Центр инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов

Малахова, Анастасия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Центр инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Центр инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов"

На правах рукописи

/О

Малахова Анастасия Александровна

«оои0077б

ЦЕНТР ИНАКТИВАЦИИ Х-ХРОМОСОМЫ ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК: ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК И АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Генетика - 03.02.07

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2011

005000776

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН, в лаборатории эпигенетики развития, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Закиян Сурен Минасович, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Высоцкая Людмила Васильевна, Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

кандидат биологических наук Ромащенко Аида Герасимовна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Томский государственный университет, г. Томск Защита состоится U&SLtytA 2011 г. на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (ДЮ3.011.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-1278; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

\ ,

Т.М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Явление инактивации одной из двух Х-хромосом у самок высших млекопитающих впервые было описано Мэри Лайон (Lyon, 1961). Инактивация Х-хромосомы - это сложный многостадийный процесс. Важнейшую функцию в регуляции этого процесса выполняет локус Х-хромосомы, получивший название «центр инактивации» (Xic). У мыши в процессе инактивации X-хромосомы задействованы ген Xist и комплементарный к нему ген Tsix, кодирующие нетранслируемые ядерные РНК, минисателлитный локус DXPas34 и район Xite (Boumil, Lee, 2001). Эти участки Х-хромосомы регулируют процесс импринтированной и случайной инактивации, а также ответственны за определение числа Х-хромосом в клетке и выбор будущей неактивной X-хромосомы. Однако в структуре локуса Xic других видов высших млекопитающих (крыса, корова, собака, шимпанзе, человек) не обнаружено таких элементов как DXPas34, Tsix и Xite (Chureau et al., 2002). Сравнительный межвидовой анализ последовательностей локуса Xic может быть информативен для выявления функционально значимых районов, принимающих участие в процессе инактивации Х-хромосомы у млекопитающих.

Данная работа направлена на исследование структуры 5'-конца гена Tsix обыкновенных полевок рода Microtus, выявление консервативных генетических элементов в локусе Xist/Tsix, установление взаимного расположения генов Cdx4, Chicl, Pgkl, Slcl6a2, которые у мыши и человека составляют генетическое окружение гена Xist. Предполагается, что последовательности ДНК, сцепленные с этими генами, являются составной частью центра инактивации и содержат регуляторные элементы, необходимые для функционирования локуса Xic (Clerc, Avner, 2003).

Одной из основных функций гена Tsix считают его подавляющее влияние на экспрессию Xist, задействованного в инактивации Х-хромосомы мыши (Lee, 2000; Sado et al., 2001). Показано, что в экстраэмбриональных тканях мыши экспрессия Tsix импринтирована на Х-хромосоме, унаследованной от матери (Takagi, 1978). Однако у человека не обнаружено импринтированной инактивации Х-хромосомы (Migeon, Do, 1979). У обыкновенных полевок с помощью биохимических маркеров показано, что в экстраэмбриональных тканях инактивированы гены отцовской X-хромосомы, а Х-хромосома, унаследованная от матери, остается активной (Нестерова, Закиян, 1994). В настоящей работе установлена связь инактивации отцовской Х-хромосомы, обнаруженной на биохимическом уровне, с импринтингом генов Xist и Tsix.

Проведено исследование транскрипционной активности

последовательностей ДНК в окружении генов Xist и Tsix полевки, поскольку ранее было показано, что соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции в 5'- и 3'-фланкирующих районах гена Xist оказывает существенное влияние на регуляцию экспрессии этого гена у мыши (Nesterova et al., 2003).

Цель и задачи работы: Исследовать организацию, генетическое окружение и характер экспрессии последовательностей ДНК локуса Xist/Tsix у обыкновенных полевок рода Microtus.

Задачи:

1. Провести определение и контекстный анализ нуклеотидной последовательности 5'-конца гена Tsix у Microtus rossiaemeridionalis с целью

выявления консервативных генетических элементов, участвующих в процессе инактивации Х-хромосомы полевок.

2. Определить локализацию генов Cdx4, Chid, Pgkl, Slcl6a2, которые составляют окружение локуса Xist/Tsix у мыши и человека.

3. Исследовать специфичность экспрессии последовательностей локуса Xist/Tsix в отношении цепи ДНК, хромосомы, пола и стадии развития в соматических и экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок.

Научная новизна. Впервые была определена нуклеотидная последовательность 3'-области гена Xist обыкновенных полевок. Показано, что в районе, гомологичном мажорному промотору гена Tsix мыши, расположена точка инициации транскрипции антисмысловой РНК гена Xist полевки, и, следовательно, локализована зона промотора гена Tsix полевки. Паттерн экспрессии гена Tsix, модулируемый промотором полевки, сходен с таковым мыши. Консервативность мажорного промотора и сходство экспрессии гена Tsix у мыши и полевки свидетельствуют о важности антисмысловой транскрипции в регуляции экспрессии гена Xist и процесса инактивации Х-хромосомы у грызунов.

Впервые выявлена перестройка порядка генов в локусе Xic полевки, в результате чего последовательности минорного промотора Tsix и района Xite оказались замещены геном Slc7a3 и окружающими его последовательностями ДНК. При исследовании транскрипции последовательностей локуса Xist/Tsix полевки показано отсутствие проявления регуляторного района Xite и минорного промотора гена Tsix на функциональном уровне. Установлено, что соотношение транскрипции смысловой и антисмысловой цепей ДНК в локусе Xist/Tsix у мыши и полевки обеспечивается за счет экспрессии различных районов локуса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Центр инактивации Х-хромосомы обыкновенной полевки перестроен по сравнению с Xic мыши и фланкирован геном Slc7a3 с 5'-стороны гена Tsix. В 3'-фланкирующей области гена Xist локализован район инициации транскрипции антисмысловой РНК, представляющий собой промотор гена Tsix.

2. Регуляция экспрессии генов Xist и Tsix у полевки и мыши обеспечивается за счет транскрипции разных районов локуса ЛЯс.

3. Экспрессия генов Xist и Tsix в экстраэмбриональных тканях полевки импринтирована.

Практическая значимость. Результаты данной работы позволяют разъяснить роль различных генетических компонентов в окружении генов Xist и Tsix в процессе инактивации Х-хромосомы. Обнаружены различия в регуляции процесса инактивации Х-хромосомы у мыши и полевок, участие различных районов локуса Xist/Tsix в этом процессе. Высказано предположение о существовании альтернативных способов регуляции процесса инактивации X-хромосомы у разных видов высших млекопитающих.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), на международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемом отечественном и зарубежном журналах.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Контекстный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК и поиск регуляторных районов в локусе Xist/Tsix полевки проводился совместно с А.И. Шевченко и Е.А. Елисафенко. Скрининг геномной библиотеки, эксперименты по исследованию экспрессии последовательностей локуса Xist/Tsix полевки и РНК-FISH анализ выполнялись совместно с А.И. Шевченко. Обработка данных FISH экспериментов проводилась автором совместно с H.A. Мазурок.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,' трех глав, заключения, выводов и списка литературы (154 наименования). Работа изложена на 111 страницах, содержит 19 рисунков и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Скрининг фаговой геномной библиотеки и определение нуклеотидной последовательности локуса Xist/Tsix полевки Microtus rossiaemeridionalis

Скрининг геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis, построенной на основе фагового вектора Lamda DASH II (Stratagene) (Nesterova et al„ 2001), проводился в соответствии со стандартной методикой (Sambrook et al., 1989). Скрининг проводили с помощью зондов к 7 экзону гена Xist и 13 экзону гена Slc7a3. Пробы получали методом ПЦР с праймерами МАХ40 - МАХ35 и STT12F-STT13R (Табл.1), очищали через колонку (Invitrogene) по фирменному протоколу, затем проводили мечение радиоактивным изотопом фосфора.

Зонды метили с помощью ПЦР при следующих условиях: 4 цикла 94°С - 2 мин., 54°С - 2 мин., 72°С - 30 мин. Для проведения одной реакции объемом 10 мкл смешивали: зонд - 25-40 нг; смесь dGTP, dTTP, dATP по 5 мМ каждого - 0,5 мкл; раствор MgCl2 (50 мМ) - 0,5-0,8 мкл; 10><ПЦР буфер (Медиген) - 1 мкл; праймеры - по 50 пмоль каждого; Taq-полимеразу (5 ед/мкл) (Медиген) - 0,2-0,5 мкл; [a PJdCTP (370 МБ к/мл) (Amersham) - 5 мкл. Радиоактивно меченые зонды очищали при помощи колонок Amersham по протоколу, предложенному фирмой.

Выделение ДНК фагов проводили согласно методу, описанному Забаровским и Туриной (1998) с некоторыми модификациями. Все методы работы с рекомбинантной ДНК (выделение плазмидной ДНК, расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование, субклонирование фрагментов ДНК, ПЦР) выполнялись согласно руководству Sambrook et al., 1989. Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation).

Контекстный анализ нуклеотидных последовательностей

Компьютерный анализ последовательностей ДНК выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al.„ 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), RepeatMasker (A. Smit, http://www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/ repeatmask.htm), PIPMaker (http:Wwww.bio.cse.psu.edu). Для сравнительного анализа использовали последовательности из соответствующих баз данных секвенированных геномов на

UCSC Genome Bioinformatics Site (http://genome.ucsc.edu/), сервере BLAST NCBI, для полевок использовали последовательности, секвенированные ранее (GeneBank АСС AY090554, AJ310130, AJ310129, AJ310127). Поиск тандемных повторов проводили с помощью программы Tandem Repeats Finder (Benson, 1999). Для выявления групп гомологичных мономеров минисателлитных повторов и построения выравниваний использовали программы AlignX, MEGA3 (Kumar et al., 2004). Поиск потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов осуществляли при помощи программы Matlnspector (Cartharius et al. 2005). Для выявления CpG-островков использовали программу CpGPlot/CpGReport (http://www.ebi.ac.uk/ emboss/cpgplot).

Локализация генов Cdx4, Chid, Pgkl, Slc7a3, Slcl6a2, Xist на метафазных хромосомах полевки Microtus rossiaemeridionalis.

Флуоресцентная гибридизация in situ на цитогенетических препаратах метафазных хромосом эмбриональных фибробластов полевки М. rossiaemeridionalis. была выполнена на основе метода, описанного ранее (Nesterova et al., 1998). В качестве зондов использовали фаговые клоны, содержащие последовательности ДНК генов Xist, Slc7a3, Chicl, Cdx4, Slcl6a2, Pg/Uполевки M. rossiaemeridionalis. Анализ препаратов проводили через интерференционный фильтр на флюоресцентном микроскопе NIKON XI00. Обработку изображения проводили с помощью программного обеспечения фирмы Imstar.

Определение экзон-интронной структура генов и анализ экспрессии последовательностей локуса Xist/Tsix полевки

ДНК и РНК выделяли из эмбрионов на 5 день развития, 13 день развития, плацент, а также органов и тканей взрослых особей обыкновенных полевок с помощью TRI REAGENT (Sigma) по методике, описанной в инструкции, позволяющей из гомогената ткани выделять отдельные фракции РНК, ДНК и белков.

3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) эксперименты определения экзон-интронной структуры генов Ts ix и Slc7a3 проводили с помощью набора BD SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) с использованием генспецифичных праймеров.

Для анализа экспрессии последовательностей ДНК в окружении локуса Xist/Tsix реакции синтеза кДНК проводили с использованием цепьспецифичных праймеров по матрице РНК, выделенной из гибридных эмбрионов ($М rossiaemeridionalis * SM. arvalis) на 3-5 и 13 день развития, плацент, а также из разных органов и тканей взрослых особей.

Выявление характера экспрессии генов Xist и Tsix в экстраэмбриональных тканях полевок

Приготовление и фиксация препаратов плацент и желточных мешков проводилась по методу, предложенному Дьюти (Duthie et al., 1999). Затем проводили флуоресцентную гибридизацию in situ с зондами к последовательностям экзонов генаЖг/, а также повтору MS4 (см. раздел 2.3).

Выявление характера экспрессии гена Tsix проводили с геномной ДНК и кДНК экстраэмбриональных тканей полевок М. rossiaemeridionalis и М. kirgisorum,

а также гибридных эмбрионов, полученных от реципрокных скрещиваний М. rossiaemeridionalis * М. kirgisorum. С геномной ДНК и кДНК амплифицировали фрагменты длиной 300-400 п.н. и проводили их секвенирование см. раздел 2.1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее была исследована нуклеотидная последовательность и экспрессия гена Xist у четырех видов обыкновенных полевок рода Microtus (Nesterova et al, 2001). Изучены экзон-интронная структура гена Xist и альтернативный сплайсинг его транскриптов. Обнаружена консервативность общей структуры гена Xist как у разных видов полевок, так и между полевкой, мышью и человеком (Nesterova et al, 2001). В данной работе продолжено исследование структуры и особенностей функционирования центра инактивации Х-хромосомы обыкновенных полевок.

Определение нуклеотидпой последовательности 5'-конца гена Tsix полевки Microtus rossiaemeridionalis

Определение нуклеотидной последовательности 5'-конца гена Tsix полевки проводили с использованием фаговых клонов, отобранных из геномной библиотеки полевки М. rossiaemeridionalis, выстроенной на основе вектора Lamda DASH II (Nesterova et al., 2001).

Определена последовательность нуклеотидов протяженностью около 13 т.п.н. При анализе баз данных показано, что данный район гомологичен 5'-фланкирующей области гена Tsix мыши, а также содержит ген Slc7a3.

В ходе анализа последовательностей ДНК локуса Xist/Tsix полевки было выяснено, что за промоторной областью Tsix на расстоянии 5000 п.н. начинается ген Slc7a3 (рис. 1). У мыши данный ген расположен на расстоянии 2,4 млн. п.н. от 5'-границы гена Tsix. Вероятно, у полевки данный участок Х-хромосомы инвертирован по сравнению с мышью и крысой. В результате перестройки ген Slc7a3 оказался приближенным к локусу Xist/Tsix, а гены Brx, Cdx4 отдалены от центра инактивации Х-хромосомы.

Ген Slc7a3 кодирует белок, который принадлежит к семейству трансмембранных переносчиков глютаминовой и аспарагиновой кислот. Данный ген экспрессируется преимущественно в мозге, но белковый продукт гена выявляется и в других тканях на всех стадиях развития организма (Hosokawa et al., 1999). Slc7a3 мыши имеет 13 экзонов, которые выявляются и у полевки. Гомология между экзонами этих двух видов составляет 75-95%. В целом по локусу Slc7a3 гомология между мышью и полевкой составляет 72,3%. Наибольшие отличия приходятся на 8 экзон, половина которого у полевки отсутствует или изменена. Наличие экзон-интронной структуры, а также отсутствие стоп-кодонов и сдвигов рамки считывания в кодирующей области свидетельствует о том, что это функциональный ген. Окружение гена Slc7a3 полевки гомологично последовательностям, окружающим этот ген у мыши.

При совмещении секвенированной нами последовательности ДНК 5'-конца Tsix и гена Slc7a3 с опубликованной в базе данных Gene Bank (регистрационный номер AJ310130) изученная последовательность локуса Xist/Tsix полевки М. rossiaemeridionalis от гена Епох до гена Slc7a3 составляет около 50 т.п.н.

Mus musculus

ТГ

rXis, .V/c/rti

•¿ВШДЙДЦИШ |UI Г.............Г' I-1-1—-f-'4fT

Tsix J <

Stcl6«2 Cnbp2 Fix Епох Tsx Chid Cdx4

Microtus rossiaemeridionalis ji*

ХЫ

т?, нашвшг

Епох ТяхЛ _Ч1с7иЗ —

Рис. 1. Схема расположения генов и генетических элементов центра инактивации Х-хромосомы мыши и полевки.

Сравнительный анализ структуры локуса Xist/Tsix грызунов

С использованием программы PIPMaker проведен сравнительный анализ локуса Xist/Tsix у грызунов - мыши, полевки и крысы. Мышь и крыса имеют сходную организацию практически по всей длине локуса от гена Епох (Jpx) до Tsx. Степень гомологии последовательностей ДНК различна в разных частях локуса. Области, в которых отсутствует гомология, в основном содержат встройки мобильных элементов.

У полевок, мыши и крысы в районе, непосредственно прилегающем к Tsix, выявлено несколько районов, гомологичных гену NIF3L1BP1. По-видимому, они являются остатками древнего псевдогена, части которого были разделены интенсивной интеграцией мобильных элементов. У полевок псевдоген NIF3L1BP1 фланкирует локус Xist/Tsix и располагается на границе перестройки, приблизившей ген Slc7a3.

У мыши и крысы гены Xist и Slc7a3 расположены на Х-хромосоме в одной ориентации, в то время как у полевки — в противоположной ориентации, навстречу друг другу. Такое расположение генов подтверждает то, что у предка полевок в этом районе произошла инверсия локуса Xist/Tsix, изменившая порядок генов.

Локус Xist/Tsix полевки имеет наименьшую длину по сравнению с остальными изученными видами. Расстояние от гена Епох до гена Slc7a3 полевки составляет около 50 т.п.н., в то время как у мыши расстояние между генами Епох (Jpx) и Tsx, фланкирующими локус Xist/Tsix, составляет около 67 т.п.н., у крысы -74 т.п.н., а у человека - 86 т.п.н. Уменьшение длины локуса Xist/Tsix полевки определяется несколькими факторами. Длина локуса Xist/Tsix у полевки существенно сокращается за счет уменьшения размера интронов. У полевок уменьшено расстояние между генами Xist и Епох (Jpx). Однако наибольший вклад в сокращение длины локуса Xist/Tsix у полевок вносит перестройка, связанная с уменьшением размера 5'-фланкирующей области Tsix и приближением к Tsix гена Slc7a3.

Особенности экзон-интронной структуры гена Tsix полевки

Экзон-интронную структуру гена Tsix изучали на эмбрионах 4,5 дней развития полевок М. rossiaemeridionalis и М. arvalis. В структуре гена Tsix полевки с помощью 3'- и 5'- RACE выявлено 4 экзона (А, В, С, D) (рис. 2, А).

Обнаружены различия в экзон-интронной структуре гена Tsix между мышью и полевкой. У полевки отсутствуют последовательности, гомологичные минорному промотору, а также первому и третьему экзонам гена Tsix мыши (рис. 2, Б). Tsix полевки имеет экзоны В и С (С' -как вариант сплайсинга), не выявленные у мыши. Эксперименты по картированию 3'- конца гена Tsix выявили у полевок М. arvalis и М. rossiaemeridionalis наличие четырех мажорных и нескольких минорных точек терминации транскрипции.

Полученные результаты показывают, что в эмбриогенезе у полевок происходит транскрипция в антисмысловой ориентации к гену Xist. Транскрипт начинается в области, гомологичной мажорному промотору гена Tsix мыши, и заканчивается в позиции 1,5 т.п.н. выше точки старта транскрипции гена Xist. Размер области антисмысловой транскрипции к гену Xist у полевок составляет 33747 п.н. Обнаружены альтернативные варианты сплайсинга транскриптов. Транскрипт Tsix полевок перекрывает первый экзон и промотор Xist, что, как показано у мыши, является обязательным для его функционирования в процессе инактивации Х-хромосомы (Luikenhuis et al., 2001; Ohhata et al., 2006). Таким образом, очень вероятно, что Tsix полевок, подобно Tsix мыши, может регулировать экспрессию генаЛЫ.

Характеристика регуляторных последовательностей гена Tsix полевки

DXPas34

У мыши в области промотора Tsix расположен регулягорный район, названный DXPas34. Этот район представляет собой массив коротких тандемных повторов, состоящий из 29 копий мономеров размером 34 п.н., и содержит CpG-островок размером 819 п.н., гиперметилированный на активной Х-хромосоме (Prissette et al., 2001).

У полевки М. rossiaemeridionalis в этом районе обнаружены разнородные минисателлитные повторы, которые имеют низкую (<50%) гомологию с мышиными, отличаются размерами мономеров и числом копий. Кроме того, у полевки в экзоне А и первом интроне гена Tsix обнаружены два CpG-островка размерами 515 п.н. и 312 п.н. на расстоянии 1068 п.н. друг от друга (Малахова и др., 2010). Возможно, этот район у полевки выполняет те же функции, что и DXPas34 мыши. ДАРя^-подобный район также найден у крысы. Можно предположить, что этот элемент является необходимым для регуляции функционирования гена Tsix грызунов.

Проведен анализ последовательности DXPas34 на наличие CpG-динуклеотидов и потенциальных сайтов связывания транскрипционного фактора CTCF, участвующего в регуляции процесса инициации инактивации Х-хромосомы мыши (Donohoe et al., 2007). Содержание CpG-динуклеотидов и число мотивов связывания CTCF-фаетора в районе DXPas34 у разных видов грызунов заметно различается (рис. 3). Наиболее богатым по содержанию CpG оказался данный район у крысы, но в нем содержится гораздо меньше мотивов связывания CTCF, чем у мыши. В структуре потенциальных сайтов связывания CTCF-фактора у

С&С'

М. агуа/к

М гочх1аетеп(Иопа1и

хш

2 3 4 5 6

I 23

4 56

С1

С'

ОХРа.г.и

-ж

тг ¿1

ОХРаШ

— ш.

Мышь

Хне

Гэтх <— Полевка

81с7аЗ

Рис. 2. Особенности экзон-интронной структуры гена обыкновенных полевок А. Определение экзон-интронной структуры гена Тяа. Продукты 3'- и 5'-11АСЕ гена и полевок М. аг\аНз (вверху) и М. га$з1аетег1(1юпаШ (внизу). Б. Схема локуса ХШ/Тяи мыши и полевки.

ЯЛ - экзоны гена 7т (А, В. С и С', О); ■да - экзоны генаЛ7.у/(1-4); — - продукты 3'- и 5'-Г!АСЕ гена 7ш\

полевок отсутствуют СрО-динуклеотиды, следовательно, их возможное функционирование не связано с метилированием данного участка ДНК.

Наименьшее число СрО-динуклеотидов в районе йХРаз34 обнаружено у М. апгаПв, в то время как у трех других видов полевок СрО-динуклеотидов в данном районе по крайней мере в два раза больше. Кроме того, у М. ашаШ в регуляторном районе ВХРа$34 не выявлено ни одного мотива связывания СТСР. Возможно, эти различия в структуре данного района частично обусловливают неслучайную инактивацию Х-хромосомы в соматических тканях у межвидовых гибридов полевок, в результате которой именно Х-хромосома М атг/и преимущественно остается активной в клетках взрослых особей (гаИап ег а1., 1991).

4 *М* О *

тттщ—тщ-

Мих пимси/из

Ни/шк norvegicus

\licrotus ап'аЦх

М. гньйпетег'нИопаИ*

М. к1г%1.\огит

М. ггапяса$р1си$

Рис. 3. Организация локуса ОХРаз34 четырех видов полевок, мыши и крысы. Показаны мономеры повторов, тандемно организованные в блоки.

| - Срв- динуклеотиды; 4 - мотивы связывания СТСР; ■■ - наиболее вероятные сайты связывания фактора СТСР.

При выравнивании консенсусных последовательностей разных типов мономеров мыши, крысы и четырех видов обыкновенных полевок нам удалось идентифицировать консервативный мотив. Возможно, он является потенциальным сайтом связывания какого-либо белкового фактора, задействованного в инактивации Х-хромосомы. Однако данный мотив не перекрывается с потенциальными сайтами связывания СТСР.

Таким образом, регуляторный район ОХРаэМ имеет сходный принцип организации у шести видов грызунов, что является подтверждением его функциональной важности.

Промоторная область гена Тбух

У мыши описано 2 промотора гена Тб\х (рис. 2, Б) (СЬигеаи е1 а.1, 2002). Мажорный промотор расположен непосредственно перед началом второго экзона гена Tsix. Минорный промотор у мыши выявлен на расстоянии около 15 т.п.н. в 5'-направлении от мажорного промотора, с него начинается транскрипция первого экзона 7т.

гл I ПГГ1 а 11

. [¿шшшю——>) т п пят-1 Л ШИШ Ш1Ш 111

Шшшгггг/пт—лттш-

пи ишнПшшгп

игщ-

У полевки в результате выявленной перестройки из района центра инактивации оказались удалены минорный промотор гена Tsix, а также большая часть регуляторного элемента Xite (X-inactivation intergenic transcription elements) (рис. 1). Xite участвует в негативной регуляции экспрессии гена Tsix у мыши (Ogawa, Lee, 2003). Вероятно, Xite и минорный промотор Tsix не являются обязательными элементами в регуляции процесса инактивации Х-хромосомы грызунов.

При сравнительном анализе последовательностей гена Tsix грызунов, показано, что район вероятного промотора Tsix проявляет наибольшую консервативность (60-75% гомологии) между разными видами. Это может свидетельствовать о существовании общих факторов регуляции экспрессии Tsix у грызунов.

Выявленная перестройка в 5'-фланкирующей области гена Tsix полевок позволяет существенно ограничить область поиска регуляторных элементов, необходимых для регуляции экспрессии Tsix и процесса инактивации X-хромосомы.

Анализ генетического окружения л о куса Xist/Tsix

В связи с обнаружением у полевки перестройки, затрагивающей локус Xist/Tsix, возник вопрос о локализации генов Chid, Cdx4, Slcl6a2 и Pgkl. Эти гены у мыши и человека составляют генетическое окружение локуса. Xist/Tsix (рис. 1) и содержат регуляторные последовательности, участвующие в процессах подсчета и выбора Х-хромосомы для инактивации (Clerc, Avner, 1998).

Сигналы in situ гибридизации всех исследуемых генов локализуются в районе Xq2.1, т.е. в пределах около 5 млн.п.н. (рис. 4). Однако по результатам FISH на метафазных хромосомах нельзя судить о взаимном расположении генов Slc7a3, Chid, Cdx4, Slcl6a2 и Pgkl.

У большинства изученных видов область, примыкающая к 5'-границе Tsix, содержит гены Tsx, Chid, Cdx4. По мнению ряда авторов, данная группа сцепления считается эволюционно консервативной, так как содержит районы, необходимые для выбора будущей неактивной Х-хромосомы (Clerc, Avner, 1998; Chureau et al., 2002). Наличие за 5'-границей гена Tsix полевки гена Slc7a3 нарушает сложившиеся представления о структуре центра инактивации Х-хромосомы. Гены Tsx, Chid, Cdx4 в результате перестройки отдалены по меньшей мере на 2,4 млн.п.н., и, по-видимому, сцепленные с ними регуляторные последовательности не являются необходимыми для регуляции экспрессии генов Xist и Tsix у полевок.

Экспрессия последовательностей ДНК локуса XistlTsix полевки

Ранее было показано, что у мыши на выбор Х-хромосомы для инактивации может влиять соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции последовательностей в окружении гена Xist (Nesterova et al., 2001). Для проверки справедливости данного утверждения для обыкновенной полевки проведен анализ транскриптов локуса Xist/Tsix.

Экспрессия гена Slc7a3

Ген Slc7a3 экспрессируется в направлении, противоположном ориентации гена Xist. Результаты экспериментов 3'- и 5'-RACE показали, что ген Slc7a3 состоит из 13 экзонов и представляет собой функциональный ген.

Особенности экспрессии 5'-фланкирующей области гена Tsix полевки

Анализ последовательности ДНК регуляторного элемента Xite мыши показал насыщенность данного района мобильными элементами. Выявленная транскрипция в это области приходится либо на район LTR, либо на микросателлитные повторы, которые могут служить местом инициации транскрипции (Ogawa, Lee, 2003). 5'-фланкирующая область Tsix полевки также насыщена различными диспергированными элементами, в основном SINE и LINE. Однако, в промежутке между 3'-границей гена Slc7a3 и точкой старта транскрипции гена Tsix, экспрессии не выявлено. Экспрессия в данном районе отсутствует даже у эмбрионов на 4 день развития, тогда как у мыши в данной области до инактивации Х-хромосомы наблюдается транскрипция регуляторного элемента Xite. Таким образом, у полевки отсутствуют как последовательности данного элемента, так и транскрипция в этом районе, которые у мышей выполняет важную функцию в регуляции экспрессии Tsix.

Экспрессия гена Tsix

Экспрессия гена Tsix выявлена на разных стадиях эмбрионального развития полевок, а также у взрослых особей, как у самок, так и у самцов. Выявляются как несплайсированные, так и сплайсированные транскрипты.

В 3'- фланкирующей области за последним сайтом терминации гена Tsix, установленным методом RACE, транскрипции не обнаружено. После инактивации Х-хромосомы Tsix продолжает экспрессироваться на активной Х-хромосоме.

Экспрессия гена Xist

Экспрессия гена Xist выявляется в тканях самок после инактивации X-хромосомы. Выявленный профиль экспрессии согласуется с данными, полученными ранее на полевках (Nesterova et al., 2003).

Особенности экспрессии 5'-фланкирующей области гена Xist полевки

В пределах 2 т.п.н. выше точки старта транскрипции гена Xist не выявлено экспрессии ни смысловой, ни противоположной цепи.

Следующая транскрипционно активная область расположена между генами Епох и Xist в районе CpG островка, свободного от мобильных элементов. Экспрессия в данном районе обнаруживается как в направлении, совпадающем с ориентацией Xist, так и в противоположном. Экспрессия наблюдается у особей обоего пола на всех стадиях развития. Промотор гена Енох, вероятно, бинаправлен, т.е. может обеспечивать инициацию транскрипции как в прямом, так и в противоположном направлениях. У мыши в данной области наблюдается экспрессия только в направлении, совпадающем с ориентацией гена Xist (Nesterova et al„ 2003).

Экспрессия гена Епох

В районе первого экзона гена Епох обнаружена транскрипция, которая имеет направление, противоположное ориентации гена Xist.

Результаты исследования транскрипции последовательностей ДНК локуса Xist/Tsix позволяют предположить, что соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции у разных видов (даже в пределах семейства Rodentia) может обеспечиваться за счет экспрессии различных районов локуса.

ceo

Pgkl * i Slcl 6aJ Cdx4, Chid Xist/Tsix, Slc7ai

Рис. 4. Локализация генов Slc7a3, Chid, Cdx4, Sld6a2 и Pgkl на Х-хромосоме

Microtus rossiaemeridionalis.

Alst

Геномная ДНК Xlll А сами гибридной Хр q полевки

кДНК фи6ро£дастов самки гибридной полевкн

кДНК плаценты самки гибридной полевки

Tsix

Епох

Slc'ai

1Ж

\ mim

Рис. 5. Хроматограммы секвенирующих реакций ПЦР-продуктов генов Епох, Тяа, 51с7аЗ, полученных с геномной ДНК и кДНК фибробластов и плацент гибридных самок полевок М. rossiaemeridionalis х М. атаИя.

Аллельспецифичность экспрессии генов локуса Хк у обыкновенных полевок. Импринтинг генов ХюГ и Гих в экстраэмбриональных тканях

Аллельспецифичность экспрессии генов центра инактивации Х-хромосомы полевки изучали при помощи секвенирования ПЦР продуктов, синтезированных с кДНК. РНК для реакций обратной транскрипции выделяли из культуры фибробластов гибридной самки полевки и из плацент гибридных эмбрионов 13-го дня развития, полученных в результате межвидовых скрещиваний гозз1аетепсИопаШ х $М. атаШ.

Сравнительный анализ последовательностей ДНК экзонов генов Лиг, 7л«, Епох и Б1с7аЗ выявил однонуклеотвдные замены у видов М. гозз1аетепсИопаИБ и М. агчаИя. Хроматограммы секвенирующих реакций ПЦР-продуктов вышеуказанных генов, полученных с геномной ДНК гибридных самок, в полиморфных позициях содержат двойные пики, что подтверждает присутствие в гибридных плацентах обоих родительских аллелей (рис. 5).

Ранее было показано, что в производных эпибласта у межвидовых гибридов полевок М. го$81аетепсИопаШ, М. ¡гап5са5р1си5, и М. Ы^зогит с М. апгаНз, независимо от направления скрещивания, Х-хромосома М. агхаНх, не имеющая гетерохроматинового блока, преимущественно остается активной (гаМап е1 а1, 1991). На хроматограммах секвенирующих реакций продуктов ПЦР генов Епох и 51с 7аЗ, полученных с кДНК фибробластов, пики в полиморфных позициях соответствуют хромосоме М. агуаИэ, т.е. гены экспрессируются с активной X-хромосомы М. атаШ и подвергаются инактивации на неактивной Х-хромосоме М. ^¡¡аетепсИопаНз (рис. 5). Ген ХШ экспрессируется с неактивной Х-хромосомы М. го5$1аетепсИопаШ.

В экстраэмбриональных тканях самок мыши экспрессия ТгЛх импринтирована на Х-хромосоме, унаследованной от матери, что приводит к импринтированной инактивации отцовской Х-хромосомы (Так<-щ!, 1978). У обыкновенных полевок с помощью биохимических маркеров показано, что в экстраэмбриональных тканях инактивируются гены отцовской Х-хромосомы (Нестерова, Закиян, 1994). Однако оставалась невыясненной связь импринтированной инактивации, обнаруженной на биохимическом уровне, с импринтингом генов Хи/ и Тга.

Хроматограммы секвенирующих реакций ПЦР-продуктов, полученных с кДНК плацент гибридных эмбрионов, показывают, что ген Лиг экспрессируется с отцовской Х-хромосомы М. апаНБ, а ген Tsix - с материнской Х-хромосомы М. гозз1аетепсИопаШ. Таким образом, в экстраэмбриональных тканях гибридов гояыаетепсИопаШ х о М- апаШ инактивации подвергается Х-хромосома отцовского происхождения. Полученные результаты подтверждают сведения о материнском импринтинге гена 7т и отцовском импринтинге гена ХШ, который наблюдается у мыши (Така§п 1978).

Гены Епох и Б1с7аЗ в плаценте гибридных самок полевки экспрессируются с активной Х-хромосомы М. го$$1аетеп<ИопаИ$, унаследованной от матери.

Ранее на мыши путем подавления экспрессии было показано, что нарушение импринтированной инактивации Х-хромосомы приводит к ранней гибели эмбрионов (Ьее, 2000; БасЬ е! а!., 2001). В случае, когда мутантный аллель несла материнская Х-хромосома, наблюдалась инактивация обеих Х-хромосом

в ранних эмбрионах самок и единственной Х-хромосомы в ранних эмбрионах самцов. Этот факт является дополнительным подтверждением того, что импринтинг гена Tsix в экстраэмбриональных тканях критичен для жизнеспособности эмбриона.

Таким образом, для грызунов характерен импринтинг генов Xist и Tsix, в результате которого инактивация Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях является импринтированной в отношении Х-хромосомы, унаследованной от отца.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований у обыкновенных полевок рода Microtus впервые описан ген Tsix. Его размер от промотора до самой отдаленной точки терминации транскрипции составляет 33747 п.н. Показано, что первичный транскрипт полиаденилируется и сплайсируется. Установлено наличие 4 экзонов. Обнаружены альтернативные варианты сплайсинга транскриптов.

В 5'- регуляторной области гена Tsix полевки выявлены районы гомологии с минисателлитным локусом DXPas34 мыши. Данный район у мыши принимает участие в регуляции экспрессии гена Tsix на стадии выбора Х-хромосомы для инактивации. Район DXPas34 полевки, мыши и крысы организован сходным образом в виде блоков тандемных повторов. Мономеры повторов содержат CpG-динуклеотиды и потенциальные сайты связывания транскрипционного фактора CTCF. Однако у полевки М. arvalis обнаружено наименьшее число CpG-динуклеотидов в районе DXPas34 и не выявлено ни одного мотива связывания CTCF. Эти факты, возможно, объясняют механизм неслучайной инактивации X-хромосомы в соматических клетках межвидовых гибридов полевок, у которых именно Х-хромосома М. arvalis остается активной.

Анализ нуклеотидной последовательности локуса Xist/Tsix полевок показал, что на расстоянии около 5 т.п.н. от 5'-границы гена Tsix расположен ген Slc7a3. Таким образом, у полевки обнаружена перестройка порядка генов в пределах центра инактивации Х-хромосомы. В результате этой перестройки из локуса Xic оказались удалены минорный промотор гена Tsix и регуляторный элемент Xite, которые у мыши играют важную роль в процессе инактивации Х-хромосомы.

Методом FISH показано, что гены Chid, Cdx4, Slcl6a2 и Pgkl, фланкирующие Xic у мыши и человека, локализуются в пределах бэцда Xq2.1 на X-хромосоме М. rossiaemeridionalis.

В экспериментах на мыши показано, что важное значение в инициации инактивации Х-хромосомы имеет соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции последовательностей локуса Xic, которое определяется экспрессией генов Xist и Tsix и окружающих их последовательностей ДНК. У полевки не обнаружено экспрессии в 5'-области гена Tsix, т.е. в районе, соответствующем регуляторному элементу Xite мыши. Антисмысловая экспрессия (совпадающая с направлением экспрессии гена Tsix) обнаружена на активной Х-хромосоме в районе гена Slc7a3 и районе, гомологичном первому экзону гена Епох мыши. Ген Tsix экспрессируется с активной Х-хромосомы в клетках самок и самцов на всех стадиях развития особей. Для плацент самок характерна импринтированная экспрессия гена Tsix с Х-хромосомы, унаследованной от матери. Ген Xist экспрессируется с неактивной Х-хромосомы в соматических клетках самок. В экстраэмбриональных тканях экспрессия Xist наблюдается с неактивной X-

хромосомы, унаследованной от отца. Между генами Епох и Xist в районе CpG-островка у полевки, как и у мыши, наблюдается экспрессия в направлении гена Xist. Полученные результаты позволяют предположить, что соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции у разных видов (даже в пределах семейства Rodentia) может обеспечиваться за счет экспрессии различных районов локусаХк.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что центр инактивации Х-хромосомы обыкновенной полевки перестроен по сравнению с Xic мыши, и фланкирован геном Slc7a3 с 5'-стороны гена Ts ix. В центре инактивации Х-хромосомы полевки отсутствуют регуляторный элемент Xite и минорный промотор гена Tsix, имеющиеся у мыши.

2. Впервые у обыкновенной полевки М. rossiaemeridionalis описан ген Tsix. Ген Tsix полевки имеет 4 экзона, первичный транскрипт полиаденилируется и сплайсируется. Обнаружены альтернативные варианты сплайсинга. Размер гена Tsix полевки от промотора до самой дальней точки терминации транскрипции составляет 33747 п.н.

3. В 5'-конце гена Tsix полевки выявлены последовательности, гомологичные регуляторному району DXPas34 мыши. DXPas34 полевки организован в виде блоков тандемных повторов 3 типов (с мономерами 70, 48 и 34 п.н.).

4. Методом флуоресцентной гибридизации in situ показано, что гены Slc7a3, Chid, Cdx4, Slcl6a2, Pgkl, входящие в состав и фланкирующие центр инактивации Х-хромосомы мыши, у полевки М. rossiaemeridionalis локализуются на Х-хромосоме в пределах бэнда Xq2.1.

5. Гены Tsix, Slc7a3 и Епох полевки экспрессируются с активной X-хромосомы у особей обоего пола на всех стадиях развития.

6. Экспрессия генов Xist и Tsix в экстраэмбриональных тканях полевки импринтирована. Ген Xist экспрессируется на Х-хромосоме, унаследованной от отца, а ген Tsix - на Х-хромосоме, унаследованной от матери.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Малахова A.A. Организация и генетическое окружение локуса Xist/Tsix полевки Microtus rossiaemeridionalis // Материалы XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология / Новосиб. гос. ун-т. Новосибирск, 2004. С.57-58.

2. Shevchenko A., Malakhova A., Pavlova М., Slobodyanyuk S., Elisaphenko Е., Mazurok N., Shilov A., Nesterova Т., Brockdorff N., Zakian S. The X-inactivation centre in common voles // 2nd Conference on X-inactivation. Paris, 2006. P. '11.

3. Малахова A.A., Шевченко А.И. Центр инактивации Х-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов // Международная молодежная научно-методическая конференция "Проблемы молекулярной клеточной биологии", 9-12 мая 2007 г., г. Томск. С. 114-115.

4. Малахова А.А., Григорьева Е.В., Шевченко А.И. Получение плюрипотентных линий гибридных клеток для изучения процесса инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок рода Microtus // Ломоносов-2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; секция «Биология»; 13-18 апреля 2009 г.; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов. С.303.

5. Малахова А.А., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Закиян С.М. Экспрессия последовательностей района центра инактивации Х-хромосомы полевок рода Microtus И Материалы международной конференции «Хромосома 2009», 31 августа-6 сентября 2009 г., Новосибирск. С. 141-142.

6. Малахова А.А., Пяткова М.С., Елисафенко Е.А., Шевченко А.И., Кель А.Э., Закиян С.М. Сравнительный анализ регуляторного района DXPas34 грызунов //Генетика, 2010. №10. С. 1236-1239.

7. Shevchenko A.I., Malakhova А.А., Elisaphenko Е.А., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Brockdorff N., Zakian S.M. Variability of the Xist gene surrounding in rodents suggests taxon-specific régulation of X chromosome inactivation // PLoS One, 2011. Vol. 6. №8. P. E22771.

Подписано к печати 04.10.2011 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ №58

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малахова, Анастасия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феноменология инактивации Х-хромосомы у млекопитающих

1.1.1. Основные положения

1.1.2. Процесс инактивации Х-хромосомы в системе ЭС клеток

1.1.3. Стадии процесса инактивации Х-хромосомы

1.1.4. Импринтированная инактивация Х-хромосомы

1.1.5. Сверхэкспрессия генов Х-хромосом

1.2. Структура центра инактивации Х-хромосомы

1.3. Ген ХШ

1.4. Ген 7т

1.5. Характеристика хроматина неактивной Х-хромосомы

1.6. Стадии процесса инактивации и роль генетических элементов

1.6.1. Факторы, участвующие на стадиях подсчета и выбора неактивной Х-хромосомы

1.6.2. Стадия инициации инактивации

1.6.3. Стадия распространения сигнала инактивации по Х-хромосоме

1.6.4. Поддержание неактивного состояния Х-хромосомы

1.7. Участие механизма РНК-интерференции в процессе инактивации Х-хромосомы

1.8. Модели инициации случайной инактивации Х-хромосомы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Скрининг фаговой геномной библиотеки полевки МісгоШз гоззіаетегійіопаШ

2.3. Выделение фаговой ДНК

2.4. Микробиологические методы работы

2.5. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.6. Методы работы с рекомбинантной ДНК

2.6.1. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.6.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.6.3. Выделение фрагментов ДНК из гелей

2.6.4. Лигирование

2.7. Выделение ДНК и РНК из плацент

2.8. Синтез кДНК методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)

2.9. Полимеразная цепная реакция

2.10. 3'- и 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)

2.11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.12. Контекстный анализ последовательности ДНК

2.13. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

2.14. PHK-FISH 58 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Определение нуклеотидной последовательности 5'-конца гена Tsix полевки Microtus rossiaemeridionalis

3.2. Сравнительный анализ 5'-конца гена Tsix грызунов

3.3. Сравнительный анализ локусаXist/Tsix млекопитающих

3.4. Характеристика регуляторных последовательностей гена Tsix полевки

3.4.1. DXPas

3.4.2. Промоторная область гена Tsix

3.5. Анализ генетического окружения локуса Xist/Tsix

3.6. Экспрессия и экзон-интронная структура гена Tsix

3.7. Экспрессия последовательностей локуса Xist/Tsix полевки

3.7.1. Экспрессия гена Slc7a

3.7.2. Экспрессия в 5'- фланкирующей области гена Tsix

3.7.3. Экспрессия гена Tsix

3.7.4. Экспрессия генаXist

3.7.5. Экспрессия в 5'- фланкирующей области гена Xist

3.7.6. Экспрессия гена Епох

3.7.7. Хромосомоспецифичность экспрессии генов локуса Xic у обыкновенных полевок

3.7.8. Выявление характера экспрессии генов Xist и 7т в экстраэмбриональных тканях обыкновенных полевок

3.7.8.1 .Импринтинг гена Xist

3.7.8.2.Импринтинг гена Тягх

Введение Диссертация по биологии, на тему "Центр инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов"

Актуальность

Явление инактивации одной из двух Х-хромосом у самок высших млекопитающих впервые было описано Мэри Лайон (Lyon, 1961). Инактивация X-хромосомы - это сложный многостадийный процесс. Важнейшую роль в регуляции этого процесса играет определенный локус Х-хромосомы, получивший название «центр инактивации» (Xic). Данный локус содержит генетические элементы; участвующие в инактивации-Х-хромосомы. У мыши наиболее важную роль в этом процессе играют ген Xist и антисмысловой к нему ген Tsix, кодирующие нетранслируемые ядерные РНК, а также минисателлитный локус BXPas34 и транскрибирующийся районке (Boumil, Lee, 2001). Данные участки Х-хромосомы регулируют экспрессию гена Xist в процессе импринтированной и случайной инактивации, а также вовлечены в* механизмы подсчета числа Х-хромосом.в клетке и выбора будущей неактивной Х-хромосомы: Однако при изучении структуры локуса, Xic у других видов высших млекопитающих' (крыса, корова, собака, шимпанзе, человек) исследователями не было описано таких элементов как DXPas34, Tsix и Xite (Chureau et al., 2002). Сравнительный межвидовой анализ последовательностей локуса Xic может быть информативен для* выявления функционально значимых районов, принимающих участие в процессе инактивации Х-хромосомы.

Данная работа направлена на изучение структуры 5'-области.гена Tsix полевки Microtus rossiaemeridionalis, выявление консервативных, генетических элементов в локусе Xist/Tsix, участвующих в- процессе инактивации Х-хромосомы, а также установление локализации« генов- Chicl, Cdx4, Slcl6a2, Pgkl, которые у мыши и человека составляют генетическое окружение гена Xist. Предполагается, что последовательности ДНК, - сцепленные с этими генами,' являются составной частью центра инактивации' и содержат регуляторные элементы, необходимые для 4 функционирования локуса Xic (Clerc, Avner, 2003).

Одной-из основных, функций'гена Tsix считают его подавляющее влияние на транскрипцию Xist (Lee, 2000; Sado et al., 2001). В исследованиях на мыши показано, что в экстраэмбриональных тканях экспрессия Tsix импринтирована на Х-хромосоме, унаследованной от матери (Takagi, 1978). Однако у человека не обнаружено импринтированной инактивации Х-хромосомы (Migeon, Do, 1979). У обыкновенных полевок с помощью биохимических маркеров показано, что в экстраэмбриональных тканях инактивируются гены отцовской Х-хромосомы (Нестерова, Закиян, 1994). В настоящей работе установлена связь импринтированной инактивации, обнаруженной на биохимическом уровне, с импринтингом генов Xist и Tsix.

Кроме того, проведено исследование транскрипционной активности последовательностей ДНК в окружении локуса Xist/Tsix полевки. Ранее было показано, что соотношение смысловой- и антисмысловой транскрипции в 5'- и 3'-фланкирующих районах- гена Xist оказывает существенное влияние на регуляцию экспрессии этого гена у мыши (Nesterova et al., 2003).

Цель работы: Исследовать организацию, генетическое окружение и характер экспрессии последовательностей ДНК локуса Xist/Tsix у обыкновенных полевок рода Microtus.

Задачи:

1. Провести определение и контекстный анализ нуклеотидной последовательности 5'-конца гена Tsix у Microtus rossiaemeridionalis с целью выявления консервативных генетических элементов, участвующих в процессе инактивации Х-хромосомы полевок.

2. Определить локализацию генов Gdx4, Chicl, Pgkl, Slcl6a2, которые составляют окружение локуса Xist/Tsix у мыши и человека.

Научная новизна

Впервые была определена нуклеотидная последовательность 3'-конца гена Xist обыкновенных полевок. Показано, что в районе, гомологичном мажорному промотору гена Tsix мыши, расположена точка инициации транскрипции антисмысловой РНК гена Xist полевки, и, следовательно, локализована зона промотора гена Tsix полевки. Паттерн экспрессии гена Tsix, модулируемый промотором полевки, сходен с таковым мыши. Консервативность мажорного промотора и сходство экспрессии гена 7з7х у мыши и полевки свидетельствуют о важности антисмысловой транскрипции в регуляции гена Xist и процесса инактивации Х-хромосомы у грызунов.

Впервые выявлена перестройка порядка генов в локусе Хю полевки, в результате чего последовательности минорного промотора Тя1х и района ХИе оказались замещены геном 81с7аЗ и окружающими его последовательностями. При исследовании транскрипции последовательностей локуса Ж^/Тя/х полевки показано отсутствие регуляторного района ХЫе и минорного промотора.гена Тз1х не только на уровне последовательности» нуклеотидов, но и на функциональном уровне. Это позволяет заключить, что данные компоненты не являются абсолютно необходимыми для обеспечения процесса инактивации Х-хромосомы. Установлено, что соотношение транскрипции смысловой и антисмысловой цепей ДНК в локусе у мыши и полевки обеспечивается за счет экспрессии за счет экспрессии различных районов локуса.

Практическая значимость.

Результаты данной работы позволяют разъяснить роль различных генетических компонентов в окружении генов и Гя/х в процессе инактивации Х-хромосомы. Обнаружены различия, в регуляции процесса инактивации. Х-хромосомы у мыши и полевок, участие различных районов^ локуса Х/^/Тягх в этом процессе. Высказано предположение о существовании альтернативных способов регуляции процесса инактивации Х-хромосомы у разных видов высших млекопитающих.

Апробация работы

Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17-22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции' «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9-12 мая12007 г.), на международной конференции «Хромосома» 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемом отечественном и зарубежном журналах.

Вклад автора

Основные результаты получены автором самостоятельно. Контекстный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК и поиск регуляторных районов в локусе Xist/Tsix полевки проводился совместно с А.И. Шевченко и Е.А. Елисафенко. Скрининг геномной библиотеки, эксперименты по исследованию экспрессии последовательностей локуса Xist/Tsix полевки и PHK-FISH анализ выполнялись совместно с А.И. Шевченко. Обработка данных FISH экспериментов проводилась автором совместно с H.A. Мазурок.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Малахова, Анастасия Александровна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что центр инактивации Х-хромосомы обыкновенной полевки перестроен по сравнению с Xic мыши, и фланкирован геном Slc7a3 с 5'-стороны гена Tsix. В центре инактивации Х-хромосомы полевки отсутствуют регуляторный элемент Xite и минорный промотор гена Tsix, имеющиеся у мыши.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований у обыкновенных полевок рода Microtus впервые описан ген Tsix. Его размер от промотора до самой дальней точки терминации транскрипции составляет 33747 п.н. Показано; что первичный транскрипт полиаденилируется и сплайсируется. Установлено наличие 4 экзонов. Обнаружены альтернативные варианты сплайсинга транскриптов.

В' 5'-регуляторной области гена Tsix полевки выявлены, районы гомологии с минисателлитным локусом DXPas34 мыши. Данный районку мыши принимает участие в регуляции экспрессии гена Tsix на,стадии выбора Х-хромосомы для инактивации. Район DXPas34 полевки, мыши и крысы организован сходным образом- в виде блоков тандемных повторов; Мономеры повторов содержат CpG-динуклеотиды и потенциальные сайты связывания ¡.транскрипционного фактора CTCF. Однако у полевки М. arvalis обнаружено наименьшее число CpG-динуклеотидов в районе DXPas34 и не выявлено- ни одного- мотива связывания CTCF. Эти факты, возможно, объясняют механизм- неслучайной инактивации Х-хромосомы в соматических клетках межвидовых гибридов полевок, у которых именно Х-хромосома М. arvalis остается активной.

Анализ нуклеотидной. последовательности локуса Xist/Tsix полевок показал, что на расстоянии около 5 т.п.н: от 5'-границы гена1 Tsix расположен ген Slc7a3. Таким образом, у полевки, обнаружена, перестройка порядка генов, захватывающая центр инактивации! Х-хромосомы. В'результате этой перестройки из локуса Xic оказались удалены минорный промотор гена Tsix и регуляторный элемент Xite, которые у мыши играют важную роль в процессе инактивации Х-хромосомы.

Методом FISH показано, что гены Chicl, Cdx4, Slcl6a2 и Pgkl, фланкирующие Xic у мыши и человека, локализуются в пределах бэнда Xq2.1 на Х-хромосоме М. rossiaemeridionalis.

В экспериментах на мыши показано, что важную роль, в инициации инактивации Х-хромосомы играет соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции последовательностей локуса Xic, которое определяется экспрессией генов Xist и Tsix и окружающих их последовательностей. У полевки не обнаружено экспрессии в 5'-фланкирующей области гена Tsix, т.е. в районе, соответствующем регуляторному элементу Xite мыши. Антисмысловая экспрессия (совпадающая по направлению с экспрессией гена Тяіх) обнаружена на активной Х-хромосоме в районе гена БІсІаЗ и районе, гомологичном первому экзону гена Епох мыши. Ген Тяіх экспрессируется с активной Х-хромосомы в клетках самок и самцов на всех стадиях развития особей. Для плацент самок характерна импринтированная экспрессия гена Тзіх с Х-хромосомы, унаследованной от матери. Ген Хіяґ экспрессируется с неактивной Х-хромосомы в соматических клетках самок. В экстраэмбриональных тканях экспрессия Хіяґ наблюдается с неактивной Х-хромосомы, унаследованной от отца. Между генами Епох и Хіяґ в районе СрС-островка у полевки, как и у мыши, наблюдается экспрессия в направлении гена Хізї. Полученные результаты позволяют предположить, что соотношение смысловой и антисмысловой транскрипции у разных видов (даже в пределах семейства ІІос1еп1:іа) может обеспечиваться за счет экспрессии различных районов локусаХ/с.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малахова, Анастасия Александровна, Новосибирск

1. Забаровский Е.Р., Турина О.В. Быстрое выделение ДНК фага X II Молекулярная биология. Вып. б. 1998. С. 1451-1455.

2. Клонирование ДНК. Методы / под ред. Гловера Д.М.: Мир. 1988. 583 С.

3. Колесников Н.Н., Елисафенко Е.А. Экзон-интронная структура гена Xist слона, броненосца и предка плацентарных млекопитающих // Генетика: 2010а. Т.46. №9. С. 1379- 1385.

4. Колесников Н.Н., Елисафенко Е.А. Сравнительная организация и происхождение некодирующих регуляторных РНК генов центра инактивации X-хромосомы человека и мыши // Генетика. 20106. Т.46. № 9. С. 1386-1391.

5. Малахова А.А., Пяткова М.С., Елисафенко Е.А., Шевченко А.И., Кель А.Э., Закиян С.М. Сравнительный анализ регуляторного района DXPas34 грызунов // Генетика. 2010. № 10. С. 1236-1239.

6. Нестерова Т.Б., Закиян С.М. Инактивация Х-хромосомы у млекопитающих // Генетика. №3. 1994. С. 293-317.

7. Ahn J.Y., Lee J.T. Retinoic acid accelerates downregulation of the Xist repressor, Oct4, and increases the likelihood of Xist activation when Tsix is deficient I I BMC Dev Biol. 2010. Vol. 10.P.E90.

8. Anguera M.C., Sun B.K., Xu N., Lee J.T. X-chromosome kiss and tell: how they go their separate ways // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2006. Vol. 71. P. 429-437.

9. Avner P., Heard E. X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation // Nature. 2001. Vol. 2. P. 59-67.

10. Augui S., Filion G.J., Huart S., Nora E., Guggiari M., Maresca M., Stewart A.F., Heard E. Sensing X chromosome pairs before X inactivation via a novel X-pairing region of the Xic // Science. 2007 Vol. 318. P. 1632-1636.

11. Bacher C.P., Guggiari M., Brors B., Augui S., Clerc P., Avner P., Eils R., Heard E. Transient colocalization of X-inactivation centres accompanies the initiation of X inactivation //Nat Cell Biol. 2006. Vol. 8. P. 293-299.

12. Barr M.L., Bertram E.G. A morphological!distinction between neurones of the male and female, and the behaviour of* the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis //Nature. 1949. Vol1. 163. P. 676.

13. Barr H., Hermann A., Berger J., Tsai H.H., A'die K., Prokhortchouk A., Hendrich B., Bird A. Mbd2 contributes to DNA methylation-directed repression of the Xist gene // Mol. Cell Biol. 2007. Vol5. 27. P. 3750-3757.

14. Beard C., Li E., Jaenisch R. Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryonic cells // Genes Dev. 1995. Vol. 9. P. 2325-2334.

15. Belyaev N.D., Keohane A.M., Turner B.M. Differential,underacelylation of histones H2A, H3 and H4 on the inactive X chromosome in human female cells // Hum Genet. 1996. Vol. 97. P. 573-578.

16. Boggs B.A., Cheung P., Heard E., Spector, D.L., Chinault A.C., Allis C.D. Differentially methylated forms of histone H3'show unique association patterns with« inactive human X chromosomes //Nat Genet. 2002. Vol. 30. P. 73-76.

17. Boggs'B.A., Connors B., Sobel'R.E., Chinault A.C., Allis C.D. Reduced levels of histone H3 acetylation on the inactive X chromosome in human females // Chromosoma. 1996. Vol: 105. P. 303-309.

18. Boumil R.M., Lee J.T. Forty, years of decoding the silence in X-chromosome inactivation // Hum Mol Genet. 2001. Vol. 10. P." 2225-2232.

19. Brockdorff N. X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA // Trends Genet. 2002. Vol. 18. № 7. P. 352-358.

20. Brown C.J., Ballabio A., Rupert J.L., Lafreniere R.G., Grompe M., Tonlorenzi R., Willard, H.F. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome //Nature. 1991. Vol. 349. P. 38^4.

21. Brown. C.J., Lafreniere R.G., Powers V.E., Sebastio G., Ballabio A., Pettigrew A.L., Ledbetter D.H., Levy E., Craig I.W., Willard H.F. Localization of the X inactivation centre on the human-X chromosome in Xql3 //Nature. 1991. Vol. 349. P. 82-84.

22. Brown C.J., Willard H.F. The human X-inactivation centre is not required for maintenance of X-chromosome inactivation//Nature. 1994. Vol. 368. P. 154-156.

23. Cao R., Wang L., Wang H., Xia L., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Jones R.S., Zhang Y. Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing // Science. 2002. Vol. 298. P. 1039-1043.

24. Carrel L., Cottle A.A., Goglin K.C., Willard H.F. A first-generation X-inactivation profile of the human X chromosome // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. Vol. 96. P. 14440-14444.

25. Cattanach B.M., Papworth D. Controlling elements in the mouse. V. Linkage tests with X-linked genes // Genet Res. 1981. V. 38. P. 57-70.

26. Chadwick B.P., Willard H.F. Chromatin of the Barr body: histone and non- histone proteins associated with or» excluded from the inactive X chromosome // Hum Mol Genet. 2003. Vol. 12. P. 2167-2178.

27. Chadwick B.P:, Willard H.F. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatm on the human inactive X chromosome // Proc Natl Acad Sci USA. 2004. Vol. 101. P. 17450-17455.

28. Chang S.C., Brown C.J. Identification of regulatory elements flanking human XIST reveals species differences // BMC Mol Biol. 2010. Vol. 11. P. E20.

29. Chao W., Huynh K.D., Spencer R.J., Davidow L.S., Lee J.T. CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice // Science. 2002. Vol. 11. P. 345-347.

30. Chaumeil J., Le Baccon P., Wutz A., Heard E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced // Genes Dev. 2006. Vol'. 20. P. 2223-2237.

31. Chen T., Ueda Y., Dodge J.E., Wang Z., Li E. Establishment and maintenance of genomic methylation patterns in mouse embryonic stem cells by Dnmt3a and Dnmt3b//Mol. Cell. Biol. 2003. Vol. 23. P. 5594-5605i

32. Chureau C., Chantalat S., Romito A., Galvani A., Duret L., Avner P., Rougculle C. Fix: is a non-coding RNA which affects Xist expression; and?- chromatin' structure within the X-inactivation center region^// Hum Mol Genet. 2011. Vol. 20. P. 705-718.

33. Ghureau G., Pnssette M:, BburdetrA'., Barbe-V:, Gattolico L:, Jones E., Eggen* A., Avner P., Duret L. Comparative sequence analysis of the X-inactivation center region immouse, human and'bovine // Genome Res: 2002: Voli 12: P. 894-908:

34. Clemson C. M:, Hall'L.L., Byron;M:, McNeil J:, Lawrence J:B. The X chromosome is, organized into a gene-rich outer rim and an internal core containing silenced nongenic sequences // Proc Natl Aca&Sci USA: 2006;.'Vol. 103. P.7688-7693.

35. Clerc P., Avner P: Multiple elements within the Xic regulate random^X inactivation« in mice // CelP&iDevelopmental'Biology. 2003. Vol; 14. P: 85-92!

36. Cohen D.E., Davidow L.S., Envin J.A., Xu N , Warshawsky D., Lee J.T. The DXPas34 repeat regulates random and imprinted X inactivation // Dev Cell. 2007. Vol. 12. P. 57-71.

37. Cohen H.R., Panning B. XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced-association with the export factor TAP/NXF1 // Chromosoma. 2007. Vol. 116. P. 373-383.

38. Constanzi C., Pehrson J.R. MacroH2Al is concentrated in the inactive X chromosome of female mammals //Nature. 1998. Vol. 393. P. 599-601.

39. Courtier B., Heard E., Avner P. Xce haplotypes show modified methylation- in a region of the active X chromosome lying 3' to Xist II Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Vol. 92. P. 3531-3535.

40. Csankovszki G., Nagy A., Jaenisch R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation // J Cell Biol: 2001. Vol. 153. P. 773-783:

41. Csankovszki G., Panning B., Bates B., Pehrson J.R., Jaenisch R. Conditional deletion of Xist disrupts histone macroH2A localization but not maintenance of X inactivation. //Nat Genet. 1999. Vol. 22. P. 322-323.

42. Donohoe M.E., Zhang L.F., Xu N., Shi Y., Lee J.T. Identication of a CTCF cofactor, Yyl, for the X chromosome binary switch // Mol Cell. 2007. Vol. 25. P. 43-56.

43. Elisaphenko E.A., Kolesnikov N.N., Shevchenko A.I., Rogozin I.B"., Nesterova T.B., Brockdorff N., Zakian S.M. A dual origin ofthe Xist gene from a protein-coding gene and a set of transposable elements // PLoS ONE. 2008. Vol. 3." P. E2521.

44. Fackelmayer F.O. A stable proteinaceous structure in the territory of inactive X chromosomes // J Biol'Chem. 2005; VoL 280^ P. 1720-1723.

45. Falk M., Lukasova E., Kozubek S;, Kozubek.M? Topography oogenetic elements of X-chromosome relative to- the cell nucleus : and to the chromosome X' territory determined for humandymphocytes. //Gene: 20021 VoE 292; P. 13-24.

46. Gilbert S.L., Sharp P.A. Promoter-specific hypoacctylation of X-inactivated genes // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. Vol. 96. P. 13825-13830.

47. Goto Y., Takagi N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited1 X.chromosome in; the mouse // Development. 1998. Vol. 125. P. 3353-3363.

48. Hall: L.E., Lawrence J.B. The; cell biology of a novel' chromosomal RNA: chromosome painting by XIST/Xist RNA initiates a remodeling- cascade // Sem in Cell Dev Biol. 2003. Vol. 14. P. 369-378.

49. HeardiE., Rougelle C., Arnaud Di, Avner PI, Allis;C:D., Spector D.L. Methylation of histone H3 -at Lys-9 is an early mark on the:X chromosome during X inactivation // Cell. 2001, Vol. 107. P. 727-738.

50. Helbig R., Fackelmayer F.O; Scaffold attachment factor A (SAF-A) is concentrated in inactive X chromosome territories through its RGG domain // Chromosoma. 2003. Vol. 112. P. 173-182.

51. Hong Y.K., Ontiveros S.D., Chen C., Strauss W.M. A new structure for the murine Xist gene and its relationship to chromosome choice/counting during X-chromosome inactivation I I Proc Natl Acad Sci USA. 1999. Vol. 96. P. 6829-6834.

52. Hong Y.K., Ontiveros S.D., Strauss W.M. A revision of the human XIST gene organization and structural comparison with mouse Xist II Mamm Genome. 2000. Vol. 11. P. 220-224.

53. Hosokawa H, Ninomiya H, Sawamura T, Sugimoto Y, Ichikawa A, Fujiwara K, Masaki T. Neuron-specific expression of cationic amino acid transporter 3 in the adult rat brain II Brain Res. 1999. Vol. 838. № 1-2. P. 158-65.

54. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals,//Nat Genet Suppl. 2003. Vol. 33. P: 245-254.

55. Jenuwein T., Allis C.D. Translating the histone code II Science: 2001. Vol. 293. P. 1074-1080.

56. Jeppesen P., Turner B. The inactive X chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone H4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression // Cell. 1993. Vol. 74. P. 281-289.

57. Johnston C.M., Newall A.E., Brockdorff N., Nesterova T.B. Enox, a novel gene that maps 10 kb upstream of Xist and partially escapes X inactivation // Genomics. 2002. Vol. 80. P. 236-244.

58. Johnston P.G., Cattanach B.M. Controlling elements in the mous: IV. Evidence of non-random X-inactivation // Genet. Res. 1981. Vol. 37. P. 151-160.

59. Jonkers I., Barakat T.S., Achame E.M., Monkhorst K., Renter A., Rentmeester E., Grosveld F., Grootegoed J.A., Gribnau J. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation II Cell. 2009. Vol. 139. P. 999-1011.

60. Kalantry S., Purushothaman S., Bowen R.B., Starmer J., Magnuson T. Evidence of Xist RNA-independent initiation of mouse imprinted X-chromosome inactivation // Nature. 2009. Vol. 460. P. 647-651.

61. Kohlmaier A., Savarese F., Lachner M., Martens J., Jenuwein T., Wutz A. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation // PLoS Biol. 2004. Vol. 2. P. E171.

62. Lee J.T. Disruption of imprinted X inactivation by parent-of origin effects at Tsix II Cell. 2000. Vol. 103. P. 17-27.

63. Lee J.T. Functional intergenic transcription: a case study of the X-inactivation centre // Phil Trans R Soc Lond. 2003. Vol. 358. P. 1417-1423.

64. Lee J.T. Lessons from X-chromosome inactivation: long ncRNA as guides and tethers to the epigenome // Genes & Development. 2009. Vol. 23. P. 1831-1842.

65. Lee J.T., Straus W.M., Dausman J.A., Jaenisch R. A 450 kb transgene displays properties of the mammalian X-inactivation center // Cell. 1996. Vol. 86. P. 83-94.

66. Lee J.T., Davidow L.S., Warshawsky D. Tsix, a gene antisense to Xist at the X-inactivation center // Nat Genet. 1999. Vol. 21. P. 400-404.

67. Lee J.T., Lu N. Targeted mutagenesis of * Tsix leads to nonrandom X inactivation. // Cell. 1999. Vol. l.P. 47-57.

68. Lichter P., Cremer T., Borden J., Manuelidis L., Ward D.C. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries // Hum Genet. 1988. Vol. 80. P. 22434.

69. Lin H., Gupta V., Vermilyea'M.D., Falciani F., Lee J.T., O'Neill L.P., Turner B.M. Dosage compensation in the mouse-balances up-regulation and silencing of X-linked genes // PLoS Biol. 2007. Vol. 5. № 12. P. E326.

70. Lyon M.F. Gene action in X-chromosome of the mouse (Mus musculus L) // Nature. 1961. Vol. 190. P. 372-373.

71. Lyon M.F. Mechanisms and evolutionary origins of variable X-chromosome activity in mammals // Proc Roy Soc London Ser B. 1974. Vol. 187. P. 243-268.

72. Lyon M.F., Rastan S. Parental source of chromosome imprinting and its relevance for X chromosome inactivation // Differentiation. 1984. V. 26. P. 63-67.

73. Lyon MiF., Zenthon J., Evans, E.P., Burtenshaw M.D., Wareham K.A., Williams E.D. Lack of inactivation of a mouse X-linked gene physically separated from the inactivation centre // J Embryol Exp Morphol. 1986. Vol. 97. P. 75-85.

74. Mak W., Baxter J., Silva J., Newall A.E., Otte A.P, Brockdorff N. Mitotically stable association of polycomb group proteins Eed and Enxl with the inactive X chromosome in trophoblast stem cells // Current Biology. 2002. Vol. 12. P. 1016— 1020.

75. Maniatis T., Fritsch P., Sambrook J. Molecular cloning, laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. Press. 1992. Vol. 27.

76. Marahrens Y., Loring J., Jaenisch R. Role of the Xist gene in X chromosome choosing // Cell. 1998. Vol.92. P. 657-664.

77. Marahrens Y., Panning B., Dausman J., Strauss W., Jaenisch R. Xwi-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis // Genes Dev. 1997. Vol. 11. P. 156-166.

78. McDonald L.E., Paterson C.A., Kay G.F. Bisulfite genomic sequencing-derived methylation profile of the Xist gene throughout early mouse development // Genomics. 1998. Vol. 54. P. 379-386.

79. McLaren A., Monk M. X-chromosome activity in the germ cells of sex-reversed mouse embryos // J Reprod Fertil. 1981. V. 63. P. 533-537.

80. Mermoud J.E., Popova B., Peters A.H., Jenuwein T., Brockdorff N. Histone H3 lysine 9 methylation occurs rapidly at the onset of random X-chromosome inactivation // Curr Biol. 2002. Vol. 12. P. 247-251.

81. Migeon B.R. X-chromosome inactivation: theme and variations // Cytogenetic and Genome Research. 2002. Vol. 99. P. 8-16.

82. Migeon B.R., Chowdhury A.K., Dunston J.A., Mcintosh I. Identification of TSIX, encoding an RNA antisense to human XIST, reveals differences from its murine counterpart: implications for X inactivation // Am J Hum Genet. 2001. Vol. 69. P. 951-960.

83. Migeon B.R., Do T.T. In search of non-random X inactivation: studies of fetal membranes heterozygous for glucose-6-phosphate dehydrogenase // Am J Hum Genet. 1979. Vol. 31. P. 581-585.

84. Migeon B.R., Kennedy J.F. Evidence for the inactivation of an X chromosome early in the development of the human female // Am J Hum Genet. 1975. Vol. 27. P. 233239.

85. Migeon B.R., Lee C.H., Chowdhury A.K., Carpenter H. Species differences in TSIX/Tsix reveal the roles of these genes in X-chromosome inactivation // Am J Hum Genet. 2002. Vol. 71. P. 286-293.

86. Mlynarczyk-Evans.S., Royce-Tolland M., Alexander M.K., Andersen A.A., Kalantry S., Gribnau J., Panning B. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation // PLoS Biol. 2006. Vol. 4. P. el59.

87. Navarro P., Pichard S., Ciaudo C., Avner, P., Rougeulle C. Tsix transcription across the Xist gene alters chromatin conformation without affecting Xist transcription: implications for X-chromosome inactivation // Genes Dev. 2005. Vol. 19. P. 14741484

88. Nesterova T.B., Johnston C.M., Appanah R., Newall A.E., Godwin J., Alexiou M., Brockdorff N. Skewing X chromosome choice by modulating sense transcription across theX/si locus // Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 2177-2190.

89. Nguyen D.K., Disteche C.M. Dosage compensation of the active X chromosome in mammals II Nat Genet. 2006. V. 38. № 1. P. 47-53.

90. Nicodemi M., Prisco A. Symmetry-breaking model for X-chromosome inactivation // Phys Rev Lett. 2007. Vol. 98. P. 108104.

91. Ohlsson R., Renkawitz R., Lobanenkov V. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease // TRENDS in Genetics. 2001. Vol.17. P. 520-527.

92. Okamoto I., Arnaud D., Le Baccon P., Otte A.P., Disteche C.M., Avner P., Heard E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice //Nature. 2005. V. 438. P. 369-373.

93. O'Neill L. P., Randall T. E. , Lavender J., Spotswood H. T., Lee J. T., Turner B: M. X-linked genes in female embryonic stem cells carry an epigenetic mark prior to the onset of X inactivation // Hum Mol Genet. 2003. Vol. 12. P. 1783-1790.

94. Ooi S.L., Henikoff S. Germline histone dynamics and epigenetics // Curr Opin Cell Biol. 2007. V. 19. P. 257-265.

95. Pearson W.R., Lipman DJ. Improved tools for biological sequence comparison // Proc Natl Acad Sci USA. 1988. Vol. 85. P. 2444-2449.

96. Pinkel D., Straume T., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V. 83. P. 2934-2938.

97. Plath K., Fang J., Mlynarczyk-Evans S.K., Cao R., Worringer K.A., Wang H., de la Cruz C.C., Otte A.P., Panning B., Zhang Y. Role of histone H3 lysine 27 methylation inX inactivation// Science. 2003. Vol. 300. P. 131-135.

98. Plenge R.M., Hendrich B.D., Schwartz C., Arena J.F., Naumova A., Sapienza C., Winter R.M., and Willard H.F. A promoter mutation in the XIST gene in two unrelated families with skewed X-chromosome inactivation // Nat. Genet. 1997. Vol. 17. P. 353-356.

99. Popova B.C., Tada T., Takagi N., Brockdorff N., Nesterova T.B. Attenuated spread of X-inactivation in an X:autosome translocation // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. Vol. 103. P. 7706-7711.

100. Prissette M., El-Maarri 0.5 Arnaud D., Walter J., Avner P. Methylation profiles of DXPas34 during the onset of X-inactivation // Hum Mol Genet. 2001. Vol. P. 31-38.

101. Rastan S. Non-random X-chromosome inactivation in mouse X-autosome translocation embryos location of the inactivation centre // J Embryol Exp Morphol. 1983. Vol. 78. P. 1-22.

102. Rea S., Eisenhaber F., O'Carroll-D., Strahl B.D., Sun Z.W., Schmid M., Opravil S., Mechtler K., Ponting C.P., Allis C.D., Jenuwein T. Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 metiltransferases //Nature. 2000. Vol. 406. P. 593-599.

103. Sado T., Hoki Y., Sasaki H. Tsix silences Xist through modification of chromatin structure // Dev. Cell. 2005. Vol. 9. P. 159-165.

104. Sado T., Hoki Y., Sasaki H. Tsix defective in splicing is competent to establish Xist silencing // Development. 2006. Vol. 133. P. 4925-4931'.

105. Sado T., Wang Z., Sasaki H., Li E. Regulation of imprinted X-chromosome inactivation in mice by Tsix //Development. 2001. Vol. 28. P. 1275-1286.

106. Savarese F., Flahndorfer K., Jaenisch R., Busslinger M., Wutz A. Hematopoietic precursor cells transiently reestablish permissiveness for X inactivation // Mol Cell Biol. 2006. Vol. 26. P. 7167-7177.

107. Sharman G. B. Late DNA replication in the paternally derived X chromosome of female kangaroos //Nature. 1971. Vol. 230. P. 231-232.

108. Sheardown S.A., DuthieS.M., Johnston C.M., NewalliA.E., Formstone E.J., Arkell R.M., Nesterova T.B., Alghisi G.C., Rastan S., Brockdorff N. Stabilization, of Xist RNA mediates,initiation ofX chromosome inactivation// Cell: 1997. Vol. 91. P. 99107.

109. Shevchenko A.I., Pavlova S.V., Dementyeva E.V., Zakian S.M. Mosaic heterochromatin of the inactive X chromosome in vole Microtus rossiaemeridionalis II Mamm Genome. 2009. Vol. 20. № 9-10. P. 644-653.

110. Shibata S., Lee J.T., Characterization and quantitation of differential Tsix transcripts: implications for Tsix function // Hum Mol Genet. 2003. Vol. 12. P. 125-136.

111. Smith K.P., Byron M., Clemson C.M., Lawrence J.B. Ubiquitinated proteins including uH2A on the human and mouse inactive X chromosome: enrichment in gene rich bands // Chromosoma. 2004. Vol. 113. P. 324-335.

112. Stavropoulos N., Lu N., Lee J.T. A functional role for Tsix transcription in blocking Xist RNA accumulation but not in X-chromosome choice // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. Vol. 28. P. 10232-10237.

113. Sun B.K., Deaton A.M., Lee J.T. A transient heterochromatic state in Xist preempts X inactivation choice without RNA stabilization // Molecular Cell. 2006. Vol. 21. P. 617-628.

114. Takagi N. Preferential inactivation of the paternally derived X chromosome in mice //BasicLife Sci. 1978. Vol.' 12. P. 341-360.

115. Takagi N., Sasaki M. Preferential inactivation of the paternally derived X-chromosome in the extraembrionic membranes of the mouse // Nature. 1975. Vol. 256. P. 640-641.

116. Tian D., Sun S., Lee J.T. The long noncoding RNA, Jpx, is a molecular switch for X chromosome inactivation II Cell. 2010. Vol. 143. P. 390-403.

117. Turner J.M. Meiotic sex chromosome inactivation // Development. 2007. Vol. 134. P. 1823-1831.

118. Xu N., Tsai C.L., Lee J.T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation // Science. 2006. Vol. 311. P. 1149-1152.

119. Vigneau S., Augui S., Navarro P., Avner P., Clerc P. An essential role for the DXPas34 tandem repeat and Tsix transcription in the counting process of X chromosome inactivation // Proc Nat Acad Sci USA. 2006. Vol. 103. P. 7390-7395.

120. Visser A.E., Eils R., Jauch A., Little G., Bakker P.J., Cremer T., Aten J.A. Spatial distributions of early and late replicating chromatin in interphase chromosome territories // Exp Cell Res. 1998., Vol. 243. P: 398-407.

121. Wang J., Mager J., Chen Y., Schneider E., Gross J.C., Nagy A4., Magnuson T. Imprinted X inactivation maintained'by a mouse polycomb group gene // Nat Genet. 2001. Vol. 28. P. 371-375.

122. Wutz A., Jaenisch R. A shift from reversible to irreversible X inactivation1 is triggered during ES cell differentiation // Mol Cell. 2000. Volt 5. P. 695-705.

123. Wutz A., Rasmussen T.P., Jaenisch R. Chromosomal silencing and localization are mediated by different domains ofXwiRNA //Nat Genet. 2002. Vol. 30. P. 167-174.

124. Zabel B.U., Baumann W.A., Pirntke W., Gerhard-Ratschow K. X-inactivation ' pattern in three cases of X/autosome translocation // Am J Med Genet. 1978. Vol. 1. P. 309-317.

125. Zakian S.M., Kulbakina N.A., Meyer M.N., Semenova L.A., Bochkarev M.N., Radjabli S.I., Serov O.L. Non-random inactivation of the X-chromosome in interspecific hybrid voles // Genet Res. 1987. Vol. 50. № 1. P. 23-27.

126. Zakian S.M., Nesterova T.B., Cheryaukene O.V., Bochkarev M.N. Heterochromatin as a factor influencing X-chromosome inactivation in hybrids of the common vole (Microtinae, Rodentia) // Genetika. 1991. Vol. 27. № 3. P. 425-433.

127. Zhao J., Sun B.K., ErwinJ.A., Song J.-J., Lee J.T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome // Science. 2008. V. 322. P.750-756.

128. Zhang L.F., Huynh K.D., Lee J.T. Perinucleolar targeting of the inactive X during S phase: evidence for a role in the maintenance of silencing // Cell. 2007. Vol. 129. P. 693-706.

Информация о работе

Малахова, Анастасия Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Центр инактивации X-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы