Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей инактивации родительских Х хромосом у самок межвидовых гибридов полевок рода Microtus

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей инактивации родительских Х хромосом у самок межвидовых гибридов полевок рода Microtus"

РГ6 од

о ^ ' пп

0'С\С' И ИСКАН АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

На правах рукописи УДК 570.16:599.74.4

С9/

I

/л

'У НЕСТЕРОВА ТАТЬЯНА БОРИСОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИНАКТИВАЦИИ РОДИТЕЛЬСКИХ X ХРОМОСОМ У САМОК МЕЖВИДОВЫХ ГИБРИДОВ ПОЛЕВОК РОДА Мхскотиз

Генетика - Q3.oo.ie

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1993

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Научный руководитель:

доктор биологических наук С.М.Закиян

Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Оффициальные оппоненты:

доктор биологических наук Е.С.Беляева

Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

доктор биологических наук В.Н.Стегний

НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, г.Томск

Ведущее учреждение

Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Защита состоится _ 1993 г. на У/н/ЖМ-ССиС^

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) в Институте ^цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан " п 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета ._/

доктор биологических наук ———' А.Д.Груздев

Актуальность темы. Изучение феномена инактивации X хромосом у самок млекопитающих началось в 1961 году, когда М.Лайон высказала ' гипотезу о дозовой компенсации генов, локализованных в X хромосомах млекопитающих. Несмотря на большое число фактов, описывающих этот феномен и однозначно доказывающих его существование, молекулярные основы процесса остаются до сих пор нераскрытыми. Привлечение в эксперименты нетрадиционных моделей, демонстрирующих нарушения в системе случайной инактивации родительских X хромосом, характерной для большинства изученных видов высших млекопитающих, может стать недостающим звеном для понимания механизмов регуляции экспрессии генов, локализованных в X хромосомах. Единственное существенное препятствие для широкого .использования таких моделей в молекулярно-генетических исследованиях заключается, как правило, в отсутствии частной генетики этих объектов. Поэтому развитие частной генетики, в особенности, построение онтогенетических карт X хромосом животных, используемых в экспериментах, важно для изучения молекулярных механизмов наблюдаемых явлений. Помимо этого картирование X хромосом вносит существенный вклад в сравнительные исследования закономерностей эволюции X хромосом млекопитающих. Расширение списка видов с известной локализацией генов X хромосомы представляется очень важным.для восстановления более полной картины эволюции X хромосом и реконструкции X хромосомы у общего предка млекопитающих.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение особенностей инактивации X хромосом у самок гибридов полевок рода щеголе и поиск возможных механизмов наблюдаемых явлений. Исходя из этого конкретные задачи настоящего исследования состоят в следующем.-

1. Изучение особенностей инактивации родительских X хромосом в соматических тканях у самок гибридов между 4 видами полевок рода шсго^з

2. Изучение характера инактивации родительских X хромосом в экстраэмбриональных тканях у самок гибридов между

Н.вгуаНз И Н.виЬагУаНз

3. Получение гибридов соматических клеток между облученными различными дозами первичными фибробластами полевок

M.eubarvaHe И К.к Irgieorua С ИНТЭКТНОЙ КЛ в ТОЧНОЙ ЛИНИвЙ

фибробластов мыши. 4. Анализ сохранения генов gala, gbpo, hprt и pgk полевки в

полученных гибридных клонах, s. Определение порядка генов gala, gbpd, hprt и pgk и

относительных расстояний между ними у полевок м.oubarvaHs

И N.Iclrglsorua.

Научная новизна. Впервые обнаружен неслучайный характер инактивации родительских X хромосом у самок гибридов полевок рода Microtua. Установлено, что неслучайность инактивации в соматических тканях гибридов коррелирует с присутствием блоков гетерохроматина на этих X хромосомах. Высказана гипотеза о влиянии гетерохроматина на инактивацию родительских X хромосом. Сформулирована гипотетическая модель • инактивации, объясняющая наблюдаемую в экспериментах неслучайность инактивации X хромосом, несущих блоки гетерохроматина. Получены радиационные гибриды соматических клеток между фибробластами полевки и мыши. Определены порядок и относительные расстояния между генами gala, G6Pd, hprt и PGK у полевок двух видов - H.eubarvalls и М.klrgisorum. Практическая ценность. Полученные в работе результаты используются при чтении лекций и проведении практических занятий в Новосибирском Государственном Университете. Результаты работы, а также предложенная гипотетическая модель инактивации X хромосом, имеют теоретическое значение для дальнейшего изучения механизмов регуляции экспрессии генов в онтогенезе млекопитающих.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и представлены на съездах ВОГИС (1987, 1992), hi Школе-семинаре по генетике и селекции животных (1989), Международном конгрессе по изоферментам (1992), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 7 научных статей в отечественной и зарубежной печати. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, разделенных на параграфы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы /£Ь страниц, 6 таблиц и 20 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные. Полевки рола Microtue были отловлены в природных популяциях в Ленинградской области, в Туркменской, Казахской, Армянской Республиках и в дальнейшем разводились в виварии Института. Работа проведена на гибридах между 4 видами этого рода.- M.arvalls, М. subarval is, Н. k1rglsorura, И. transcasplcus. Клетки и клеточные культуры. В работе использовали перевиваемые фибробласты мыши линии mphi , дефицитные по активности фермента гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (hprt, К.Ф.2.4.2.0), культуру первичных фибробластов легкого и клетки костного мозга самцов полевок m.eubarvalis и M.klrgl-вогиш. Линию mphi получали из перевивных фибробластов мыши линии мр по методике, предложенной Шарп с соавт. (Sharp at ai, 1973). Линия клеток мр возникла в результате длительного пассирования первичных фибробластов легкого самца мыши конгенной линии pgk st (Pgka), полученных методом трипсинизашга (Хаймэн > Полдинг, 197в).

Условия культивирования. Все клеточные культуры, используемые

в работе, выращивали'в среде Наш*s F12 с добавлением юз эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) при температуре 37°с в атмосфере воздуха с 55 сог. Линию mphi в течение нескольких дней до гибридизации культивировали в среде с добавлением б-тиогуанина (6ТГ) в конечной концентрации ю мкг/мл для удаления возможных ревертэнтов hprt+. Последние г пассажа перед слиянием клетки растили на среде, не содержащей вТГ. Среду с бТГ в той же концентрации использовали в эксперименте с возвратной селекцией для определения у полевки M.subarvalis группы сцепления генов hprt, pgk, gbpd ' и gala. Гибридные клетки мышьхполевка выделяли и выращивали на селективной среде hat.

Гибридизация соматических клеток. Гибрида между клетками костного мозга самца м.subarvalis и культурой фибробластов мыши линии mphi получали полиэтиленгликоль (ПЭГ)-индуцированным слиянием. Гибридные колонии отбирали через 7-ю дней. Клетки наращивали до 5 млн. на среде нлт. Перед биохимическим анализом клетки снимали с субстрата с помощью раствора трипсин—edta, промывали и хранили в виде клеточных осадков при —70°с до использования.

Облученные первичные фибробласты самца полевки, получившие дозы 20, зо и 40 j kg",1 использовали для получения гибридов с клетками линии mphi.

Электрофорез проводили в 14* крахмальном геле. Буферные системы и условия электрофореза описаны ранее (Zakijan et ai, 1984). Гистохимическое выявление изоферментов hprt, «-галак-тозидазы (gala, К.Ф. 3.2:1.22), глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы (g6pd, К.Ф. 1.1.1.49) и фосфоглицераткиназы ipgk, К.Ф. 2.7.2.3) проводили методами, описанными Харрисом и Хопкинсо-ном (Harris & Hopkinson, 197в) с нашими модификациями. Определение специфической активности G6PD в эритроцитах всех использованных в работе видов обыкновенной полевки проводили по методике, описанной ранее (Serov & Zakijan, 1977). Экстраэмбриональные ткани и органы эмбрионов брали у гибридов на 14 день после оплодотворения.

I Цитогенетический анализ. Препараты метафазных хромосом ГОТОВИЛИ ПО стандартному методу (Rubtsov et al, 1981). g-окраску метафазных хромосом проводили по методу, описанному Графодатским и Раджабли (1988). Для окраски структурного гетерохроматина использовали метод, предложенный Самнером (Sinner, 1972). Цитогенетическое выявление неактивной X ХРОМОСОМЫ ПРОВОДИЛИ ПО Методу КаНДа (Kanda, 1973).

Статистический анализ. Результаты экспериментов, представленные численностями разных клонов, были обработаны программой КНМАР (Гинзбург и др., 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ИЗУЧЕНИЕ ИНАКТИВАЦИИ РОДИТЕЛЬСКИХ X ХРОМОСОМ У ГИБРИДНЫХ ПОЛЕВОК ГОДА MICROTUS .

1.1. Характеристика экспериментальной модели В качестве экспериментальной модели были использованы гибриды между 4 видами полевок ИЗ группы Mlcrotus arvalls. Недостатками этой модели являются отсутствие лабораторных линий, скудность данных по частной генетике, большие трудности в . получении гибридного потомства, а также стерильность гибридов т . Однако она обладает и неоспоримыми преимуществами. Различия по электрофоретической подвижности, по крайней мере, по одному из ферментов (gbpd или gala), гены

которых локализованы в X хройосоме, позволяют проследить проявление изучаемых генов у исследуемых гибридных' самок. Кроме того, в диплоидном наборе у всех а видов полевок

половые хромосомы цитологически хорошо идентифицируема п различаются по величине, а также, по размеру и расположения на хромосоме блоков гетерохроматкпа (Рпс.и. "Таким"образомГ при изучении инактивации X хромосомы у самок гибридов \мы располагаем как биохимическими, так и цитологическшя маркерами.

б

а

Рис.1 '

С-окраска половых хромосом у четырех видов полевок.

я, И.subarval1 а; Ь, к.trsnsoaBplous; с, И.klrgieorun;

d, Н.arvaiis

1.2. Экспрессия Х-сцеплениых генов у гибридов между к.arvaiis и остальными видами Были получены гибриды между 4 видами полеЕок, имение различные комбинации родительских X хромосом.

Характер расщепления гомологичных генов g6pd и gala во всех исследованных комбинациях межвидовых скрещиваний показал X хромосомную локализацию исследуемых генов у полевок M.erva-lis, й.subarvalia, М.kirglsorun И M.transcaoplcua.

Анализ электрофоретических спектров gspd в эритроцитах гибридных самок, полученных от скрещивания м.arvaiis и м.впь-arvaiis выявил очевидное преобладание формы gspd M.arvaiie. Такое проявление не зависело ни от направления скрещивания,

ни от исследуемой ткани. Практически гемизиготная экспрессия

гена G6pd м.агvails наблюдалась в печени, сердечной и скелетной мышцах у большинства исследованных гибридных самок. Аналогичные результаты были получены и для фермента gala, во всех трех комбинациях скрещиваний с участием M.&rvaiis. У всех проанализированных животных наблюдалась преимущественная

ЭКСПреССИЯ Гена X ХРОМОСОМЫ M.arvaiis.

Т.о. при анализе электрофоретических спектров gbpd и/или gala во всех случаях, когда в гибридизации в качестве одного партнера участвовал вид, содержащий блок гетерохроматина на X хромосоме, а в качестве другого - M.arvaiis, X хромосома которого не содержит такого блока, мы наблюдали преимущественную экспрессию генов X хромосомы M.arvaiis (Табл.1).

Мы проанализировали возможные причины наблюдаемого феномена. Было показано, что преимущественная экспрессия генов X хромосомы M.arvaiis не вызвана различиями в специфических активностях gspd у исследуемых видов. Различия В темпах эмбрионального развития между M.arvaiis И М.subarva-iis также не могут быть причиной различной фенотипической экспрессии родительских -генов gbpd и gala у исследуемых гибридов, т.к. все стадии эмбриогенеза у этих видов совпадали. Кроме того, не было обнаружено никаких различий между спектром gbpd и gala у e.s-, 7.5-, э, ю и 17-дневных самок эмбрионов и у взрослых животных, полученных от скрещивания M.arvaiis х М.subarvalis. ПОСКОЛЬКУ ИНЭКТИВаЦИЯ X хромосомы происходит на 5.5-й день после оплодотворения, то маловероятно, чтобы наблюдаемые смещения родительских X хромосом ОТ соотношения 1:1 у гибридов могли возникнуть в результате селекции клеток с активной X хромосомой M.subarva-•iis за 1-2 клеточных цикла с момента инактивации X хромосомы.

1.з Экспрессия Х-сцепленных генов у гибридов между видами с блоками гетерохроматина на X хромосомах Полученные данные позволили нам предположить, что наблюдаемая преимущественная экспрессия генов X хромосомы M.arvaiis у ГИбрИДОВ M.arvaiis х М.subarvalIs, M.arvaiis х M.trans-casplcus И M.arvaiis x M.klrglsorum вызвана преимущественной инактивацией X хромосом M.subarvalls, М.transcasplcus И M.klrglsorum соответственно. Принимая во внимание структурные

в

Таблица 1

Суммарные данные относительной экспрессии X хромосом,

полученных от матери и от i отца (хт и хр)

Скрещивания Маркер Неактивная X хромосома

(самка х самец! Ткани взрослых Эмбрион Желточный

самок мешок

H.arvalls х Kanda хр > X (77S Хр)

М.Bubarvalls* G6PD хр > X" хр > хт

GALA X" > X" хр > X"

fí. su&arvallo* Kanda vfl» л > хр (858 X")

х H.arvalls G6PD X" > хр X" > Хр Хр» X"

GALA X" > хр X" > хр

М.Bubarvalls* х Kanda X" Ж хр (54* X")

М. transcasplcus* G6PD X" 3 хр

М. transcasplcus* Kanda X" 3 хр (47* X")

* M.aubarvalls* G8PB X" = хр

H.blrglsorun" x Kanda V« л > X р (83S X")

H.агvallo GALA X* > хр

M.klrglaorum' x G8PD X" £ хр

И.subarvallss

M.transcssplcuc* Kanda X" > хр (79S X"J

x H.arvalls GALA X" > х»

M.trsnscasplcuo* GALA Х- = хр

я Н. Mrglsorun

* х хромосома имеет блок конститутивного гетерохроматина.

различия X хромосом у 4-х видов полевок, мы выдвинули гипотезу, что именно гетерохроматин, локализованный блоками различной величины в прицентромерном (м.1гапвсавр1сив, к.иг-д1вогии) ИЛИ теломерном (Н.виЬагуаПв) районах Х-хромосом, является причиной, вызывающей преимущественную инактивацию ЭТИХ хромосом у гибридов с М.агУаНв.

Исходя из гипотезы, предполагалось, что в случае, когда оба вида, участвующие в гибридизации, содержат на X хромосомах блоки гетерохроматина, будет наблюдаться случайная инактивация каждой из родительских X хромосом. Для проверки ЭТОГО предположения бЫЛИ ПОЛучеНЫ ГИбрИДЫ МеЖДУ H.eubarvalis Н Н.transcasplcus, M.klrglsorum И И.transcasplcus, И M.subar-vmllB и M.klrglsorum. При анализе ферментативных спектров OOPD ГИбрИДОВ M.subarvalls х М.transcasplcus И M.subarvalls х íí.kirgieoruja, действительно, было показано примерно равное соотношение родительских форм ферментов. Аналогично, равное соотношение родительских форм gala было получено у гибрида И.transcasplcus х M.klrglsorum, ЧТО вполне согласуется С высказанной гипотезой (Табл.1).

1.4 Цитологический анализ гибридных самок Результаты цитологического анализа гибридов по методу Канда, позволяющему дифференциально выявлять в клетке активную и неактивную X хромосомы, приведены в таблице 1. У гибридных самок, полученных в различных комбинациях скрещиваний с участием M.arvaiis, в большинстве клеток (7988«) в неактивном состоянии находится X хромосома, содержащая блок гетерохроматина. Анализ реципрокных гибридов M.transcao-picue х M.subarvalls показал, что неактивные X хромосомы обоих родителей встречаются примерно в равных соотношениях. Следовательно, результаты, полученные цитологически, подтверждают данные биохимического анализа. .

1.б.Инактивация родительских X хромосом в экстраэмбриональных мембранах гибридов полевок M.arvalls х H.subarvallB Как известно, в экстраэмбриональных мембранах грызунов происходит преимущественная инактивация отцовской X хромосомы, в отличие от случайной инактивации родительких X хромосом, характерной для их соматических тканей (Takagi & Saaakl, 1975). Поэтому для нас значительный интерес представляло выяснение вопроса, какой механизм будет преобладать в желточном мешке гибридов полевок, демонстрирующих неслучайную инактивацию X хромосомы с блоком гетерохроматина,

- неслучайной инактивации отцовской X хромосомы, как и у других грызунов, или преимущественной инактивации, вызванной присутствием--"" блока гетерохроматина? Электрофоретический анализ спектра gbpd в желточных мешках 14-дневных эмбрионов гибридных самок ОТ скрещиваний о M.subarvalla х о M.arvalls выявил преимущественную экспрессию материнской формы gbpd, т.е. экспрессию гена X хромосомы M.subarvalla. При анализе .же спектра ggpd в различных органах этих эмбрионов мы наблюдали преимущественную экспрессию X хромосомы ü.arvaiin, как и в органах и тканях взрослых животных (Табл.1).

яолзгг^м, "то получзнныз в этом эксперименте результата согласуются с гипотезой о неслучайности инактивации родительских X хромосом в экстразмбриональных мембранах грызунов (Cartier a Riggs, 1983J. В рамках этой гипотезы предполагается, что различный импринтинг родительских X хромосом во время гаметогенеза вызывает различия в молекулярных механизмах инактивации в экстраэмбриональных ■ и соматических тканях. Таким образом, отличительной чертой этого эксперимента является то, что гетерохрсматин пе "К83КВ36Т влияния на инактивацию X хромосом в зкстраемб-•люяаяьных тканях гибридов полевок, которое мы наблюдали в .■om-::t:;-'¿gckiíx ::'ннях. Полученные данные свидетельствуют з ::ользу предположения, что механизмы инициации и поддержания ••¡■нактивацик s экстразмбриональных и соматических тканях отличаются, скорее всего, на молекулярном уровне.

.";. АНАЛИЗ ВОЗМОЖНЫХ МЕХАНИЗМОВ ИНАКТИВАЦИИ á ХРОМОСОМ У ГИБРИДНЫХ ПОЛЕВОК 2.1. Различные йякторн, способные вызвать нвблюлэемчй Феномен Мы рассмотрели уже несколько факторов, которые могли бы вызвать неслучайную экспрессия родительских X хромосом у гибридов в комбинациях скрещиваний с участием M.arvalls. К их числу относятся клеточная селекция, темпы эмбрионального развития и уровни специфической активности ферментов у исследуемых видов. Последствия отдаленной гибридизации и наличие каких-либо цис-действукщих факторов, типа Хсв локуса, описанного у мышей, также могли привести к наблюдаемому нами феномену неслучайной инактивации. В работе подробно рассмат-

ривается возможность влияния этих факторов. Для обсуждения привлекаются результаты оценки степени генетического родства мевду видами, используемыми в экспериментах. Учитывая, что наиболее близкие родственные взаимоотношения установлены между н.агуапв и и.виЬагуа11в, и наиболее отдаленные - у всех видов с м.Ыгд1вогит, очень трудно объяснить наблюдаемые отклонения от случайной инактивации при гибридизации внутри группы наиболее близкородственных видов и случайную инактивацию при гибридизации н.гт'апвсаврхсив и и.виЬагуа11а с наиболее удаленным видом м.к1гд1вогио. Исходя из изложенного, в работе высказано предположение, что ни один из рассмотренных факторов, вероятнее всего, не является первопричиной наблюдаемого феномена. Однако, для окончательного ответа на этот вопрос необходимы прямые эксперименты, а именно, результаты семейного анализа для всех полученных гибридов. К сожалению, стерильность гибридов во всех комбинациях скрещиваний не позволяет в настоящее время проверить это предположение.

Таким образом, проведенный анализ позволяет заключить, что гетерохроматин, локализованный блоками в различных районах Х-хромосом исследуемых видов, в настоящее время является наиболее вероятным фактором, влияющим ни инактивацию родительских X хромосом у самок гибридов полевок. К возможному механизму его влияния мы переходим в следующей главе.

2.2. Модель инактивации X хромосомы у гибридных полевок

Несмотря на большое разнообразие предложенных моделей инактивации X хромосом, ни одна из них не дает адекватного представления о рассматриваемом феномене. В рамках существующих гипотез невозможно объяснить и наши результаты, полученные при изучении Х-инактивации у гибридов полевок. Поэтому в данном исследовании мы предприняли попытку разработать новый гипотетический механизм Х-инактивации, который был бы в состоянии объяснить феномен неслучайной инактивации X хромосом у межвидовых гибридов полевок.

В основе предлагаемой модели Х-инактивации лежат следующие предположения, подробно обсуждаемые в диссертации:

1. У полевок рода Шсгогив существует центр инактивации Х1С.

2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая центр инакти-

зашш, включает в себя повторяющуюся ДНК, которая в определенных условиях может выполнять функцию центра, нуклеации X -хромосомы.-------------- ------------------------------

3. Гетерохроматин оказывает воздействие не на всю X хромосому, а только на специфические последовательности, локализованные в центре инактивации, и исключительно в момент инициирования этого процесса. Удаленность Х1С от блока гетерохроматина является существенным фактором в инициировании инактивации той или иной хромосомы.

4. Высококооперативное связывание специфических негистоновых белков с центром инактивации рассматривается как ключевой момент компактизации X хромосомы.

Суть нашей гипотезы заключается в следующем. На ранних стадиях эмбриогенеза у млекопитающих происходит упаковка гетерохроматических районов хромосом в оформленные блоки, и вдоль хромосом, имеющих такие районы, будет наблюдаться направленный поток белков, участвующих в упаковке. Специфическое связывание негистоновых белков с последовательностями гетерохроматина в процессе их компактизации вызывает неспецифическое изменение в белок-связывающей способности центра инактивации. Это может быть конформационный переход последовательностей центра инактивации или повышение сродства связывания XI с к специфическим белкам-компактизаторам. В результате белки, ответственные за Х-инактивацию, специфически связываются с центром инактивации и вызвают распространение. инактивации вдоль X хромосомы, вследствие высокой кооперативности белковых взаимодействий. Таким образом, в данной модели мы отводим гетерохроматину роль неспецифически действующего активатора нуклеации последовательностей центра инактивации хромосом, на которой он локализован, для объяснения большей вероятности связывания белков, с центром инактивации этой хромосомы по сравнению с - хромосомой, лишенной блока гетерохроматина.

Рассмотренный выше механизм инактивации, по нашему мнению, объясняет результаты, полученные в наших экспериментах на полевках рода м1сгойив. Однако, из-за недостатка экспериментальных данных в настоящее время мы не можем исключить возможность того, что наблюдаемый феромен

обусловлен действием каких-то иных факторов, не рассмотренных в данной работе. Поэтому накопление данных в этой области может послужить существенным шагом в понимании механизмов, лежащих в основе инактивации.

3. УСТАНОВЛЕНИЕ СЦЕПЛЕНИЯ И ПОРЯДКА ГЕНОВ GALA.G6PD, HPRT И PGK НА X ХРОМОСОМЕ У ДВУХ ВВДОВ ПОЛЕВОК РОДА MICROTUS В этой главе мы представляем данные по установлению первой группы сцепления на X хромосоме у полевок рода Microtis и результаты картирования X хромосомы у двух видов этого рода - н.subarvaiis и M.kirgieoruo. Картирование X хромосом у полевок рода Microtus представляет для нас особый интерес, поскольку создает основу для дальнейших исследований обнаруженного явления неслучайной инактивации родительских X хромосом в некоторых комбинациях межвидовых скрещиваний полевок. Но помимо частного интереса к этой проблеме, подобные исследования важны в плане сравнительного изучения эволюции X хромосом в различных отрядах млекопитающих.

3.1. Установление группы сцепленйя генов gala, g6PD. hprt и pgk у полевок Mlcrotue «чЬагуаПв.

Семейным анализом потомства от реципрокных скрещиваний H.arvalls х M.subarvalis бЫЛО ПОКаЗЭНО, ЧТО Г6НЫ G6PD И gala

у этих двух видов локализованы в X хромосомах. ^Отсутствие внутривидового полиморфизма генов pgk и hprt, а также изоферментных вариантов pgk и hprt между M.arvalls и M.subarvalis, не позволило анализом родословных установить принадлежность этих генов к X хромосоме. Поэтому мы использовали гибридизацию соматических клеток полевка х мышь для установления хромосомной локализации pgk и hprt у полевок M.eubarva-' lie. Результаты этого эксперимента позволяют утверждать, что гены hprt и pgk локализованы^ в X хромосоме h.subarvaiie. Гибридизация in situ радиоактивно меченых зондов для генов hprt и pgk на метафазных хромосомах полевок M.subarvalis подтвердила Х-хромосомную локализацию этих генов. Таким образом, результаты этих экспериментов позволяют заключить, что первая группа сцепления у полевки M.subarvalis включает гены g6pd, gala, hprt и pgk, локализованные в X хромосоме.

3.2 Определение порядка генов gala, gspd. hprt и pgk У полевок HlerotUB subarvalls и MlcrotUB blrglsorua

Лля определения порядка исследуемых генов у полевок был использован метод радиационного картирования, основанный на способности ионизирующей радиации индуцировать разрывы хромосом. Анализ частот сегрегации маркеров хромосом полевки в гибридах соматических клеток, полученных от слияния облученных различными дозами радиации фибробластов полевки с янтактной линией фибробластов мыши mphi, позволяет оценить порядок кодирующих их генов на хромосоме, т.к. чем теснее сцеплены гены, тем больше вероятность их совместного сохранения в гибридных клонах. Результаты электрофоретэтеско-го анализа изоферментов в гибридах соматических клеток свидетельствуют, ЧТО gala, g6pd И pgk M.eubarvalla сохранялись В клонах с различной частотой (Табл.а). Кроме того, в подавляющем большинстве клонов был обнаружен взаимозависимый характер сегрегации gala и gspd и независимый - для pgk. и g6pd, а также для pgk и gala, что позволило предположить следующий порядок генов на X хромосоме M.subarvaiie: pgk-hprt-G6pd-gala. Статистическая обработка полученных результатов подтвердила этот порядок как единственный из 12 возможных, удовлетворяющий трем критериям, введенным в нашей статистической модели (Гинзбург и др., 1эзз).

Таблица 2

\

Численности гибридных клонов, полученные в экспериментах

Экспе- Доза nD Численности клонов

римент J kg" ■ 1 4 .1 noi 1 n.o, nooi "no noio ri__ Î 0 0 nooo

Mierotus 20 37 26 2 0 0 1 2 1 5

subarvalIs 30 46 30 3 0 0 5 1 : 3 1

40 66 34 13 1 0 4 6 2 в

Mlcrotue klrglsoruo 30 75 54 8 3 0 4 2 2 2

Чье - ГДе a - PGK, b - G6PD, с - GALA

Более сложная ситуация возникла при определении порядка исследуемых генов у полевок M.kirgisorum (Табл.2). Из 12 возможных статистические критерии не отвергли три генных порядка, которые можно сравнить по степени правдоподобия. Порядок pgk-hprt-g6pd-gala оказался правдоподобнее порядка

pgk—g6p.d-hprt-gala и ПОрЯДКЭ pgk-gala-hprt-g6pd В 10 И 12.6

раза, соответственно. Эти соотношения не очень велики, чтобы безоговорочно предпочесть первый порядок (такой же, как для м.subarvaiis), поэтому для окончательного решения о порядке этих генов у полевок M.kirgisorum необходимы дополнительные исследования. Интересно отметить, что если принять порядок pgk-hprt-g6pd-gala для M.kirgisorum, т.е. такой же, кэк для м.subarvaiis, то оказывается, что и относительные расстояния между этими четырьмя генами одинаковы у двух исследуемых видов.

з.з Сравнение порядков генов G6pd. pgk, gala и hprt на X хромосомах некоторых видов млекопитающих

Суммируя все известные к настоящему времени данные о расположении генов gbpd, pgk, gala и hprt на X хромосомах у человека (Goes г Harris, 1977), мыши (Genetic Maps, 1990), норки (Zhdanova et al, 1988), Двух видов сумчэтых (Dobrovlc в Graves, 1986; Dawson & Graves, 1986) и двух видов п0л6в0к,

можно заключить, что для эволюции предковой X хромосомы млекопитающих характерны многочисленные внутрихромосомные перестройки. X хромосомы человека и мыши разделяются более чем двумя перестройками; требуется как минимум одна инверсия, чтобы вывести порядок генов, характерный для норки из порядка генов, установленного для человека. Сравнение генетических карт у трех видов отряда грызунов - двух видов полевок и мыши - выявляет удивительный феномен, свидетельствующий о том, что перекомпановка генетического материала в«эволюции X хромосом происходила даже внутри одного отряда млекопитающих. Как минимум две инверсии разделили X хромосомы мыши и полевок в эволюционном процессе. Вероятно, линейный консерватизм X хромосомы характерен только для видов, недавно дивергировавпшх друг от друга, как мы обнаружили для полевок рода Microtus. Однако, даже сходный порядок 4 генов у м.виь-

arvaiis и M.kirgisorun не дает гарантии идентичности их X хромосом, поскольку сравнение G-бэндинга у этих видов

выявляет значительные расхождения в исчерченности X хромосом. _____

Кроме того, в настоящее время, к сожалению, мы не можем сообщить ориентацию установленной группы сцепления относительно центромеры на X хромосомах исследуемых видов. Вполне возможно, что даже внутри одного рода происходили хромосомные инверсии, захватывающие большие участки хромосомы.

ВЫВОДЫ

1. Анализом спектров gbpd и/или gala у самок межвидовых гибридов полевок рода Microtus показана преимущественная экспрессия генов X хромосомы M.arvaiis при- гибридизации этого вида с остальными исследуемыми видами. Равная экспрессия генов gbpd и gala выявлена у гибридных самок во всех комбинациях скрещиваний М.subarvaiis, M.klrglsorum и Н.transcasplcus.

2. На основании сравнения спектров gbpd и gala у эмбрионов различных возрастов и у взрослых животных, полученных от скрещивания M.arvaiis X М.subarvaliз, уСТЭНОВЛОНО отсутствие селективного преимущества клеток с активной X хромосомой M.arvaiis над клетками с активной X хромосомой

Я.oubarvalia.

3. Установлено, что наблюдаемая преимущественная экспрессия генов X хромосомы M.arvaiis у гибридных самок вызвана преимущественной инактивацией X хромосом м.subarvaiis, И.transcasplcus И M.kirgtsorum при ГИбрИДИЗЭЦИИ ЭТИХ ЕНДОВ с M.arvaiis. Случайный характер инактивации X хромосом М.subarvaiis, М.transcasplcus и H.klrgisorua установлен у гибридных самок при гибридизации этих видов между собой.

4. Сформулирована гипотеза о влиянии гетерохроматина, локализованного блоками в различных районах X хромосом у исследуемых видов полевок, на вероятность инактивации родительских X хромосом в соматических тканях самок гибридов полевок.

s. Установлено, что гетерохроматин не оказывает влияния на инактивацию X хромосом в экстраэмбриональных тканях гибридов полевок, которое наблюдается в соматических

тканях этих же животных. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения, что молекулярные механизмы инициации и поддержания инактивации в экстраэмбриональных и соматических тканях различны.

е. Проанализированы возможные механизмы влияния гетерохрома-тина на процесс инактивации X хромосом. Предлагается гипотеза, согласно которой изменение в белок-связываюшей способности центра инактивации, возникающее вследствие компактизации гетерохроматиновых блоков X хромосомы, способствует связыванию с ним специфических белков и может объяснить большую вероятность связывания белков с центром инактивации этой хромосомы по сравнению с хромосомой без блока гетерохроматина.

7. Установлена первая группа сцепленных генов gala, gepd, hprt и pgk на X хромосоме полевок Mlcrotus subarvalls. Определен порядок этих генов на X хромосомах двух видов полевок Н.subarvalls И М.klrglsorum. На ОСНОВаНИИ полученных результатов порядок картируемых генов pgk-hprt-g6pd-gala признан КЭК единственно ВОЗМОЖНЫЙ ДЛЯ М.subarvalls и как наиболее правдоподобный для н.klrglsorum.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жданова Н.С., Пак С.Д..Нестерова Т.Е..Мазурок Н.А.,Градов А.А., Серов О.Л. Расположение четырех генов («-gal, pgki, hprt и G6PD) на X хромосоме американской норки (Musteia vlson) // Генетика. 1988. Т.24. N8. С.1448-1455.

2. Zhdanova H.S., Pack S.D., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Gradov A.A., Serov O.L. Subchromosomal localization and order of GLA, PGK1, HPRT and G6PD loci on the X chromosome of the American mink (Musteia vlson) // Cytogenet. Cell Genet. 1988. V.48. P.2-5.

3. Закиян C.M., Нестерова Т.Б., Черяукене О.В., Бочкарев М.Н. Гетерохроматин как фактор, влияющий на инактивацию X хромосомы у гибридов обыкновенной полевки (Mlcrotldae, Rodentla) // Генетика. 1991. Т.27. НЗ. С.425-433.

4. Zaklan S.M., Nesterova Т.В., Cheryaukene O.V., Bochkarev M.N. Heterochronatln as a factor affecting X-lnactlvatlon In Interspecific female vole hybrids (Mlcrotldao, Rodan-tia) // Genet.Research. 1991. У.58. »2. P.105-110.

5. Закиян C.M., Нестерова Т.Б. Структурный гетерохроматин и инактивация X хромосомы // Генетика. 1992. Т.28, Н12, С.18-30.

8. Нестерова Т.Б., Мазурок Н.А., Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Янцен Е.И., Гинзбург Э.Х., Закиян С.М. Установление сцепления и порядка генов gala, gspd, hprt и pgk на X хромосоме у двух видов полевок рода Microtus // Генетика. 1ЭЭЗ. Т.29. N9. в печати

7. Гинзбург Э.Х., Свищева Г.Р., Юданин А.Я., Нестерова Т.Б., Закиян С.М. Статистическое обеспечение метода радиационного картирования // Генетика. 1ээз. Т.29. нэ. в печати