих приводит к нарушению соотношения уровней экспрессии генов Х-хромосомы между полами, которое устраняется с помощью подавления транскрипции, инактивации, генов на одной из двух Х-хромосом у самок. Процесс инактивации Х-хромосомы изучается уже на протяжении нескольких десятилетий. И хотя в понимании его механизмов достигнут значительный прогресс, остается еще целый ряд невыясненных вопросов.

Гены Х-хромосомы самок млекопитающих в различной степени вовлечены в систему дозовой компенсации. Так, ряд генов избегает инактивации и сохраняет экспрессию на неактивной Х-хромосоме. Имеющиеся данные о статусе экспрессии генов Х-хромосомы у человека, мыши и некоторых других видов (Jegalian, Page, 1998; Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Yen et ai, 2007) указывают на то, что избегающие инактивации гены характерны для X-хромосомы многих таксонов плацентарных млекопитающих. Было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих различия в статусе экспрессии генов X-хромосомы, однако причины, по которым те или иные гены избегают инактивации, на сегодняшний день не известны.

Существует две формы процесса инактивации Х-хромосомы: импринтированная и случайная. Импринтированная инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца, наблюдается у некоторых видов плацентарных млекопитающих (например, грызунов) на предымплантационных стадиях развития эмбриона и сохраняется в клетках экстраэмбриональных тканей. В клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время имплантации происходит реактивация отцовской Х-хромосомы и последующий процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской X-хромосомы. Оба типа инактивации зависят от экспрессии гена Xist. Установление неактивного состояния сопровождается распространением Xist РНК вдоль инакгивируемой Х-хромосомы, утратой модификаций, характерных для транскрипционно активного хроматина, и приобретением модификаций транскрипционно неактивного хроматина (Heard, Disteche, 2006; Шевченко и др., 2006). Было показано, что при случайной инактивации в соматических тканях человека и коровы модификации хроматина на неактивной Х-хромосоме формируют два типа гетерохроматина, которые ассоциированы с различными типами G-бэндов и отличаются по времени репликации в поздней 8ч{)азе (Chadwick, Willard, 2004; Coppola ei al., 2008). Тем не менее, остается неясным, свойственна ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосоме других видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два тина гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-хромосомы при импринтированной инактивации.

Случайная инактивация Х-хромосомы в отличие от импринтированной стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений. Принято считать, что

за стабильность случайной инактивации у ¡человека и мыши отвечает мегилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хромосомы. Роль метилирования ДНК в процессе импринтированной инактивации еще только предстоит выяснить, поскольку в настоящее время существует очень мало данных как о статусе метилирования, так и о статусе экспрессии генов X-хромосомн в экстраэмбриональных тканях самок млекопитающих.

Решению вопросов о том, с чем связаны различия в статусе экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, и о роли модификаций хроматина в процессах случайной и импринтированной инактивации, будет способствовать детальное изучение процесса инактивации Х-хромосомы у других видов млекопитающих. В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН проводится исследование процесса инактивации X-хромосомы у обыкновенных полевок рода \iicrotus. В данной работе на примере обыкновенных полевок впервые проведено сравнение статусов экспрессии и метилирования генов, а также распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме при случайной и импринтированной инактивации.

Цель и задачи работы. Цель работы - установление статуса экспрессии генов и модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;

2. Сравнение статуса метилирования промоторных областей и/или первых экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок;

3. Выяснение характера распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в фибробластах, трофобластных стволовых клетках и клетках экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок.

Научная новизна работы. На основе клеточных линий самок межвидовых гибридов М. го$$1аетепсИопаИ.<; х М. аюаНя создана модельная система для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы, и определен статус экспрессии 15 генрв в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. Проведено, сравнение профиля экспрессии генов Х-хромосомы обыкновенных полевок с данными, имеющимися по человеку и мыши. Впервые установлен статус метилирования промоторных областей и/или первых экзонов 4 генов X-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. На примере трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок впервые исследован характер распределения модификаций хроматина на мегафазных хромосомах при импринтированной инактивации Х-хромосомы.

Положения, выносимые на защиту.

1. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация X-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с соматическими тканями;

2. В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от экстраэмбриональных тканей наблюдается четкое соответствие между статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов X-хромосомы и их транскрипционной активностью;

3. При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух типов гетерохроматина, различающихся по составу и локализации.

Научно-практическая значимость работы. Результаты данной работы вносят вклад в понимание эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17 — 22 сентября 2006 г.), на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. '

По теме диссертации опубликованы три работы. Одна - в рецензируемом отечественном журнале, две - в рецензируемых зарубежных журналах.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК выполнялась совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Анализ результатов иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом клеточных линий обыкновенных полевок проводился совместно с к.б.н. C.B. Павловой и к.б.н. А.И. Шевченко.

Структура и объем диссертации. Диссертация. включает разделы: введение, обзор литературы, материалы й методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы (182 наименования). Работа изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ 1. Получение и цитогенетическая характеристика линий фибробластов самок гибридов M. rossiaemeridionalis х M. arvalis.

Первичные культуры фибробластов легкого гибридной самки М. rossiaemeridionalis * M. arvalis получали методом трипсинизации (Nesterovà et al., 1994). Препараты метафазных хромосом субкпонов готовили согласно

(Nesterova et al., 1998). Для выявления позднореплицирующегося хроматина за 6 часов до начала приготовления цитогенетических препаратов метафазных хромосом к клеткам добавляли 5-бромдезоксиуридин. Дальнейшую обработку препаратов и иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к 5-бромдезоксиуридину проводили как описано в работе Shevchenko et al. (2009). РНК-ДНК FISH с зондами на Xist РНК и повтор MS4 из блока гетерохроматина Х-хромосомы M. rossiaemeridionalis был выполнен по стандартным методикам (Lawrence et al. 1989; Fantes et al, 1995). Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе NIKON XI00 с помощью программного обеспечения фирмы Imstar.

2, Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок.

РНК была выделена из 12,5-дневных эмбрионов самцов и самок M. arvalis и М. rossiaemeridionalis, а также из фибробластов легкого, плацент и субклона линии клеток экстраэмбриональной эндодермы (XEN) гибридных самок М. rossiaemeridionalis * M. arvalis с помощью TRI REAGENT (Sigma) или RNAzol В (Biogenesis) согласно инструкциям фирм производителей. Для очистки образцов РНК от контаминаций ДНК использовали набор реагентов TURBO DNA-free (Ambion). Реакции обратной транскрипции проводили при помощи обратной транскриптазы M-MLV (Promega) и random decamer праймеров (Invitrogene) согласно прилагаемым рекомендациям. При анализе экспрессии гена Xist в экстраэмбриональных тканях для синтеза кДНК использовался цепь-специфичный праймер SDX3 (5'-cccagtgctggtgagctattcc-3'). Полученная кДНК амплифицировалась с помощью ПЦР. Нуклеотидную последовательность ПЦР-продуктов определяли согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation) на автоматическом секвенаторе в Межинститутском центре секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН). Поиск межвидовых отличий нуклеотидных последовательностей кДНК осуществлялся программой SeqMan (DNASTAR). Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах, плацентах и клетках XEN самок гибридов М. rossiaemeridionalis х М. arvalis определяли методом удлинения праймера на 1 нуклеотид (single nucleotide primer extension, SNuPE) (Singer-Sam et al., 1992). В случае генов Chm, Napll3, Rbbp7, Sybil, Utx в реакции добавлялись [a32PJdATP или [a32P]dGTP; для генов Atrx, Ddx3x, Hprt, Midi, Pgkl, Rab9, Sbi.8, Slc7a3, Ubelx, Xist использовались [a32P]dCTP или [a32P]dTTP.

3. Определение статуса метилирования генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок.

Геномная ДНК из печени, трофобластных стволовых (ТС) и XEN клеток была выделена как описано в работе Слрбодянюка с соавт. (1994). Геномная ДНК гидролизировалась ЕсоШ, а затем; чувствительными к метилированию эндонуклеазами рестрикции (New England BioLabs). Саузерн блот-гибридизацию с зондами на прсмоторную область и/или первый экзон генов проводили согласно руководству Маниатис и др. (1984). Подбор чувствительных к метилированию

эвдоиуклеаз рестрикции осуществляли с помощью программы MapDraw (DNASTAR).

4. Иммунофлуорссцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом.

Цитоцентрифугирование фибробластов, ТС и XEN клеток и последующее иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом антителами к различным модификациям хроматина проводилось как описано в работе Shevchenko et al. (2009). Анализ препаратов осуществлялся как при ДНК-РНК PISH. Для каждой модификации хроматина было проанализировано не менее 100 метафазных пластинок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Статуе экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических тканях обыкновенных полевок из легкого гибридной самки М. гох$\аетег1(ИопаИз х М. апгаШ была получена первичная культура фибробластов. У гибридных самок М. го$.ьчаетег1сИопа11$ х М. агуаШ инактивация Х-хромосомы происходит неслучайным образом. В 85% клеток неактивной становится Х-хромосома М. гоях^аетепсИопаНз, остальные клетки содержат неактивную Х-хромосому М. атаИх (/.ак'тп ег а1., 1987). Чтобы иметь линии фибробластов, где точно известно, Х-хромосома какого вида неактивна, было проведено субклонирование первичной культуры. В результате были получены четыре субклона фибробластов (линии 8А004, 8А005, 8А006, 5А007). В работе также использовался ранее полученный в лаборатории эиигенетики развития ИЦиГ СО РАН субклон фибробластов гибридной самки М. гоязгаетегШопаНз х М. атаШ (линия БАГМ). Транскрипционный статус X-хромосом обоих видов в субклонах оценивался на основании двух свойств неактивной Х-хромосомы: более поздней репликации по сравнению с активным гомологом и экспрессии гена ХШ. Было показано, что в субклонах БА004-7 неактивной является Х-хромосома М. гозвшетеИсЧопаИя, а в субклоне -

Х-хромосома М. ап>аШ. В качестве экетраэмбриональных тканей использовались плаценты и субклон клеток ХЕК гибридных самок М. гоз$1аетег1сИопаШ х М. атаИз, в которых импринтированной инактивации подвергается отцовская Х-хромосома М. агхаШ (Шевченко и др., 2008).

Для того чтобы различить аллели генов на активной и неактивной X-хромосоме в клетках гибридных самок, был осуществлен поиск межвидовых различий нуклеотидных последовательностей их кДНК у М. аггаШ и М. гоз$1аетепс1юпаШ. Пары праймеров были подобраны по известным нуклеотидным последовательностям генов обыкновенных полевок или нуклеотидным последовательностям ортологичных генов мыши, крысы и человека. ПЦР-продукты ожидаемых размеров с кДНК М. атаШ и М. гозвшетепсИотИз были получены для 26 генов. Секвенирование подтвердило их гомологию исследуемым генам. Межвидовые различия нуклеотидных последовательностей кДНК были найдены только для 15 генов. В случае

остальных 11 генов межвидовые различия нуклеотидных последовательностей кДНК не были обнаружены, что в дальнейшем не позволило определить их статус экспрессии.

При исследовании статуса экспрессии 15 генов в фибробластах обыкновенных полевок были обнаружены практически все типы экспрессии генов Х-хромосомы (рис. 1). Так, гены Atrx, Chm. Hprt, Midi, Naplß, Pgkl, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybil, Ubelx экспрессируются на активной Х-хромосоме и подвергаются инактивации на неактивной Х-хромосоме. Ген Xist экспрессируется на неактивной Х-хромосоме, а на активной Х-хромосоме его транскрипция репрессирована. Ген Utx экспрессируется как на активной, так и на неактивной Х-хромосоме, т.е. избегает инактивации. Статус экспрессии этих 13 генов одинаков во всех 5 исследуемых субклонах фибробластов в отличие от генов Sbl,8 и Ddx3x. В линиях SA004-7 ген БЫ.8 экспрессируется на активной Х-хромосоме, а в линии SAD4 - на активной и неактивной Х-хромосоме. Напротив, ген Ddx3x экспрессируется на обеих Х-хромосомах в линиях SA004-7 и лишь на активной Х-хромосоме в линии SAD4. По-видимому, гены Sbl.8 и > Ddx3x имеют гетерогенную экспрессию у обыкновенных полевок. Поскольку субклоны SA004-7 и SAD4 были получены из первичных культур фибробластов легкого разных гибридных самок, то уровень экспрессии генов Sbl. 8 и Ddx3x может варьировать между особями и, если эта разница в уровне экспрессии имеет какое-либо значение, то она может вносить вклад в индивидуальные различия.

По профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных полевок более сходна с Х-хромосомой мыши, чем с Х-хромосомой человека. Так, на X-хромосоме обыкновенных полевок была выявлена группа инактивирующихся генов Chm, NaplB, Rab9, Rbbp7, Ubelx. У человека ортологи большинства из них избегают инактивации (Carrel, Willard, 1999, 2005). У мыши установлен статус экспрессии лишь для гена Ubelx, который также подвергается инактивации (Carrel et al., 1996; Yen et al., 2007). Кроме того, известно, что ряд генов, избегающих инактивации у человека, подвергается инактивации у мыши (Disteche, 1995, 1999; Brown, Greally, 2003). Возможно, что у представителей отряда грызунов (мышь, обыкновенные полевки и др.) число избегающих инактивации генов может быть меньше, чем в других отрядах плацентарных, либо инактивации избегают совсем другие гены Х-хромосомы. Это предполагает, что эволюция процесса инактивации Х-хромосомы в различных группах плацентарных млекопитающих происходила независимым образом.

Ранее было показано, что некоторые гены и трансгены, подвергающиеся инактивации в соматических тканях, способны экспрессироваться на неактивной Х-хромосоме в экстраэмбриональных тканях (Kratzer et al, 1983; KrumJauf et al., 1986; Hadjantonakis et al., 2001; Garrick et al., 2006). В связи с этим принято считать, что импринтированная инактивация Х-хромосомы является менее полной и/или стабильной, чем случайная. Тем не менее, систематического исследования статуса экспрессии генов Х-хромосомы при импринтированной инактивации до сих пор не проводилось.

фибробласты контроль геномная SA004-7 SAD4 ДНК arv ros arv ros arv ros arv ros Xa Xi Xi Xa

плацента XEN arv ros arv ros Xi Xa Xi Xa

№pU3

Atrx

Midi

Chm

Ubelx

Xist

Utx

Sbl.8

Ddx3x

щ щ ■<

Рис. 1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах и экстраэмбриональных тканях гибридных самок M. rossiaemeridionalis х M. arvalis. Ха и Xi - активная и неактивная Х-хромосомы, arv - M. arvalis, ros — M. rossiaemeridionalis, XEN - клетки экстраэмбриональной эндодермы. Контрольные реакции проводились без добавления матрицы.

В плацентах и субклоне клеток XEN обыкновенных полевок большинство исследуемых генов имеет тот же статус экспрессии, что и в фибробластах (рис. 1). Гены Hprt, Napll3, Pgkl, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, экспрессируются только на активной Х-хромосоме. Экспрессия гена Xist осуществляется лишь с неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации. Однако между профилями экспрессии генов Х-хромосомы в фибробластах и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок был обнаружен ряд отличий. Гены Sbl.8 и Ddx3x, которые имеют гетерогенную экспрессию в фибробластах, экспрессируются на активной и неактивной Х-хромосоме в обоих типах экстраэмбриональных тканей. Инактивирующийся в фибробластах ген Ubelx экспрессируется на обеих Х-хромосомах в субклоне клеток XEN и в плаценте. Интересно, что гены Atrx, Chm, Midi демонстрируют линиеспецифическую инактивацию. В плаценте гены Atrx и Midi экспрессируются на обеих Х-хромосомах, а в субклоне клеток XEN инактивируются также как и в фибробластах. Напротив, ген Chm подвергается инактивации в плаценте и фибробластах, но экспрессируется на обеих X-хромосомах в субклоне клеток XEN. Линиеспецифичность инактивации генов Atrx, Chm и Midi может быть следствием относительной нестабильности импринтированной инактивации. Кроме того, линиеспецифичность инактивации

(доза) некоторых генов Х-хромосомы может влиять на развитие и функционирование экстраэмбриональных тканей. Это предположение подкрепляется тем, что ген Atrx избегает инактивации в производных трофобласта и подвергается инактивации в экстраэмбриональной эндодерме не только у обыкновенных полевок, но и у мыши (Garrick et al., 2006; Patrat et al., 2009).

Таким образом, часть генов, подвергающихся инактивации в соматических тканях, может экспрессироваться на неактивной Х-хромосоме в экстраэмбриональных тканях. Это свидетельствует в пользу предположений о меньшей полноте и/или стабильности импринтированной инактивации. Вероятно, соматические и экстраэмбриональные ткани имеют различные потребности в дозовой компенсации генов Х-хромосомы. Поскольку экстраэмбриональные ткани необходимы в онтогенезе млекопитающих ограниченный период времени, дозовая компенсация при импринтированной инактивации Х-хромосомы может быть менее строгой (Heard, 2005), и значение имеет только уровень экспрессии ограниченного набора генов Х-хромосомы.

2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Статус метилирования определялся для 4 генов Х-хромосомы с известными нуклеотидными последовательностями промоторной области и/или 1 экзона (рис. 2). Были использованы печени самцов и самок М. arvalis и М. rossiaemeridionalis, а также недифференцированные и дифференцированные ТС и XEN клетки М. rossiaemeridionalis. В ТС клетках обыкновенных полевок, как и в XEN клетках, инактивация Х-хромосомы импринтирована (Grigor'evaeía/., 2009).

Е E + MS E + MS Е E + MS E + MS

arv ros arv ros ТС XEN arvros arvros arvros TCXENTCXEN <?¥<??<?$(?? нд<?? <J?<?? ¿Ш <??<JS нД(??нД<?¥

m m m m m <■-■ -4 * ШшЩф

Nap2l3 »»«•<з-*м»м||<|

• 1 * •** »* « <3

»*-# <1

Sbi.8 ** 94 Vtx

» m,.«. _ Чувствительные к метилированию

• в < эндонуклеазы рестрикции:

NapU3, Sbl.8 - Aval, Xist - Pvul, Utx -BssНП, HpaTL. Е-ЯсоЫ

arv - M. arvalis, ros - M. rossiaemeridionalis 4 метилированный аллель с неметилированный аллель

Рис. 2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. ТС - трофобластные стволовые клетки самок М. rossiaemeridionalis'. н - недифференцированные, д -

дифференцированные. XEN - клетки экстраэмбрионалыюй эндодермы М rossiaemeridionalis.

3meH3K27

Ха

г , , Xi

ЗшеЮК27|

ШЬпННЬ • Ха

' \ %

ЗтеШК9

Рис. 3. Модификации хроматина в фибробластах самок М. го$31аетепсИопа/г5. А. Триметилированный НЗК27 (ЗтеНЗК27) и убиквитинированный гистон Н2А (иН2А). Б. Триметилированный НЗК9 (ЗшеНЗК9) и триметилированный НЗК27 (ЗтеНЗК27). В. Гетерохроматиновый белок НР1 и триметилированный НЗК27 (ЗшеНЗК27). Ха и Х1 -активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался 4,6 -диамидино-2-фенилиндол (ОАР1).

Рис. 4. Модификации хроматина в клетках экстраэмбриональной эндодермы самок М. rossiaemeridionalis. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом антителами к гетерохроматиновому белку НР1 и убиквитинированному гистону Н2А (иН2А). Ха и Xi - активная и неактивная Х-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался DAPI.

Рис. 5. Модификации хроматина в недифференцированных трофобластных стволовых клетках самок М. го$$1аетеп<1юпаИз. А. Убиквитинированный гистон Н2А (иН2А) и триметилированный НЗК9 (ЗтеНЗК9). Б. Гетерохроматиновый белок НР1 и триметилированный НЗК9 (ЗшеНЗК9). В. Убиквитинированный гистон Н2А (иН2А) и триметилированный НЗК27 (ЗшеНЗК27). Ха и XI - активная и неактивная X-хромосомы. Для общего окрашивания хромосом использовался ЭАР1.

Рис. 6. Модификации хроматина в трофобластных стволовых клетках самок М. го$$1аетег1сИопаН8 на различных стадиях дифференцировки. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер антителами к гетерохроматиновому белку НР1 и триметилированному НЗК27 (ЗшеНЗК27). Верхний ряд соответствует 4 дню дифференцировки, нижний ряд - 6 дню дифференцировки.

В соматических тканях самцов обыкновенных полевок были выявлены только немегилированные аллели генов Napll3 и Sbl.8. У самок наблюдаются неметилированные и метилированные аллели, которые, по всей видимости, соответствуют активной и неактивной Х-хромосоме. Эго результат согласуется с инактивацией гена Napll3 и гетерогенной экспрессией гена Sbl.8 в фибробластах полевок. Ген Xist полностью метилирован у самцов и частично метилирован у самок, чго соответствует его репрессии у самцов и экспрессии лишь на неактивной Х-хромосоме у самок. Ген Utx не подвергается метилированию ни у самцов, ни у самок обыкновенных полевок, что согласуется с его экспрессией на единственной Х-хромосоме у самцов и обеих X-хромосомах у самок.

Метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной X-хромосомы является самым поздним событием при установлении случайной инактивации и считается ответственным за стабильное поддержание неактивного состояния (Brockdorff, 2002). У человека и мыши между статусом метилирования CpG-островков 5' областей и транскрипционной активностью генов Х-хромосомы прослеживается четкая корреляция: активные аллели не метилированы, тогда как неактивные аллели метилированы (Carrel et al., 1996; Gilbert, Sharp, 1999; Matarazzo et al., 2002). Данная закономерность наблюдается и в соматических тканях обыкновенных полевок и означает, что метилирование ДНК в промоторных районах и/или 1 экзонах генов Х-хромоеомы играет важную роль в поддержании их неактивного состояния при случайной инактивации.

В экстраэмбриональных тканях статус метилирования генов неактивной Х-хромосомы до сих пор остается неясным. Считается, что уровень метилирования генов неактивной Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях ниже, чем в соматических тканях. Об этом свидетельствуют экспрессия некоторых генов и трансгенов на неактивной Х-хромосоме (Kratzer et al, 1983; Krumlauf et al., 1986; Hadjantonakis et al, 2001; Garrick et al., 2006), а также устойчивость экстраэмбриональных тканей к экстенсивному деметилированию in vivo (Sado et al., 2000). Однако CpG-динуклеотиды в 5' областях некоторых генов Х-хромосомы подвергаются, метилированию в экстраэмбриональных тканях мыши и человека (Grant et al., 1992; Norris et al., 1994; Goto et al., 1997).

У обыкновенных полевок в клетках XEN, как и в фибробластах, ген Nap 113 не подвергается метилированию у самца и частично метилируется у самки, что согласуется с его инактивацией в данной линии клеток (рис. 2). Несмотря на то, что в плаценте ген Napll3 также инактивируется, он не метилируется в ТС клетках самки ни до дифференцировки, ни в процессе дифференцировки. Это означает, что метилирование данного гена на неактивной Х-хромосоме может осуществляться на более поздних стадиях дифференцировки либо он остается гипометилированным в производных трофобласта. Ген Sbl.8 избегает инактивации и в плаценте, и в клетках XEN. Однако в ТС и XEN клетках самок обыкновенных полевок выявляется метилированный аллель гена Sbl.8. Известно, что уровень экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, как правило, ниже, чем на активной Х-хромосоме (Disteche et al, 2002; Carrel, Willard, 2005; Johnston et al., 2008). В таком случае

метилирование гена Sbl.H в ТС и XEN клетках самок обыкновенных полевок могло бы отражать более низкий уровень экспрессии его аллеля на неактивной Х-хромосоме. Возможно также, что в ТС и XEN клетках метилирование ДНК не принимает участия в регуляции экспрессии генов Napll3 и Sbl.8 или метилирование совсем других CpG-сайтов участвует в регуляции их экспрессии. Об этом может свидетельствовать метилирование единственного аллеля гена Sbl.8 в XEN клетках самца. Статусы экспрессии и метилирования генов Xist и Utx сходны в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. В экстраэмбриональных тканях ген Xist также репрессирован у самцов и транскрибируется лишь на неактивной Х-хромосоме у самок. В клетках XEN самцов ген Xist полностью метилирован. В ТС и XEN клетках самок наряду с метилированным аллелем выявляется неметилированный аллель, соответствующий экспрессии данного гена на неактивной Х-хромосоме. Ген Utx не метилируется ни в ТС клетках, ни в клетках XEN у обыкновенных полевок, что согласуется с избеганием инактивации в плаценте и клетках XEN.

В экстраэмбриональных тканях метилирование ДНК, вероятно, участвует в регуляции экспрессии только части генов Х-хромосомы. Значит, при импринтированной инактивации Х-хромосомы метилирование ДНК может оказаться менее важным для поддержания неактивного состояния,' чем при случайной, и другие эпигенетические механизмы, например, Polycomb белки (Wang et al, 2001; Plath et al, 2004), могут вносить основной вклад в инактивацию генов в экстраэмбриональных тканях. Меньшей роли метилирования ДНК в поддержании неактивного состояния генов при импринтированной инактивации может способствовать ограниченная по времени необходимость в экстраэмбриональных тканях, и в результате корректно метилированными оказываются только те гены Х-хромосомы, уровень экспрессии которых является критичным.

3. Модификации хроматина Х-хромосомы обыкновенных полевок при случайной и импринтированной инактивации.

Модификации хроматина исследовались у самок M. rossiaemeridionalis на примере фибробластов, где инактивация Х-хромосомы происходит случайным образом, а также XEN и ТС клеток, где инактивация импринтирована (Шевченко и др., 2008; Grigor'eva et al, 2009). Клетки XEN получают из гинобласта бластоцисты, поэтому они могут моделировать события, происходящие в экстраэмбриональной эндодерме. ТС клетки, по-видимому, отражают события, происходящие в трофобластной линии экстраэмбриональных тканей.

Методом иммунофлуоресцентного окрашивания метафазных хромосом антителами к различным модификациям хроматина на неактивной Х-хромосоме фибробластов и большинства клеток XEN были обнаружены два неперекрывающихся типа гетерохроматина. Первый тип гетерохроматина представлен триметилированным по лизину в 27 положении гистоном НЗ (ЗшеЩК27) и моноубиквитинированным по лизину в 119 положении гистоном Н2А (иН2А) (рис. ЗА, 4). Их локализация совпадает с G-негативными бэндами Х-хромосомы, а также с ранее установленной локализацией Xist РНК (Duthie et al, 1999). Второй тип гетерохроматина образован триметилированным по

лизину в 9 положении гистоном НЗ (ЗтеНЗК9) и гетерохроматиновым белком НР1 и соответствует G-позитивным бэцдам Х-хромосомы (рис. ЗБ-В, 4). Кроме того, ЗгаеНЗК9 и НР1 выявляются в центрсмерпых и теломерных районах аутосом и половых хромосом, а также в блоках конститутивного гетерохроматина на обеих, активной и неактивной, Х-хромосомах.

На примере хромосом человека и мыши было показано, что ЗтеНЗК27 локализуется в участках хроматина, содержащих неактивные гены, фланкирующие межгенные районы и SINE элементы. Напротив, ЗтеНЗК9 маркирует протяженные участки неактивного хроматина, обогащенные LINE элементами и LTR и имеющие низкую плотность генов (Valley et al., 2006; Chadwick, 2007; Pauter et al., 2009). Таким образом, на неактивной Х-хромосоме, по всей видимости, действуют две системы сайленсинга, направленные на инактивацию различных типов нуклеотидных последовательностей. Гетерохроматин первого типа (3meH3K27, иН2А и Xisi РНК) необходим для инактивации генов, в то время как гетерохроматин второго типа (ЗтеНЗК9 и НР1) участвует в инактивации районов Х-хромосомы, содержащих преимущественно повторенные последовательности.

До настоящего времени существование на неактивной Х-хромосоме двух различных по набору модификаций и локализации типов гетерохроматина было установлено лишь для человека (приматы) и коровы (парнокопытные) (Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). В данной работе они выявлены на неактивной Х-хромосоме в фибробластах и клетках XEN самок обыкновенных полевок - представителей еще одного отряда плацентарных млекопитающих, грызунов. Этот факт свидетельствует, во-первых, о едином принципе поддержания неактивного состояния при случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а, во-вторых, о сходстве структуры хроматина неактивной Х-хромосомы у различных видов плацентарных.

В недифференцированных ТС клетках самок М. rossiaemeridionalis, которые, вероятно, представляют ранние этапы импринтированной инактивации, характер распределения 3meH3K9, НР1 и иН2А существенно отличается от фибробластов и клеток XEN. 3meH3K9, НР1 и, что удивительно uH2A, были равномерно распределены вдоль всей неактивной Х-хромосомы и детектировались в центромерных и теломерных районах на аутосомах и обеих Х-хромосомах (рис. 5А, Б). Интересно, что примерно в половине случаев иН2А не обнаруживался в блоке конститутивного гетерохроматина неактивной X-хромосомы (рис. 5В), а ЗтеНЗК9 и HPI не выявлялись в блоке конститутивного гетерохроматина на активной Х-хромосоме (рис. 5А, Б). Это свидетельствует о том, что на данных стадиях развития блок конститутивного гетерохроматина на Х-хромосоме еще окончательно не сформирован.

На неактивной Х-хромосоме в недифференцированных ТС клетках не был выявлен ЗтеНЗК27 (рис. 5В). Интересно, что в ТС клетках мыши ЗтеНЗК27 является типичной для неактивной Х-хромосомы модификацией хроматина (Мак et al., 2002; Silva et al., 2003). Данное различие может объясняться иной динамикой процесса инактивации в предымплантационном развитии по сравнению с мышью. Считается, что ЗтеНЗК27 отвечает за появление на неактивной Х-хромосоме uH2A (de Ñapóles et al., 2004; Plath et al., 2004). Однако

в недифференцированных ТС клетках полевок иН2А появляется на неактивной Х-хромосоме раньше, чем ЗтеНЗК27, что подтверждает существование независимого от 3meH3K27 механизма убиквитинирования гистона Н2А (Schoeftner et а!., 2006).

Структура хроматина неактивной Х-хромосомы в недифференцированных ТС клетках обыкновенных полевок очень сходна со структурой Х-хромосомы в сперматогенезе млекопитающих. Те же самые модификации хроматина (3meH3K9, НР1, иН2А) устанавливаются на Х-хромосоме в пахитене первого деления мейоза, когда инициируется мейотическая инактивация половых хромосом, и сохраняются после мейоза вплоть до замены гистонов на протамины. Этот факт указывает на возможность существования связи между мейотической и импринтированной инактивацией Х-хромосомы и предполагает, что модификации хроматина, установленные в процессе мейотической инактивации, могут- быть тем самым импринтом, который обеспечивает инактивацию отцовской Х-хромосомы в раннем развитии.

Для того чтобы выяснить, когда ЗтеНЗК27 появляется на неактивной X-хромосоме, были исследованы ТС клетки на различных стадиях дифференцировки (рис. 6). На 4 день дифференцировки ЗтеНЗК27 обнаруживается на неактивной Х-хромосоме лишь в отдельных клетках. На 6 день дифференцировки ЗтеНЗК27 наблюдается практически во всех ТС клетках. Установление ЗтеНЗК27 сопровождается снижением уровня ЗтеНЗК9 и НР1 на неактивной Х-хромосоме. Вероятно, в процессе дифференцировки ТС клеток происходит постепенное замещение системы сайленсинга ЗтеНЗК9/НР1 на ЗтеНЗК27/цН2А, а дальнейшее поддержание неактивного состояния X-хромосомы в трофобластной линии осуществляется, как в экстраэмбриональной эндодерме и при случайной инактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа направлена на изучение механизмов инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих. Впервые установлены статусы экспрессии и метилирования генов, а также распределение модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

В соматических тканях, фибробластах гибридных самок М. гозьгаетепсИопаШ * М. ап/аИ.ч, были обнаружены практически все известные на сегодняшний день типы экспрессии генов Х-хромосомы: инактивирующиеся, избегающие инактивации, гены с гетерогенной экспрессией. Сравнение полученных результатов с данными, имеющимися по человеку и мыши, показало, что по профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных полевок сходна с мышиной Х-хромосомой и, скорее всего, заметно отличается по набору избегающих инактивации генов от Х-хромосомы человека.

Исследование статуса экспрессии генов Х-хромосомы в плацентах и субклоне клеток ХЕК гибридных самок дало возможность сравнить профили экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок большинство

исследуемых генов Х-хромосомы имеет тот же статус экспрессии, что и в фибробластах. Однако несколько генов Х-хромосомы, которые подвергались инактивации в фибробластах, экспрессиревались на обеих Х-хромосомах, по крайней мере, в одном из типов экстраэмбриональных тканей. Этот факт подтвердил высказанные ранее предположения о меньшей полноте и/или стабильности импринтированной инактивации Х-хромосомы но сравнению со случайной.

Определение статуса метилирования промоторных областей и/или 1 экзонов генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок позволило выяснить роль метилирования ДИК в процессах случайной и импринтированной инактивации. В соматических тканях наблюдалось четкое соответствие между статусами экспрессии и метилирования гена: транскрипционно активные аллели не подвергались метилированию, тогда как транскрипционно неактивные аллели были метилированы. Этот результат согласуется с данными, имеющимися по мыши и человеку, и свидетельствует о важности метилирования ДНК дня поддержания неактивного состояния1 генов при случайной инактивации Х-хромосомы. В экстраэмбриональпых тканях данная закономерность соблюдалась лишь для части генов, т.е. при импринтированной инактивации ведущая роль в поддержании : неактивного состояния генов, вероятно, принадлежит другим модификациям хроматина.

Изучение распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах фибробластов, а также ХЕК и ТС клеток самок М. гашае/нтЛодо/гя, дало возможность сравнить структуру хроматина неактивной Х-хромосомы при случайной и импринтированной инактивации. Было показано, что при случайной и импринтированной инактивации на неактивной X-хромосоме устанавливаются два неперекрывающихся типа гегерохроматина: один образован ЗтеНЗК27 и иН2А, другой - ЗтеНЗК9 и НР1. Поскольку те же самые типы гетерохроматина были ранее обнаружены у человека и коровы, то они, по-видимому, являются универсальными для неактивной Х-хромосомы плацентарных млекопитающих.

В недифференцированных ГС клетках, соответствующих ранним стадиям импринтированной инактивации, ЗшеНЗК27 не выявляется, а ЗтеНЗК9, НР1 и иН2А равномерно распределены вдоль неактивной Х-хромосомы. Аналогичную структуру хроматина имеет X-хромосома в сперматогенезе млекопитающих, что предполагает существование связи между мейотической и импринтированной инактивацией. ЗшеНЗК27 устанавливается на неактивной Х-хромосоме в процессе дифференцировки ТС клеток, что сопровождается снижением уровня ЗшеНЗК9 и НР1.

Полученные данные способствуют пониманию эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации Х-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.

выводы

1. В фибробластах гибридных самок М. rossiaemeridionalis х М. arvalis выявлены все основные типы экспрессии генов Х-хромосомы. U генов (Atrx, Chm, Hprt, Midi, Nap] 13, Pgkl, Rab9, Rbbp?, Slc7a3, Sybil, Ubelx) подвергаются инактивации, ген Xist транскрибируется только с неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации, гены Sb 1.8 и Ddx3x демонстрируют гетерогенную экспрессию;

2. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация X-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с фибробластами. Гены Atrx, Chm, Midi, Ubelx, подвергающиеся инактивации в фибробластах, в плацентах и клетках экстраэмбриональной эндодермы гибридных самок М. rossiaemeridionalis * М. arvalis экспрессируются не только на активной, но и на неактивной Х-хромосоме;

3. В соматических тканях обыкновенных полевок в отличие от трофобластных стволовых клеток и клеток экстраэмбриональной эндодермы наблюдается четкое соответствие между статусом метилирования промоторной области и/или 1 экзона генов Х-хромосомы и их транскрипционной активностью. Данный факт предполагает, что при случайной инактивации метилирование ДНК имеет большее значение для поддержания неактивного состояния генов Х-хромосомы, чем при импринтированной инактивации;

4. При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух неперекрывающихся типов гетерохроматина: первый образован триметилированным НЗК27 и убиквитинированным Н2А, второй — триметилированным НЗК9 и гетерохроматиновым белком НР1;

5. В недифференцированных трофобластных стволовых клетках обыкновенных полевок, соответствующих ранним стадиям импринтированной инактивации, триметилированный НЗК9, НР1 и убиквитинированный Н2А равномерно распределены на неактивной X-хромосоме, а триметилированный НЗК27 отсутствует. Триметилирование НЗК27 на неактивной Х-хромосоме происходит в процессе дифференцировки трофобластных стволовых клеток и сопровождается снижением уровня триметилированного НЗК9 и НР1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Шевченко А.И., Павлова C.B., Дементьева К.В.. Голубева Д.В., Закияи С.М. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1225-1234.

2. Dementyeva E.V.. Shevchenko A.I., Zakian S.M. X-chromosorne upregulation and motivation two sides of the dosage compensation mechanism in mammals //BioEssays. 2009. V. 31. Ms 1. P. 21-28.

3. Shevchenko A.I., Pavlova S.V., Dementyeva E.V., Zakian S.M. Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus rossiaemeridionalis //Mammalian Genome. 2009. V. 20. № 9-10. P. 644-653.

4. Dementyeva E.V., Shevchenko A.!., Anoprivenko O.V., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. X-linked genes mapping and expression status analysis in common voles // Book of abstracts of the 2nd Conference on X-inactivation. Paris, 2006. P. 68.

5. Дементьева E.B.. Шевченко А.Й., Аноприенко O.B.. Мазурок H.A., Закиян С.М. Картирование и статус экспрессии генов Х-хромосомы у обыкновенных полевок //' Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск. 2007. С. 65-66.

6. Шевченко А.И., Павлова C.B., Дементьева Е.В. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы у обыкновенных подевок рода Microtus ¡I Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 2007. С. 186.

7. Васькова Е.А., Дементьева Е.В. Сравнение модификаций хроматина неактивной Х-хромосомы фибробластов и трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок // Материалы XLVI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический

. прогресс», секция биология. Новосибирск, 2008. С. 100-101.

8. Вагнер Т.В., Дементьева Е.В. Изучение статуса экспрессии генов X-хромосомы у обыкновенных полевок рода Microtus II Тез. докл. Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», секция биология. Москва, 2009. С. 88.

9. Дементьева Е.В.. Шевченко А.И., Вагнер Т.В., Захиян С.М. Статусы экспрессии и метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок // Материалы Международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск, 2009. С. 94-95.

10. Васькова Е.А., Шевченко А.И., Павлова C.B., Дементьева Е.В.. Григорьева Е.В., Закиян С.М. Модификации хроматина неактивной X-хромосомы у обыкновенных полевок // Материалы Международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск, 2009. С. 94.

Подписано к печати 26.02.2010 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч. изд. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 14.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дементьева, Елена Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Дозовая компенсация генов Х-хромосомы у млекопитающих

1.1.1. Коэволюция половых хромосом и процесса дозовой компенсации у млекопитающих

1.1.2. Дозовая компенсация генов Х-хромосомы в онтогенезе млекопитающих

1.1.2.1. Оогенез

1.1.2.2. Сперматогенез

1.1.2.3. Предымплантационное и раннее постимплантационное развитие

1.1.2.4. Соматические ткани взрослых особей

1.1.3. Экспрессия генов Х-хромосомы в соматических тканях млекопитающих

1.1.3.1. Полностью сбалансированная экспрессия генов Х-хромосомы

1.1.3.2. Экспрессия генов Х-хромосомы, сбалансированная между полами

1.1.3.3. Несбалансированная экспрессия генов Х-хромосомы

1.1.4. Экспрессия генов Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях млекопитающих

1.1.5. Механизмы регуляции экспрессии генов Х-хромосомы млекопитающих

1.2. Модификации хроматина Х-хромосомы млекопитающих

1.2.1. Модификации хроматина неактивной Х-хромосомы в ходе эмбриогенеза самок млекопитающих

1.2.2. Распределение модификаций хроматина на неактивной Х-хромосоме

1.2.3. Модификации хроматина на Х-хромосоме в сперматогенезе самцов млекопитающих

1.2.4. Статус метилирования генов Х-хромосомы млекопитающих

1.3. Х-хромосома группы обыкновенных полевок рода М1сго1ш 51 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56 2.1. Объект исследования 56 2.2 Методы работы с клеточными культурами

2.2.1. Состав культуральных сред и условия культивирования

2.2.2. Получение первичной культуры фибробластов легкого и ее субклонирование

2.2.3. Замораживание клеток

2.2.4. Размораживание клеток

2.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом

2.4. Выявление позднореплицирующегося хроматина

2.5. РНК-ДНК флуоресцентная гибридизация in situ

2.6. Выделение РНК

2.7. Синтез кДНК методом обратной транскрипции

2.8. Полимеразная цепная реакция

2.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.10. Выделение фрагментов ДНК из гелей

2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.12. SNuPE (single nucleotide primer extension)

2.13. Выделение геномной ДНК

2.14. Саузерн блот-гибридизация геномной ДНК

2.15. Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер и метафазных хромосом

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок

3.1.1. Получение и цитогенетическая характеристика линий фибробластов самок гибридов M. rossiaemeridionalis х M. arvalis

3.1.2. Поиск межвидовых различий нуклеотидных последовательностей генов X-хромосомы у М. arvalis и М. rossiaemeridionalis

3.1.3. Определение статуса экспрессии генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок

3.1.3.1. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в соматических тканях

3.1.3.2. Статус экспрессии генов Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях

3.2. Статус метилирования генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок

3.3. Модификации хроматина Х-хромосомы обыкновенных полевок при случайной и импринтированной инактивации

3.3.1. Модификации хроматина Х-хромосомы в фибробластах обыкновенных полевок

3.3.2. Модификации хроматина Х-хромосомы в клетках экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок

3.3.3. Модификации хроматина Х-хромосомы в трофобластных стволовых клетках обыкновенных полевок

Введение Диссертация по биологии, на тему "Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и неактивной X-хромосоме у обыкновенных полевок"

Актуальность. Дозовая компенсация генов половых хромосом является одной из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем современной биологии. Необходимость дозовой компенсации возникает у организмов, половые хромосомы которых значительно отличаются по морфологии и генетическому содержанию. У млекопитающих специализация и деградация генов на Y-хромосоме нарушает соотношение уровней экспрессии генов Х-хромосомы и аутосом у самцов, а также соотношение уровней экспрессии генов Х-хромосомы между полами. Несбалансированная экспрессия генов Х-хромосомы у млекопитающих устраняется с помощью сложной системы дозовой компенсации, которая включает удвоение уровня экспрессии генов на Х-хромосоме у самцов и одной из Х-хромосом у самок и подавление транскрипции, инактивацию, генов на второй Х-хромосоме у самок. Однако если убедительные доказательства удвоения уровня экспрессии генов на активной Х-хромосоме были получены сравнительно недавно (Gupta et al., 2006; Nguyen, Disteche, 2006; Johnston et al, 2008), то процесс инактивации изучается уже на протяжении нескольких десятилетий. И хотя в понимании механизмов инактивации Х-хромосомы достигнут значительный прогресс, остается еще целый ряд невыясненных вопросов.

Несмотря на общую сбалансированность уровня экспрессии, гены X-хромосомы самок млекопитающих в различной степени вовлечены в систему дозовой компенсации. Так, ряд генов избегает инактивации и сохраняет экспрессию на неактивной Х-хромосоме. Имеющиеся данные о статусе экспрессии генов X-хромосомы у человека, мыши и некоторых других видов (Jegalian, Page, 1998; Disteche et al., 2002; Carrel, Willard, 2005; Yen et al, 2007) указывают на то, что избегающие инактивации гены характерны для Х-хромосомы многих таксонов плацентарных млекопитающих. Было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих различия в статусе экспрессии генов Х-хромосомы, однако причины, по которым те или иные гены избегают инактивации, на сегодняшний день не известны.

Существует две формы процесса инактивации Х-хромосомы: импринтированная и случайная. Импринтированная инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца, наблюдается у некоторых видов плацентарных млекопитающих (например, грызунов) на предымплантационных стадиях развития эмбриона и сохраняется в клетках экстраэмбриональных тканей. В клетках, из которых формируются ткани собственно эмбриона, во время имплантации происходит реактивация отцовской Х-хромосомы и последующий процесс случайной инактивации либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Оба типа инактивации зависят от экспрессии гена Xist. Установление неактивного состояния сопровождается распространением Xist РНК вдоль инактивируемой Х-хромосомы, утратой модификаций, характерных для транскрипционно активного хроматина, и приобретением модификаций транскрипционно неактивного хроматина (Heard, 2005; Heard, Disteche, 2006; Шевченко и др., 2006; Wulz, Gribnau, 2007; Erwin, Lee, 2008). Было показано, что при случайной инактивации в соматических тканях человека и коровы модификации хроматина на неактивной Х-хромосоме формируют два типа гетерохроматина, которые ассоциированы с различными типами G-бэидов и отличаются по времени репликации в поздней S-фазе (Chadwick, Willard, 2004; Coppola et al., 2008). Тем не менее, остается неясным, свойствена ли такая организация хроматина неактивной Х-хромосомс других видов плацентарных млекопитающих, а также принимают ли эти два типа гетерохроматина участие в поддержании неактивного состояния Х-хромосомы при импринтированной инактивации.

Случайная инактивация Х-хромосомы в отличие от импринтированной стабильно поддерживается в ряду клеточных поколений. Принято считать, что за стабильность случайной инактивации у человека и мыши отвечает метилирование ДНК промоторных областей генов неактивной Х-хромосомы. Роль метилирования ДНК в процессе импринтированной инактивации еще только предстоит выяснить, поскольку в настоящее время существует очень мало данных как о статусе метилирования, так и о статусе экспрессии генов Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях самок млекопитающих.

Решению вопросов о том, с чем связаны различия в статусе экспрессии генов на неактивной Х-хромосоме, и о роли модификаций хроматина в процессах случайной и импринтированной инактивации, будет способствовать детальное изучение процесса инактивации Х-хромосомы у других видов млекопитающих. В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН проводится исследование процесса инактивации Х-хромосомы у обыкновенных полевок рода МгсгоШ. Показано, что виды полевок группы 'аюаИз' отличаются разнообразием морфологий Х-хромосомы, а у самок межвидовых гибридов инактивация Х-хромосомы происходит неслучайным образом. Кроме того, установлена локализация и нуклеотидные последовательности целого ряда генов X-хромосомы. Все это делает полевок группы 'агуаШ' очень перспективной моделью для изучения механизмов инактивации Х-хромосомы.

В данной работе на примере обыкновенных полевок впервые проведено сравнение статусов экспрессии и метилирования генов, а также распределения модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме при случайной и импринтированной инактивации.

Цели и задачи работы.

Цель работы - установление статуса экспрессии генов и модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Задачи работы:

Научная новизна. На основе клеточных линий самок межвидовых гибридов М. гозягаетепсИопаИя х М. агуаНз создана модельная система для изучения статуса экспрессии генов Х-хромосомы, и определен статус экспрессии 15 генов в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. Проведено сравнение профиля экспрессии генов Х-хромосомы обыкновенных полевок с данными, имеющимися по человеку и мыши. Впервые установлен статус метилирования промоторных областей и/или первых экзонов 4 генов Х-хромосомы в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок. На примере трофобластных стволовых клеток и клеток эксграэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок впервые исследован характер распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах при импринтированной инактивации X-хромосомы.

Практическая значимость. Результаты данной работы вносят вклад в понимание эпигенетических механизмов случайной и импринтированной инактивации X-хромосомы, а также механизмов регуляции экспрессии генов Х-хромосомы у самок млекопитающих.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), на международной' конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 124 страницах, содержит 12 рисунков и 8 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Дементьева, Елена Вячеславовна

108 ВЫВОДЫ

1. В фибробластах гибридных самок М. rossiaemeridionalis * М. arvalis выявлены все основные типы экспрессии генов Х-хромосомы. 11 генов (Atrx, Chm, Hprt, Midi, NapllS, Pgkl, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybil, Ubelx) подвергаются инактивации, ген Xist транскрибируется только с неактивной Х-хромосомы, ген Utx избегает инактивации, гены Sbl.8 и Ddx3x демонстрируют гетерогенную экспрессию;

2. В экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок инактивация X-хромосомы является менее полной и/или стабильной по сравнению с фибробластами. Гены Atrx, Chm, Midi, Ubelx, подвергающиеся инактивации в фибробластах, в плацентах и клетках экстраэмбриональной эндодермы гибридных самок М. rossiaemeridionalis х М. arvalis экспрессируются не только на активной, но и на неактивной Х-хромосоме;

4. При случайной и импринтированной инактивации у обыкновенных полевок поддержание неактивного состояния Х-хромосомы осуществляется с помощью двух неперекрывающихся типов гетерохроматина: первый образован триметилированным НЗК27 и убиквитинированным Н2А, второй триметилированным НЗК9 и гетерохроматиновым белком НР1;

5. В недифференцированных трофобластных стволовых клетках обыкновенных полевок, соответствующих ранним стадиям импринтированной инактивации, триметилированный НЗК9, НР1 и убиквитинированный Н2А равномерно распределены на неактивной Х-хромосоме, а триметилированный НЗК27 отсутствует. Триметилирование НЗК27 на неактивной Х-хромосоме происходит в процессе дифференцировки трофобластных стволовых клеток и сопровождается снижением уровня триметилированного НЗК9 и НР1.

109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа направлена на изучение механизмов инактивации X-хромосомы у самок млекопитающих. В ходе работы впервые установлены статусы экспрессии и метилирования генов, а также распределение модификаций хроматина на активной и неактивной Х-хромосоме в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Анализ статуса экспрессии 15 генов Х-хромосомы в субклонах фибробластов гибридных самок М. rossiaemeridionalis * М. arvalis, являющихся примером соматических тканей, выявил практически все известные на сегодняшний день типы экспрессии генов Х-хромосомы. Так, гены Atrx, Chm, Hprt, Midi, Napll3, Pgkl, Rab9, Rbbp7, Slc7a3, Sybll, Ubelx подвергаются инактивации, ген Xist экспрессируется только на неактивной Х-хромосоме, ген Utx избегает инактивации, еще два гена Sbl.8 и Ddx3x демонстрируют гетерогенную экспрессию. Сравнение полученных результатов с данными, имеющимися по человеку и мыши, показало, что по профилю экспрессии генов Х-хромосома обыкновенных полевок сходна с мышиной X-хромосомой и, скорее всего, заметно отличается по набору избегающих инактивации генов от Х-хромосомы человека. Различия в морфологии Х-хромосом М. arvalis и М. rossiaemeridionalis и локализации исследуемых генов позволили рассмотреть возможность влияния прицентромерного гетерохроматина, как препятствия для распространения сигнала инактивации, и хромосомных перестроек на экспрессию генов. Было сделано заключение о том, что они не играют решающей роли в установлении статуса экспрессии генов Х-хромосомы.

Исследование статуса экспрессии генов Х-хромосомы в плацентах и субклоне клеток XEN гибридных самок М. rossiaemeridionalis х М. arvalis дало возможность установить статус экспрессии целого ряда генов Х-хромосомы в экстраэмбриопальных тканях и сравнить его со статусом экспрессии генов X-хромосомы в соматических тканях. Было показано, что в плацентах и субклоне клеток XEN гибридных самок большинство генов Х-хромосомы имеет тот же статус экспрессии, что и в фибробластах. Однако несколько генов Х-хромосомы Atrx, Chm, Midi и Ubelx, которые подвергались инактивации в фибробластах, экспрессировались на обеих Х-хромосомах, по крайней мере, в одном из типов экстраэмбриональных тканей. Этот факт подтвердил высказанные ранее предположения о меньшей полноте и/или стабильности инактивации Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях.

Определение статуса метилирования промоторных областей и/или 1 экзонов генов АГарПЗ, БЫ.8, И1х в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок позволило выяснить роль метилирования ДНК в процессах случайной и импринтированной инактивации. В соматических тканях наблюдалось четкое соответствие между статусами экспрессии и метилирования гена: транскрипционно активные аллели не подвергались метилированию, в то время как транскрипционно неактивные аллели были метилированы. Этот результат согласуется с данными, имеющимися по мыши и человеку, и свидетельствует о важности метилирования ДНК для поддержания неактивного состояния генов при случайной инактивации Х-хромосомы. В экстраэмбриональных тканях данная закономерность соблюдалась лишь для части генов, что предполагает, что при импринтированной инактивации ведущая роль в поддержании неактивного состояния генов принадлежит другим модификациям хроматина.

Изучение распределения модификаций хроматина на метафазных хромосомах фибробластов, а также ХЕ1Ч и ТС клеток самок М. говягаетепсИопаИз, предоставило возможность сравнить структуру хроматина неактивной Х-хромосомы при случайной и импринтированной инактивации. Нами было показано, что и в фибробластах, где инактивация является случайной, и в клетках ХЕ1М, где инактивация импринтирована, на неактивной Х-хромосоме устанавливается два неперекрывающихся типа гетерохроматина: один образован триметилированным НЗК27 и убиквитинированиым Н2А, другой - триметилированным НЗК9 и гетерохроматиновым белком НР1.

В недифференцированных ТС клетках, соответствующих ранним стадиям импринтированной инактивации, триметилированный НЗК9, НР1 и убиквитинированный Н2А были равномерно распределены на неактивной X-хромосоме, в то время как триметилированный НЗК27 не был выявлен. Аналогичную структуру хроматина имеет Х-хромосома в сперматогенезе самцов млекопитающих, что указывает на существование связи между М8С1 и импринтированной инактивацией Х-хромосомы в предымплантационном развитии. Триметилированный НЗК27 устанавливался на неактивной Х-хромосоме в процессе дифференцировки ТС клеток, что сопровождалось снижением уровня триметилированного НЗК9 и белка

НР1. Таким образом, у обыкновенных полевок два типа гетерохроматина, образованные триметилированным НЗК27/иН2А и триметилированным НЗК9/белком НР1 соответственно, принимают участие в поддержании неактивного состояния X-хромосомы как при случайной, так и при импринтированной инактивации. Поскольку те же самые типы гетерохроматина были ранее обнаружены у человека и коровы, то они, по-видимому, являются универсальными для неактивной Х-хромосомы плацентарных млекопитающих.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дементьева, Елена Вячеславовна, Новосибирск

1. Бородин П.М., Саблина О.В., Закиян С.М. и др. Морфология и поведение в мейозе половых хромосом у четырех видов полевок рода Microtus // Генетика. 1991. Т. 27. № 6. С. 1059-1065. --------

2. Маяиатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва: Мир, 1984. 397с.

3. Мейер М.Н., Радэ/сабли С.И., Булатова Н.Ш. и др. Кариологические особенности и вероятные родственные связи полевок группы "arvalis" (Rodentia, Cricetidae) // Зоол. журн. 1985. Т. 64. С. 417-428.

4. Слободянюк С.Я., Павлова М.Е., Федоров А.Н. и др. ^/»МП-семейство тандемно организованных последовательностей байкальских коттоидных рыб (Cottoidei) //Молекулярная биология. 1994. Т. 28. С. 419-428.

5. Шевченко А.И., Павлова C.B., Дементьева Е.В. и др. Модификации хроматина в процессе инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих // Генетика. 2006. Т. 42. № 9. С. 1225-1234.

6. Шевченко А.И., Демина В.В., Мазурок H.A. и др. Линии стволовых клеток экстраэмбриональной эндодермы обыкновенных полевок рода Microtus // Генетика. 2008. Т. 44. № 11. С. 1477-1485.

7. Akhtar A. Dosage compensation: an intertwined world of RNA and chromatin remodelling // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. V. 13. № 2. P. 161-169.

8. Avner P., Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. № 1. P. 59-67.

9. Baarends W.M., Hoogerbrugge J. W., Roest H.P. et al. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis // Dev. Biol. 1999. V. 207. № 2. P. 322-333.

10. Baarends W.M., Wassenaar E., van der Laan R. et al. Silencing of unpairedchromatin and histone H2A ubiquitination in mammalian meiosis // Mol. Cell. Biol.2005. V. 25. № 3. P. 1041-1053.

11. Backer C.P., Guggiari M., Brors B. et al. Transient colocalization of X-inactivation centres accompanies the initiation of X inactivation // Nat. Cell. Biol. 2006. V. 8. № 3. P.293-299.

12. Bailey J.A., Carrel L., Chakravarti A. et al. Molecular evidence for a relationship between LINE-1 elements and X chromosome inactivation: the Lyon repeat hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 12. P. 6634-6639.

13. Bannister A. J., Zegerman P., Partridge J.F. et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain // Nature. 2001. V. 410. № 6824. P. 120-124.

14. Boumil R.M., Lee J.T. Forty years of decoding the silence in X-chromo'some inactivation // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. № 20. P. 2225-2232.

15. Boumil R.M., Ogawa Y., Sun B.K. et al. Differential methylation of Xite and CTCF sites in Tsix mirrors the pattern of X-inactivation choice in mice // Mol. Cell Biol.2006. V. 26. № 6. P. 2109-2117.

16. Brockdorff N. X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA // Trends Genet. 2002. V. 18. № 7. P. 352-358.

17. Brown C.J., Carrel L., Willard H.F. Expression of genes from the human active and inactive X chromosomes // Am. J. Hum. Genet. 1997. V. 60. № 6. P. 1333-1343.

18. Brown C.J., Greally J.M. A stain upon the silence: genes escaping X inactivation // Trends Genet. 2003. V. 19. № 8. P. 432-438.

19. Cao R., Zhang Y The functions of E(Z)/EZFI2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3 // Curr. Opin. Genet. Dev. 2004. V. 14. № 2. P. 155-164.

20. Carrel L., Clemson CM., Dunn J.M. et al. X inactivation analysis and DNA methylation studies of the ubiquitin activating enzyme El and PCTAIRE-1 genes in human and mouse // Hum. Mol. Genet. 1996. V. 5. № 3. P. 391-401.

21. Carrel L., Cottle A.A., Goglin K.C. et al. A first-generation X-inactivation profile of the human X chromosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 25. P. 14440-14444.

22. Carrel L., Willard H.F. Heterogeneous gene expression from the inactive X chromosome: an X-linked gene that escapes X inactivation in some human cell lines but is inactivated in others // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 13. P. 7364-7369.

23. Carrel L., Willard H.F. X-inactivation profile reveals extensive variability in X-1 inked gene expression in females //Nature. 2005. V. 434. № 7031. P. 400-404.

24. Chadwick B.P. Variation in Xi chromatin organization and correlation of the H3K27me3 chromatin territories to transcribed sequences by microarray analysis // Chromosoma. 2007. V. 116. № 2. P. 147-157.

25. Chadwick B.P., Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 50. P. 17450-17455.

26. Charchar F.J., Svartman M., El-Mogharbel N. et al. Complex events in the evolution of the human pseudoautosomal region 2 (PAR2) // Genome Res. 2003. V. 13. № 2. P. 281-286.

27. Charlesworth B. The evolution of sex chromosomes // Science. 1991. V. 251. № 4997. P. 1030-1033.

28. Chaumeil J., Okamoto I., Guggiari M. et al. Integrated kinetics of X chromosome inactivation in differentiating embryonic stem cells // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 75-84.

29. Chiba H., Hirasawa R., Kaneda M. et al. De novo DNA methylation independent establishment of maternal imprint on X chromosome in mouse oocytes // Genesis. 2008. V. 46. № 12.

30. Ciccodicola A., D'Esposito M, Esposito T. et al. Differentially regulated and evolved genes in the fully sequenced Xq/Yq pseudoautosomal region // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 9. № 3. P. 395-401.

31. Cooper D.W., Johnston P.G., Watson J.M. et al. X-inactivation in marsupials and monotremes // Semin. Dev. Biol. 1993. V. 4. P. 117-128.

32. Coppola G., Pinton A., Joudrey E.M. et al. Spatial distribution of histone isoforms on the bovine active and inactive X chromosomes // Sex. Dev. 2008. V. 2. № 1. P. 1223.

33. Costanzi C., Pehrson J.R. Histone macroH2Al is concentrated in the inactive X chromosome of female mammals //Nature. 1998. V. 393. № 6685. P. 599-601.

34. Dandolo L., Stewart C.L., Mattel M.G. et al. Inactivation of an X-linked transgene in murine extraembryonic and adult tissues // Development. 1993. V. 118. № 2. P. 641649.

35. Disteche C.M. Escape from X inactivation in human and mouse // Trends Genet. 1995. V. 11. № l.P. 17-22.

36. Disteche C.M. Escapees on the X chromosome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. №25. P. 14180-14182.

37. Disteche C.M. The not-so-silent X // Nat. Genet. 2008. V. 40. № 6. P. 689-690.

38. Disteche C.M., Dinulos M.B., Bassi M.T. et al. Mapping of the murine tbll gene reveals a new rearrangement between mouse and human X chromosomes // Mamm. Genome. 1998. V. 9. № 12. P. 1062-1064.

39. Disteche C.M., Filippova G.N., Tsuchiya K.D. Escape from X inactivation // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 36-43.

40. Duret L., Chureau C., Samain S. et al. The Xist RNA gene evolved in eutherians by pseudogenization of a prolein-coding gene // Science. 2006. V. 312. № 5780. P. 1653-1655.

41. Duthie S.M., Nesterova T.B., Formstone E.J. et al. Xist RNA exhibits a banded localization on the inactive X chromosome and is excluded from autosomal material in eis // Hum. Mol. Genet. 1999. V. 8. № 2. P. 195-204.

42. Erwin J.A., Lee J.T. New twists in X-chromosome inactivation // Curr. Opin. Cell Biol. 2008. V. 20. N° 3. P. 349-355.

43. Fang J., Chen T., Chadwick B. et al. Ring lb-mediated H2A ubiquitination associates with inactive X chromosomes and is involved in initiation of X inactivation // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 51. P. 52812-52815.

44. Fantes J.A., Oghene K., Boyle S. et al. A high-resolution integrated physical, cytogenetic, and genetic map of human chromosome 11: distal pl3 to proximal pi 5.1 // Genomics. 1995. V. 25. № 2. P. 447-461.

45. Filippova G.N., Cheng M.K., Moore J.M. et al. Boundaries between chromosomal domains of X inactivation and escape bind CTCF and lack CpG methylation during early development//Dev. Cell. 2005. V. 8. № 1. P. 31-42.

46. GarrickD., Sharpe J.A., Arkell R. et al. Loss of Atrx affects trophoblast development and the pattern of X-inactivation in extraembryonic tissues // PLoS Genet. 2006. V. 2. № 4. e58.

47. Gilbert S.L., Sharp P.A. Promoter-specific hypoacetylation of X-inactivated genes // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. V. 96. № 24. P. 13825-13830.

48. Goldman M.A., Stokes K.R., Idzerda R.L. et al. A chicken transferrin gene in transgenic mice escapes X-chromosome inactivation // Science. 1987. V. 236. № 4801. P. 593-595.

49. Goto T., MonkM. Regulation of X-chromosome inactivation in development in mice and humans // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. № 2. P. 362-378.

50. Goto T., Wright E., Monk M. Paternal X-chromosome inactivation in human trophoblastic cells //Mol. Hum. Reprod. 1997. V. 3. № 1. P. 77-80.

51. Goto Y., Gomez M., Brockdorff N. et al. Differential patterns of histone methylation and acetylation distinguish active and repressed alleles at X-linked genes // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 66-74.

52. Grant M., Zuccotti M., Monk M. Methylation of CpG sites of two X-linked genes coincides with X-inactivation in the female mouse embryo but not in the germ line // Nat. Genet. 1992. V. 2. № 2. P. 161-166.

53. Graves J.A. The origin and function of the mammalian Y chromosome and Y-borne genes an evolving understanding // BioEssays. 1995. V. 17. № 4. P. 311-320.

54. Graves J.A., Disteche C.M. Does gene dosage really matter? // J. Biol. 2007. V. 6. № l.P. 1.

55. Graves J.A., Disteche C.M., Toder R. Gene dosage in the evolution and function of mammalian sex chromosomes // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V. 80. P. 94-103.

56. Greaves I.K., Rangasamy D., Devoy M. et al. The X and Y chromosomes assemble into H2A.Z-containing facultative heterochromatin following meiosis // Mol. Cell Biol. 2006. V. 26. № 14. P. 5394-5405.

57. Greenfield A., Carrel L., Pennisi D. et al. The UTX gene escapes X inactivation in mice and humans // Hum. Mol. Genet. 1998. V. 7. № 4. P. 737-742.

58. Grigor'eva E.V., Shevchenko A.I., Mazurok N.A. et al. FGF4 independent derivation of trophoblast stem cells from the common vole // PLoS ONE. 2009. V. 4. № 9. e7161.

59. Gupta V., Parisi M., Sturgill D. et al. Global analysis of X-chromosome dosage compensation//J. Biol. 2006. V. 5. № 1. P. 3.

60. Hadjantonakis A.K., Cox L.L., Tarn P.P. et al. An X-linked GFP transgene reveals unexpected paternal X-chromosome activity in trophoblastic giant cells of the mouse placenta//Genesis. 2001. V. 29. №3. P. 133-140.

61. Hansen R.S. X inactivation-specific methylation of LINE-1 elements by DNMT3B: implications for the Lyon repeat hypothesis // Hum. Mol. Genet. 2003. V. 12. № 19. P. 2559-2567.

62. Hansen R.S., Canfield. T.K., Fjeld A.D. et al. Role of late replication timing in the silencing of X-linked genes // Hum. Mol. Genet. 1996. V. 5. № 9. P. 1345-1353.

63. Hansen R.S., Stoger R., Wijmenga C. et al. Escape from gene silencing in ICF syndrome: evidence for advanced replication time as a major determinant // Hum. Mol. Genet. 2000. V. 9. № 18. P. 2575-2587.

64. Heard E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. V. 15. № 5. P. 482-489.

65. Heard E., Clerc P., Avner P. X-chromosome inactivation in mammals // Annu. Rev. Genet. 1997. V. 31. P. 571-610.

66. Heard E., Disteche C.M. Dosage compensation in mammals: fine-tuning the expression of the X chromosome // Genes Dev. 2006. V. 20. № 14. P. 1848-1867.

67. Heard E., Rougeulle C., Arnaud D. et al. Methylation of histone H3 at Lys-9 is an early mark on the X chromosome during X inactivation // Cell. 2001. V. 107. № 6. P. 727-738.

68. Hellman A., Chess A. Gene body-specific methylation on the active X chromosome // Science. 2007. V. 315. № 5815. P. 1141-1143.

69. Holstein A.F., Schidze W., Davidoff M. Understanding spermatogenesis is a prerequisite for treatment // Reprod. Biol. Endocrinol. 2003. V. l.P. 107.

70. Hoyer-Fender S., Costanzi C., Pehrson J.R. Histone macroH2A1.2 is concentrated in the XY-body by the early pachytene stage of spermatogenesis // Exp. Cell Res. 2000. V. 258. № 2. P. 254-260.

71. Hunt P.A. Survival of XO mouse fetuses: effect of parental origin of the X chromosome or uterine environment? // Development. 1991. V. 111. № 4. P. 11371141.

72. Huynh K.D., Lee J.T. Inheritance of a pre-inactivated paternal X chromosome in early mouse embryos //Nature. 2003. V. 426. № 6968. P. 857-862.

73. Itoh Y, Melamed E., Yang X. et al. Dosage compensation is less effective in birds than in mammals // J. Biol. 2007. V. 6. № 1. P. 2.

74. Jegalian K., Page D.C. A proposed path by which genes common to mammalian X and Y chromosomes evolve to become X inactivated // Nature. 1998. V. 394. № 6695. P. 776-780.

75. Johnston C.M., Lovell F.L., Leongamornlert D.A. et al. Large-scale population study of human cell lines indicates that dosage compensation is virtually complete // PLoS Genet. 2008. V. 4. № 1. e9.

76. Kaslow D.C., Migeon B.R. DNA methylation stabilizes X chromosome inactivation in eutherians but not in marsupials: evidence for multistep maintenance of mammalian X dosage compensation // Proc. Natl. Acad. Sci." U S A. 1987. V. 84. № 17. P.6210-6214.

77. Ke X., Collins A. CpG islands in human X-inactivation // Ann. Hum. Genet. 2003. V. 67. P. 242-249.

78. Keohane A.M., O'Neill L.P., Belyaev N.D. et al. X-Inactivation and histone H4 acetylation in embryonic stem cells // Dev. Biol. 1996. V. 180. № 2. P. 618-630.

79. Khalil A.M., Boyar F.Z., Driscoll D.J. Dynamic histone modifications mark sex chromosome inactivation and reactivation during mammalian spermatogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 47. P. 16583-16587.

80. Kohlmaier A., Savarese F., Lachner M. et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation // PLoS Biol. 2004. V. 2. № 7. E171.

81. Koopman P., Gubbay J., Vivian N. et al. Male development of chromosomally female mice transgenic for Sry //Nature. 1991. V. 351. № 6322. P. 117-121.

82. Kratzer P.G., Chapman V.M., Lambert H. et al. Differences in the DNA of the inactive X chromosomes of fetal and extraembryonic tissues of mice // Cell. 1983. V. 33. № l.P. 37-42.

83. Krumlauf R., Chapman V.M., Hammer R.E. et al. Differential expression of alpha-fetoprotein genes on the inactive X chromosome in extraembryonic and somatic tissues of a transgenic mouse line //Nature. 1986. V. 319. № 6050. P. 224-226.

84. Kunath T., Arnaud D., Uy G.D. et al. Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts // Development. 2005. V. 132. № 7. P. 1649-1661.

85. Kvaloy K., Galvagni F., Brown W.R. The sequence organization of the long arm pseudoautosomal region of the human sex chromosomes // Hum. Mol. Genet. 1994. V. 3.№5.P. 771-778.

86. Lachner M., O'Carroll D., Rea S. et al. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins // Nature. 2001. V. 410. № 6824. P. 116-120.

87. Lahn B.T., Page D.C. Four evolutionary strata on the human X chromosome // Science. 1999. V. 286. № 5441. P. 964-967.

88. Lawrence J.B., Singer R.H., Marselle L.M. Highly localized tracks of specifictranscripts within interphase nuclei visualized by in situ hybridization // Cell. 1989. V. 57. P. 493-502.

89. Li N., Carrel L. Escape from X chromosome inactivation is an intrinsic property of the Jaridlc locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 44. P. 1705517060.

90. Lin H., Gupta V., Vermilyea M.D. et al. Dosage compensation in the mouse balances up-regulation and silencing of X-linked genes // PLoS Biol. 2007. V. 5. № 12. e326.

91. Lingenfelter P.A., Adler D.A., Poslinski D. et al. Escape from X inactivation of Smcx is preceded by silencing during mouse development // Nat. Genet. 1998. V. 18. № 3. P. 212-213.

92. Lock L.F. Takagi N., Martin G.R. Methylation of the Hprt gene on the inactive X occurs after chromosome inactivation // Cell. 1987. V. 48. № 1. P. 39-46.

93. Luoh S. ¡V., Jegalian K., Lee A. et al. CpG islands in human ZFX and ZFY and mouse Zfx genes: sequence similarities and methylation differences // Genomics. 1995. V. 29. №2. P. 353-363.

94. Lyon M.F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L.) // Nature. 1961. V. 190. P. 372-373.

95. Lyon M.F. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V. 80. P. 133-137.

96. Mahadevaiah S.K., Turner J.M., Baudat F. et al. Recombinational DNA doublestrand breaks in mice precede synapsis // Nat. Genet. 2001. V. 27. № 3. P. 271-276.

97. Mak W., Baxter J., Silva J. et al. Mitotically stable association of polycomb group proteins eed and enxl with the inactive x chromosome in trophoblast stem cells // Curr. Biol. 2002. V. 12. № 12. P. 1016-1020.

98. Mak W, Nesterova T.B., de Napoles M. et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos // Science. 2004. V. 303. № 5658. P. 666-669.

99. Matarazzo M.R., Boyle S., D'Esposito M. et al. Chromosome territory reorganization in a human disease with altered DNA methylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 42. P. 16546-16551.

100. Matarazzo M.R., Cuccurese M., Strazzullo M. et al. Human and mouse SYBL1 gene structure and expression // Gene. 1999. V. 240. № 1. P. 233-238.

101. Matarazzo M.R., De Bonis M.L., Gregory R.I. et al. Allelic inactivation of the pseudoautosomal gene SYBL1 is controlled byepigenetic mechanisms common to the X and Y chromosomes //Hum. Mol. Genet. 2002. V. 11. № 25. P. 3191-3198.

102. Mazurok N.A., Rubtsova N.V., Isaenko A.A. et al. Comparative chromosome and mitochondrial DNA analyses and phylogenetic relationships within common voles (Microtus, Arvicolidae) // Chromosome Res. 2001. V. 9. № 2. P. 107-120.

103. McCarrey J.R., Watson C., Atencio J. et al. X-chromosome inactivation during spermatogenesis is regulated by an Xist/Tsix-independent mechanism in the mouse // Genesis. 2002. V. 34. № 4. P. 257-266.

104. McNeil J.A., Smith K.P., Hall L.L. et al. Word frequency analysis reveals enrichment of dinucleotide repeats on the human X chromosome and GATA.n in the X escape region // Genome Res. 2006. V. 16. № 4. P. 477-484.

105. Mermond J.E., Costanzi C., Pehrson J.R. et al. Histone macroH2A1.2 relocates to the inactive X chromosome after initiation and propagation of X-inactivation // J. Cell Biol. 1999. V. 147. № 7. P. 1399-1408.

106. Metzler-Guillemain C., Luciani J., Depetris D. et al. HP 1 beta and HP 1 gamma, but not PIP 1 alpha, decorate the entire XY body during human male meiosis // Chromosome Res. 2003. V. 11. № 1. P. 73-81.

107. Migeon B.R., Schmidt M., Axelman J. et al. Complete reactivation of X chromosomes from human chorionic villi with a switch to early DNA replication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. № 7. P. 2182-2186.

108. Mine E„ Allory Y., Worman H.J. et al. Localization and phosphorylation of HP1 proteins during the cell cycle in mammalian cells // Chromosoma. 1999. V. 108. № 4. P. 220-234.

109. Mohandas T.K., Speed R.M., Passage M.B. et al. Role of the pseudoautosomal region in sex-chromosome pairing during male meiosis: meiotic studies in a man with a deletion of distal Xp //Am. J. Hum. Genet. 1992. V. 51. № 3. P. 526-533.

110. Mondello C., Goodfellow P. J., Goodfellow P.N. Analysis of methylation of a human X located gene which escapes X inactivation // Nucleic Acids Res. 1988. Y. 16. № 14B.P. 6813-6824.

111. Monk M., Boubelik M., Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development // Development. "1987. V.997№f3. P. 371-382. "

112. Mueller J.L., Mahadevaiah S.K., Park P.J. et al. The mouse X chromosome is enriched for multicopy testis gênés showing postmeiotic expression // Nat. Genet. 2008. V. 40. № 6. P. 794-799.

113. Namekawa S.H., Park P. J., Zhang L.F. et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice // Curr. Biol. 2006. V. 16. № 7. P. 660-667.

114. Namekawa S.H., VandeBerg J.L., McCarrey J.R. et al. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 23. P. 9730-9735.

115. Navarro P., Pichard S., Ciaudo C. et al. Tsix transcription across the Xist gene alters chromatin conformation without affecting Xist transcription: implications for X-chromosome inactivation// Genes Dev. 2005. V. 19. № 12. P. 1474-1484.

116. Nesterova T.B., Duthie S.M., Mazurok N.A. et al. Comparative mapping of X chromosomes in vole species of the genus Microtus // Chromosome Res. 1998. V. 6. № l.P. 41-48.

117. Nguyen D.K., Disteche C.M. Dosage compensation of the active X chromosome in mammals //Nat. Genet. 2006. V. 38. № 1. P. 47-53.

118. Norris D.P., Patel D., Kay G.F. et al. Evidence that random and imprinted Xist expression is controlled by preemptive methylation // Cell. 1994. V. 77. № l.P. 4151.

119. Ogata T., Matsuo N. Turner syndrome and female sex chromosome aberrations: deduction of the principal factors involved in the development of clinical features // Hum. Genet. 1995. V. 95. № 6. P. 607-629.

120. Ohhata T., Tachibana M., Tada M. et al. X-inactivation is stably maintained in mouse embryos deficient for histone methyl transferase G9a // Genesis. 2004. V. 40. № 3. P. 151-156.

121. Ohno S. Sex chromosomes and sex-linked genes // Springer. Berlin. Heidelberg. New York. 1967.

122. Okamoto I., Arnaud D., Le Baccon P. et al. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice // Nature. 2005. V. 438. №7066. P. 369-373.

123. Okamoto I., Heard E. The dynamics of imprinted X inactivation during preimplantation development in mice // Cytogenet. Genome Res. 2006. V. 113. P. 318-324.

124. Okamoto I., Otte A.P., Allis C.D. et al. Epigenetic dynamics of imprinted X inactivation during early mouse development // Science. 2004. V. 303. № 5658. P. 644-649.

125. Palmer S., Perry J., Kipling D. et al. A gene spans the pseudoautosomal boundary in mice // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. № 22. P. 12030-12035.

126. Patrat C., Okamoto I., Diabangouaya P. et al. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2009. V. 106. № 13. P. 5198-5203.

127. Pauler F.M., Sloane M.A., Huang R. et al. H3K27me3 forms BLOCs over silent genes and intergenic regions and specifies a histone banding pattern on a mouse autosomal chromosome // Genome Res. 2009. V. 19. № 2. P. 221-233.

128. Perry J., Palmer S., Gabriel A. et al. A short pseudoautosomal region in laboratory mice//Genome Res. 2001. V. 11. № 11. P. 1826-1832.

129. Plath K., Fang J., Mlynarczyk-Evans S.K. et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation // Science. 2003. V. 300. № 5616. P. 131-135.

130. Plath K., Talbot D., Hamer K.M. et al. Developmentally regulated alterations in Polycomb repressive complex 1 proteins on the inactive X chromosome // J. Cell Biol. 2004. V. 167. № 6. P. 1025-1035.

131. Raefski A.S., O'Neill M.J. Identification of a cluster of X-linked imprinted genes in mice // Nat. Genet. 2005. V. 37. № 6. P. 620-624.

132. Reik W., Santos F., Mitsuya K. et al. Epigenetic asymmetry in the mammalian zygote and early embryo: relationship to lineage commitment? // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2003. V. 358. № 1436. P. 1403-1409.

133. Ross M.T., Grafliam D.V., Coffey A.J. et al. The DNA sequence of the human X chromosome //Nature. 2005. V. 434. № 7031. P. 325-337.

134. Rougeulle C., Chaumeil J., Sarma K. et al. Differential histone H3 Lys-9 and Lys-27 methylation profiles on the X chromosome // Mol. Cell Biol. 2004. V. 24. № 12. P. 5475-5484.

135. Rougeulle C., Navarro P., Avner P. Promoter-restricted H3 Lys 4 di-methylation is an epigenetic mark for monoallelic expression // Hum. Mol. Genet. 2003. V. 12. №24. P. 3343-3348.

136. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Anopriyenko O.V. et al. Reorganization of the X chromosome in voles of the genus Microtus // Cytogenet. Genome Res. 2002. V. 99. P. 323-329.

137. Sado T., Fenner M.H., Tan S.S. et al. X inactivation in the mouse embryo deficient for Dnmtl: distinct effect of hypomethylation on imprinted and random X inactivation // Dev. Biol. 2000. V. 225. № 2. P. 294-303.

138. Sado T., Hoki Y, Sasaki H. Tsix silences Xist through modification of chromatin structure // Dev. Cell. 2005. V. 9. № 1. P. 159-165.

139. Schoeftner S., Sengupta A.K., Kubicek S. et al. Recruitment of PRC 1 function at the initiation of X inactivation independent of PRC2 and silencing // EMBO J. 2006. V.25. № 13. P. 3110-3122.

140. Sharman G.B. Late DNA replication in the paternally derived X chromosome of female kangaroos //Nature. 1971. V. 230. № 5291. P. 231-232.

141. Shevchenko A.I., Pavlova S. V., Dementyeva E. V. et al. Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus rossiaemeridionalis // Mamm. Genome. 2009. V. 20. № 9-10. P. 644-653.

142. Silva J., Mak W., Zvetkova I. et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enxl polycomb group complexes // Dev. Cell. 2003. V. 4. № 4. P. 481-495.

143. Singer-Sam J., Grant M., LeBon J.M. et al. Use of a Hpall-polymerase chain reaction assay to study DNA methylation in the Pgk-1 CpG island of mouse embryos at the time of X-chromosome inactivation // Mol. Cell Biol. 1990. V. 10. № 9. P. 49874989.

144. Skaletsky H., Kuroda-Kawaguchi T., Minx P.J. et al. The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes // Nature. 2003. V. 423. № 6942. P. 825-837.~ ~

145. Smith K.P., Byron M., Clemson C.M. et al. Ubiquitinated proteins including uH2A on the human and mouse inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands // Chromosoma. 2004. V. 113. № 6. P. 324-335.

146. Stucki M., Clapperton J.A., Mohammad D. et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks // Cell. 2005. V. 123. № 7. P. 1213-1226.

147. Sugawara O., Takagi N., Sasaki M. Allocyclic early replicating X chromosome in mice: genetic inactivity and shift into a late replicator in early embrogenesis // Chromosoma. 1983. V. 88. № 2. P. 133-138.

148. Sun B.K., Deaton A.M., Lee J.T. A transient heterochromatic state in Xist preempts X inactivation choice without RNA stabilization // Mol. Cell. 2006. V. 21. № 5. P. 617628.

149. Takagi N., Sugawara O., Sasaki M. Regional and temporal changes in the pattern of X-chromosome replication during the early post-implantation development of the female mouse // Chromosoma. 1982. V. 85. № 2. P. 275-286.

150. Tsuchiya K.D., Greally J.M., Yi Y. et al. Comparative sequence and x-inactivation analyses of a domain of escape in human xpll.2 and the conserved segment in mouse // Genome Res. 2004. V. 14. № 7. P. 1275-1284.

151. Tsuchiya K.D., Willard H.F. Chromosomal domains and escape from X inactivation: comparative X inactivation analysis in mouse and human // Mamm. Genome. 2000. V. 11. № 10. P. 849-854.

152. Turner J.M. Meiotic sex chromosome inactivation // Development. 2007. V. 134. № 10. P. 1823-1831.

153. Turner J.M., Mahadevaiah S.K., Elliott D.J. et al. Meiotic sex chromosome inactivation in male mice with targeted disruptions of Xist // J. Cell Sci. 2002. V. 115. P. 4097-4105.

154. Turner J.M., Mahadevaiah S.K., Ellis P.J. et al. Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids //Dev. Cell. 2006. V. 10. № 4. P. 521-529.

155. Wakefield M.J., Keohane A.M., Turner B.M. et al. Histone underacetylation is an ancient component of mammalian X chromosome inactivation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 18. P. 9665-9668.

156. Wang J., Mager J., Chen Y. et al. Imprinted X inactivation maintained by a mouse Polycomb group gene //Nat. Genet. 2001. V. 28. № 4. P. 371-375.

157. Wang P.J., Page D.C., McCarrey J.R. Differential expression of sex-linked and autosomal germ-cell-specific genes during spermatogenesis in the mouse // Hum. Mol. Genet. 2005. V. 14. № 19. P. 2911-2918.

158. Wang Z., Willard H.F., Mukherjee S. et al. Evidence of influence of genomic DNA sequence on human X chromosome inactivation // PLoS Comput. Biol. 2006. V. 2. № 9.ell3.

159. Wilcox S.A., Watson J.M., Spencer J.A. et al. Comparative mapping identifies the fusion point of an ancient mammalian X-autosomal rearrangement // Genomics. 1996. V. 35. № l.P. 66-70.

160. Wu H., Fassler R., Schnieke A. et al. An X-linked human collagen transgene escapes X inactivation in a subset of cells // Development. 1992. V. 116. № 3. P. 687-695.

161. Wutz A., Gribnau J. X inactivation Xplained // Curr. Opin. Genet. Dev. 2007. V. 17. №5. P. 387-393.

162. Wutz A., Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X inactivation is triggered during ES cell differentiation // Mol. Cell. 2000. V. 5. № 4. P. 695-705.

163. Xu J., Burgoyne P.S., Arnold A.P. Sex differences in sex chromosome gene expression in mouse brain // Hum. Mol. Genet. 2002. V. 11. № 12. P. 1409-1419.

164. Xu J., Watkins R., Arnold A.P. Sexually dimorphic expression of the X-linked gene Eif2s3x mRNA but not protein in mouse brain // Gene Expr. Patterns. 2006a. V. 6. № 2. P. 146-155.

165. Xu N., Tsai C.L., Lee J.T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation// Science. 2006b. V. 311. № 5764. P. 1149-1152.

166. Yen Z.C., Meyer I.M., Karalic S. et al. A cross-species comparison of X-chromosome inactivation in Eutheria // Genomics. 2007. V. 90. № 4. P. 453-463.

167. Zakian S.M., Kulbakina N.A., Meyer M.N. et al. Non-random inactivation of the X-chromosome in interspecific hybrid voles // Genet. Res. 1987. V. 50. № 1. P. 23-27.

168. Zhao J., Sun B.K., Erwin J.A. et al. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome // Science. 2008. V. 322. № 5902. P. 750-756.

169. Zinn A.R., Page D.C., Fisher E.M. Turner syndrome: the case of the missing sex chromosome // Trends Genet. 1993. V. 9. № 3. P. 90-93.

Информация о работе

Дементьева, Елена Вячеславовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Статус экспрессии генов и модификации хроматина на активной и неактивной X-хромосоме у обыкновенных полевок - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы