Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетический анализ эволюции хромосом полевок группы "arvalis" рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетический анализ эволюции хромосом полевок группы "arvalis" рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)"

На правах рукописи УДК(576.316.352:575.224):595.773.4

^ РУБЦОВА

Надежда Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭВОЛЮЦИИ ХРОМОСОМ ПОЛЕВОК ГРУППЫ «АКУАЫй» РОДА ШСЯОТиБ (АЯУ1СОЬШАЕ, RODENTIA).

Генетика-03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2003

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор С.М. Закиян Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.С. Жданова

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, Л.В. Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт проблем экологии и эволюции

им. А.Н. Северцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 19 ноября 2003 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10. Факс: (3832) 33-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета, ____. - _

доктор биологических наук А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Совокупность результатов дифференциального окрашивания хромосом, сравнительного картирования и сравнительного хромосомного пэйнтинга (ZOO-FISH) позволила установить гомологию хромосом и хромосомных районов у нескольких десятков видов млекопитающих и выявить консервативные районы хромосом, сохранившие свою целостность в течение десятков миллионов лет эволюции (O'Brien et al., 1999). Кариотипическая эволюция внутри большинства таксонов обычно ограничивалась рекомбинацией базовых элементов, внутрихромосомными инверсиями, транспозициями центромер и вариациями в локализации и размерах блоков С-гетерохроматина. В то же время, в некоторых филогенетических ветвях происходили значительные преобразования кариотипов за счет множественных перестроек хромосом, приводящих к нарушению их целостности и образованию новых групп сцепления (Rubtsov et al., 1988; Graphodatsky 1989). Значительная реорганизация хромосом в одних таксонах и их высокая консервативность в других свидетельствуют о неравномерных темпах хромосомной эволюции в разных ветвях филогенетического древа млекопитающих. Самые высокие темпы кариотипической дивергенции по современным представлениям характерны для мышевидных грызунов (Van Etten et al., 1999; Murphy et al., 2001).

Наиболее эволюционно лабильными элементами хромосом являются центромерные, теломерные и ядрышкообразующие районы. Именно эти районы хромосом чаще всего принимают участие в эволюционных межхромосомных перестройках при рекомбинации базовых групп сцепления и при создании новых морфологических вариантов хромосом за счет внутрихромосомных перестроек. Во всех перечисленных выше районах хромосом находится большое число разнообразных повторяющихся последовательностей ДНК (Karpen, Allshire, 1997; Blackburn, 1991; Mefford, Trask, 2002). Возможно, именно изучение закономерностей формирования кластеров повторяющихся последовательностей ДНК даст ключ к пониманию механизмов эволюционной реорганизации хромосом млекопитающих.

В решении ряда вопросов при изучении механизмов эволюционных хромосомных перестроек, большую пользу может принести сравнительный анализ близкородственных видов из таксонов, для которых характерны высокие темпы кариотипической эволюции. В хромосомах видов, начавших дивергировать относительно недавно, с большей вероятностью могут сохраниться «следы» молекулярных процессов, сопряженных с реорганизацией хромосом.

Одним из эффективных методов анализа реорганизации хромосом при сравнении близкородственных видов млекопитающих является хромосомный пэйнтинг с использованием районоспецифических ДНК-проб, полученных на основе микродиссекции метафазных хромосом. Такие ДНК-пробы с равным успехом могут быть получены и для эухроматиновых, и для гетерохроматиновых

районов хромосом, что позволяет использовать их для анализа самых разных перестроек хромосом (Оиап й а1., 1994; ЯиЫзоу й а1., 1995).

Группа видов обыкновенных полевок (группа «агуа/и», род МигоШв) относится к быстро эволюционирующей филогенетической ветви мышевидных грызунов (МуотогрЬа, Яоёепйа) и обладает набором кариологических характеристик, которые делают ее весьма перспективной для использования в качестве модельного объекта при изучении механизмов эволюции хромосом млекопитающих (Мейер и др., 1996; Магигок ег а!., 2001).

Цели и задачи. Основные цели данного исследования - выявление закономерностей реорганизации эволюционно лабильных районов хромосом и консервативных хромосомных элементов в ходе дивергенции близкородственных видов полевок рода МйгоШя. Для достижения поставленных целей необходимо было решить несколько конкретных задач.

1. Установить хромосомную локализацию ядрьппкообразующих районов и сравнить ЯОР-несущие хромосомы у 4 видов обыкновенных полевок.

2. Определить наличие в хромосомах М.ап/аИя «оЬзсигия» кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК, принимавшим участие в формировании «новых» С-гетерохроматиновых блоков в аутосомах 5 и 8.

3. Провести анализ распределения в хромосомах обыкновенных полевок кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК «новых» С-гетерохроматиновых блоков двух аутосом М. агуаШ «оЬясигм».

4. Сравнить порядок расположения эухроматиновых сегментов р-плеча и околоцентромерного района q-плeчa в стандартной хромосоме 5 М. апюШ «оЪэсигш» с расположением гомологичных сегментов в перестроенном акроцентрическом гомологе с дополнительным блоком С-гетерохроматина.

5. Сравнить порядок расположения эухроматионовых сегментов р-плеча и околоцентромерного района q-плeчa в хромосоме 5 М. атаШ «оЬзсигия» с порядком сегментов в гомеологичных районах хромосом других видов обыкновенных полевок.

6. Определить расположение гомологичных эухроматиновых районов в X-хромосомах пяти близкородственных видов рода КйсгоШз, и провести анализ возможных перестроек в эволюции Х-хромосом полевок.

Научная новизна. Впервые для сравнительного анализа хромосом полевок был применен пэйнтинг с использованием районоспецифических ДНК-проб, не только эухроматиновых, но и гетерохроматиновых районов хромосом.

Впервые было показано, что формирование «новых» гетерохроматиновых С-блоков в хромосомах полевок может происходить за счет амплификации последовательностей ДНК, представленных в виде кластеров в прителомерных, прицентромерных и ядрьппкообразующих районах многих хромосом кариотипа.

Впервые однозначно показано, что транспозиция центромерного района при формировании акроцентрического гомолога хромосомы 5 M.arvalis «obscurus» не сопровождалась изменением позиции теломерного, центромерного и эухроматиновых сегментов р-плеча исходной субметацентрической хромосомы.

Впервые в хромосомах четырех видов обыкновенных полевок показана связь межвидовых различий по субхромосомной локализации ЯОР с наличием разных наборов кластеров повторяющихся последовательностей ДНК.

Впервые сравнительный анализ Х-хромосом близкородственных видов был проведен с использованием набора районоспецифических ДНК-проб, перекрывающих все эухроматиновые районы Х-хромосомы. При анализе перестроек в Х-хромосомах пяти видов серых полевок была обнаружена солокализация «горячих точек» эволюционных перестроек с расположением интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей ДНК.

Практическая ценность. Данные по хромосомной локализации ЯО-районов и перестройкам внутри Х-хромосом дополняют общую цитогенетическую характеристику хромосомных наборов четырех видов группы обыкновенных полевок, которая в настоящее время используется в качестве модельного объекта в работах по исследованию механизмов процесса инактивации в Х-хромосомах млекопитающих. Полученные в работе результаты расширяют наши представления о возможных механизмах эволюционных перестроек в хромосомах млекопитающих и позволяют по-новому взглянуть на роль повторяющихся последовательностей ДНК в возникновении однотипных перестроек хромосом, в том числе в эволюции ядрышкообразующих районов.

Апробация. Результаты работы были доложены на Конференции «Геном человека 2000» (Черноголовка, декабрь 2000); на Всероссийском Совещании «Современные проблемы эволюции и филогении животных» (Москва, декабрь 2001); на международном семинаре ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic science in ISTC Activities" (Новосибирск, апрель, 2001); на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (февраль 2002г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объём диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (257ссылок); изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 4 таблицы.

Автор выражает благодарность сотрудникам ИЦиГ СО РАН, принимавшим участие в экспериментальной части работы на разных этапах: д.б.н. Н.Б. Рубцову, к.б.н. Т.В. Карамышевой, к.б.н. H.A. Мазурок, н.с. A.A. Исаенко, к.б.н. Н.В. Воробьевой, н.с. H.A. Сердюковой, к.б.н. А.И. Шевченко.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Животные. В работе использовали полевок пяти видов из рода Microtus: четыре вида из группы «arvalis» - M.rossiaemeridionalis (M.subarvalis), M.transcaspicus, M.kirgisorum (M.ilaeus) и M.arvalis (хромосомные формы «arvalis» и «obscurus»), и один вид из группы «agrestis» - M.agrestis. Животные были отловлены в природных популяциях на территории бывшего СССР и содержались в виварии Института цитологии и генетики СО РАН.

Культуры первичных фибробластов легкого полевок получали с использованием трипсинизации кусочков тканей, культивирование и криоконсервацию проводили стандартными методами (Nesterova et al., 1994).

Препараты метафазных хромосом. При фиксации клеток и приготовлении препаратов использовали стандартные общепринятые методы (Графодатский, Раджабли, 1988) с некоторыми изменениями в концентрациях растворов и в продолжительности той или иной процедуры. Для FISH препараты хромосом готовили из клеток первичных фибробластов, перед использованием препараты выдерживали в вакуумной камере.

Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом. GTG-дифференциальное окрашивание хромосом проводили по методу Сибрайт (Seabright, 1971) с модификациями Графодатского и Раджабли (Графодатский, Раджабли, 1988). Районы конститутивного гетерохроматина окрашивали с использованием стандартного метода С-окраски (Sumner, 1972). Выявление активных ЯО-районов хромосом проводили с применением окрашивания раствором азотнокислого серебра (Howell, Black, 1980). Для получения последующего дифференциального или гомогенного (рутинного) окрашивания метафазных хромосом использовали методику Графодатского A.C. (Графодатский, Раджабли, 1988). Для описания хромосом полевок использовали предложенную ранее номенклатуру (Mazurok et al., 1994,1995,1996).

ДНК-пробы. Микродиссекционные районоспецифические ДНК-пробы для хромосом полевок были получены в лаборатории морфологии и функции клеточных структур ИЦиГ СО РАН с использованием описанных ранее методических приемов (Rubtsov et al., 2000). ДНК-проба для детекции р-ДНК была любезно предоставлена сотрудниками лаборатории цитогенетики человека и животных ИЦиГ СО РАН.

Флуоресцентная in situ гибридизация. FISH и детекцию меченых ДНК-проб проводили по методу, описанному Пинкелем с соавт. (Pinkel et al, 1986). CISS-гибридизацию проводили по стандартному методу (Lichter et al., 1988), используя C0t-1 ДНК M.rossiaemeridionalis. Для окрашивания хромосом применяли DAPI.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Локализация ЯО-районов в хромосомах обыкновенных полевок.

Хромосомную локализацию ЯО-районов в метафазных хромосомах всех исследованных видов проводили с помощью последовательного окрашивания хромосом: сначала А§-методом, затем азур-эозином и/или вТО-методом. Окрашивание хромосом азур-эозином использовали для уточнения субхромосомной локализации прицентромерных ЯО-районов в акроцентрических хромосомах, йТв-окрашивание - для идентификации ЯОР-несущих хромосом. Основные морфологические характеристики ЯОР-несущих хромосом и номера соответствующих хромосомных пар в кариотипе четырех > исследованных видов полевок представлены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика ЯОР-несущих хромосом у разных видов полевок.

Название вида Номера хромосом Морфология хромосом Локализация ЯОР

М.атаИз «оЬзсигиз» 1-4 крупные метацентрики прителомерные районы одного из плеч

14,16-18, 20-22 средние и мелкие акроцентрики р-плечи

М.апкгИя «агуаШ» 10 мелкий субметацентрик прителомерный район р-плеча

19,20-22 мелкие акроцентрики р-плечи

М.Шг&зогит 14-26 акроцентрики всех размеров р-плечи

X- хромосома акроцентрик с прицентромерным блоком гетерохроматина гетерохроматиновое р-плечо

М.Штсайркиз 8-11, 15-20, 23 акроцентрики всех размеров прицентромерные районы q-плeч (вторичные перетяжки)

М. гоязгаетепсИопаНя 10-25 акроцентрики всех размеров прицентромерные районы q-плeч (вторичные перетяжки

Для определения общего числа районов локализации генов 18S- и 28S-рРНК была проведена FISH меченной биотином клонированной последовательности ДНК, содержащей участки гена 28S-pPHK человека, с метафазными хромосомами всех видов обыкновенных полевок. Для всех клеток, используемых в in situ гибридизации, определялось также и общее число ЯО-районов, выявляемых при Ag-окрашивании. Между разными видами обыкновенных полевок и хромосомными формами M.arvalis были выявлены различия и по количеству, и по хромосомной локализации локусов, содержащих гены рРНК. Характер установленных при этом различий соответствует результатам, полученным при Ag-окрашивании хромосом. Гомеологичные хромосомы разных видов и разных форм M.arvalis отличаются не просто функциональным состоянием генов рРНК, а их наличием или числом в соответствующих районах. На рисунке 1 (стр. 8) представлены результаты FISH для определения локализации кластеров генов 18S- и 28S-pPHK в метафазных хромосомах M.arvalis «obscurus» и M.arvalis «arvalis».

Если исходить из общего числа хромосомных пар, для которых была установлена локализация ЯО-районов, максимально возможное число районов локализации генов рРНК у исследованных видов различается значительно: от 10 у M.arvalis «arvalis» до 32 у M.rossiaemeridionalis. При этом фактическое число районов локализации генов рРНК, выявленное экспериментально двумя разными методами, у исследованных животных отличается в меньшей степени (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение числа ЯО-районов, максимально возможного и выявленного экспериментально, в клетках обыкновенных полевок.

Число пар Число ЯО-районов в одной клетке

Название вида хромосом сЯОР Максимально возможное Выявленное разными методами

Ag-метод FISH

M.arvalis «obscurus» 10 20 9-12 10-14

M.arvalis «arvalis» 5 10 5-10 9-10

M.kirgisorum 14 28 8-14 15-20

M. transcaspicus 11 22 9-18 14-20

M. rossiaemeridionalis 16 32 12-17 18-24

Практически во всех хромосомных элементах, составляющих кариотипы обыкновенных полевок, были обнаружены ЯО-районы, хотя бы у одного из исследованных видов. В половых хромосомах ЯО-район был выявлен только в X-хромосоме ММг%1$огшп (табл. 1). Кариотипы исследованных видов обыкновенных полевок отличаются как по числу, так и по набору хромосом, несущих ЯО-районы. При этом у М.го$$1аетег1<ИопаИЕ и М.Ь-аюсазр1сий ЯО-районы локализованы вдали от теломерных районов (прицентромерные районы

длинных плеч акроцентриков), в то время как у M.kirgisorum и M.arvalis ЯО-районы расположены в непосредственной близости к теломерным районам: либо в коротких плечах акроцентрических хромосом, либо в прителомерных районах субмета- и метацентрических хромосом. Различия по числу и хромосомной локализации ЯО-районов, выявленные у M.arvalis «obscurus» и M.arvalis «arvalis», сопоставимы с межвидовыми различиями.

2. Анализ реорганизации гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus".

В процессе анализа хромосом М. arvalis «obscurus» мы обнаружили у двух особей гетероморфные пары аутосом. Этот гетероморфизм был результатом наличия дополнительных блоков С-гетерохроматина на одном из гомологов в двух разных парах хромосом: у одной особи - на длинном плече хромосомы 8, у другой - на коротком плече хромосомы 5 (рис.2). Перестройка хромосомы 5 М. arvalis «obscurus» полностью соответствовала описанной ранее в литературе (Раджабли, Графодатский, 1977; Малыгин, Саблина, 1994; Ахвердян и др., 1999). Гетероморфизм гомологов 8-ой пары хромосом М. arvalis «obscurus» мы обнаружили впервые и только у одной самки, отловленной на территории Армении (Разданский район). Хромосомы с дополнительными блоками гетерохроматина были нами обозначены как 5К и 8К, а соответствующие им С-блоки - 5ЯС и 8rC.

Гетерохроматиновые блоки хромосомы 5К и хромосомы 8R M.arvalis «obscurus» представляют собой «новые» С-блоки, сформировавшиеся в прителомерных районах одного из гомологов хромосомной пары. Их формирование сопряжено с возникновением ядрышкообразующих районов, в то время как в стандартных хромосомах 5 и 8 М arvalis «obscurus» ЯО-районы обнаружены не были (табл. 1). В С-блоке хромосомы 5R, кроме того, находится функционально активная центромера.

С помощью метода микородисекции и последующей DOP-PCR были получены ДНК-пробы разных районов хромосом 5, 5R и 8R M.arvalis «obscurus» (рис. 2а). Полученные ДНК-пробы были использованы в различных вариантах FISH с метафазными хромосомами M.arvalis «obscurus», M.arvalis «arvalis», M.rossiaemeridionalis, M. kirgisorum, M. transcaspicus и M. agrestis.

Для выявления гомологичных повторяющихся последовательностей ДНК (ПП-ДНК) в «новых» гетерохроматиновых блоках была проведена CISS-гибридизация ДНК-проб 5R-C1, 5R-C2 и 8К-С с хромосомами 5К и 8" (рис.3). Результаты показали, что С-гетерохроматиновые блоки хромосом 5К и 8R состоят в основном из негомологичных ПП-ДНК. Незначительное количество гомологичных последовательностей ДНК, выявленное в них при CISS-гибридизации, обусловлено, по-видимому, наличием в этих блоках ПП-ДНК, ассоциированных с ядрышкообразующими и/или теломерными районами.

В стандартной хромосоме 5 M.arvalis «obscurus» и в гомеологичных ей хромосомах других видов обыкновенных полевок ДНК-пробы 5К-С1 и 8R-C не

О j v ш f Vi 1 -¿г % ' А » 1 * XN f- % * тщь т щ ч

Рис. 1. FISH клонированного фрагмента ДНК человека, содержащего последовательности гена 28S-PHK, с метафазными хромосомами полевок M.amalis формы «obscurus» (О) и формы «arvalis» (А) (негативное изображение). Из восьми крупных метацентриков (обозначены стрелками) у M.arvalis «obscurus» пять имеют четкие зоны гибридизации в прителомерных районах.

Рис. 2. Гетероморфные пары аутосом М.ап/аШ «оЬзсигиз»: 5 и 8 - стандартные хромосомы, 5Л и 8К - их гомологи с дополнительными гетерохроматиновыми блоками: а - вТО-окраска, б - С-окраска (слева) и Ag-oкpacкa (справа). Квадратными скобками отмечены районы диссекции. Хромосома 5: район 1 соответствует ДНК-пробе 5-1; район 2 - ДНК-пробе 5-2, район 11 - ДНК-пробе 5-11, район 12 - ДНК-пробе 5-12. Хромосома 5К: район С1 соответствует ДНК-пробе 5К-С1; район С2 -ДНК-пробе 5К-С2. Хромосома 8я: район 1 соответствует ДНК-пробе 8я-1, район 2 - ДНК-пробе 8к-2, район С - ДНК-пробе 8К-С. На схеме утолщенной линией обозначены участки районов диссекции, для которых собиралось максимальное число хромосомных фрагментов при получении соответствующей ДНК-пробы. (*) показывает положение центромерного района._

Рис. 3. ОБЗ-гибридизация ДНК-проб С-блоков 5КС и 8КС с хромосомами 5К и 8К Магаг/и «оЬзсигш» (негативное изображение): а - ОАРЬбэндинг хромосом; б - ДНК-проба 5К-С1 (слева) в хромосоме 5К интенсивно окрасила С-блок, а в хромосоме 8К дала сигнал в центромерном районе и слабое диспергированное окрашивание в С-блоке; ДНК-проба 5К-С2 (справа) в хромосоме 5К интенсивно окрасила небольшой эухроматиновый район и часть С-блока до центромеры, а в хромосоме 8* дала сигнал

только в прицентромерном районе; в - ДНК-проба 8К-С в хромосоме 8К

интенсивно окрасила С-блок, а в хромосоме 5я дала сигнал в ЯО-районе.

(*) показывает положение центромерного района._

а

Рис. 4. СКБ-гибридизация ДНК-проб С-блоков 5КС и с хромосомой 8 Ма/та/й «оЬзсигш» (О) и гомеологичными ей хромосомами М.атаШ «атаШ» (А), ММг^огит (К), Млгатсаьргсив (Т), М.гоьйаетег'кИопаНз (Я) (негативное изображение): а - ДНК-проба 5К-С1 окрасила ЯО-районы в хромосомах у всех видов и прицентомерные районы в хромосомах М.атаНз «оЬзсигиз» и М.агуаШ «апаШ»-,б - ДНК-проба 8К-С окрасила прителомерные районы хромосом у всех видов и прителомерные ЯО-районы в хромосомах М.агуаИз «агуаШ» и М.Ыг^огит._

•1 1 1 1

1 в 1 10 1 30 1 19 30

мвл 05 05« Т1 Я1 11 11 05 Ш

Рис. 5. СКЗ-гибридизациия двух пар перекрывающихся ДНК-проб эухроматиновых районов хромосомы 5 М.агчаИъ «оЬзсигт» (негативное изображение): а - ДНК-пробы 5-1 (слева) и 5-2 (справа); б - ДНК-пробы 5-11 (слева) и 5-12 (справа). 05 и 05* - метацентрический и акроцентрический гомологи хромосомы 5 М.ап/аНя «оЬзсигия», Т1 и Я1- эгоцентрические хромосомы М. Шюсаяркш и М.гозй'шетепсЧопаШ. Стрелкой обозначен инвертированный район в хромосоме Я1, квадратной скобкой - С-блок в хромосоме 5К, (*) показывает положение центромерного района.

дали никаких сигналов, а в стандартной хромосоме 8 M.arvalis «obscurus» и в гомеологичных ей хромосомах окрасили центромерные и/или ядрышкообразующие районы (рис. 4).

При формировании блока 8RC у M.arvalis «obscurus», вероятно, произошла амплификация прителомерных ПП-ДНК, характерных для q-плеча стандартной хромосомы 8 M.arvalis «obscurus». В формировании блока 5*4? принимали участие последовательности ДНК, либо полностью отсутствующие в прителомерном районе р-плеча стандартной хромосомы 5 M.arvalis «obscurus», либо представленные там единичными копиями.

Для детального сравнительного анализа последовательности эухроматиновых сегментов в хромосомах 5 и 5R M.arvalis «obscurus» и в гомеологичных им хромосомах других обьткновеннных полевок были использованы две пары перекрывающихся ДНК-проб (5-1 и 5-2, 5-11 и 5-12). ДНК-пробы создавались так, чтобы участки, для которых собиралось максимальное число копий, находились в противоположных концах анализируемых районов. В результате для разных сегментов внутри суммарного района гибридизации было характерно определенное соотношение уровней интенсивности сигналов двух ДНК-проб. В хромосоме 5 M.arvalis «obscurus» ДНК-пробы 5-1 и 5-2 в совокупности окрашивали район pter-» ql.3, а ДНК-пробы 5-11 и 5-12 район pter-» ql7.

Результаты CISS-гибридизации ДНК-проб 5-1 и 5-2 (рис. 5а) позволили сделать вывод, что порядок расположения эухроматиновых сегментов в субметацентрической хромосоме 5 и ее акроцентрическом гомологе 5R M.arvalis «obscurus» одинаков несмотря на различную локализацию центромер. Такой же порядок сегментов сохранился в гомеологичных субметацентрических хромосомах M.arvalis «arvalis» и M.kirgisorum и в акроцентрической хромосоме M.transcaspicus. В гомеологичной акроцентрической хромосоме M.rossiaemeridionalis порядок эухроматиновых сегментов инвертирован. Следует отметить, что ДНК-проба 5-2 окрашивала прицентромерные районы всех субметацентрических гомеологов, но не окрашивала прицентромерные районы ни в одной из акроцентрических гомеологичных хромосом.

Для уточнения границ инверсии была проведена CISS-гибридизация с использованием ДНК-проб 5-11 и 5-12 (рис. 56). Было установлено, что в хромосоме 1 M.rossiaemeridionalis район ql.2->q2.4 инвертирован относительно района pter-»ql.3 хромосомы 5 M.arvalis «obscurus».

Для выяснения вопроса, какой из морфологических вариантов хромосомы следует рассматривать предковым для группы «arvalis», мы провели CISS-гибридизацию ДНК-проб 5-11 и 5-12 с метафазными хромосомами М. agrestis. Окрашенные зоны были выявлены в прицентромерных районах двух акроцентрических хромосом. Этот факт свидетельствует в пользу того, что у

общего предка обыкновенных полевок гомеолог хромосомы 5 М. arvalis был субметацентриком.

3. Распределение в хромосомах полевок кластеров повторяющихся последовательностей ДНК, гомологичных ДНК "новых" гетерохроматиновых блоков.

В хромосомах всех видов обыкновенных полевок были выявлены многочисленные кластеры повторяющихся последовательностей ДНК (ПП-ДНК), гомологичных ДНК «новых» гетерохроматиновых блоков аутосом 5 и 8 Marvalis «obscurus». Большинство обнаруженных кластеров были расположены в прицентромерных, прителомерных и ядрышкообразующих районах хромосом. •> ДНК-пробы обоих блоков выявляли также небольшие интеркалярные блоки ПП-

, ДНК в некоторых аутосомах и Х-хромосомах полевок. У M.agrestis только ДНК-

\ пробой 8К-С был выявлен прителомерный кластер ПП-ДНК в хромосомах одной

пары, гомеологичной хромосоме 8 M.arvalis «obscurus».

Результаты FISH свидетельствуют о том, что окрашивание определенных районов хромосом происходило не за счет присутствия в полученных ДНК-пробах собственно центромерных, теломерных повторов и/или генов рРНК, за счет наличия в них других ПП-ДНК. Так в составе гетерохроматинового блока 5RC были выявлены ассоциированные с ЯО-районами ПП-ДНК, прицентромерные ПП-ДНК и прителомерные ПП-ДНК; в составе блока 8КС -прителомерные ПП-ДНК и ассоциированные с ЯО-районами ПП-ДНК. В составе обоих исследуемых С-блоков были обнаружены и диспергированные ПП-ДНК.

В хромосомах исследованных видов кластеры разных ПП-ДНК представлены неодинаково. В общем виде эти различия отражены в таблице 3.

Таблица 3. Присутствие в геномах исследованных видов полевок кластеров разных ПП-ДНК, гомологичных ДНК гетерохроматиновых блоков 5КС и 8RC.

Типы повторяющихся последовательностей

Название вида ПП-ДНК блока 5*4: ПП-ДНК блока 8КС

полевок ЯОР Цен телПП тел«8»ПП телПП ЯОР

-ПП ПП -ПП

М. arvalis«obscurus» + + + + + +

M.arvalis «arvalis» + + - + + +

M.kirgisorum + - - + - +

M. rossiaemeridionalis + - - + + -

M. transcaspicus + - - + + -

M.agrestis - - - + - -

ЯОР-ПП - ПП-ДНК, ассоциированные с ЯО-районами; ценПП - прицентромерные ПП-ДНК; телПП - прителомерные ПП-ДНК; тел«8»ПП - ПП-ДНК прителомерного блока длинного плеча гомеологов хромосомы 8 Мдата/м «оЪзсигт»', «+» означает присутствие, «-» означает отсутствие последовательностей определенного типа.

Сокращения, введенные для обозначения разных наборов ПП-ДНК, отражают особенности их хромосомной локализации, а не принадлежность конкретному гетерохроматиновому блоку. Поэтому одинаково обозначенные, но выявляемые разными ДНК-пробами ПП-ДНК представляют собой разные наборы последовательностей.

По наличию-отсутствию в хромосомах указанных выше кластеров ПП-ДНК наиболее похожи, с одной стороны, виды М. го551аетеп<ИопаИ$ и М. ¡гатсаяркия, с другой - формы М.атаИх «апгаНя» и М.агмаИх «вЬясигия» (табл. 4). В то же время между собой эти две пары отличаются. Вид ММг^огит по этим характеристикам отличается и от одной, и от другой пары, но по субхромосомной локализации ЯО-районов и ассоциированных с ними кластеров ПП-ДНК имеет больше сходства с хромосомными формами М.стаИх.

4 .Анализ организации эухроматиновых районов Х-хромосом полевок.

С целью установления гомологии эухроматиновых районов Х-хромосом разных видов полевок и выявления внутрихромосомных перестроек были получены микродиссекционные районоспецифичные ДНК-пробы Х-хромосомы М.гои1аетег{с1юпаН$. Схема микродиссекции Х-хромосомы М.го.<;х1аетег1сИопаИ$ показана на рисунке 6а. Всего были получены ДНК-пробы четырех эухроматиновых районов и обозначены соответственно как ЮС1, 11X2, ЯХЗ и КХ4.

Все ДНК-пробы окрашивали районы Х-хромосомы М.гоязгаетепсИопаШ, соответствующие районам микродиссекции (рис. 6 б). Кроме ЮС1, ДНК-пробы помимо основного сигнала давали дополнительные минорные сигналы. Локализация и интенсивность этих минорных сигналов, позволили предположить, что они обусловлены наличием в данных районах Х-хромосомы М.го$$1аетепс1юпаИз небольших кластеров ПП-ДНК. В Х-хромосомах остальных видов ДНК-проба ЮС1 окрасила один основной район, а ДНК-пробы Ю£2, ЙХЗ и ИХ4 - более одного района, при этом характер распределения сигналов отличался у разных видов (рис. 6 6). — - - -

Каждый сегмент исследуемых Х-хромосом был охарактеризован наличием той или иной комбинации сигналов ДНК-проб. Это было положено в основу идентификации гомологичных районов. В качестве дополнительных маркеров гомологичных сегментов Х-хромосом были использованы данные по локализации генов СТА, ОбРБ, НРЯТ, РвК1 и ХКТ О^егоуа е1 а1., 1998), а также данные по локализации ряда клонированных последовательностей ДНК, полученных в параллельных исследованиях в нашей лаборатории (Аноприенко и др., неопубликованные данные). В работе представлен один вариант X-хромосомы М.ап>аШ, поскольку для Х-хромосом форм «стаИя» и «оЬясигш» не было выявлено различий.

При анализе возможных перестроек, имевших место в эволюции эухроматиновых районов Х-хромосом полевок, для каждого хромосомного

сегмента учитывали совокупность трех характеристик: комбинацию сигналов четырех районоспецифических ДНК-проб, локализацию уникальных последовательностей ДНК и характер ОТС-исчерченности.

Рис. 6. Идиограммы Х-хромосом полевок М.гозягаетепсИопаШ (Я), Млгатсазркю (Т), ММг&югит (К), М.ап>аНх (А) и МмягеяНя (АО), а - схема микродиссекции при получении районоспецифических ДНК-проб Х-хромосомы М. го8$1аетег1(ИопаШ. б - схема распределения сигналов ДНК-проб и локализации уникальных клонированных фрагментов ДНК в Х-хромосомах полевок: справа обозначены районы окрашиваемые ДНК-пробами ЮС1, 11X2, ЯХЗ и ЮС4 (слева направо); цифрами обозначены районы локализации генов ХТЭТ (5), РбК (6), йЬА (8), НРЯТ (10), вбРР (11) и анонимных последовательностей ДНК (1-4,7, 9,12).

При попарном сравнении Х-хромосом всех исследуемых видов полевок были определены районы, которые позволяли минимальным числом инверсионных событий трансформировать Х-хромосому одного вида в Х-хромосому другого. При этом предполагалось максимальное восстановление в реконструированных Х-хромосомах указанных выше характеристик. Положение центромер и блоков гетерохроматина не учитывалось.

В ходе взаимных преобразований Х-хромосом была определена общая для всех пар промежуточная форма, которая и была выбрана в качестве предковой Х-хромосомы обыкновенных полевок. По всем указанным характеристикам она совпала с Х-хромосомой М.Мг&вогит. Проведенный анализ показал, что из гипотетической предковой формы Х-хромосома М.ап>аШ могла возникнуть в результате двух инверсий, Х-хромосомы МЛгатсавркиъ и Ма^га'Гй - трех, а X-хромосома М. го8$1аетеп<ИопаШ - в результате четырех инверсий. При этом формирование Х-хромосомы Мгомюеотегг'Лоиа/« является продолжением на одну инверсию «пути» МЛгатсаъргсиз. В остальных случаях все инверсии уникальны.

Всего было выявлено 9 различных инверсий (6 из них в пределах группы «arvalis»), позволяющих реконструировать Х-хромосомы всех исследованных видов из одного исходного варианта. Нанесение на идиограмму гипотетической предковой Х-хромосомы обыкновенных полевок несовпадающих друг с другом границ инверсий, позволило определить 10 консервативных районов, сохранивших целостность в процессе эволюции Х-хромосом полевок. Расположение этих районов и их взаимная ориентация отличаются в X-хромосомах исследованных видов.

На идиограмме гипотетической предковой Х-хромосомы были определены три района, в которых находилось максимальное число точек разрывов-воссоединений. В этих же районах были локализованы кластеры ПП-ДНК, выявленные ДНК-пробой гетерохроматинового блока 8RC, и дополнительные минорные сигналы, выявленные районоспецифическими ДНК-пробами M.rossiaemeridionalis.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Наши исследования показали, что вошедшие в состав «новых» гетерохроматиновых блоков двух аутосом M.arvalis «obscurus» ПП-ДНК довольно широко представлены в хромосомах обыкновенных полевок. Расселение определенных ПП-ДНК происходило, в основном, по однотипным районам хромосом полевок: прителомерным, прицентромерным и ядрышкообразующим. Обнаруженные различия в распределении кластеров ПП-ДНК в хромосомах обыкновенных полевок вполне согласуются со сложившимися к настоящему времени представлениями о дивергенции исследованных видов и выделении в процессе эволюции двух независимых ветвей: M.transcaspicus~M.rossiaemeridionalis и MMrgisorum-M.arvalis.

Сравнение распределения кластеров ПП-ДНК в ЯОР-несущих хромосомах позволило предположить, что формирование новых ЯО-районов в эволюции хромосом обыкновенных полевок происходило за счет транспозиции и амплификации ПП-ДНК с вовлечением в- эти процессы генов рРНК. Формирование новых ЯО-районов в хромосомах полевок из разных эволюционных ветвей было сопряжено, по-видимому, с расселением разных наборов ПП-ДНК.

Анализ гомеологов хромосомы 5 M.arvalis «obscurus» показал, что транспозиция центромеры и возникновение нового прицентромерного гетерохроматинового блока при формировании хромосомы 5К явились результатом амплификации ПП-ДНК, одновременно или последовательно перенесенных в прителомерный район р-плеча исходной субметацентрической хромосомы. Подобным же образом, вероятно, в процессе эволюции видов обыкновенных полевок произошло изменение положения центромеры в гомеологичной хромосоме у общего предка M.transcaspicus и M.rossiaemeridionalis с образованием акроцентрической хромосомы.

При анализе точек разрывов-воссоединений предполагаемых перестроек в эволюции Х-хромосом полевок нами было обнаружено совпадение локализации «горячих точек» эволюционных перестроек и интеркалярных кластеров ПП-ДНК.

Результаты проведенного анализа дают основание полагать, что к предковым вариантам Х-хромосом и гомеологов хромосомы 5 Мап>а/и наиболее близки хромосомы ММг^огит и М.апнйк, а не хромосомы М.^ашсавркш и М.го$$1аетег1сИопаИч, как предполагалось раньше. Это дает основание по-новому взглянуть на эволюцию хромосом обыкновенных полевок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Данное исследование было направлено на изучение закономерностей эволюции ЯО-районов, механизмов формирования «новых» гетерохроматиновых блоков, особенностей реорганизации хромосомных районов при транспозиции центромер и эволюции эухроматиновых районов в Х-хромосомах близкородственных видов обыкновенных полевок (группа «ап>а/м» рода МкгоЫй).

Полученные результаты дают основания полагать, что в процессе эволюционной реорганизации хромосом обыкновенных полевок происходили транспозиции и амплификация различных повторяющихся последовательностей ДНК. Формирование в новых хромосомных районах кластеров повторяющихся последовательностей ДНК, по-видимому, обеспечивало возникновение новых функционально активных центромерных и ядрышкообразующих районов хромосом. Возникновение интеркалярных кластеров в эухроматиновых районах хромосом, вероятно, приводило к повышению частоты хромосомных разрывов в районах их локализации.

Процессы транспозиции и амплификации различных последовательностей ДНК, по-видимому, играют значительную роль в определении темпов и направления хромосомной эволюции у млекопитающих. Формирование кластеров определенных повторяющихся последовательностей может создавать предрасположенность к возникновению множественных однотипных хромосомных перестроек.

ВЫВОДЫ.

1. Выявлены различия кариотипов обыкновенных полевок по числу и набору ЯОР-несухцих хромосом, а также по субхромосомной локализации ЯО-районов в гомеологичных хромосомах. У М.гозпаетепсИопаИв ЯО-районы локализованы в прицентромерных районах я-плеч 16 пар акроцентрических хромосом, у М.^атсаБркш - в прицентромерных районах я-плеч И пар акроцентрических хромосом, у М.Мг&йогит - в р-плечах 13 пар акроцентрических аутосом и в р-плечах Х-хромосомы, у М.ап>аШ «оЬзсигий» - в р-плечах 6 пар акроцентрических хромосом и в прителомерных районах четырех пар крупных

метацентриков, у - М.агуаНь «апюИя» в р-плечах 4 пар акроцентрических хромосом и в прителомерных районах р-плеч одной пары субметацентриков.

2. Показано, что дополнительные С-гетерохроматиновые блоки в двух аутосомах М.атаНз «оЬясигиз» сформировались в результате амплификации разных последовательностей ДНК:

а) в хромосоме 8 «новый» гетерохроматиновый блок сформировался на базе уже существующего в q-плeчe прителомерного кластера повторяющихся последовательностей ДНК;

б) в хромосоме 5 «новый» гетерохроматиновый блок сформировался в результате амплификации повторяющихся последовательностей ДНК, кластеры которых отсутствуют в стандартной хромосоме 5, но были выявлены в прицентромерных, прителомерных и ядрышкообразующих районах многих других хромосом.

3. Кластеры повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК «новых» гетерохроматиновых блоков хромосом 5 и 8 М.атаНя «оЬзсигш», выявлены во многих хромосомах у всех исследованных видов обыкновенных полевок, преимущественно в прицентромерных, прителомерных и ядрышкообразующих районах. Небольшое число интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей ДНК обнаружено в эухроматиновых районах Х-хромосом и некоторых аутосом.

4. Показано, что транспозиция центромеры в гетерохроматиновый блок при формировании акроцентрического гомолога хромосомы 5 М.ап>а& «оЬ5сигих» произошла без изменения позиции теломерного, центромерного и эухроматиновых сегментов р-плеча исходной субметацентрической хромосомы.

5. Установлено совпадение порядка эухроматиновых сегментов района р1ег-^1.3 хромосомы 5 М.агуаШ с порядком гомологичных сегментов в субметацентрической хромосоме 5 М.Мг&яогит и акроцентрической хромосоме 1 М.¡гапзса.чр1сш. В акроцентрической хромосоме 1 М-гоязгаетепсЧопаШ в гомео логичном районе ц 1.2-^2.4 порядок эухроматиновых сегментов инвертирован.

6. Выявлены различия в расположении гомологичных эухроматиновых сегментов в Х-хромосомах пяти видов серых полевок - МгозвигетегиНопсйк, М.¡гатсазркиз, М.Ыг&вогит, М.агуаНя и Не менее 6 различных инверсий отличают между собой Х-хромосомы разных видов полевок в группе «ап>а/;'?», и минимум 3 инверсии отличают Х-хромосому Мя^еяГи от X-хромосомы ММг^огит, наиболее близкой к предковой Х-хромосоме обыкновенных полевок.

7. Показано совпадение локализации гипотетических «горячих точек» эволюционных перестроек и интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей ДНК в реконструированной предковой Х-хромосоме обыкновенных полевок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Мазурок Н.А., Рубцова Н.В., Исаенко А.А., Нестерова Т.Б., Мейер М.Н., Закиян С.М. GTG-окраска высокого разрешения и ядрышкообразующие районы хромосом двух видов обыкновенных полевок: M.rossiaemeridionalis и M.transcaspicus (Rodentia, Arvicolidae). // Генетика. 1998. Т. 34. С. 1073-1080.

2. Рубцова Н.В., Карамышева Т.В., Закиян С.М., Рубцов Н.Б. Молекулярно-цитогенетический анализ реорганизации Х-хромосом в эволюции. // Научный совет подпрограммы «Геном человека». Сборник отчетов за 2000 год. Москва. 2001. С. 42.

3. Рубцова Н.В., Карамышева Т.В., Бабочкина Т.И., Закиян С.М., Андреенкова О.В., Рубцов Н.Б. Анализ реорганизации хромосом микродиссекцией метафазных хромосом и многоцветным высокоразрешающим бэндингом (МСВ). // Научный совет подпрограммы «Геном человека». Сборник отчетов за 2000 год. Москва. 2001. С. 166.

4. Рубцова Н.В., Карамышева Т.В., Закиян С.М., Рубцов Н.Б. Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ организации Х-хромосом полевок подрода Microtus. //Биологические мембраны. 2001. Т. 18. С. 180-188.

5. Mazurok N.A., Rubtsova N.V., Isaenko А.А., Nesterova T.B., Zakian S.M. Comparative analysis of chromosomes in Microtus transcaspicus and Microtus subarvalis (Arvicolidae, Rodentia): high-resolution G-banding and localization of NORs. // Hereditas. 1996. V. 124. P. 243-250.

6. Nesterova T.B., Duthie S.M., Mazurok N.A., Isaenko A.A., Rubtsova N.V., Zakian S.M., Brockdorff N. Comparative mapping of X chromosomes in rat and five vole species of the genus Microtus. // Chromosome Research. 1998. V.6. P.41-48.

7. Nesterova T.B., Mazurok N.A., Rubtsova N.V., Isaenko A.A., Zakian S.M. The vole gene map. // ILAR Journal. 1998. V. 39. P. 138-144.

8. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Karamysheva T.V., Zakian S.M. Microdissection of metaphase chromosomes and painting probes in clinical diagnostics and studies of karyotype evolution in mammals. // Proceedings of IV Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic science in ISTC Activities". Novosibirsk. 2001. P. 213-217.

9. Mazurok N.A., Rubtsova N.V., Isaenko A.A., Pavlova M.E., Slobodyanyuk S.Y., Nesterova T.B., Zakian S.M. Comparative chromosome and mitochondrial DNA analyses and phylogenetic relationships within common voles (Microtus, Arvicolidae). // Chromosome Research. 2001. V. 9. P. 107-120.

10. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Anopriyenko O.V., Karamysheva T.V., Shevchenko A. I., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. Reorganization of the X chromosome in voles of the genus Microtus. // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.99. P. 323-329.

3 -А

Подписано к печати 29. 09. 2003.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 93.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН

630090, Новосибирск, проспект академика М. А. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рубцова, Надежда Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.777.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Некоторые аспекты организации и эволюции генома млекопитающих.

1.2. Гетерохроматиновые районы в хромосомах млекопитающих.

1.2.1. Конститутивный гетерохроматин.

1.2.2. Центромерные районы.

1.2.3. Теломерные районы.

1.2.4. Ядрышкообразующие районы.

1.3. Повторяющиеся последовательности ДНК и хромосомные перестройки.

1.3.1. Мобильные элементы.

1.3.2. Интерстициальные теломерные повторы.

1.3.3. Сегментные дупликации.

1.4. Эволюционная консервативность Х-хромосомы млекопитающих.

1.5. Микродисекционные ДНК-пробы в хромосомном пэйнтинге.

1.6. Группа обыкновенных полевок рода Microtus (отряд Rodentia).

1.6.1. Систематическое положение и филогенетические отношения внутри группы.

1.6.2. Кариологические характеристики обыкновенных полевок.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2. Получение культур первичных фибробластов легких.

2.3. Фиксация клеток.

2.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом.

2.5. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом.

2.5.1. GTG-дифференциальное окрашивание хромосом.

2.5.2. Ag-окрашивание.

2.5.3. Последовательное окрашивание хромосом разными методами.-.

2.5.4. С-дифференциальное окрашивание.

2.5.5. GTG-окрашивание хромосом для микродиссекции.

2.6. Получение микродиссекционных ДНК-проб.

2.7. Введение метки в ДИК микродиссекционных ДНК-проб.

2.8. ДНК-проба для детекции рДНК.

2.9. Флуоресцентная in situ гибридизация.

2.9.1. Супрессионная in situ гибридизация.

2.10. Детекция на цитологических препаратах меченых ДНК-проб.

2.10.1. Детекция ДНК-проб, меченных биотин-16-дУТФ.

2.10.2. Детекция ДНК-проб, меченых дигоксигенин-11-дУТФ.

2.10.3. Совместное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб.

2.11. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Локализация ядрышкообразующих районов в хромосомах обыкновенных полевок.

3.1.1. Локализация ЯО-районов с применением Ag-окрашивания хромосом.

3.1.2. Локализация генов рибосомных РНКс применением FISH.

3.1.3. Сравнение хромосомной локализации ЯО-районов у разных видов.

3.2. Анализ реорганизации гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus" при формировании дополнительных блоков гетерохроматина и в процессе эволюции видов.

3.2.1. Характеристика дополнительных блоков гетерохроматина перестроенных гомологов хромосом 5 и 8 М arvalis "obscurus".

3.2.2. Районоспецифические ДНК-пробы хромосом M.arvalis «obscurus».

3.2.3. CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматиновых блоков 5КС и 8КС.

3.2.4. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосом 8, 8К M.arvalis «obscurus» и их гомеологов.

3.2.5. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосом

5 и 5RM.arvalis "obscurus".

3.2.6. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосомы

M.arvalis "obscurus" и ее гомеологов.

3.3. Распределение в хромосомах полевок подрода Microtus кластеров повторяющихся последовательностей ДНК, выявленных в разных вариантах FISH.

3.3.1. CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматинового блока 5КС с метафазными хромосомами полевок.

3.3.2. CISS-гибридизация ДНК-пробы гетерохроматинового блока 8КС с метафазными хромосомами полевок.

3.3.3. CISS-гибридизация ДНК-пробы р-плеча хромосомы 8R с метафазными хромосомами полевок.;.

3.3.4. Одновременная FISH ДНК-проб разных гетерохроматиновых блоков с метафазными хромосомами полевок.

3.3.5. Межвидовые различия обыкновенных полевок по характеру распределения кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных ДНК гетерохроматиновых блоков M.arvalis «obscurus».

3.4. Анализ организации эухроматиновых районов Х-хромосом обыкновенных полевок.

3.4.1. Установление гомологии эухроматиновых районов в Х-хромосомах полевок.

3.4.2. Анализ возможных перестроек эухроматиновых районов Х-хромосом в эволюции обыкновенных полевок.

3.4.3. Анализ локализации точек разрывов-воссоединений предполагаемых инверсий в ходе реорганизации Х-хромосом полевок.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Кластеры гомологичных повторяющихся последовательностей

ДНК в хромосомах обыкновенных полевок.

4.2. Повторяющиеся последовательности ДНК и дивергенция видов обыкновенных полевок.

4.3. ЯО-районы и кластеры повторяющихся последовательностей

ДНК в хромосомах обыкновенных полевок.

4.4. Эволюция ЯО-районов обыкновенных полевок.

4.5. Транспозиции центромер в хромосомах полевок.

4.5. Эволюция Х-хромосом обыкновенных полевок.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-цитогенетический анализ эволюции хромосом полевок группы "arvalis" рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia)"

Актуальность проблемы.

Совокупность результатов дифференциального окрашивания хромосом, сравнительного картирования и сравнительного хромосомного пэйнтинга (ZOO-FISH) позволила провести сравнение хромосом у большого числа видов, даже у филогенетически весьма далеких, и определить основные закономерности макроэволюции геномов млекопитающих. К настоящему времени установлена гомология хромосом и хромосомных районов у нескольких десятков видов, выявлены, так называемые, консервативные районы хромосом млекопитающих, которые в ряде таксонов сохраняют свою целостность в течение десятков миллионов лет эволюции (O'Brien et al., 1999). Самой консервативной группой сцепления в геноме млекопитающих является Х-хромосома, и у всех плацентарных она представлена единым элементом (Graves, 1998). Кариотипическая эволюция внутри большинства таксонов обычно ограничивается рекомбинацией базовых элементов, внутрихромосомными инверсиями, транспозициями центромер и вариациями в локализации и размерах блоков С-гетерохроматина. В то же время, в некоторых филогенетических ветвях происходили значительные преобразования кариотипов за счет множественных перестроек хромосом, приводящих к нарушению их целостности и образованию новых групп сцепления (Rubtsov et al., 1988; Graphodatsky 1989). Значительная реорганизация хромосом в одних таксонах и их высокая консервативность в других свидетельствуют о неравномерных темпах хромосомной эволюции в разных ветвях филогенетического древа млекопитающих. Самые высокие темпы кариотипической дивергенции по современным представлениям характерны для мышевидных грызунов (Van Etten et al., 1999; Murphy et al., 2001).

Сравнительный цитогенетический и молекулярно-генетический анализ близкородственных видов показал, что наиболее эволюционно лабильными элементами хромосом являются центромерные, теломерные и ядрышкообразующие районы. Именно эти районы хромосом чаще- всего принимают участие в эволюционных межхромосомных перестройках при рекомбинации базовых групп сцепления и при создании новых морфологических вариантов хромосом за счет внутрихромсомных перестроек. Во всех перечисленных выше районах хромосом находится большое число разнообразных повторяющихся последовательностей ДНК (Karpen, Allshire, 1997; Blackburn, 1991; Mefford, Trask, 2002).

Возможно, именно изучение закономерностей формирования кластеров повторяющихся последовательностей ДНК даст ключ к пониманию механизмов эволюционной реорганизации хромосом млекопитающих. Расположение «горячих точек» хромосомных перестроек при патологиях у человека в значительной степени совпадает с локализацией кластеров различных повторов в эухроматиновых районах хромосом (Azzalin et al., 2001; Bailey et al., 2002). Результаты ZOO-FISH продемонстрировали, что в эволюционных перестройках хромосом млекопитающих также существуют «горячие точки», то есть районы, в которых происходят разрывы хромосом в разных филогенетических ветвях. В некоторых случаях было показано совпадение локализации точек разрыва хромосом в эволюции млекопитающих с точками разрыва при хромосомных аномалиях у человека (Schibler et al., 1998).

В решении ряда вопросов, связанных с механизмами эволюционных хромосомных перестроек, большую пользу может принести сравнительный анализ близкородственных видов из таксонов, для которых характерны высокие темпы кариотипической эволюции. В хромосомах видов, начавших дивергировать относительно недавно, с большей вероятностью могут сохраниться «следы» молекулярных процессов, сопряженных с реорганизацией хромосом.

Одним из эффективных методов анализа реорганизации хромосом при сравнении близкородственных видов млекопитающих является хромосомный пэйнтинг с использованием районоспецифических ДНК-проб, полученных на основе микродиссекции метафазных хромосом. Такие ДНК-пробы с равным успехом могут быть получены и для эухроматиновых, и для гетерохроматиновых районов хромосом, поэтому их можно использовать для анализа различных вариантов хромосомных перестроек (Guan et al., 1994; Rubtsov et al., 1995; Chudoba et al., 1996). Применение районоспецифических ДНК-проб позволяет выявлять внутрихромосомные перестройки при сравнении гомологичных по генетическому составу хромосомных элементов разных видов. При анализе перестроек в эухроматиновых районах Х-хромосом млекопитающих хромосомный пэйнтинг может быть информативным только при использовании районоспецифических ДНК-проб (Rubtsov et al., 1997; Hassanane et al., 1998).

Группа видов обыкновенных полевок (группа «arvalis») рода Microtus обладает набором характеристик, которые делают ее весьма перспективной для использования в качестве модельного объекта при изучении механизмов эволюции хромосом млекопитающих. Род Microtus относится к быстро эволюционирующей филогенетической ветви отряда Rodentia - мышевидным грызунам (Myomorpha). Обыкновенные полевки начали дивергировать относительно недавно, но при этом отличаются большим набором внутрихромосомных перестроек (Мейер и др., 1996; Mazurok et al., 2001). Ряд данных свидетельствует о том, что процесс реорганизации хромосом у наиболее молодого вида M.arvalis продолжается и в настоящее время.

Цели и задачи.

Основные цели данного исследования - выявление закономерностей реорганизации эволюционно лабильных районов хромосом и консервативных хромосомных элементов в ходе дивергенции близкородственных видов полевок рода Microtus. Для достижения поставленных целей необходимо было решить несколько конкретных задач.

1. Установить хромосомную локализацию ядрышкообразующих районов и сравнить ЯОР-несущие хромосомы у 4 видов обыкновенных полевок.

2. Определить наличие в хромосомах вида M.arvalis «obscurus» кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК, принимавшим участие в формировании «новых» С-гетерохроматиновых блоков в аутосомах 5 и 8.

3. Провести анализ распределения в хромосомах обыкновенных полевок кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК новых С-гетерохроматиновых блоков двух аутосом М. arvalis «obscurus».

4. Сравнить порядок расположения эухроматиновых сегментов р-плеча и околоцентромерного района q-плеча в стандартной хромосоме 5 М. arvalis «obscurus» с расположением гомологичных сегментов в перестроенном акроцентрическом гомологе с дополнительным блоком С-гетерохроматина.

5. Сравнить порядок расположения эухроматионовых сегментов р-плеча и околоцентромерного района q-плеча в хромосоме 5 М. arvalis «obscurus» с порядком сегментов в гомеологичных районах хромосом других видов обыкновенных полевок.

6. Определить расположение гомологичных эухроматиновых районов в Х-хромосомах пяти близкородственных видов рода Microtus, и провести анализ возможных перестроек в эволюции Х-хромосом полевок.

Научная новизна.

Впервые для сравнительного анализа хромосом полевок был применен пэйнтинг с использованием районоспецифических ДНК-проб, и не только эухроматиновых, но и гетерохроматиновых районов хромосом полевок.

Впервые было показано, что формирование «новых» гетерохроматиновых С-блоков в аутосомах полевок может происходить за счет амплификации последовательностей ДНК, представленных в виде кластеров в прителомерных, прицентромерных и ядрышкообразующих районах многих хромосом кариотипа.

Впервые однозначно показано, что транспозиция центромерного района при формировании акроцентрического гомолога хромосомы 5 М. arvalis «obscurus» не сопровождалась изменением позиции теломерного, центромерного и эухроматиновых сегментов р-плеча исходной субметацентрической хромосомы.

Впервые в хромосомах четырех видов обыкновенных полевок показана связь межвидовых различий в субхромосомной локализации ЯОР с наличием разных наборов кластеров повторяющихся последовательностей ДНК.

Впервые сравнительный анализ Х-хромосом близкородственных видов был проведен с использованием набора районоспецифических ДНК-проб, перекрывающих все эухроматиновые районы Х-хромосомы. При анализе перестроек в Х-хромосомах пяти видов серых полевок была обнаружена солокализация «горячих точек» эволюционных перестроек с расположением интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей.

Практическая ценность.

Данные по хромосомной локализации ЯО-районов и перестройкам внутри X-хромосом дополняют общую цитогенетическую характеристику хромосомных наборов четырех видов группы обыкновенных полевок, которая в настоящее время используется в качестве модельного объекта в работах по исследованию механизмов процесса инактивации в Х-хромосомах млекопитающих. Полученные в работе результаты расширяют наши представления о возможных механизмах эволюционных перестроек в хромосомах млекопитающих и позволяют по-новому взглянуть на роль повторяющихся последовательностей ДНК в возникновении однотипных перестроек хромосом, в том числе в эволюции ядрышкообразующих районов.

Апробация.

Результаты работы были доложены на следующих конференциях и совещаниях:

Конференция «Геном человека 2000», Черноголовка, декабрь 2000;

Всероссийское Совещание «Современные проблемы эволюции и филогении животных» Москва, 3-5 декабря 2001;

ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic science in ISTC Activities" Novosibirsk, 23-27 April, 2001.

Кроме того, результаты были представлены на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2002.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях. Работы были поддержаны грантами РФФИ, ПНГ и INTAS.

Вклад автора.

Автором были выполнены в основном или в полном объеме следующие виды работ: получение и культивирование используемых в работе первичных линий фибробластов полевок; фиксация клеток и приготовление препаратов метафазных хромосом для всех вариантов цитогенетического анализа и для микродиссекции; дифференциальное окрашивание хромосом разными методами и в различных комбинациях и анализ полученных при этом результатов; анализ результатов всех вариантов FISH; обработка и анализ полученных данных.

Мечение и FISH клонированного фрагмента ДНК, содержащего последовательности рДНК человека, провели к.б.н. Воробьева Н.В. и с.н.с. Сердюкова Н.А. (лаборатория цитогенетики человека и животных Института цитологии и генетики СО РАН).

Получение микродиссекционных ДНК-проб и FISH с их использованием выполнили д.б.н. Рубцов Н.Б.и к.б.н. Карамышева Т.В. (лаборатория морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН).

Структура и объём диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Рубцова, Надежда Владимировна

ВЫВОДЫ.

1. Выявлены различия кариотипов обыкновенных полевок по числу и набору ЯОР-несущих хромосом, а также по субхромосомной локализации ЯО-районов в гомеологичных хромосомах. У M.rossiaemeridionalis ЯО-районы локализованы в прицентромерных районах q-плеч 16 пар акроцентрических хромосом, у М. transcaspicus - в прицентромерных районах q-плеч 11 пар акроцентрических хромосом, у M.kirgisorum - в р-плечах 13 пар акроцентрических аутосом и в р-плечах Х-хромосомы, у M.arvalis «obscurus» - в р-плечах 6 пар акроцентрических хромосом и в прителомерных районах четырех пар крупных метацентриков, у -M.arvalis «arvalis» в р-плечах 4 пар акроцентрических хромосом и в прителомерных районах р-плеч одной пары субметацентриков.

2. Показано, что дополнительные С-гетерохромати новые блоки в двух аутосомах M.arvalis «obscurus» сформировались в результате амплификации разных последовательностей ДНК: а) в хромосоме 8 «новый» гетерохроматиновый блок сформировался на базе уже существующего в q-плече прителомерного кластера повторяющихся последовательностей ДНК; б) в хромосоме 5 «новый» гетерохроматиновый блок сформировался в результате амплификации повторяющихся последовательностей ДНК, кластеры которых отсутствуют в стандартной хромосоме 5, но были выявлены в прицентромерных, прителомерных и ядрышкообразующих районах многих других хромосом.

3. Кластеры повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК «новых» гетерохроматиновых блоков хромосом 5 и 8 M.arvalis «obscurus», выявлены во многих хромосомах у всех исследованных видов обыкновенных полевок, преимущественно в прицентромерных, прителомерных и ядрышкообразующих районах. Небольшое число интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей ДНК обнаружено в эухроматиновых районах Х-хромосом и некоторых аутосом.

4. Показано, что транспозиция центромеры при формировании акроцентрического гомолога хромосомы 5 M.arvalis «obscurus» произошла без изменения позиции теломерного, центромерного и эухроматиновых сегментов р-плеча исходной субметацентрической хромосомы.

5. Установлено совпадение порядка эухроматиновых сегментов района pter-»ql.3 хромосомы 5 M.arvalis с порядком гомологичных сегментов в субметацентрической хромосоме 5 M.kirgisorum и акроцентрической хромосоме 1 M.transcaspicus. В акроцентрической хромосоме 1 M.rossiaemeridionalis в гомеологичном районе ql.2—>q2.4 порядок эухроматиновых сегментов инвертирован.

6. Выявлены различия в расположении гомологичных эухроматиновых сегментов в Х-хромосомах пяти видов серых полевок — M.rossiaemeridionalis, M.transcaspicus, M.kirgisorum, M.arvalis и M.agrestis. He менее 6 различных инверсий отличают между собой Х-хромосомы разных видов полевок в группе «arvalis», и минимум 3 инверсии отличают Х-хромосому M.agrestis от X-хромосомы M.kirgisorum, наиболее близкой к предковой Х-хромосоме обыкновенных полевок.

7. Показано совпадение локализации гипотетических «горячих точек» эволюционных перестроек и интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей ДНК в реконструированной предковой Х-хромосоме обыкновенных полевок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Несмотря на многочисленные и всесторонние исследования эволюции хромосом млекопитающих, до настоящего времени остаются неизученными молекулярные механизмы возникновения хромосомных перестроек и неизвестны факторы, определяющие их интенсивность. Самыми эволюционно лабильными элементами хромосом являются гетерохроматиновые районы, в которых находится большое количество разнообразных повторяющихся последовательностей ДНК. Крупные кластеры повторяющихся последовательностей локализованы в теломерных, центромерных и ядрышкообразующих районах. И именно эти районы наиболее часто принимают участие в перекомбинации хромосомных элементов и в создании новых морфологических вариантов хромосом в эволюции кариотипов млекопитающих.

Наиболее высокие шансы обнаружить «следы» реорганизации хромосом в кариотипах современных видов возникают при проведении сравнительных молекулярно-цитогенетических исследований в «молодых» таксонах, характеризующихся высоким уровнем хромосомной изменчивости. Это определило наш выбор близкородственных видов обыкновенных полевок, составляющих группу «arvalis» рода Microtus, в качестве модельного объекта для изучения закономерностей хромосомной эволюции. Наше исследование было направлено на изучение закономерностей эволюции ЯО-районов, механизмов формирования «новых» гетерохроматиновых блоков, особенностей реорганизации хромосомных районов при транспозиции центромер и эволюции эухроматиновых районов Х-хромосом полевок. Для сравнительного анализа хромосом исследуемых видов была применена флуоресцентная in situ гибридизация с использованием микродиссекционных ДНК-проб различных эухроматиновых и гетерохроматиновых районов хромосом обыкновенных полевок.

В результате проведенного исследования было установлено, что виды обыкновенных полевок отличаются числом и набором ЯОР-несущих хромосом. Выявлены также различия по субхромосомной локализации ЯО-районов. Эти различия оказались сопряжены с наличием в ЯО-районах кластеров разных наборов повторяющихся последовательностей ДНК, которые были обнаружены при анализе хромосом с помощью FISH ДНК-проб «новых» гетерохроматиновых блоков аутосом M.arvalis «obscurus». Полученные данные согласуются с современными представлениями о нескольких этапах дивергенции видов обыкновенных полевок в ходе эволюции.

В формировании «новых» гетерохроматиновых блоков M.arvalis «obscurus» принимали участие повторяющиеся последовательности ДНК, присутствующие в виде кластеров в прителомерных, прицентромерных и ядрышкообразующих районах многих хромосом обеих кариоформ вида M.arvalis. Морфологическое сходство ЯОР-несущих акроцентриков и акроцентрического гомолога хромосомы 5 M.arvalis «obscurus», и наличие у них прицентромерных и ассоциированных с ЯО-районами кластеров гомологичных повторяющихся последовательностей, указывает на то, что формирование новых ЯО-районов в эволюции хромосом полевок могло происходить в результате транспозиций и последующей амплификации повторяющихся последовательностей ДНК с вовлечением в эти процессы генов рибосомных РНК.

В результате сравнения организации эухроматиновых и прицентромерных гетерохроматиновых районов гетероморфных гомологов хромосомы 5 M.arvalis «obscurus» было показано, что транспозиция центромеры в этой паре хромосом произошла без изменения порядка эухроматиновых сегментов. Реорганизация субметацентрической хромосомы 5, видимо, явилась следствием одновременного или последовательного переноса в прителомерный район р-плеча повторяющихся последовательностей ДНК, последующая амплификация которых привела к формированию нового гетерохроматинового блока, новой центромеры и нового ЯО-района. В эволюции гомеологов хромосомы 5 M.arvalis центрическая транспозиция произошла, вероятнее всего, в филогенетической ветви M.rossiaemeridionalis и M.transcaspicus и не за счет инверсионных событии, а в результате переноса и амплификации последовательностей ДНК, способных формировать активную центромеру.

Установление гомологии эухроматиновых районов Х-хромосом пяти близкородственных видов полевок рода Microtus было проведено на основании результатов FISH с использованием набора районоспецифических ДНК-проб. Эти данные в совокупности с данными по локализации в Х-хромосомах полевок уникальных последовательностей ДНК позволили реконструировать предковый вариант эухроматинового района Х-хромосомы обыкновенных полевок и определить минимальное количество инверсионных событий, отличающих современные формы друг от друга и от предполагаемого предкового варианта. При этом гипотетические «горячие точки» эволюционных перестроек Х-хромосом полевок совпали по локализации с районами расположения в реконструированной предковой Х-хромосоме интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей ДНК.

В результате проведенного анализа перестроек в эволюции эухроматиновых районов Х-хромосом и гомеологов хромосомы 5 M.arvalis оказалось, что к предковому варианту соответствующих хромосом обыкновенных полевок в обоих случаях наиболее близки хромосомы M.kirgisorum и M.arvalis, а не хромосомы M.rossiaemeridionalis и M.transcaspicus, как предполагалось раньше. Это дает повод по-новому взглянуть на эволюцию кариотипов обыкновенных полевок.

На основании проведенного исследования можно сделать заключение, что в процессе эволюционной реорганизации хромосом обыкновенных полевок происходили транспозиции и амплификация различных повторяющихся последовательностей ДНК. Формирование в новых хромосомных районах кластеров повторяющихся последовательностей, по-видимому, обеспечивало возникновение новых функционально активных центромерных и ядрышкообразующих районов хромосом. Возникновение интеркалярных кластеров в эухроматиновых районах хромосом, могло приводить к повышению частоты хромосомных разрывов в районах их локализации.

Процессы транспозиции и амплификации различных последовательностей ДНК, вероятно, играют значительную роль в определении темпов и направления хромосомной эволюции у млекопитающих. Формирование кластеров определенных повторяющихся последовательностей может создавать предрасположенность к возникновению множественных однотипных хромосомных перестроек. Возможно, именно этим объясняется ряд проблем, возникающих при филогенетических построениях в различных таксонах, базирующихся на результатах сравнительного хромосомного анализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рубцова, Надежда Владимировна, Новосибирск

1. Ахвердян М.Р., Ляпунова Е.А., Воронцов И.Н., Тесленко С.В. Внутрипопуляционный аутосомный полиморфизм обыкновенной полевки Microtus arvalis Закавказья. // Генетика. 1999. Т.35. N.12, С.1687-1698.

2. Беридзе Т.Г. Сателлитная ДНК. // М.: Наука. 1982. С. 120.

3. Графодатский А.С. Сравнительная цитогенетика трех видов собачьих (Carnivora, Canidae). //Генетика. 1983. Т.19. С.778-783.

4. Графодатский А.С. Ядрышкообразующие хромосомы домашней свиньи. // Цитология и генетика. 1981. Т. 15. С. 29-31.

5. Графодатский А.С., Лушникова Т.П., Воробьева Н.В. Инактивация кластера рРНК генов на 2-й паре хромосом у алеутских норок. // ДАН 1985. Т.282. С.171-173.

6. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих. Новосибирск: Наука. 1988. 128 С.

7. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Ядрышкообразующие хромосомы девяти видов куницеобразных (Carnivora, Mustelida). // ДАН. 1980. Т. 225. С.1487-1489.

8. Громов И.М., Поляков И.Я. Фауна СССР. Млекопитающие. Полевки (Microtinae) // Л.: Наука. 1977. Т.З. 504 С.

9. Дейвис К. Полимеразная цепная реакция. // Анализ генома. Методы. Изд-во «Мир» 1990.

10. Иваницкая Е.Ю. Существуют ли закономерности хромосомной эволюции млекопитающих? // Мат. Всесоюз. совещ. "Эволюционные и генетические исследования млекопитающих". Влад. ДВО АН СССР. 1990. 4.1. С.3-16

11. Козловский А.И., Булатова Н.Ш., Новиков А.Д. Двойной эффект инверсии в кариотипе обыкновенной полевки. //ДАН. 1988. Т.298. С.994-997.

12. Малыгин В.М. Систематика обыкновенной полевки. // М.:Наука. 1983.208 С.

13. Малыгин В.М., Саблина О.В. Кариотипы. // Обыкновенная полевка: Виды* двойники. М.: Наука. 1994. С.7-25.

14. Мейер М.Н., Голенищев Ф.Н., Раджабли С.И., Саблина O.JI. Серые полевки фауны России и сопредельных территорий. // Труды Зоологического института. Санкт-Петербург. 1996. Т.232. 320 С.

15. Мейер М.Н., Раджабли С.И. , Булатова Н.Ш. , Голенищев Ф.Н. ! Кариологические особенности и вероятные родственные связи полевокгруппы "arvalis" (Rodentia, Cricetidae; // Зоол. ж. 1985. Т.64. №3. С.417-428.

16. Родин С.Н. Проблемы теории эволюции мультигенных семейств. // Итоги науки и техники "Молекулярная биология". 1985. Т.21. М.: ВИНИТИ С.198-240.ft

17. Рубцов Н.Б., Плюснина Е.В., Сердюкова Н.А., Астахова Н.М., и др. Новые возможности анализа сложных хромосомных перестроек в клеточных гибридах. //Генетика. 1998. Т. 34. С.240-247.

18. Рубцова Н.В., Карамышева Т.В., Закиян С.М., Рубцов Н.Б. Молекулярно-цитогенетический анализ реорганизации Х-хромосом в эволюции. // Научный совет подпрограммы «Геном человека». Сборник отчетов за 2000 год. Москва. 2001а. С.42.

19. Рубцова Н.В., Карамышева Т.В., Закиян С.М., Рубцов Н.Б. Сравнительный молекулярно-цитогенетический анализ организации Х-хромосом полевок подрода Microtus. /У Биологические мембраны. 2001в. Т.18. С.180-188.

20. Храпов Е.А., Елисафенко Е.А., Рогозин И.Б., Павлова С.В., и др. Характеристика нового семейства тандемно организованных повторов STR47 у обыкновенных полевок. // Молекулярная Биология. 1998. N.32. С.987-991.

21. Agresti A, Rainaldi G, Lobbiani A, Magnani I, et al. Chromosomal location by in situ hybridization of the human Sau3A family of DNA repeats. // Hum. Genet. 1987. V.75. N.4. P.326-332.

22. Alexandrov I., Kazakov A., Tumeneva I., Shepelev V., Yurov Y. Alpha-satellite DNA of primates: old and new families. // Chromosoma. 2001. V.l 10. P.253-266.

23. Alexandrov I.A., Mitkevich S.P., Yurov Y.B. The phylogeny of human chromosome specific alpha satellite. // Chromosoma. 1988. V.96. P.443- 453.

24. Amar L.C., Danadalo L., Hanauer A., et al. Conservation and reorganization of loci on the mammalian X chromosome: A molecular framework for the identification of homologous subchromosomal regions in man and mouse. // Genomics. 1988. V.22. P.220-230.

25. Amor D.J., Choo H.A. Neocentromeres: role in human disease, evolution, and centromere study. //Am. J. Hum. Genet. 2002. V.71. P.695-714.

26. Arnheim N., Krystal M., Sdhmickel R., Wilson G., et al. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonghomologous chromosomes in man and ape // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 7323-7327.

27. Arrighi F.E., Hsu Т.Е. Localization of heterochromatin in human chromosomes. // Cytogenetics. 1971. V.10. P.81-86.

28. Assum G., Pasantes J., Glaser В., Schempp W., Wohr G. Concerted evolution of members of the multisequence family chAB4 located on various nonhomologous chromosomes. //Mammalian Genome. 1998. V.9. P.58-63.

29. Azzalin C.M., Nergadze S.G., Giulotto E. Human intrachromosomal telomeric-like repeats: sequence organization and mechanisms of origin. // Chromosoma. 2001. V.110. N.2. P.75-82.

30. Bailey J.A., Gu Z., Clark R.A., Reinert K., Samonte R.V., et al. Recent segmental duplications in the human genome. // Science. 2002. V297. N.5583. P.945-947.

31. Baltimore D. Gene conversion: some implication for immunoglobulin genes // Cell. 1981.V.21.P. 592- 594.

32. Band M.R., Larson J.Y., Rebeiz M. et al. An ordered comparative map of the cattle and human genomes // Genome Res. 2000. V.10. P.1359-1368.

33. Bertoni L., Attolini C., Faravelli M., et al. Intrachromosomal telomere-like DNA sequences in Chinese hamster. // Mamm. Genome. 1996. V.7. N.l 1. P.853-855.

34. Bertoni L., Attolini C., Tessera L., Mucciolo E., Giulotto E. Telomeric and nontelomeric (TTAGGG)n sequences in gene amplification and chromosome stability. // Genomics. 1994. V.24. P.53-62.

35. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. // Nature. 1991. V.350. P.569-573.

36. Blair H.J., Reed V., Laval S.H., Boyd Y. New insights into the man-mouse comparative map of the X chromosome. // Genomics. 1994. Y.19. 215-220.

37. Bloom S.E., Goodpasture C. An improved techniqe for selective silver staining of nucleolar organizer regions in human chromosomes. // Hum. Genet. 1976. V.34. P.323-331.

38. Bouffler S.D., Morgan W.F., Pandita Т.К., Slijepcevic P. The involvement of telomeric sequences in chromosomal aberrations. // Mutat. Res. 1996. V.366. N.2.1. Р.129-135.

39. Breen М., Thomas R., Binns M.M., et al. Reciprocal chromosome painting reveals detailed regions of conserved synteny between the karyotypes of the domestic dog (Canis familiaris) and human. // Genomics. 1999. V.61. P. 145-155.

40. Brinkley B.R., Ouspenski I., Zinkovski R.P. Structure and molecular organization of the centromere-kinetochore complex. // Trends Cell Biol. 1992. V.2. P. 15-21.

41. Buchwitz B.J., Ahmad K., Moore L.L., Roth M.B., Henikoff S. A histone-H3-like protein in C. elegans. //Nature. 1999. V.401. P.547-548.

42. Cavagna P., Stone G., Stanyon R. Black rat (Rattus rattus) genomic variability characterized by chromosome painting. // Mamm Genome. 2002. V.13. P.157-163.

43. Charlesworth В., Sniegowski P., Stephan W. The evolutionary dynamic of repetitive DNA in eukaryotes. // Nature. 1994. V.371. P.215-220.

44. Cheung S.W., Sun L., Feathestone T. Visualization of NORs inrelation to the precise chromosomal localization of ribosomal RNA genes. // Cytogenet. Cell Genet. 1989. V.50. P.93-97.

45. Chudoba I., Plesch A., Loerch Т., et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosomes. // Cytogenet Cell Genet. 1999. V.84. P.156-160.

46. Chudoba I., Rubtsov N., Senger G., et al. Improved detection of chromosome 16 rearrangements in acute myeloid leukemias using 16p and 16q specific microdissection DNA libraries. // Oncology reports. 1996. N.3. P.829-832.

47. Chute I., Le Y., Ashley Т., Dobson MJ. The telomere-associated DNA from human chromosome 20p contains a pseudotelomere structure and shares sequences with the subtelomeric regions of 4q and 18p.// Genomics. 1997. V.15. P.51-60.

48. Clarke L. Centromeres of budding and fission yeasts. // Trends Genet. 1990. V.6. N.5. P.150-154.

49. Cremer Т., Lichter P., Borden J., et al.-Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. // Hum Genet. 1988. V.80. P.235-246.

50. Csink A.K., Henikoff S. Somthing from nothing: the evolution and utility of satellite repeats. // Trends Genet. 1998. V.14. P.200-204.

51. Curcio M.J., Morse R.H. Tying together integration and cromatin (comment). // Trends Genet. 1996. V.12. P. 436-438

52. DeBry R.W., Seldin M.F. Human/mouse homology relationships. // Genomics. 1996. V.33. P.337-351.

53. Dev V.G., Miller D.A., Rechsteiner M., Miller O.J. Time of suppression of human rRNA genes in mouse-human hybrid cells. // Exp. Cell Res. 1979. V.123. P.47-54.

54. Earnshaw W.C., Ratril H., Seffen G. Visualization of centromere proteins CENT-B and CENT-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. // Chromosoma. 1989. V.98. P.l-12.

55. Eichler EE. Recent duplication, domain accretion and the dynamic mutation of the human genome. // Trends Genet. 2001. V.17. P.661-669.

56. Elder J.F., Turner B.J. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes. // The Quarterly Review of Biology. 1995. V.70. N.3. P.297-320.

57. Emanuel BS, Shaikh TH. Segmental duplications: an 'expanding' role in genomic instability and disease. // Nat. Rev. Genet. 2001. V.2. N.10. P.791-800.

58. Engel W., Zenzes M.T., Schmid M. Activation of mouse ribosomal RNA genes at the 2-cell stage. //Hum. Genet. 1977. V.38. P.57-63.

59. Evans H.J., Buckland R.A., Pardue M.L. Location of the genes coding for 18S and 28S ribosomal RNA in the human genome. // Chromosoma. 1974. V.48. P.405-426.

60. Everts R.E., van Wolferen M.E., Versteeg S.A., et al. A radiation hybrid map of the X-chromosome of the dog (Canis familiaris). II Cytogenet. Cell Genet. 2002. V.98. P.86-92.

61. Faravelli M., Moralli D., Bertoni L., Attolini C., et al. Two extended arrays of a satellite DNA sequence at the centromere and.afthe short-arm telomere of Chinese hamster chromosome 5. // Cytogcnct. Cell Genet. 1998.V.83. N.3-4. P.281-286.

62. Ferguson-Smith M.A. Genetic analysis by chromosome sorting and painting: Phylogenetic and diagnostic applications. // Eur.J. Hum. Genet. 1997. V.5. P .253-265.

63. Ferguson-Smith M.A., O'Brien P.C. et al. Comparative chromosome painting // Chromosomes Today. 2000. V.13. P.259-265.

64. Flint J., Bates G.P., Clark K., Dorman A., et al. Sequence comparison of human and yeast telomeres identifies structurally distinct subtelomeric domains. // Hum. Mol. Genet. 1997. V.6. N.8. P.1305-1313.

65. Ford C.E., Pollock D.L., Gustavsson J. Proceedings of the first international conference for the standartisation of banded kariotypes of domestic animals. // Hereditas. 1980. V.92. P. 145-162.

66. Fronicke L., Wienberg J. Comparative chromosome painting defines the high rate of karyotype changes between pigs and bovids. // Mamm Genome. 2001. V.12. N.6. P.442-449.

67. Garagna S, Broccoli D, Redi CA, Searle JB, et al. Robertsonian metacentrics of the house mouse lose telomeric sequences but retain some minor satellite DNA in the pericentromeric area. // Chromosoma. 1995. V.103. N.10. P.685-692.

68. Gimelli G., Zuffardi O., Giglio S., Zeng C., Dacheng He. CENP-G in neocentromeres and inactive centromeres. // Chromosoma. 2000. V.109. P.328-333.

69. Glas R., Graves .A., Toder R., et al. Cross-species chromosome painting between human and marsupial directly demonstrates the ancient region of the mammalian X. //Mammalian Genome. 1999. V.10. P.l 115-1116.

70. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Complete sequence of the 43-kb human ribosomal DNA repeat: analysis of the intergenic spacer. // Genomics. 1995. V.27. P. 320-328.

71. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Beyond ribosomal DNA: on towards the telomere. // Chromosoma. 1997. V.105. P.431-437.

72. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. Human rDNA: evolutionary patterns within the genes and tandem arrays derived from multiple chromosomes. // Genomics. 2001 V.73. P.255-263.

73. Gosden J.R., Mitchell A.R., Buckland R.A., et al. The location of four human human satellite DNAs on human chromosomes. // Exp. Cell Res. 1975. V.92. P.148-158.

74. Graphodatsky A.S. Conserved and variable elements of mammalian chromosomes. //In Hainan CRE (ed). Cytogenetics of Animals. 1989. P.95-123.

75. Graves J.A.M. Background and overview of comparative genomics. // ILAR J. 1998. V.39. N.2. P.48-65.

76. Graves J.A.M., Watson J.M. Mammalian sex chromosomes: Evolution of organization and function. // Chromosoma. 1991. V.101. P.63-68.

77. Griffiths D.J. Endogenous retroviruses in the human genome sequence. // Genome Biology. 2001. V.2. P.1017.1-1017.5

78. Guan X.-Y., Meltzer P.S., Cao J., Trent J.M. Rapid generation of region-specific genomic clones by chromosome microdissection: isolation of DNA from a region frequently deleted in malignant melanoma. // Genomics. 1992. V.14. P.680-684.

79. Guan X.-Y., Trent JM, Meltzer P.S. Generation of band-specific painting probes from single microdissected chromosome. // Hum. mol. Genet. 1993. V.2. P.1117-1121.

80. Guan X-Y, Meltzer P.S, Dalton W.S, Trent J.M. Identification of cryptic sites of DNA sequence amplification in human breast cancer by chromosome microdissection.//Nature Genetics. 1994. V.8. P.155-161.

81. Haaf Т., Ward D.C. Structural analysis of a-satellite DNA and centromere proteins using extended chromatin and chromosomes. // Hum. Mol. Genet. 1994. V.3. P.697-709.

82. Harding R.M., Royce A.J., Clegg J.B. The evolution of tandemly repetitive DNA: Recombination rules. // Genetics. 1992. V.132. P.847-859.

83. Harrington J.J., Bokkelen G.V., Mays R.W., et al. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes.//Nat. Genet. 1997. V.15. P.345-355.

84. Hassanane M.S., Chaudhary R., Chowdhary B.P. Microdissected bovine X chromosome segment delineates homologous chromosomal regions in sheep, goat, and buffalo. // Chrom. Res. 1998. V.6. P.213-217.

85. Hastie ND, Allshire RC. Human telomeres: fusion and interstitial sites. // Trends Genet. 1989. V.5.N.10. P.326-331.

86. Hayes H. Chromosome painting with human chromosome-specific DNA libraries reveals the extent and distribution of conserved segments in bovine chromosomes. // Cytogenet. Cell Genet. 1995. V.71. P.168-174.

87. Henderson A.S., Eicher E.M., Yu M.T., Atwood K.C. Variation in ribosomal RNA gene number in mouse chromosomes. // Cytogenet. Cell Genet. 1976. V.17. P.307-316.

88. Henderson L.M., Bruere A.N. Conservation of nuclear organizer regions during evolution on sheep, goat, cattle and aoudad. // Canad. J. Genet. Cytol. 1979. V. 21. P.l-6.

89. Henikoff S., Ahmad K., Malik H.S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA. // Science. 2001. V.293. P.1098-1102.

90. Henikoff S., Ahmad K., Platero J.S., van Steensel B. Heterochromatic deposition of centromeric histone H3-like proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. P.716-721.

91. Hennig W. Heterochromatin. //Chromosoma. 1999. V.108. P.l-9.

92. Hillis D.M., Dixon M.T. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic interference //Quart. Rev. Biol. 1991. V.66. P.411-453.

93. Hirai H., Hasegawa Y., Kawamoto Y., Tokita E. Tandem duplication of nucleolus organizer region (NOR) in the Japanese macaque, Macaca fuscata fuscata. II Chromosome Res. 1998. V.6. P.191-197.

94. Hirai H., Taguchi Т., Godwin A.K. Genomic differentiation of 18S ribosomal DNA * and /З-satellite DNA in the hominoid and its evolutionary aspects. // Chromosome

95. Research. 1999. V.7. P.531-540.

96. Horvath JE, Bailey JA, Locke DP, Eichler EE. Lessons from the human genome: transitions between euchromatin and heterochromatin. // Hum Mol Genet. 2001. V.10. P.2215-2223.

97. Howard-Peebles P.N., Howell W.M. Nucleolus organizer regions of tht " canine karyotype. // Cytogenet. Cell Genet. 1983. V.35. N.4. P.293-294.

98. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver staining of nucleolus organizer region with a protective colloidal developer: a 1 step, method. // Experientia. 1980. V.36. P.1014-1015.

99. Howell W.M., Denton Т.Е., Diamond J.R. Differential staining of the satellite region of human acrocentric chromosomes. // Experientia. 1975. V.31. P.260-262.

100. Hsu T.C., Arrighi F.E. Distribution of constitutive heterochromatin in mammalian chromosomes. // Chromosoma. 1971. V.34. P.243-253.

101. Hsu T.C., Spirito S.E., Pardue M.L. Distribution of 18+28S ribosomal genes in mammalian genomes. // Chromosoma. 1975. V.53. P.25-36.

102. Hurley J.E., Pathak S. Elimination of nucleolus organizers in a case of 13/14 Robertsonian translocation. // Hum. Genet. 1977. V.35. P.169-173.

103. Jauch A., Wienberg J., Stanyon R., et al. Recostruction of genomic rearrangements in the great apes and gibbons by chromosome painting. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89.P.8611-8615.

104. Karamysheva T.V., Andreenkova O.V., Bochkaerev M.N., Borisov Y.M., et al. В chromosome of Korean field mouse Apodemus peninsulae (Rodentia, Murinae) analysed by micridissection and FISH. // Cytogenet. Genome Res. 2002. V.96. P.

105. Kaipen G.H., Allshire R.C. The case for epigfnetic effect on centromere identity and function. //Trends Genet. 1997. V.13. P.489-496.

106. Kodama Y., Yoshida M.C., Sasaki M. An improved silver staining technique for nucleolus organizer regions by using nylon cloth. // Jap. J. Hum. Genet. 1980. V.25. P.229-233.

107. Koehler U, Bigoni F, Wienberg J, Stanyon R. Genomic reorganization in the concolor gibbon (Hylobates concolor) revealed by chromosome painting. // Genomics. 1995. V.30. N.2. P.287-292.

108. Kuroiwa A, Tsuchiya K, Watanabe T, Hishigaki H, et al. Conservation of the rat X chromosome gene order in rodent species. // Chromosome Res. 2001. V.9. P.61-67.

109. Kuroiwa A., Watanabe Т., Hishigaki H., et al. Comparative FISH mapping of mouse and rat homologues of twenty-five human X-linked genes. // Cytogenet. Cell Genet. 1998. V.81. P.208-212.

110. Levan A., Fredga K., Sanderson A.A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. //Hereditas. 1964. V.60. P.269-271.

111. Lichter P., Cremer Т., Borden J.,Manuelidis L., Ward D.C. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ supression hybridization using recombinant DNA libraries. // Hum Genet. 1988. V.80. P.224-234.

112. Liehr Т., Heller A., Starke H., Rubtsov N., et al. Microdissection based high resolution multicolor banding for all 24 human chromosomes. // International Journal of molecular medicine. 2002. V.9 P.335-339.

113. Lonnig W.E., Saedler H. Chromosome rearrangements and transposable elements. Annu. Rev. Genet. 2002. V.36. P.389-410.

114. Maeda N., Smithies O. The evolution of multigene families: Human haptoglobin genes. //Ann. Rev. Genet. 1986. V.20. P.81-108.

115. Mandahl N. Variation in C-stained chromosome regions in European hedgehogs СInsectivora, Mammalia). II Hereditas. 1978. V.89. P.107-128.

116. Manuelidis L. Chromosomal localization of complex and simple repeated human DNAs. Chromosoma. 1978. V.66. P.23-32.

117. Martin-DeLeon P.A., Fleming M.E. Petrosky D.L. Patterns of silver staining in cells of six-day blastocyst and kidney fibroblast of the domestic rabbit. // Chromosoma. 1978. V.67. P.2145-2152.

118. Masumoto H., Masukata H., Muro Y., Nozaki N., Okazaki T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. //J. Cell Biol. 1989. V.109. N.5. P.1963-1973.

119. Matsui S.I., Sasaki M. Differential staining of nucleolus organizers in mammalian chromosomes. //Nature. 1973. V.246. P.148-150.

120. Mazurok N.A., Isaenko A.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. High-resolution G-banding of chromosomes in the common, vole Microtus arvalis (Rodentia, Arvicolidae). // Hereditas. 1996a. V.124. P.229-232.

121. Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. High-resolution G-banding of chromosomes in Microtus subarvalis (Rodentia, Arvicolidae). // Hereditas. 1995. V.123. P.47-52.

122. Mazurok N.A., Rubtsov N.B., Nesterova T.B., Zakian S.M. High-resolution G-banding of chromosomes in Microtus kirgisorum (Muridae, Rodentia). // Cytogenet. Cell Genet. 1994. V.67. P.208-210.

123. Mazurok N.A., Rubtsova N.V., Isaenko A.A., Pavlova M.E., et al. Comparative chromosome and mitochondrial DNA analyses and phylogenetic relationships within common voles (Microtus, Arvicolidae). //Chromosome Res. 2001. V.9. P.107-120.

124. McClintock B. The relation of particular chromosomal element to the development of the nucleoli in Zea mays. // Z. Zellforsch. 1934. V.21. P.294-328.

125. Mefford HC, Trask В J. The complex structure and dynamic evolution of human subtelomeres. // Nat. Rev. Genet. 2002. V.3. N.2. P.91-102.

126. Mellink C.H., Bosma A.A., De Haan N.A. Variation in size of Ag-NORs and fluorescent rDNA in situ hybridization signals in six breeds of domestic pig. // Hereditas. 1994. V.120. N.2. P.141-149.

127. Meltzer P.S., Guan X.-Y., Burgess A, Trent J.M. Rapid generation of region specific probes by chromosome microdissection and their application. // Nature Genet. 1992. V.l P.24-28.

128. Meluh P.B., Yang P., Glowczewski L., Koshland D., Smith M.M. Cse4p is a component of the core centromere of Saccharomyces cerevisiae. // Cell. 1998. V.94. N.5. P.607-613.

129. Meneveri R., Agresti A., Marozzi A., et al. Molecular organization and chromosomal location of human GC-rich heterochromatic blocks. // Gene. 1993. V.123. P.227-234.

130. Meneveri R., Agresti A., Rocchi M., et al. Analysis of GC-rich repetitive nucleotide sequences in great apes. // J. Mol. Evol. 1995. V.40. P.405-412.

131. Mermer В., Colb M., Krontiris T.G. A family of short, interspersed repeats is associated with tandemly repetitive DNA in the human genome. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1987. V.84. P.3320-3324.

132. Merry D.E., Pahtak S., VandeBerg J.L. Differential NOR activities in somatic and germ cells of Monodelfis domestica (Marsupialia, Mammalia). // Cytogenet. Cell Genet. 1983. V.35. P.244-251.

133. Meyne J., Baker R.J., Hobart H.H., Hsu T.C., et al. Distirbution of non-telomeric sites of the (TTAGGG)n telomeric sequense in vertabrate chromosomes. // Chromosoma. 1990. V.99. P.3-10.

134. Mikelsaar A.-V., Schmid M., Krone W., et al. Frequency of Ag-stained nucleolus organizer regions in the acrocentric chromosome of man. // Hum. Genet. 1977. V.37. P.73-77.

135. Miklos G.L.G. Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrate and invertebrate genomes. In "Molecular evolutionary genetics" Ed. by Mclntyre J.R., Plenum, New York. 1985. P.241-313.

136. Miller D.A., Dev V.G., Tantravahi R., Miller O.J. Suppression of human nucleolus organizer activity in mouse-human somatic hybrid cells. // Exp. Cell Res. 1976. V.101.P.23 5-243.

137. Miller D.A., Roy Breg W., Warburton D., Dev V.G., Miller O.J. Regulation of rRNA gene expression in a human familial 14p+ marker chromosome. // Hum. Genet. 1978. V.43. P.289-297.

138. Modi W.S. Comparative analyses of heterochromatin in Microtus: sequence heterogeneity and localized expansion and contraction of satellite DNA arrays // Cytogenet.Cell Genet. 1993. V.62. P. 142-148.

139. Modi W.S. Phylogcnetic analyses of chromosomal banding patterns among the nearctic Arvicolidae (Mammalia, Rodentia) // Syst. Zool. 1987. V.36. P.109-136.

140. Modi W.S. Sex chromosomes and sex determination in Arvicolid rodents. // Chrom. Today. 1990. V.10. P.233-242.

141. Muelen A.J. 197Microtus and Pitymys (Arvicolidae) from Cumberland Cave. Maryland, with a comparisonof some new and old world species. // Ann. Carnegi Mus. 1978. V.47.P.101-145.

142. Muiphy W.J., Staynon R., O'Brien S.J. Evolution of mammalian genome organization inferred from comparative gene mapping. // Genome Biology. 2001. V.2. N.6. P. 1-8.

143. Nanda I, Schneider-Rasp S, Winking H, Schmid M. Loss of telomeric sites in the chromosomes of Mus musculus domesticus (Rodentia: Muridae) during Robertsonian rearrangements. // Chromosome Res. 1995. V.3. N.7. P.399-409.

144. Nash WG, Menninger JC, Wienberg J, et al. The pattern of phylogenomic evolutionof the Canidae. // Cytogenet Cell Genet. 2001.V.95. N.3-4. P.210-224.

145. Neitzel H. Chromosome evolution of Cervidae: karyotypic and molecular aspects. // In G.Obe, A.Blaster (ed.) Cytogenetics. 1987. P.90-112.

146. Nesterova T.B., Mazurok N.A., Matveeva N.M., et al. Demonstration of the X-linkage and order of the genes GALA, G6PD, HPRT and PGK in two vole species of the genus Microtus. II Cytogenet.Cell Genet. 1994. V.65. P.250-255.Ф

147. Nesterova T.B. Duthie S.M., Mazurok N.A., Isaenko A.A., Rubtsova N.V., Zakian S.M., BrockdorffN: Comparative mapping of X chromosomes in vole species of the genus Microtus. И Chrom. Res. 1998. V.6. P.41-48.

148. Nesterova T.B., Mazurok N.A., Rubtsova N.V^Tbaenko A.A., Zakian S.M. The vole gene map. // ILAR Journal. 1998. V.39. P. 138-144.

149. Nie W., Rens W., Wang J., Yang F. Conserved chromosome segments in Hylobates hoolock revealed by human and H.leucogenys paint probes. // Cytogenet. Cell Genet. 2001. V.92. P.248-253.

150. O'Neill R.J.W., O'Neill M.J., Graves J.A.M. Undermethylation associated with retroelement activation and chromosome remodeling in an interspecific mammalian hybrid. //Nature. 1998. V.393. P.68-72.

151. Obe G., Pfeiffer P., Savage J.R., Johannes C., et al. Chromosomal aberrations: formation, identification and distribution. // Mutat. Res. 2002. V.504. P. 17-36.

152. O'Brien S.J. Genetic maps: Locus Maps of Complex Genomes. // Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1990.

153. O'Brien S.J., Menotti-Raymond M., Murphy W.J., Nash W.G., et al. The promise of comparative genomics in mammals. // Science. 1999. V.286. P.458-481.

154. Ohno S. Conservation of ancient linkage groups in evolution and some insight into the genetic regulatory mechanism of X-inactivation // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1973. V.38. P.155-164.

155. Ohno S. Sex chromosomes and sex-linked genes. // Springer, Berlin, Heidelberg, New York. 1967.

156. Ostroverkhova N.V., Nazarenko S.A., Rubtsov N.B. Characterization of a small supernumary ring marker derived from chromosome 2 by forward and reverse chromosome painting. //Am. J. Med. Genetics. 1999. V.87. P.217-220.

157. Pathak S., Stock A.D. The Xchromosomes of mammals: karyological homology as revealed by banding techniques. // Genetics. 1974. V.78. P.703-714.

158. Pathak S., Wurster-Hill D.M. Distribution of constitutive heterochromatin in carnivores // Cytogenet. Cell Genet. 1977. V.18. P.245-254.

159. Pearson M.D., Seabright M., Maclean N. Silver staining of nucleolar organizer regions in the domestic cat, Felis catus.// Cytogenet. Cell Genet. 1979. V.24. P.245-247.

160. Pinkel D., Straume Т., Gray J.W. Cytogenetic^analysis using quantitative highsensitivity fluorescence hybridization. // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V.83. P.2934-2938.

161. Platero J.S., Ahmad K., Henikoff S. A distal heterochromatic block displays centromeric activity when dctached from a natural centromere. // Mol. Cell. 1999. V.4. N.6. P.995-1004

162. PopescuN.C., DiPaolo J.A. Heterogenity of constitutive heterochromatin in somatic Syrian hamster chromosomes. // Cytogenet. Cell Genet. 1979. V.24. P.53-60.

163. Rubtsov N, Senger G, Kucera H, Neumann A, et al. Interstitial deletion ofichromosome 6q: report of a case and precise definition of the breakpoints bymicrodissection and reverse painting. // Hum Genet. 1996. V.97. P.705-709.

164. Rubtsov N., Junker K., von Eggeling F., Michel S., Claussen U. Chromosomal origin and distribution of DNA from the homogeneously staining regions in COLO

165. HSR cells. // Medgen. 1995, V.7. P56.

166. Rubtsov N., Sablina O., Ivanova I., Zhdanova N., Graphodatsky A. Chromosome microdissection is a universal tool for studies of mammalian chromosome rearrangements.//Medgen. 1998, 10, p.149.

167. Rubtsov N., Serdukova N., Kaftanovskaya E., et al. Visualization of the cattle Xp homologous regions on the X chromosomes of some pecorans by chromosome microdissection and heterologous painting. // Cytologia. 1997. V.62. P.203-208.

168. Rubtsov N.B, Graphodatsky A.S., Matveeva VjG^ Radjabli S.I., et al. Silver fox gene mapping: conserved chromosome regions in the order Carnivora. // Cytogenet. Cell Genet. 1988. V.4. P.95-98.

169. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Anopriyenko O.V., Karamysheva T.V., Shevchenko A. I., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Zakian S.M. Reorganization of the X chromosome in voles of the genus Microtus. // Cytogenet. Genome Res. 2003. (accepted).

170. Saffery R., Wong L.H., Irvine D.V., Bateman M.A., et al. Construction of neocentromere-based human minichromosomes by telomere-associated chromosomal truncation. // Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 2001. V.98. P.5705-5710.

171. Saffery R., Earle E., Irvine D.V., Kalitsis P., Choo K.H. Conservation of centromere protein in vertebrates. // Chromosome Res. 1999. V.7. N.4. P.261-265.

172. Saffery R., Irvine D.V., Griffiths В., et al. Human centromeres and neocentromeres show identical distribution patterns of >20 functionally important kinetochore-associated proteins. // Hum. Mol.Genet. 2000. V.22. V.9. N.2. P.175-185.

173. Sakai K., Ohta Т., Minoshima S., Kudoh J., et al. Human ribosomal RNA gene cluster: identification of the proximal end containing a novel tandem repeat sequence. // Genomics. 1995. V.26. P.521-526

174. Sam C.K., Yong H.S., Dhaliwal S.S. The G and C-bands in relation to Robertsonian polymorphism in the Malayan house shrew, Suncus murinus (Mammalia, Insectivira) // Caryologia. 1979. V.32. P.355-363.

175. Samonte RV, Eichler EE. Segmental duplications and the evolution of the primate genome. // Nat. Rev. Genet. 2002. V.3 N. 1. P.65-72.

176. Scalenghe F, Turco E, Edstroem J-E. et al. Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Dr. Melanogastcr polytene chromosomes. // Chromosoma.1981. V.82.P.205-216.

177. Scharzacher H.G., Wachtler F. The nucleolus. // Anat. Embryol. 1993. V.188. P.515-536.

178. Schempp W., Toder R., Wolfram R., et al. Inverted and satellited Y chromosome in the orangutan (Pongopygmaeus). II Chromosome Research. 1993. V.l. P.69-75.

179. Schibler L., Vaiman D., Oustry A., Giraud-Delville C., Cribiu E.P. Comparative gene mapping: a fine-scale survey of chromosome rearrangements between ruminants and humans. // Genome Res. 1998. V.8. N.9. P.901-915.

180. Schmickel R.D. Quantitation of human ribosomal DNA: hybridization of human DNA with ribosomal RNA for quantitation and fractionation. // Pediatr Res. 1973. V.7. P.5-12.

181. Schmid M., Haaf Т., Solleder E., et al. Satellitied Y chromosomes: structure, origin, and clinical significace. //Hum. Genet. 1984. V.67. P.72-85.

182. Schubert I., Schriever-Schwemmer G., Werner Т., Adler I.D. Telomeric signals in robertsonian fusion and fission chromosomes: implications for the origin of pseudoaneuploidy. // Cytogenet. Cell Genet. 1992.V.59. N.l. P.6-9.

183. Schwarzacher G., Mikelsaar A., Schnedel W. The nature of Ag-staining of nucleolus organizer regions. // Cytogenet. Cell Genet. 1978. V.20. P.24-39.

184. Schweizer D., Loidl J. A model for heterochromatic dispersion and the evolution of C-band patterns. // Chromosoma Today. 1987. V.9. P.61-74.

185. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes // Lancet. 1971. V.2.P.971-972.

186. Shen M.H., Ross A., Yang J., et al. Neo-centromere formation on a 2.6 Mb mini-chromosome in DT40 cells. // Chromosoma. 2001. V.l 10. P.421-429.

187. Shevchenko A.I., Mazurok N.A., Slobodyanyuk S.Ya., and Zakian S.M. Comparative analysis of the MSAT-160 repeats in four species of common vole (Microtus, Arvicolidae). // Chromosome Research. 2002. V.10. P.l 17-126.

188. Singer M.F. Highly repeated sequences in mammalian genome // Int. Rev. Cytol.1982. V.76. P.67-112.

189. Slijepcevic P. Telomeres and mechanisms of Robertsonian fusion. // Chromosoma.1998a. V.107. N.2. Р.136-140.

190. Slijepcevic P. Telomere length and telomere-centromere relationships? // Mutat. Res. 1998b. V.404. N.l-2. P.215-220.

191. Slijepcevic P. Telomere length regulation a view from the individual chromosome perspective. Exp. Cell Res. 1998c. V.244. N.l. P.268-274.

192. Slijepcevic P., Bryant P.E. Chromosome healing, telomere capture and mechanisms of radiation-induced chromosome breakage. // Int. J. Radiat. Biol. 1998. V.73. N.l. P.l-13.

193. Slijepcevic P., Hande M.P., Bouffler S.D., Lansdorp P., Bryant P.E. Telomere length, chromatin structure and chromosome fiisigenic potential. // Chromosoma. 1997. V.106 N.7.P.413-421.

194. Slijepcevic P., Xiao Y., Dominguez I., Natarajan A.T. Spontaneous and radiation-induced chromosomal breakage at interstitial telomeric sites. // Chromosoma. 1996. V.104. P.596-604.

195. Smith G.P. Evolution of repeated DNA sequences by unequal crossing over. // Science. 1976. V.191. P.528-535.

196. Spenser J.A., Sinclair A.H., Watson J.M., Graves J.A. Genes on the shot arm of the human X chromosome are not shared with marsupial. // Genomics. 1991. V.ll. P.339-345.

197. Stanyon R., Consigliere S., Bigoni F., Ferguson-Smith M., et al. Reciprocal chromosome painting between a New World primate, the woolly monkey, and humans. // Chromosome Res. 2001. V.9. P.97-106.

198. Stanyon R., Yang F., Cavagna P., O'Brien P.C., et al. Reciprocal chromosome painting shows that genomic rearrangement between rat and mouse proceeds ten times faster than between humans and cats. // Cytogenet Cell Genet. 1999. V.84. P.150-155.

199. Starling J.A., Maule J., Hastie N.D., Allshire R.C. Extensive telemere repeat arrays in mouse are hypervariable. //Nucleic Acids Res. 1990. V.18. P.6881-6888.

200. Stitou S., Burgos M., Zurita F., Jimenez R., et al. Recent evolution of NOR-bearing and sex chromosomes of the North African rodent Lemniscomys barbarus. // Chromosome Res. 1997. V.5. P.481-485.

201. Sumner A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. // Exp Cell Res. 1972. V.75. P.304-306.

202. Takahashi K., Chen E.S., Yanagida M. Requirement of Mis6 centromere connector for localizing a CENP-A-like protein in fission yeast. // Science. 2000. V.288. P.2215-2219.

203. Tantravahi R., Miller D.A., Dev V.G., Miller O.J. Detection of nucleolus organizer region in chromosomes of human, chimpanzee, gorilla, orangutan and gibbon. // Chromosoma. 1976. V.56. P. 15-27.

204. Tantravahi R., Roy Breg W., Werteleci V., Evlanger B.E., Miller O.J. Evidence for methylation of inactive human rRNA genes in amplified regions. // Hum. Genet. 1981. V.56. P.315-320.

205. Telenius H., Pelmear A.H., Tunnacliffe A., et al. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. // Genes Chromosomes Canser. 1992. V.4. P.257-266.

206. TomilinN. Control by mammalian retroposons. // Int. Rev. Cytol. V.186. P. 1-48.

207. Van Dilla M.A., Deaven L.L.,et al., Human chromosome-specific DNA libraries: Construction and availability. // Biotechnology. 1986. V.4. P.537-552.

208. Van Etten W.J., Steen R.G., Nguyen H., et al. Radiation hybrid map of the mouse genome // Nat. Genet. 1999. V.22. N.4. P.384-7.

209. Varley J.M. Patterns of silver staining of human chromosomes. // Chromosoma. 1977. V.61. P.207-214.

210. Ventura M., Archidiacono N., Rocchi M. Centromere emergence in evolution. // Genome Res. 2001. V. 11. P.595-599.

211. Vistorin G, Gamperl R, Rosenkranz W. Studies on sex chromosomes of four hamster species: Cricetus cricetus, Cricetulus griseus, Mesocricetus auratus, and Phodopus sungorus. II Cytogenet. Cell Genet. 1977. V.18. P.24-32.

212. Vogt P. Potential genetic function of tandem repeated DNA sequence blocks in the human genome are based on highly conserved "chromatin folding code". // Hum. Genet. 1990. V.84. P.301-336.

213. Volleth M. Differences in the location of nucleolus organizer regions in European vespertilionid bats. // Cytogenet. Cell Genet. 1987. V.44. P.186-197.

214. Warburton D., Atwood K.C., Henderson A.E. Variation in the number of genes for rRNA among human acrocentric chromosomes: correlation with frequency of satellite association. // Cytogenet. Cell Genet. 1976. V.17. P.221-230.

215. Warburton D., Henderson A.S. Sequential silver staining and hybridization in situ on nucleolus organizing regions in human cells. // Cytogenet. Cell Genet. 1979. V.24. P.168-175.

216. Watson J.M., Spencer J.A. Riggs A.D., Graves J.A. Sex chromosome evolution: platypus gene mapping suggests that part of the human X chromosome was originally autosomal. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P.l 1256-11260.

217. Wcimer J., Kiechle M., Senger G., Wiedemann U. et al. An easy and reliable procedure of microdissection technique for the analysis of chromosomal breakpoints and marker chromosomes. // Chromosome Research. 1999. V.7. P.355-362.

218. Wienberg J, Stanyon R, Nash WG, O'Brien PC, et al. Conservation of human vs. feline genome organization revealed by reciprocal chromosome painting. // Cytogenet Cell Genet. 1997. У.11. N.3-4. P.211-217.

219. Wienberg J, Stanyon R. Comparative Chromosome Painting of Primate Genomes. // ILARJ. 1998. V.39. P.77-91.

220. Wienberg J, Stanyon R. Comparative painting of mammalian chromosomes. // Curr Opin Genet Dev. 1997. V.7. P.784-91.

221. Willard H.F. Centromere of mammalian chromosomes. // Trends Genet. 1990. V.6. P.410- 416.

222. Willard H.F., Waye J.S. Hierarchical order in chromosome specific human alpha satellite DNA. //Trends Genet. 1987. V.3. P. 192-198.

223. Wong A.K.C., Biddle F.G., Rattner J.B. The chromosomal distribution of the major and minor satellite is not conserved in the genus Mus. II Chromosoma. 1990. V.99. P.190-195.

224. Wong A.K.C., Rattner J.B. Sequence organisation and cytological localization of the minor satellite of mouse.//Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 11645-11661.

225. Yang F., Carter N.P., Shi L., Ferguson-Smith M.A. A comparative study of karyotipes of muntjacs by chromosome painting. // Chromosoma. 1995. V.103. P.452-462.

226. Yang F., O'Brien P.C.M., Milne B.S., Grafodatsky A.S. et al. A complete comparative chromosome map for the dog, red fox, and human and its integration with canine genetic maps. // Genomics. 1999. V.62. P. 189-202.

227. Yang F., O'Brien P.C.M., Ferguson-Smith M.A. Comparative chromosome map of the laboratory mouse and Chinese hamster defined by reciprocal chromosome painting. // Chromosome Research. 2000. V.8 P.219-227.

228. Yen CH, Pazik J, Elliott RW. A polymorphic interstitial telomere array near the center of mouse chromosome 8. // Mamm. Genome. 1996. V.7. N.3. P.218-221.

229. Yen CH, Pazik J, Zhang Y, Elliott RW. An interstitial telomere array proximal to the distal telomere of mouse chromosome 13. // Mamm. Genome. 1997. V.8. N.6. P .411-417.

230. Yosida Т.Н. A comparative study on nucleolus organizer region (NORs) in rattus special emphasis on the organizer differentiation and species evolution. // Proc. Japan Acad. 1979. V.55. P.10-15.

231. Zakian V.A. Telomeres: beginning to anderstand the end. // Science. 1995. V.270. P.1601-1607.

232. Zenzes M.T., Schmid M., Engel W. Silver-stained nucleolus organizers in the guinea pig, Cavia cobaya. //Cytogenet. Cell Genet. 1977. V.19. P.368-372.

233. Zhdanova N.S., Larkin D.M., Kuznetsov S.B. et al. The order of genes on porcine chromosome 12 // Animal Genomics: Synthesis of Past, Present, and Future Directions. 2000. P.52.

234. Zijlmans J.M.J.M., Martens U.M., Poon S.S.S., Raap A.K., et al. Telomeres in the mouse have large inter-chromosomal variations in the number of T2AG3 repeats. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P.7423-7428.