Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный цитогенетический анализ четырех видов обыкновенных полевок рода

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный цитогенетический анализ четырех видов обыкновенных полевок рода"

,г6 ОЛ

- а <да «96

На правах рукописи УДК 575.853 316.7:599.323

МАЗУРОК Нинл Алексеевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЧЕТЫРЕХ ВИДОВ ОБЫКНОВЕННЫХ ПОЛЕВОК РОДА МЮЮТиБ (ЯООЕ^ПА, АЯУ1СОЬЮАЕ)

Генетика 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

С.М.Закиян

Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Е.С.Беляева

Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

доктор биологаческих наук, профессор Л.В.Высоцкая

Новосибирский государственный

университет

г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт проблем экологии и эволюции

им. А.Н.Северцова РАН, г.Москва

Защита состоится "^//Р" АйТг 1996 г. на У^Я^Ыт заседании диссертационного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " ¿¿^^/¿^¿Т) 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Л———^^

доктор биологических наук А.Д.Груздев

\

Актуальность темы. Генетические механизмы, лежащие в основе эволюции видов млекопитающих, изучают главным образом путем сравнения генетических различий между современными близкими видами. Такие сравнения проводят на разных уровнях организации генома, в том числе на хромосомном. Сравнение кариотнпов разных видов помогает в реконструкции числа и типа хромосомных перестроек, произошедших за время дивергенции данных видов. Такач реконструкция стала возможной после разработки методов дифференциального окрашивания хромосом. Точность исследований значительно повышается при использовании в анализе дифференциально окрашенных слабоконденснровашшх хромосом.

Взятая нами для изучения группа близкородственных видов М.ш каш относите« к серим полевкам. Серые Пилезки сравни'ельно недавно начали интенсивно дивергировать (Громов, Поляков, 1977). За короткое время у многих фенотипически сходных видов произошла быстрая перестройка хромосомного аппарата. О филогении в группе ¡\ficrotiis атаИ$ ($ирегзрес1е$) невозможно судить по каким-либо морфологическим признакам и палеонтологическим сведениям. Поэтому важное значение имеют попытки проследить родственные связи обыкновенных полевок по особенностям их хромосомных наборов (Малыгин, 1983; Мейер и др.. 1985; Малыши, Слблина, 1994)!

Анализ цнтогенетичесхих различий мсаду современными видами полевок группы М.аггаИз и выйсн^чие генетических механизмов, лежащих в основе эволюции и видообразования в яэшгой группе видов, могут дагь дополнительную информацию для понимания эволюционного процесса у млекопитающих. Исследование кариотипов полевок группы АИсгош$ аг\>аИ$ (шрег.чрас1е5) при высоком уровне разрешения в-дифференциального окрашивания хромосом представляет интерес как в общетеоретическом плане, так и с точки зрения дальнейшего развития работ по частной цитогенетике каждого из изученных видов.

В течение последних лет полевки группы М.агмаИк служат в нашей лаборатории экспериментальной моделью для изучения феномена неслучайной инактивации Х-хромосом. Однако невозможно далеко продвинуться вперед в понимании молекулярных основ наблюдаемых явлений без развития частной генетики, в особенности, без построения цитогенетической карты Х-хромосом исследуемых

видов. Подобные работы вносят также существенный вклад в сравнительные исследования по изучению закономерностей эволюции Х-хромосом млекопитающих и реконструкции Х-хромосомы у общего предка млекопитающих.

цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является проведение сравнительного цитогенетического анализа четырех видов обыкновенных полевок рода Microtus. Исходя из этого конкретные задачи настоящего исследования состоят в следующем:

1. Создание надежных номенклатур хромосом восточноевропейской, закаспийской, обыкновенной и киргизской полевок с использованием GTG-дифференциального окрашивания хромосом на разных уровнях конденсации и построение идеограмм хромосом этих видов.

2. Проведение сравнительного анализа GTG-сегментации хромосом четырех вадов обыкновенных полевок.

3. Установление степени сходства кариотипов сравниваемых видов и построение филогенетического древа, показывающего, в каком порядке происходила дивергенция кариотипов этих видов от общего предка.

4. Установление группы сцепления генов GALA, G6PD, HPRT и PGK1 у полевок Microtus arvalis и M.transcaspicus.

5. Анализ присутствия генов GALA, G6PD, HPRT и PGK1 в гибридных клонах, полученных при слиянии облученных первичных фибробластов полевок M.transcaspicus, М.arvalis и M.kirgisorum с интактной клеточной линией фибробластов мыши. Определение порядка генов GALA, G6PD, HPRT и PGK1 и относительных расстояний между ними у полевок M.transcaspicus, M.arvalis и M.kirgisorum.

научная новизна. Впервые созданы надежные номенклатуры хромосом четырех видов обыкновенных полевок рода Microtus и построены идеограммы хромосом на стадии прометафазы для данных видов. При сравнительном цитогенетическом анализе кариотипов полевок этих видов впервые обнаружена полная гомология всех элементов их кариотипов, а также определены число и типы хромосомных перестроек, произошедших после расхождения этих видов в ходе эволюции. Высказаны предположения о филогенетических взаимоотношениях изучаемых видов. Установлена первая группа сцепления у полевок M.transcaspicus и M.arvalis.

Определены порядок и относительные расстояния между генами GALA, G6PD, HPRT и PGK1 у трех видов полевок - M.transcaspicus, M.arvalis и M.kirgisorum.

Практическая ценность. Полученные в работе результаты необходимы для развития частной генетики данных видов, создают основу для проведения хромосомного и субхромосошюго картирования. Результаты работы также имеют теоретическое значение для изучения генетических механизмов эволюции к видообразования у высших млекопитающих.

Апробация работы. Материалы диссертации бьши доложены м представлены на Всесоюзном совещании "Популяционная изменчивость и проблемы охраны генофонда у'лекошггающи" (Моск^э, 1983), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Публикации. По материалам диссертации автором опубликовано 15 научных статей в отечественной и зарубежной печати. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, разделенных на параграфы, заключения, выводов и списка цитируемой литературы .(207 ссылок). Работа изложена на 172 страницах, иллюстрирована 11 рисунками и содержит 13 тзблин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные. В работе использовали четыре айда полевок группы "arvalis" рода Microtus: M.arvalis, М subarvalis, M.transcaspicus, M.kirgisorum. Животные бьши отловлены и природных популяциях в Ленинградской области (M.arvalis), ч Туркменской (M.transcaspicus) и Казахской (M.kirgisorum) Республиках. Полевки М.subarvalis были отловлены в Новосибирской области (Академгородок) и содержались в виварии Института цитологии и генетики СО РАН. Клетки и клеточные культуры. В работе использовали клет-пт костного мозга и культуры клеток селезенки и первичных фибробластов легкого четырех видов полевок. Культуру клеток селезенки получали стандартным методом (Графодатский, Раджабли, 1988) с небольшими модификациями. Культуры первичных фибробластов легкого получали методом трипсинизации (Хаймэн, Полдинг, 1976) с небольшими модификациями. Также использовали перевиваемые фибробласты мыши линии МРН1, дефицитные по активности фермента гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазы (HPRT, К.Ф.2.4.2.8). Культивирование и гибридизацию соматических

з

клеток проводили по методике, описанной ранее (Нестерова и др., 1993).

Кариологическнй анализ. Препараты метафазных хромосом готовили по стандартному методу (Графодатский, Раджабли, 1988). Дня увеличения числа клеток на стадии прометафазы препараты хромосом готовили с использованием бромистого этидия (Ikeuchi, 1984). Дифференциальное окрашивание хромосом проводили по GTG-методу Сибрайт (Seabright, 1971).

Электрофорез проводили в 14%-ном крахмальном геле с добавлением 10% сахарозы. Буферные системы и условия разделения ферментов описаны ранее (Zakijan et al., 1984). Гистохимическое выявление изоферментов HPRT, а-галактозидазы (GALA, К.Ф.3.2.1.22) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD, К.Ф. 1.1.1.49) и фосфоглицераткиназы 1 (PGK1, К.Ф.2.7.2.3) проводили методами, описанными Харрисом и Хопкинсом (Harris, Hopkinson, 1976) с нашими модификациями. Статистический анализ. Результаты экспериментов, представленные численностями разных клонов, были обработаны программой RHMAP (Гинзбург и др., 1993).

Гибридизацию in situ радиоактивно меченых тритием ДНК зондов дня генов HPRT и PGK1 на метафазных пластинках полевок M.arvalis и M.transcaspicus проводили по описанному ранее методу (Graphodatsky et al., 1992).

Автор выражает признательность А.А.Исаенко, совместно с которой проводилось приготовление препаратов хромосом M.arvalis; Т.Б.Нестеровой и сотрудникам лаборатории генетических основ онтогенеза Н.М.Матвеевой и А.Г.Шилову за проведение культивирования и гибридизации соматических клеток; Н.В.Рубцовой и С.М.Закияну за ценные замечания, высказанные при прочтении рукописи.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. GTG-окраска высокого разрешения хромосом четырех видов обыкновенной поливки M.kirgisorum. M.subarvalis. M.transcaspicus

и M.arvalis

Обыкновенные полевки неоднократно подвергались цитогенетическому анализу (Meyer et al., 1971; Булатова и др., 1978; Малыгин, 1983; Мейер и др., 1985 и др.), однако единого мнения в нумерации хромосомных пар изучаемых видов не было достигнуто. Это объясняется тем, что у обыкновенных полевок многие

хромосомы небольшого размера и имеют мало О-сегмёнтов. Предыдущие исследования проводились на в-окрашенных метафазных Х-хромосомах среднего уровня спиралнзации, который не всегда обеспечивает полную идентификацию всех хромосомных пар, особенно мелких акроцентрических. Для создания четкой номенклатуры хромосом четырех видов обыкновенной полевки мы провели ОТС-окраску хромосом разной степени конденсации. Для всех изучаемых видов были получены составные С-окрашепные кариотипы, представляющие четыре разные степени конденсации хромосом 01 поздней метафазы яо прометафазы. В основном мм придерживались нумерации хромосом, предложенной Раджабли (Мейер и др., 1985). Однако мы внесли несколько и^'егкчгзй, поскольку пром^ч-аФазнг'!' уровень кош&нсации хромосом позволяет более ючно ранжировать определенные пары хромосом по размерам. Это особенно касается самых мелких хромосом. На основе детального изучения хромосом для прометафазного уровня конденсации были построены идеограммы вТО-окрашенных хромосом. Полученный в результате кариотип М.Ы^зогит имеет 524 чередующихся темных и светлых сегмента на гаплоидный набор, \i.subarvalis - 488 сегментов, Млгтзса$р1си.% - 402 сегмента и ."'.агу.яПл - 426 сегментов.

Полученная нами С-сегментация высокого разрешения (400-500 сегментов) и предложенная система распределения и нумерации хромосомных пар создают основу для проведения хромосомного и субхромосомного картирования геномов почезок ро;\ь ШсгоШ.

2. Сравнительное исследование (1ТС-рисунка хромосом четырех видов обыкновенной полепкн 2.1. Структурные перестройки и гомологи;: хромосом обыкновенных полевок Проведенный сравнительный анализ в-окрашенных прометафазных хромосом показал, что все хромосомы изучаемых видов, за исключением гетерохроматиновых У-хромосом, имеют гомологию по в-рисунку с целыми хромосомами или крупными частями хромосом какого-либо другого (других) вида (видов). Нами установлена гомология по б-рисунку дополнительно у 23 хромосом изучаемых видов, по сравнению с данными Мейер и др. (1985), а также снесен ряд существенных изменений в распределение хромосом с установленной ранее гомологией. Кроме того, мы

уточнили возможные пути перестройки кариотипов, происходившие при формировании этих видов и определили хромосомы, участвовавшие в таких перестройках.

Кариотипическая эволюция внутри данной группы шла за счет перекомбинации гомологичных элементов. Эволюция кариотипа в исследованной группе видов определялась тандемными слияниями (центрическими, дентромерно-теломерными и теломерными) очень мелких акроцентрических хромосом, что вытекает из •чюжносоставной природы большинства хромосом у изученных видов.

2.2. Эволюция кариотипов обыкновенных полевок Преобразование кариотипов у полевок идет преимущественно'в сторону уменьшения числа хромосом путем тандемных слияний (Matthey, 1973; Раджабли, Графодатский, 1977; Мейер и др., 1985; Modi, 1987). Следовательно, наиболее примитивным видом в группе "arvalis" является M.subarvalis, имеющий наибольшее число акроцентрических хромосом, к нему очень близок M.transcaspicus. Обыкновенная и киргизская полевка резко отличаются от первых двух видов тем, что среди их аутосом большое число пар представлено двуплечими элементами.

Исследованные виды полевок имеют много сходных по G-рисунку целых хромосом (таблица 1), хотя и отличаются по строению кариотипа. В то же время при одинаковом G-рисунке многие хромосомы различаются по положению центромеры.

Число гомологичных по рисунку G-окраски и морфологии

аутосом у полевок группы "arvalis". _ __Таблица 1

Виды Гаплоидное число M.subarvalis М. transcaspicus М.arvalis M.kirgisorum

M.s. 27 - 22'(172) 11(5) 15(8)

M.t. 26 22(17) - 10(3) 13(8)

М.а. 23 И (5) 10(3) - 13(9)

М.к. 27 15(8) 13(8) 13(9) -

1 - число хромосом, сходных по G-рисунку, но отличающихся по положению

центромеры

2 - число хромосом, идентичных по О-рисунку и положению центромеры

Из приведенных данных следует, что наибольшее число сходных элементов имеется у М.БиЬяга»/« и л/.1гап5са.у71си.г. М.апаИз и ММг%1зоги.т имеют с М.виЬатаНз больше сходных

элементов, чем с МЛгатсаврких^ Это может говорить о том, что предковая форма М.аюаШ и М.Ыг&хогит по кариотипу была ближе к М.хиЬаг\'аИз.

Между хромосомами четырех видов полевок наряду со сходством имеются и различия (таблица 4).

Соответствие хромосом полевок \i.subanalis (Мл), Млгап$саьр1сиь (Мл), М.агуа/15 (М.а) и М.Иг°}*огнт (М.к)

Таблица 4

Д/.х МЛ М.а М.к

1 1 (пара.инв) 5 (пери.инв+перн.инв) 1 (пери.инв ьпери.инв)

2 2 (ц.транс.) Ц (тан.сл.т-т) 13 (ц.транс.)

3 3 (ц.транс.) 1р (тан.сл.т-т) 2 (и.тпянс

л 2д (тап.сл.ц-?) 15 (чара.ик?)

5 5 (ц.транс.) Зц (тан.сл.т-ц) 14 (ц.транс.)

6 6 4р (тан.сл.ц-т) 16

7 7 (ц.транс.) 2р (тан.сл.т-ц) 17 (ц.транс.)

8 8 (ц.транс.) 4q (тан.сл.т-ц) 3 (ц.транс.*)

9 9 6 (пери.инв) 4 (пери.инв)

10 10 Зр (тан.сл.ц-т) 18

11 И 8 (ц.транс.) 5 (пери.инв)

12 I 12 7 (пери.инв) 8 (нери.инв)

! п П 13 (пери.инв) (пери.инв)

I 14 ! 14 9 (ц.транс.*) 7 (ц.транс *)

15 15 12 (ц.транс.) 19 (пара.инв)

16 16 14 (пери.ннг.) !П (псрч.инв)

17 17 19 31 (ц.транс. *+пара.инс)

58 25ц (роб.сл) 15 (пери.инв) 22

19 18 11 (пери.инв) 9 (пери.инв)

20 19 10 (ц.транс.*) 20

21 20 21 23 (пара.инв)

22 21 17 (ц.транс.) 24

23 22 16 (ц.транс.*) 21 (ц.транс.*)

24 23 20 25

25 25р (роб.сл) 22 26

26 24 (пери.инв) 18 12

пери.инв. - перицентрическая инверсия; пара.инв. - парацентрическая инверсия; тан.сл. - тандемное слияние, т-т - теломерное, ц-т (т-ц)- центромерно-теломерное; роб.сл. - робертсоновское слияние; ц.транс - центрическая

транспозиция (разное положение центромеры у одинаковых по в-сегментации хромосом), * - характер О-рисунка не отрицает возможности перицентрической инверсии.

Разнообразие хромосомных перестроек у обыкновенных полевок ограничено пятью типами. Центрические транспозиции встречаются у всех видов примерно с одинаковой частотой. Парацентрические инверсии характерны в основном для кариотипа киргизской полевки, а перицентрические инверсии - для М.ап>аИх и М.кщ1$огит в равной степени. Кариотип М.агуаШ отличается от другах наличием тандемных слияний.

Наличие у М.атаШ и М.к1г^1зогит 5 общих перицентрических инверсий, не встречающихся у других видов, говорит о существовании у них общей промежуточной формы в ходе эволюции. Возможно, существовало два разных кариотипических варианта: эволюция первого привела к становлению видов М.зиЬатаШ и Млгаюсазргсиз, второго - М.к1^15огит и \i.arvalis. Меньше всего различий среди исследуемых видов полевок имеют кариотипы М.зиЬагуаЧз и МАгаюсайр^ш. Они различаются (помимо центрических транспозиций) одним робертсоновским слиянием и одной парацентрической инверсией. Для кариотипов киргизской и обыкновенной полевки характерно много различий. Во-первых, структура кариотипа М.атаИв говорит о существовании нового этапа слияний, когда исходными партнерами при образовании больших двуплечих хромосом являлись уже сложносоставные хромосомы. Во-вторых, в кариотипе киргизской полевки имеются пять парацентрических и одна перицентрическая инверсии, уникальные для данного вида. О значительной дивергенции видов М.к^тзогит и М.ап>аИ$, с одной стороны, и близости видов М.зиЬапаИз и \i.transcaspicus, с другой, свидетельствуют также результаты гибридологических исследований (Мейер и др., 1985). На основании полученных нами данных мы построили гипотетическое филогенетическое древо кариотипов четырех видов обыкновенных полевок (рис. 1). Подсчет числа составных элементов хромосом обыкновенных полевок по числу центромер дает значение около 100. Вероятно, таким было диплоидное число хромосом у предковой для этой группы формы. Весь путь эволюции кариотипов обыкновенных полевок можно разделить на два этапа, для каждого из которых характерны определенные типы перестроек. На первом этапе

М.йшк. МлиЬату. М.ап>. М.к

Рис. 1. Филогенетическое грево четырех гидов.

тандемное слпи/ие, - пернцешричесК'Л инверсия, О центрическая транспозиция,- педокЯТанная ¡¡еитрическая транспозиция, - парацентрическая инверсия Показаны перестройки всех хромосом относительно хромосом М.тоНагуцИя (я скобках), тгр4.мс 1 хромосомы.

преобладали тапдемныс слияния нредковых мелких акроцентрических хромосом теломер-теломерного и теломер-центромерного типа. После достижения диплодного числа примерно равного 54 кариотипические преобразования определялись в основном парацентрическими инверсиями (ММг&зогит), тандемными слияниями уже сложносоставных хромосом (М.агхаИн) и робертссновскими слияниями {МЛгапзсазркия). Кариотип обыкновенной полевки сложился, вероятно, позднее, чем кариотипы трех остальных видов.

Два вида полевок из изучаемой группы, M.subarvalis и M.arvalis, являются симпатрическими видами-двойниками, морфологически они неразличимы. Особенности их кариотипов указывают на значительную генетическую обособленность. Полученная в нашей лаборатории (Zakijan et al., 1984) оценка генетического расстояния по методу Нея (Nei, 1972) между видами-двойниками M.arvalis и M.subarvalis совпадает со средним значением генетического расстояния для отчетливо морфологически отличающихся видов. Таким образом, данные, полученные при сравнительном анализе кариотипов хорошо соответствуют данным,полученным при анализе биохимическеского полиморфизма. Значительная генетическая дифференциация между видами-двойниками M.arvalis и M.subarvalis, возможно, свидетельствует о географическом образовании данных видов-двойников.

3. Установление сцепления и порядка генов GALA, G6PD. HPRT к PGK1 на X хромосоме у трех видов обыкновенной полевки

Знание порядков генов на Х-хромосомах в группе близкородственных видов поможет в реконструкции "предковой" для данной группы Х-хромосомы, а также будет полезным при изучении филогенетических взаимоотношений и эволюции Х-хромосом в данной группе. Ранее в нашей лаборатории были определены порядки четырех генов, кодирующих биохимические маркеры GALA, G6PD, HPRT и PGK1. на Х-хромосомах двух видов - M.subarvalis и M.kirgisorum, причем для второго вида порядок был предполагаемым и требовал дополнительных экспериментов, а для M.subarvalis - точно установленным (Nesterova et al., 1994). Здесь мы представляем результаты картирования Х-хромосомы у трех видов обыкновенных полевок - M.transcaspicus, M.arvalis и M.kirgisorum.

3.1. Установление группы сцепления генов GALA, G6PD, HPRT и PGK1 у полевок Microtus arvalis и Microtus transcaspicus На сегодняшний день не известно ни одного случая аутосомной локализации генов GALA, G6PD, HPRT и PGK1 у млекопитающих, поэтому естественно было предположить, что и у обыкновенных полевок они сцеплены с Х-хромосомой. Мы получили дополнительные данные, подтверждающие это предположение. Во-первых, семейный анализ потомства от реципрокных скрещиваний M.arvalis х M.subarvalis, M.arvalis х M.transcaspicus и M.transcaspicus х M.subarvalis показал, что гены G6PD и GALA у этих двух видов

локализованы в Х-хромосомах (Zakian et al„ 1987; 1991). Во-вторых, для подтверждения Х-хромосомной локализации HPRT и PGK1 мы

провели гибридизацию in situ радиоактивно меченых зондов для этих генов на метафазных хромосомах полевок M.arvalis и M.transcaspicus. Анализ метафазных пластинок показал, что оба гена локализованы на Х-хромосоме. Из-за использования гетерологичных для полевки зондоч нам не удалось установить региональную локализацию юно?, г'PR'Г и PGK1.

3.2. Определение попялка генов CAJ.A, G^PP, НР"Т т " пояоздх MMrgi^crnm, М gi eui!s f« M.iiemseaspicus Для определения порядка генов мы воспользовались методом радиационного кацтиоования. ^тпт \»стпл ос"0"?уг zz~ спсссб::ссга ьил Bbijbi«aiK пччоыи" гро'/тнм Лпзлпз частот сегрегации маркеров полевки в шбридах соматических клеток между облученными фибрсбластами полевки и интактными клетками мыши позволяет оценить порядок генов, поскольку чем теснее сцеплены гены, тем больше вероятность их совместного сохранения в гибридных клетках. Результаты электрофоретического анализа изоферментов в гибридах соматических клеток приведены в таблице 3. Электрофоретический анализ выявил. что GALA, G6PD и FGK1 сохранялись » гибридных хлоцах с различной частотой.

Численности гибридных клонов, полученных в различных экспериментах

Таблица 3

Эксперимент Дж/кг Числе и нос :ти KJ 'ЮНОЕ

П*ш Поп "101 I'OOl Ппо П0!0 'Пюо 11000

M.kirgisorum 1 30 75 54 8 3 0 4 2 2 2

«=0.05 51.3 7.6 2.85 0 6.7 2.4 2.15 X.

2 30 3 23 50 15 т 3 20 25 0 7

1+2 30 198 104 23 6 3 24 27 2 9

М. transcaspicus 30 . 171 86 12 1 1 32 15 6 18

а 160 79 12 1 1 31 14 6 16

б 170 79 19 1 1 32 15 7 16

M.arvalis 30 203 95 30 1 19 24 27 0 1

а~0Л 85.5 30 1 19 33.5 27 0 7

*nabc - где а - PGK1, b - G6PD, с - GALA

При обработке результатов эксперимента для M.transcaspicus

11

программой RHMAP из 12 возможных генных порядков был выбран порядок PGK1-HPRT-G6PD-GALA, удовлетворяющий трем критериям, введенным в статистической модели (Гинзбург и др., 1993). Такой же порядок был установлен ранее для M.subarvalis (Nesterova et al., 1994). Для M.arvalis статистическая обработка результатов также дала только один генный порядок GALA-HPRT-G6PD-PGK1, удовлетворяющий всем трем критериям модели. По результатам предыдущего, эксперимента для M.kirgisorum из 12 возможных статистические критерии не отвергли три генных порядка (Nesterova et al., 1994). Для дальнейшего выяснения вопроса о порядке этих генов у полевок M.kirgisorum мы провели второй эксперимент, результаты которого приведены в таблице 3. Согласно этим данным два критерия (кроме х2) не отвергают только один порядок GALA-HPRT-G6PD-PGK, совпадающий с порядком, выбранным для M.arvalis. При обработке программой RHMAP суммарных результатов двух экспериментов не были отвергнуты по двум критериям (кроме %2) два генных порядка, совпадающие с порядками, установленными для M.arvalis и M.subarvalis. По степени правдоподобия они близки. Для окончательного решения о порядке этих генов у полевок M.kirgisorum необходимо либо увеличение выборки и числа информативных клонов, либо локализация исследуемых генов другими методами.

4. Сравнение порядков генов GALA, G6PDT HPRT и PGK1 на X-

К настоящему времени в литературе имеются данные о порядке генов G6PD, PGK1, GALA и HPRT для трех видов высших млекопитающих и для трех видов сумчатых, причем только у двух видов сумчатых порядки генов одинаковы.

Мы пополнили список видов с известным порядком генов еще тремя видами отряда грызунов - M.transcaspicus, M.arvalis и M.kirgisorum. У M.subarvalis и M.transcaspicus порядок генов G6PD, GALA, PGK1 и HPRT совпадает; у M.arvalis эти гены расположены в другом порядке. Если для M.kirgisorum принять первый из двух вероятных порядков, то тогда у M.arvalis и M.kirgisorum порядок генов также будет совпадать. Эти данные соответствуют предположению о существовании двух разных кариотипических ветвей в ходе эволюции обыкновенных полевок. Как показал сравнительный кариотипический анализ, виды M.subarvalis и

M.transcaspicus очень близки друг к другу в целом, и, в частности, их Х-хромосомы имеют очень сходный G-рисунок эухроматиновых

частей. С этими данными хорошо согласуется обнаружение одинакового порядка четырех генов на Х-хромосомах этих двух видов. Так как кариотип M.subarvalis наиболее близок х "предкомому" кариотипу дачной группы полевок, можно предположить, что порядок четырех X сцепленных генов, одинаковый у M.subarvalis и M.transcaspicus, возможно, является ''предковым" порядком для этой группы видов. Х-хромосомы M.arvalis и M.kirgisorum гомеологи-лны по G-рисунку только в обших чертах, к тому л:с Х-хромосйма M.arvalis отличается от остальных по морфологии. Принимая во внимание эти данные, я также та что в ;.ис;оятее Бремя виды М.ш тИх и M.kirgisorum сильно дивергнрозг>ли, вполне возможно существование разных порядков генов у M.arvalis и M.kirgisorum, если принять для M.kirgisorum второй вероятный порядок генов. При этом второй порядок генов, у M.kirgisorum совпадает с принятым порядком генов для M.subarvalis и M.transcaspicus, условно названным "предковым".

Суммируя все известные к настоящему времени данные о расположении четырех генов на Х-хромосомах у различных р.чдов млекопитающих, можно заключить, что для эволюции прецковой X-xpoMocoMLi млекопитающих характерны многочисленные внутрихромосомные перестройки. Как минимум, одна инверсия произошла в ходе эволюции Х-хромосом человека и американской норки (Zhdanova et а!,, 1988) Из сравнения генетических карт X-хромосом человека и мыши следует, что они разделяются, но меньшей мере, тремя инверсиями (Blair et al., 1994). При сравнении локализации 48 гомологичных генов на Х-хромосомах человека и мыши было обнаружено 8 высококонсервативных сегментов (Blair et al., 1994). Два самых крупных консервативных элемента содержат интересующие нас гены: один - PGK1 я GALA, второй - I-IPRT и G6PD. У норки и трех - видов сумчатых, вероятно, также наблюдается сохранение консервативности этих сегментов, по крайней мере, PGK1 у всех сцеплен с GALA, a HPRT - с G6PD. Но у полевок группы "arvalis" мы видим нарушение консервативности одного из этих сегментов у всех четырех видов: гены GALA и PGK1 разорваны и располагаются по разные стороны сегмента, маркированного генами HPRT и G6PD. Это нарушение консервативности произошло, по-

видимому, еще у предковой формы данной группы. Установление порядка четырех генов у полевок позволяет провести сравнение генетических карт у пяти видов отряда грызунов - четырех видов полевок и мыши. Сравнительный анализ показывает, что внутри отряда грызунов в ходе эволюции Х-хромосом происходили, вероятно, многочисленные внутрихромосомные перестройки. Как минимум, две инверсии разделили Х-хромосомы мыши и полевок в эволюционном процессе. По меньшей мере, одной инверсией должны отличаться Х-хромосомы полевок, имеющих разные порядки X-сцепленных генов. Возможно, линейный консерватизм Х-хромосомы характерен только для близхородственных видов, недавно дивергировавших друг от друга, как мы обнаружили это Дня двух (возможно, трех) полевок рода М1сго1т.

ВЫВОДЫ

1. Проведено детальное исследование кариотипов четырех видов обыкновенных полевок МкгоШз зиЬатаШ, Мкгош ^атсахр^ш, ШсгоШ апгаШ и МкгоШ Ыг&зогит. Метод дифференциального окрашивания хромосом высокого разрешения позволил выявить в кариотипе восточноевропейской полевки 488 в-сегментОв, в кариотипе закаспийской полевки 402 сегмента, в кариотипе обыкновенной полевки 426 сегментов и в кариотипе киргизской полевки 524 сегмента. Созданы надежные номенклатуры данных видов и построены идеограммы хромосом всех четырех видов.

2. В результате сравнительного исследования ОТв-рисунка хромосом четырех видов обыкновенных полевок впервые установлена гомология всех элементов кариотипов (за исключением У-хромосом). Сравнительный анализ прометафазных хромосом позволил установить гомологию по в-рисунку дополнительно у 23 хромосом изучаемых видов, а также внести ряд существенных изменений в установленные ранее гомологии.

3. Показано, что кариотипическая эволюция внутри группы М.агуаЫз шла за счет перекомбинации гомологичных элементов. Сложносоставная природа большинства хромосом у изученных видов свидетельствует в пользу предположения, что эволюция кариотипа ' в исследованной группе видов определялась тандемными слияниями очень мелких акроцентрических хромосом (центрическими, центромерно-теломерными и теломерными.

Вероятно, диплоидное число хромосом у предковой для этой группы формы было около 100. Наиболее распространенная

перестройка, встречающаяся у всех видов примерно с одинаковой частотой (6-8) - центрическая транспозиция. Эволюция M.kirgisorum основывалась также на пери- (6) и парацентрических (4) инверсиях, a M.arvalis - па перицентрических инверсиях (6) ?: тандемных слияниях (4). Кариотип M.arvalis говорит о новом этапе слияний уже сложносоставных хромосом.

4. Построено филогенетическое древо кариотипов полевок группы Microtus arvalis. Наименьшее число структурных перестроек разделяет виды Microtus subarvalis и Microtus transcaspicus (8). Остальные виды разделяются большим и ппимерно п.ггичяк-гтьтм числом перестроек (iö-2ü). Нчличие в кэриотчпях M.arvabs и M.kirgisorum пяти общих перестроек, вероятно, говорит о существовании у них общей предковой формы, по кариотипу близкой к М. subarvalis, наиболее примитивному виду среди обыкновенных полевок.

5. Установлена первая группа сцепления PGK1, HPRT, G6PD и GALA на Х-хромосоме полевок Microtus subarvalis и Microtus transcaspicus. Определен порядок этих генов у трех видов полевок М.subarvalis, М.transcaspicus и M.kirgisorum. Для двух видов установлен единственно возможный порядок, а именно: у M.arvalis GALA-HPRT-G6PD-PGK1, у М.transcaspicus PGK1-HPRT-G6PD-GALA. Для M.kirgisorum возможны два порядка: GALA-HPRT-G6PD-PGK! и PGK1-HPRT G6PD-GALA.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Закиян С.М., Кульбакина Е.А., Серов О.Л., Мейер М.Н. Изучение внутри- и межвидового полиморфизма у видов-двойников обыкновенной полевки !! Тезисы Всесоюз. совещ. "Популяционная изменчивость н проблемы охраны генофонда млекопитающих". Москва - 1983 - С.64-65

2. Закиян С.М., Кульбакипа H.A., Серов O.JI., Мейер М.Н. Биохимический полиморфизм обыкновенной полевки // Тезисы Всесоюз. совещ. "Популяционная изменчивость и проблемы охраны генофонда млекопитающих". Москва - 1983 - С.66-67

3. Закиян СМ., Кульбакнна H.A., Серов О.Л. Избирательная инактивация Х-хромосом у самок межвидовых гибридов Microtus

subarvalis x Microtus arvalis II ДАН СССР - 1984 - T.278 - No.6 -C.1477-1478

4. Закиян C.M., Кульбакина H.A., Серов O.JL, Мейер М.Н., Жарких А.А. Оценка степени генетической дивергенции видов-двойников обыкновенной полевки Microtus arvalis, Microtus subarvalis (Rodentia) II Генетика - 1984 - T.20 - No.8 - С. 1365-1373

5. Zakijan S.M., Kulbakina N.A., Serov O.L., Meyer M.N., Zharkikh A.A. An estimation of the degree of the genetic divergence of sibling species Microtus arvalis and Microtus subarvalis (Rodentia) based on electrophoretic analysis // Biochem. Genet. - 1984 - V.22 - P. 1081

6. Zakijan S.M., Kulbakina N.A., Serov O.L. Biochemical polymorphism in voles Microtus arvalis (Rodentia) II Isozyme Bulletin -1985 - V.18 - P.79

7. Zakian S.M., Kulbakina N.A., Meyer M.N., Semenova L.A.,Bochkarev M.N., Radjabli S.I., Serov O.L. Non-random inactivation of the X-chromosome in interspecific hybrid voles // Genet. Research. - .1987 - V.50 - H.23-27

8. Жданова H.C., Пак С.Д., Нестерова Т.Е., Мазурок Н.А., Градов А.А., Серов O.JI. Расположение четырех генов (a-GAL, PGK1, HPRT и G6PD) на Х-хромосоме американской норки (Mustela vison) И Генетика - 1988 - Т.24 - No.8 -С.1448-1455

9. Zhdanova N.S., Pack S.D., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Gradov A.A., Serov O.L. // Subchromosomal localization and order of GLA, PGK1, HPRT and G6PD loci on the X chromosome of the American mink (Mustela vison) II Cytogenet. Cell Genet. - 1988 - V.48 -P.2-5

Ю.Нестерова Т.Б., Мазурок H.A., Матвеева H.M., Шилов А.Г., Янцен Е.И., Гинзбург Э.Х., Закиян С.М. Установление сцепления и порядка генов GALA, G6PD, HPRT и PGK на X хромосоме у двух видов полевок рода Microtus II Генетика - 1993 -Т.29 - No. 11 -С.1811-1820

11.Nesterova Т.В., Mazurok N.A., Matveeva N.M., Shilov A.G., Yantsen E.I., Ginsburg E.Kh., S.J.Goss, Zakian S.M. Demonstration of the X-linkage and order of the genes GALA, G6PD, HPRT and PGK in two vole species of the genus Microtus И Cytogenet.Cell Genet. -1994 -V.65 - P.250-255

12.Mazurok N.A., Rubtsov N.B., Nesterova T.B., Zakian S.M. High resolution G-banding of chromosomes of Microtus kirgisorum (Muridae, Rodentia) H Cytogenet.Cell Genet. 1994 - V.67 - No.3 -

Р.208-210

13.Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. High-resolution G-banding of chromosomes in Microtus subarvalis (Rodentia, Arvicolidae) II Hereditas - 1995 - V.123 - P.47-52

14.Мазурок H.A., Рубцов Н.Б., Овечкина Ю.Ю., Нестерова Т.Е., Закиян С.М. GTG-окраска высокого разрешения и ядрышкообразующие районы хромосом полевки Microtus kirgisorum II Генетика - 1995 - Т.31 - No.8 -С.1132-1138

15.Mazurok N.A., Isaenko A.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. Highresolution G-banding of chromosomes in the common vole Microtus arvalis (Rodentia, Arvicolidae) И Hereditas - 1996, in press

Подписано к печати 15.07.1996

Формат бумага 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 53

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.