Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение повторяющихся последовательностей ДНК у полевок рода MICROTUS

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение повторяющихся последовательностей ДНК у полевок рода MICROTUS"

Г; :.)

На правах рукописи УДК 577.214.32:599.323.4

МАЙОРОВ ВЛАДИМИР ИВАНОВИЧ

"ИЗУЧЕНИЕ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСУЩЦОВАТЕЛЬНОСТЕЯ ДНК У ПОЛЕВОК РОДА МТСЕОТиЗ"

клеточная биология - 03.00.25

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики со РАН г.Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологичесеих наук

С.М.Закиян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Н.Н.Колесников

Институт цитологии и генетики СО РАН. г.Новосибирск

доктор биологических наук В.Н.Стегний

НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета; г.Томск

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им.Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Зашита состоится .1996 г. на

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

1-СО^Л<Л 1995

Ученый секретарь специализированного•совета доктор биологических наук

А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Изучение организации геномов высших организмов является фундаментальной задачей молекулярной биологии. Одна из центральных проблем, возникших в ходе молекулярно-генетических исследований эукариот, - наличие в их геномах многократно повторяющихся последовательностей ДНК, составляющих значительную доле ДНК генома, и функции абсолютного большинства которых неизвестны. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют, что они могут играть существенную роль в геноме. Так, например, высказана гипотеза о существовании специфических повторяющихся

последовательностей, участвующих в механизме инактивации Х-хромосомы у самок млекопитающих (Ото, 1973; Gartier, Riggs, 1983; Нестерова, Закиян, 1994).

Специфические повторы ДНК в виде островков, содержащих интегрированные line элементы, обнаружены при анализе структуры Х-хромосомы мыши (Naair et al, 1990). Тандемные повторы обнаружены также в гене Xiat, который экспрессируется только с неактивной Х-хромосомы и, предположительно, отвечает за конденсацию х-хромосомы в момент инактивации.

Идея о причастности гетерохроматических структур к инактивации получила подтверждение при изучении инактивации родительских х-хромосом у самок гибридов полевок рода Microtu-s. имеющих на х-хромосомах различающиеся по размеру и расположению блоки гетерохроматина (Zakian et al, 1991). Бйло обнаружено, что у гибридов инактивации подвергается преимущественно х-хромосома, с блоком гетерохроматина. На основе этих данных была высказана гипотеза, что именно гетерохроматин, локализованный блоками на х -хромосомах у трех видов полевок этого рода, является неспецифическим фактором инактиваци х-хромосом.

Таким образом, изучение повторов ДНК у полевок рода Microtias может дать дополнительную информацию для понимания их роли в геноме, а также выяснения их возможного участия в инактивации Х-хромосомы и механизма влияния блоков гетерохроматина, на процесс инактивации.

Цель и задачи исследования. Полевки рода Microtus являются

уникальным объектом для изучения повторяющихся последовательностей ДНК благодаря наличию на их Х-хромосомах блоков гетерохроматина, значительно отличащихся по расположению и размерам у разных видов. Учитывая эту особенность нашего объекта исследования в данной работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Выделить и клонировать из геномной ДНК полевок рода -Ш.сго1;ия повторяющиеся последовательности.

2. Изучить специфичность клонированных последовательностей и их распределение в геномах полевок рода М1сго1;иа.

3. Определить первичную структуру клонированных повторов ДНК, представляющих интерес для дальнейших исследований.

4. Провести контекстный анализ прочитанных первичных структур повторов и поиск гомологичных последовательностей ДНК в банках данных.

5. Изучить локализацию выделенных повторов ДНК на метафазных хромосомах полевок рода М1сго-Ьия.

Научная новизна. Впервые выделены из геномной ДНК полевок рода МхсгЫиа повторяющиеся последовательности, относящиеся к семейству ы элементов. Определена первичная структура ы элемента полевки М.аиЪагуаНз. Показана преимущественная локализация ы элементов ' в гетерохроматических областях половых хромосом полевок рода тсго-Ьча. Впервые у'полевок из геномной ДНК , М.зиЪагуаНз выделена и охарактеризована гетерохроматин- специфическая повторяющаяся

последовательность, содержащая В1 элемент, определена ее первичная структура. Выявлены уникальная кластерная локализация этой последовательности в блоках гетерохроматина на х-хромосомах и ее отсутствие в центромерном гетерохроматше аутосом у 4-х видов полевок рода М1сго1;из.

Практическая ценность. Полученные в работе результаты имеют теоретическое значение для дальнейшего изучения организации геномов млекопитающих и функций повторяющихся последовательностей ДНК. Результаты работы также будут полезны для дальнейшей разработки предложенной ранее гипотетической модели инактивации х-хромосом, и исследования возможного участия и роли повторяющихся последовательностей ДНК в механизме инактивации. Нуклеотидные последовательности

исследованных 'повторов зарегистрированы в банке данных ишь Data Library.

Апробация работы. Основные результаты данного исследования были доложены на Международном конгрессе по иЭоферментам (Новосибирск,1992), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, результаты и обсуждение, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы 124 страницы, I таблица и 21 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клонирование исследуемых фрагментов ДНК проводили с использованием плазмиды pUCi9. Для трансформации использовали компетентные клетки е.coli М15. приготовленные по методу Чанга, Миллера (Chung, Miller, 1988).

Геномную ДНК из печени полевок выделяли с помощью метода, описанного ранее (Henry et al, 1990) с некоторыми модифик ациями.

Мечение ДНК дигоксигешщом и гибридизацию с мечеными ДНК проводили с помощью набора и в соответствии с протоколом фермы Boeringer marmheim ( cat. No1093657).

in situ гибридизацию с 3Н-меченкми зондами на метафазных хромосомах выполняли по стандартным методикам (Gall, Pardue, 1971; Atherton, Gall, 1972). Для неизотопной-гибридизации in situ ДНК метили био-II-dUTP ("Ферментас", Литва) с помощью ник-трансляции. Детекцию проводили с помощью коньюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза. Во флуоресцентном варианте (PISH) для детекции использовали коньюгат авидин-флюоресцеин без дополнительного усиления.

Установление нуклеотидной последовательности ДНК по методу Максама-Гилберта проводили, как описано в сборнике методов по молекулярной генетике и генетической инженерии (Мазин и др., 1990). В работе также использовали набор для секвенирования по методу Сэнгера фирмы Fermentas MBг (Литва).

Реакции проводили в соответствии с инструкцией к данному набору.

Остальные методики, использованные в данной работе, выполняли по руководству Манниатиса и др. (Manniatis et al, 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. L1 элементы полевок рода Microtus I.I Сравнительный рестрикционный анализ геномных ДНК полевок рода Microtus и клонирование фрагментов Мз1 и ffld Анализ EcoRl-гидролизатов геномных ДНК полевок проводили с помощью электрофореза в геле 1% агарозы с по еле душим окрашиванием бромистым этидием. Каждый из проанализированных видов полевок имеет на электрофореграмме характерное количество и распределение полос повторяющихся фрагментов ДНК. Следует отметить, что в случае гидролизатов ДНК полевок, содержащих блоки гетерохроматина на Х-хромосоме, количество полос повторов существенно больше, чем в гидролизате ДНК М.аг-valis, Х-хромосома которой не имеет гетерохроматинового блока. Общая для всех видов интенсивная полоса представляет повторяющийся фрагмент ДНК с размером около 1800 п.н., имеющий примерно одинаковую копийность в этих геномах. Этот фрагмент из ЕсоЕ1-гидролизата ДНК полевки M. subarvalis (обозначенный нами как Мз1 ) был клонирован в плазмиде риС19 и на электрофореграмме соответствовал исходной полосе повтора.

!.£ Изучение специфичности повтора Mai С помощью Саузерн блот-гибридизации было изучено распределение Да1-повтора в геномных ДНК 4 видов полевок рода Microtus. Кроме основной полосы гибридизации, соответствующей повтору, во всех геномах выявляются минорные полосы гибридизации, специфические для каждого вида. В случае Pst-гидролизатрв в ДНК M.kirgisorum выявляется мрщная полоса гибридизации, соответствующая фрагментам ДНК размером около 5 т.п.н. Видоспецифичность повтора Мз1 была изучена дот-гибридизацией с геномными ДНК разных видов. Выраженная гомология проявляется только с ДНК всех видов полевок и более

слабая - с ДНК некоторых видов хомячков, мышей, песчанок и челоЕЭка. Видоспецифический характер распределения Mai повтора в геномах полевок и результаты дот-гибридизации свидетельствовали о том, что он относится к классу диспергированных повторов, широко представленных не только у полевок, но и у других видов грызунов и человека. Наличие общих для зсех четырех видов, а также и видоспецифических минорных полос гибридизации, свидетельствовали о том , что он является частью более высокомолекулярного диспергированного повтора. Количество копий повтора Mal в геномах полевок было оценено дот-гибридизацией и составляет около I05 на геном, что соответствует копийности Ы элементов.

1.3 Анализ первичной структуры повтора Ма1 Первичная структура повтора Мз1 была определена методом Максама-Гилберта и состоит из 1834 п.н. Компьютерный анализ и поиск, проведенный в банке последовательностей емвь, выявил ее примерно 70£-ную гомологию с последовательностью LINE элемента мыши L1Md- А2 (Loeb - et al, 1986). Сравнение структуры последовательности Msl со структурой гомологичных областей LiMd-A2 элемента показало, что Mal такге содержит большую часть ORF1 и около 25% ORF2, которые отличаются от соответствиях рамок мышиного элемента небольшими делециями и вставками (Рис.1). Таким образом, изучение структуры последовательности повтора Мз1 позволяет отнести его к классу L1 элементов, которее у полевок выявлены впервые, и в соответствии с принятой номенклатурой его следует обозначать ЫМз1.

1.4 L1Mk1 элемент полевки M.kirgisoruro. Из Pstj-гидролизата геномной ДНК полевки . M.kirgisorum была выделена и клонирована аналогично повтору Mal повторяющаяся последовательность размером около 5 т.п.н., которая соответствовала наиболее мощной полосе гибридизации с ЫМз1. Этот повтор, очевидно, является L1 элементом полевки M.kirgisoruni, что было подтверждено сравнением его секвенированных фрагментов с первичной структурой LiMd-A2 элемента мыши и последовательностью Ь1Мз1 (Рис.1), и мокет

1 I I Ms1

1200_3050_

•♦»»»II 0RF1 I QRF2 1 I (A )n*I1Md-A2

I I I Mk1

Рис.1. Сравнение структуры последовательностей повторов Мэ1 и Мк1 с Ь1Мй-А2 элементом мыши (ЬоеЪ et а1., 1986).-Обозначения: V - вставки, л - делении. Цифры внизу означают их размер, верхние цифры - расстояние от 5' конца Ъ1Мй-А2; * -концевые дупликации; »> -5'-концевая область; (А)п - поли-А тракт; 1200, 3050 - Начало и конец области гомологии; ойр -открытые рамки трансляции.

быть обозначен как Ы№1. На Рис.2 показано, выравнивание 5'-концевого фрагмента последовательности LlMkl с последовательностью Ь1Мз1. Эти фрагменты последовательностей практически полностью совпадают, имеются лишь единичные замены нуклеотидов, что свидетельствует о консервативном характере данного участка первичной структуры L1 элементов у ползвок рода Micro tus. Сравнение структуры последовательности 1>ш<:1 с Ь1Мз1 и структурой мышиного элемента L1Md-A2 (Рис.1) показало, что ымк1 содержит полностью 0RF2, однако значительно меньшую часть 0RF1, чем LiMsl.

К сожалению, полученные результаты не позволяют сделать вывод о том, являются лиЬ1Мз1 и Ь1Мк1 усеченными с 5'-концов копиями или представляют собой части полных копий ы элементов. Однако принимая во внимание, что практически у всех изученных видов млекопитающих* они представлены в основном 5'-усеченными копиями,- в геномах полевок можно ожидать такой же картины.

10 20 30

1 -------------------------TGCAGAAGCATAGAGAACAGGGCAIGCAAGCCCAGA

2 CCAGAAGGTCITGGATAGATATACTGCJLAAAGCTAA^

850 860 870 SCO 890 SOO

40 50 60 70 ' 80 90

1 CTACTATACCCAGCCAAGCTTTCGTTCACTATAAATGGAGAAAACAAAiTTTTCCAGGAT

2 CTACTASGCCCGGCCAAGCTTTCGITCACTATAAATACAGAAAACAAAATTTTC-AGGAT 910 920 930 940 950

100 110 120 130 140 150

1 AAAAACAAATTTAAACAATACGTAGCCCACAAATCCAGCCTTACAGAACGTAATAGAAAG

2 AAAAACAAATTTAA.i.CAATACGTAGCC-ACAAATCCAGCCTTACAGAAAGTAATAGAA-G 960 "970 980 990 1000 1010

160 170 180 190 200 210

1 GAAAATCACAAACGAAGGAGACCAACAATTGCCCACAATAACTCAAACTTCTAGACCCCC

2 GAAAATCACAAACCAAGGAGACCAACAAT-GACCACAATTACTCAAACTTCTAGACACCC 1020 1030 1040 1050 1060 1070

220 230 24u 250 1 TTTACCAGCGCAACTAAAAGAAGGCAAACA-ACAAA-----------.-------------

2 TTTACCAGCGCAACTAAAAGAAAGCAAACACACAAACTATATGACTAAAAAAGTGACCGG 1080 1090 1100 1110 1120 1130

Рис.2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей повтороЕ М>1 (1) и Мв1 (2).

1.5 Локализация Ы элементов на метафазннх хромосомах полевок рода Microtua Гибридизации in situ повторов ЫМэ1 и Ь1Мк1 на метафазных хромосомах, показала, что L1 элементы диспергированы в геномах полевок рода Microtus, и у всех изученных видов выявляется их преимущественная локализация в гетерохроматических районах половых хромосом. Однако на x-хромосоме M.arvalis, не имеющей блока гетерохроматина, этого не наблюдается. Преимущественная локализация повторов LiMs1 и LlMki на х-хромосомах -полевок М.subarvalis, М.transcaspicus и M.kirgisorum связана, скорее всего, с наличием на них блоков гетерохроматина.

Аналогичный характер распределения Ы элементов обнаружен и в геномах других видов млекопитаэдих (Korenberg, P.ykowski,

1988). Показано, что line и sine элементы, распределены в геноме человека неслучайным образом, образуя взаимоисключающие кластеры, примерно соответствующие . Гимза-темным и Гимза-светлым бандам (Chen, Manuelidis, 1989). l1 элементы кластеризуются в связанных с матриксом АТ-богатнх поздаореплицирущихся районах хромосом, обогащенных тканеспециЗическими генами, тогда как кластеры sine элементов находятся главным образом в ранореплицирущихся районах с генами домашнего хозяйства. Полагают, что l1 элементы могут участвовать в конденсации доменов факультативного гетерохроматина которые транскрибируются и реплицируются тканеспецифическим образом, как это имеет место в случае инактивации х-хромосомы. Свидетельством неслучайного распределения l1 элементов в геномах может также служить обнаруженное скопление l1 элементов в составе сложных . повторов в A3 Гимза-положительном бэнде на Х-хромосоме мыши (Naair et al, 1990).

Интересная корреляция обнаруживается между инактивацией х-хромосомы в процессе сперматогенеза у млекопитающих и экспрессией Ы элементов. В терминальных клетках ^самцов млекопиташих, в отличие от. соматических клеток, Х-хромосома гетерохроматизируется на стадиях лептотены и ,зиготены и остается неактивной в течение всего сперматогенеза (Koíman-Alíaro, Chandley, 1970; Odartchenco, Pavillard, 1970). Механизм инактивации Х-хромосомы в герминальнх клетках самцов, по-видимому, сходен с механизмом инактивации Х-хромосомы в соматических клетках самок млекопиташих (Salido et al, 1992; МсСагеу, Dilworth, 1992). Врансифорт и Мартин (Branciforte, Martin, 1994) показали что только в сперматоцитах мышей в стадии лептотены и , зиготены происходит соэкспрессия РНК полноразмерного ы элемента и белка, кодируемого его 0KF1. Хотя авторы на основании этих результатов делают выводы только относительно транспозиции L1 элементов, нам представляется не менее важной четкая временная корреляция инактивации х-хромосомы с появлением белкового продукта 0KF1 L1 элемента в процессе сперматогенеза.

Функции белка, кодируемого 0RP1 до сих пор неизвестны, однако структура ORF1 L1 элементов содержит цистеиновые

мотивы, ларахтерныо для gsg генов ретроэлементов, и которого являются ДНК ц/или РНК-связневдкчи центрами белка e^tS (Bsrg, 1990; I.»eton, S.t.yth, 1993). H опублжовапвоЧ: недг.вяо рпбстэ (Pippinelli st al, ■'i995) показано, что L1-подобные мобильные элемента образуют высококонсервативные кластеры в гетерохроматических районах хромосом дрозофилы, что заставляет по-новому взглянуть на их роль в геноме хозяина в качестве основных структурных компонентов гетерохроматина. Тахим образом, все белые данных появляется в пользу того, что L1 элемента являются важным компонентом ' гетерохроматических районов хромосом и выполняют существенные функции в генома..

Одной из таких возможных функций может быть их участие в механизме инактивации х-хромосомы, поэтому дальнейшия исследования элементов полевок рода Microtus могут

оказаться чрезвычайно полезными для уточнения .гипотезы о влиянии блоков гетерохроматина на преимущественную инактивацию содержащих их х-хромосом и тем самым приблизить нас к разгадке этого феномена.

2. Гетерохроматин-специфический повтор ДНК полевки M.subarvalis, содержащий. В1 элемент (Мз2 повтор)

2.1 Клонирование и изучение специфичности повтора Мз2 Выделение и клонирование повтора Мз2, было проведено аналогично описанному вьшэ для повтора Mal с той лишь разницей, что из геля вырезали соответствующую этому повтору полосу повторяющихся EcoRl-фрагментов геномной ДНК M.subarval-is длиной около 1200 п.н., которая отсутствует в гидролизате ДНК M.arvalis, не содержащей блока гетерохроматина на х-хромоссме. При блот-гибридизации с EcoRl-гидролизатом ДНК M.subarvalis повтор Мз2 давал полосу гибридизации в области, соответствующей размеру клонированного фрагмента. У остальных видов полевок, исследованных в. данной работе, гибридизации в этой области не наблюдалось. - Однако в более высокомолекулярной области были выявлены две менее интенсивные полосы гибридизации, общие для всех четырех- исследованных видов полевок (в районе 1500 н.п. и 5000 н.п.), причем у M.arvalia сигнал гибридизации был наиболее слабый.' У M.subarvalis и М.к-

irgisorum выявлено тлкже несколько минорных вндоспецифичэских полос.

Z.Z Гетерохроматическая локализация повтора Msg Исследование локализации повтора М?2 с помощью гибридизации in situ методом PISH, на метафазных хромосомах показало, что у M.subarvalis в больших гетерохроматических сегментах половых хромосом Мз2 локализуется в виде чередующихся полос. В гетерохроматине X хромосомы выявляются 4-5 полос интенсивной гибридизации, менад которыми расположены сайты, в которых этот повтор не выявляется. На Y-хромосоме Мя2 интенсивно гибридизуется в узком центромеряом сайте и в виде двух бэндов разной ширины в дистальной части. В большей части гетерохроматина У-хромосомы этот повтор отсутствует.

У м.arvalis гибридизация in situ выявляет небольшое число копий Ms2, сопоставимое с уникальными последовательностями. Локализованы они в длинном плече самой крупной поры аутосом в районе интерстициального гетерохроматического блока. На половых хромосомах и в центромерных районах аутосом м.arvalis повтор Ms 2 нэ выявляется.

У M.fcirgiscrum повтор Ms2 локализуется на большей части Y-хромосомы, за исключением ее прицентромерной части. На Х-хромосоме он занимает прицентромерную половину добавочного гетерохроматического плеча. Кроме того, интенсивный сигнал гибридизации выявляется в интерстициальном блоке гетерохроматина крупной пары акроцентрических аутосом. В центромерных блока>: гетерохроматина аутосом it.kirgisorum повтор Мэ2 отсутствует.

У м. transoaspicus локализация Ms2 выявляется в большей части гетерохроматического блока х-хромосомы и в дистальной части Y-хромосомы. Большая часть Y-хромосомы, центромерная часть x-хрсмосомы и аутосомы этого повтора не содержат. Таким образом, полученные данный позволяют заключить, что повтор Ма2 у M.subarvalis расположен в гетерохроматине половых хромосом, однако концентрируется в нем в виде отдельных бэндов разной степени ширины. Этот результат указывает на гетерогенность состава гигантских гетерохроматических блоков половых хромосом у этого вида полевок и уникальное кластернсэ расположение

внутри этих бло;-:ов повтора Мз2. Кроме того у М.агуа11з и М.к1-гд!аогига повтор Мй2 выявляется в ютерстициальннх районах

аут'"-с см.

2.3 Отрук турные о собендости повтора Мб2

Уникальная локализация повтора '/Б2 вызвала повышенный интерес к его молекулярной структуре. Методом Максама-Гилберта была определена его нуклеотндная последовательность (Рис.3). Интересной особенностью данной последовательности является наличие протяженной открытой рамки трансляции в комплементарной цепи (Рис.3). Однако поиск гомологии с помощью программы . ВЬЛБТР (А1хзс£ш1 et а1, 1990) по базе дачных аминокислотных последовательностей Р13 (выпуск 37) не выявил значимого сходстза этой последовательности с каким-табо белком из базы данных. Таким образом, вопрос о возможной функциональной ро ли выявленной открытой рачки трансляции остается открытым.

Поиск по базе данных с.епВапк (выпуск 76) с помощью программы БСАЫ (ЗоХоууеу ег а1, 1992) выявил, что область с 344 по 480 нуклеотид Мэг последовательности гомологична последовательности В1 повтора мыши. Выравнивание этой области к консенсуса В1 элемента мыши (Кгауеу ех а1, !1980) показало, что степень гомологии составляет около 551 (Рис.4). В1-подобная последовательность повтора Мв 2 полевки также содержит два участка потенциального промотора РНК-полимеразы III (л- и В-блоки) и 3'-концевую А,с-богатую область, характерные для В1-элемента (Егауеу е!; а1, 1560; \Veiner et а1, 19В6). В обоих промоторных участках отсутствуют делеции/вставки, в А-блоке наблюдается высокий уровень гомологии.

Последовательность Мз2 характеризуется . высоким содержанием А+т пуклеотйдов (58%) и поли-А/поли-т трактов. Анализ структурной- организации, последовательности Мз2 не выявил выраженных регулярно стей (тандемные и инвертированные повторы),- характерных для последовательностей из гетерохроматиновых районов хромосом. Примеры наиболее выраженных повторяющихся структур приведены на Рис.3. Можно видеть, что и прямой, и инвертированный повторы попадают в

20 . 49 . 60 И .100 .120

ТСМТСТТС1СТА1ЙПТТ1МТТв1аиТ£«ТССТС«АМйТ^Т1ТСТТ«»1ТШТ;ТСТй1/«Т1Т1«СТАТ:свТТА!гТТйМТС1СТАе11£М5Гй1ТТА4ТАДТС6Тг

1(0

16«

180

гоо

220

240

4....................................>

А»ШС7СС1И8Аад17ККАСШ77С7С77С777«1^ШШеШШАтСП7АШ7Аад^

260 . 230 ' . 300 ■ . 320 . ¡40 . МО

<....................................1

ситммткмкодшдшшвзхитшпшш^

«штт«а1тсссст1:т1ГС1стссстссс1ттш^11кшсА151{1мшл!1тнмт(шт1С1пт1111г«11«11тшс1С1м^^

330 . 430 . 420 . 440 . 460 . 480

юшсш{!7М7М7сетвАДАТС7см7тм7са«САеАс«сдс8шш7сшс7вАС7Аб77

520

¡(0

560

520

600

СТССТ5ШСЗАСЗТТСАТМСТТШСвТАТА£СШТ»Д£$МТТАТШК10ИЭДДО1ТША7АШйСШССТТС^

620 . 640 . 660 . 630 . 700 . 720

—> , I!..........>

КСТСб7АБСДС4ШТСиЖТСАС7ССТАСТ7СС$7£7ААС7и7СС7АААС£ТАС&б676Т&ТСС777Т7СБ7С7вТСАА&САаААСА77ААСД27А2«А7С7А7СС76Б76ССТА&

740 . 763 . ■ 780 . 800 . 820 . 840

Й£ТСТ1АД£ТС&ГТТиТТесСАТАТБТАА££гМСАТА£вТеСТАеАСТСТСССАСТСМеАСААСвТ£С«САТААСйСйе7СССТСССй^£СА£ССЫаеТАеДйСАТТ1СС«ТСТСЙ 1СйСАА7ТСМТАйАС6ААСССТй1йСАТТСССТТ6ТЙТССАССЯТСТйАСА£С&Т£АСТССТ6ТТССАССТС1АТТ&Т6ТСАйС5АСС«ТСС6ТСС£СТССАТСТТСТАААв«ТАСА6Т

860 . £83 . 900 . 920 . 940 . 960

»(7«771ССАйг7С1С71С77еС!ТСС7АСА6АА4й17СССМ«АТ!СА£СТ77СеС7665АСА5М1616С71СТ6СД!ССС7С7С7«СС7776С7«ММ16ССАСАССС7С7£СА5 ТСАСАААС4ТТйА£А£АА5ААССАА£&АТС7СТТТТААС&&аТТ1АС6ТССААА5ССАСССТбТСТТ4САССАА£АС6ТС&£&АбА&АСССАААССАСТССТТАС&&Т6Т6£&А£ЛС€ТС

980 . 1030 . 1320 1040 1060 . 1080

СААьС67£Т67АА777ТС7АССб€0ТСТССАС7СС&С(САаАА76АССТСАССА7&бС7СС777СА7САоА77ССАССАСА0СТвССА6СА£С7СА6б0АСБ&ТбАС7&ТСТТ1АААААС СТ7СвСАСАС*ТТАМАиТ«ССССМАС«ТеАв«£САвТС;ТАСТСМТС&ТАССиавАААвТАвТСТААСиТСеТЕТСвЯСв£ТС£ТССА57СССТеСС«СТ£АСА6АМ1ТТТТ£ Г I Е V С 5 I. I I Е А К 5 8 Е 0 в Е I V А А I I £ ? У 7 У 7 « I Г

1103 . 1120 . 1140 . 1160 . 1183

СА^70(САС^аА7С:7ШСМСШСАе«ССА:ААССА:Д17СС7АС7ТССАШ7777СТАТССАА£7(71С7ССАС7:СШС7ШАСШгиСЖСАШ;ТС С7С&АСС$Т€С76б7АС(АС76АС1ССЛА6ТС7&£7С77057СТААСБАТбАА£67СТАААААбА7АС8ТТСАСААбАЗ&7£АССС7А&А67С7Г7П£67в67667С77АА« ЗЗАЙкбЙОЗЬК

Рис.З. Нухлеотидная последовательность повтора Ма2 полевки М.виЬагуаНв. Область, гомологичная " В1 элементу приведена строчными буквами. Для комплементарной цепи приведена оттранслированная аминокислотная

последовательность выявленной открытой рамки ■ трансляции. Прямой повтор (длины ' 13 п.н.) обозначен стрелками с буквой <1. Инвертированный повтор (длины 38 п.н.) с 13 некомплементарными основаниями обозначен стрелками с буквой 1.

области поли-А трактов и, по всей видимости, являются отражением высокой насыщенности последовательности Ыз2 этими трактами. Такие черты нуклеотидннх последовательностей характерны для участков встраивания Alu и В1 элементов (Krayev et al, 19SO).

Box A 1 RHYNNRRYGG

B1 con CCGGGCATGGTGGTGCATG------CCTITAATCCCAGCACTCGGGAGGCAGAGGC

*** ****♦»• «**» •• • ******** ******** **

Ma2 ATTGGCCTGGTGGT-CATGGTCGGGGCTCCAGCACCAGCACTTTAGAGGCAGAAGC 3-11

Box В GWTCRANNCC .

B1con AGGC—GGATTTCTGAGTTCGAGGCCAGCCTGGTC—TTCAGAGTGAGTTCCAGG-••*• * * * ** *** * ***** *** ** * *** ****** ***

Ms2 AGGCCTGTCTGTGTGCTTTCAAAGCCAGACTGATCAATGTAGATTGAGTTT-AGGC

129

B1 con -----ACACC---AGGGCTACAGAGAAACCCTGTCT

• *** ** ** *******

Мз2 ACTCTATACCGTAAGATCTGCAGAGAACAGGACAAAGTTCCAAGTAT

=========== 500

Рис.4. Сравнение консенсуса B1 элемента мыши (Krayev et al, 1980) и участка с 344 по 500 нуклеотид последовательности Ms2. Совпадающие нуклеотиды отмечены звездочкой. Над областями, гомологичными промоторным участкам РНКполимеразы III (box А и box В), приведены соответствующие консенсусные последовательности (Weiner et al, 1986). Двойной прерывистой линией обозначен А,с-богатый участок (Krayev et al, 1980; Weiner et al,1986)

Анализ с помощью программы ВЬАБТЫ (А^зс1т1 et а1, 1990) показал, что среди всех последовательностей из СепВапк (выпуск 79) наиболее сходной была последовательность НАМЗНСА (ген тяжелой цепи альфа-кардиак миозина, экзоны 1-39 из Мезосг1се^ ив ашге^ив). В Мв2 последовательности гомологичный участок соответствовал В1 элементу (позиции 344-480). В последовательности НАМБНСА гомологичный участок располагается внутри 34 интрона (позиции 26113-26276). Процент совпадающих

нуклеотидов - около 65$ (Рис.5). Для оставшейся части последовательности М52 никаких значимых гомологий с известными последовательностями выявлено не было.

Выделенные и охарактеризованные до настоящего времени группы повторов разнообразны по своей структуре, но локализуются равномерно вдоль всей длины крупных гетерохроматических блоков. Таким образом, изученный нами Мз2 повтор по особенностям своей кластерной локализации в гетерохроматиновых блоках принципиально отличается от других

347

Мэ2 ATTGGCCTGGTGGTCATGGT-CGGGGCTCCAGCACCAGCACTTTAGAGGCAGAA * * ** ****** • « ***** ********* *********

HAMSHCA ACTCACCAGGTGGTGGTGCCGCATGCCTTTAATCCCAGCACTIGGGAGGCAGAA 26113

Ms2 GCAGGCCTGTCTGIGTGCTTTCAAAGCCAGACTGATCAATGTAGATIGAGTTTA ***»»* *** **** *** ******* *** *« * *** * * *

HAMSHCA GCAGGCGGATCTCTGTGAGTTCCAAGCCAGTCTGGTCTACAAGACCTAGTTCCA

500

Ma2 GGCA—CTCTATACCGTAAGAiCTGCAGAG---AACAGGACAAAGTICCAAGTAI

** * *** • * * *** * *

HAMSHCA GGAAGCCTCCAAAACCACAGAGAAACCCTGTCTCGAAAAACCAAAACCIGGGGCT

Рис.5. Сравнение потенциального В1 элемента повтора Мз2 и участка с 26113 по 26276 позиции из последовательности намзнса. Совпадающие нуклеотиды отмечены звездочкой. Двойной прерывистой линией обозначен А,с-богатый участок (Кгауеу et а1, 1560; ВДегпег et а1, 1986).

известных повторяющихся последовательностей ДНК у полевок. Еще одним отличительным признаком является отсутствие сайтов локализации повтора Мз2 в центромэрном гетерохроматине аутосом.

Компьютерный анализ, проведьнный с помощью. базы данных GenBank, показал что выявлен новый представитель семейства В1 элементов, который значительно отличается от других представителей семейства. Это важно для исследования эволюции

В1 и Alu семейств повторяющихся элементов. Интересной чертой последовательности Мз2 является отсутствие в ней ряда свойств, характерных для гетерохроматиновой ДКК (Modi, 1993b). Во-первых, в ней отсутствует выраженная внутренняя повторенность (прямые и инвертированные повторы). Во-вторых, поиск по базе дачных нуклеотидных последовательностей не выявил сходства повтора Мз2 с другими последовательностями гетерохроматиновой -ДНК. ' В-третьих, в составе последовательности Мз2 выявлен В1 элемент, относящийся к классу SINE элементов, не характерных для гетерохроматина (Brutlag, 1980). Все эти особенности последовательности Мз2 делают ее интересным объектом для дальнейших исследований. -

ВЫВОДЫ

1. Из геномной ДНК полевки M.subarvalis выделен и охарактеризован повтор Ms1, обший для полевок рода Microtias. Количество его копий составляет около 10 на геном. Определена его первичная структура, состоящая из 1834 п.н. Компьютерный анализ с использованием банков данных показал 70$ гомологию повтора Мз1 с LINE элементом мыши LUid-A2.

2. Выделен и клонирован из геномной ДНК полевки M. kirgisortim повтор мм размером около 5000 п.н. Частично прочитана его первичная структура. Сравнение 5'-концевого фрагмента последовательности №1 с аналогичной последовательностью Мз1 показало их практически полную идентичность.

3. Анализ гибридизацией in situ показал, что выделенные ЫЫЕ элементы полевок Ms1 и Мк1 локализованы преимущественно в гетерохроматических областях половых хромосом четырех исследованных.видов полевок.

4. Из геномной ДНК полевки M.subarvalis выделен и клонирован специфичный для этого вида повтор Мз2. Блот-гибридизацией показано наличие двух более высокомолекулярных копий этого повтора, общих для четырех видов полевок рода Microtus.

Прочитана первичная последовательность повтора, состоящая из 1194 п.н.

5. Копьютерный анализ первичной структуры и поиск в банках данных показали, что повтор Ms2 не имеет аналогов среди известных последовательностей ДНК. В позиции с 344 по 500 нуклеотид он содержит В1 элемент, последовательность которого имеет 55$ гомологии с консенсусом последовательности В1 элемента мыши.

6. Результаты гибридизации In situ методом FISH показали уникальную кластерную локализацию повтора Ма2 в гетерохроматических блоках Х-хромосом полевок рода Microtua и его отсутствие в Х-хромосоме M.arvalis, не содержащей такого блока. Данный повтор выявляется также в интерстициальшх районах самых крупных пар аутосом у полевок M.arvalis и M.kirgisorum.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Холодилов Н.Г, Майоров В.И., Муллакандов М.Р., Черяукене О.В., Нестерова Т.В., Рогозин И.В., Закиян С.М. ы-элемент полевки Microtufl subarvalis // Докл РАН - 1992 - Т.323 -No5 - С.963-965

2. Kholodilov N.G., Mayorov V.I., Mullokandov M.R., Cheryauke-ne O.V., Nesterova T.B., Eogozin I.В., Zakian S.M. LINE-1 element in the vole.Microtus subarvalis // Manmalian Genome - 1993, V.4 - P.621-626.

3. Mayorov V.I., Vorobyeva N.Y., Khrapov Eu.A., Kholodilov M.G., Rogozin I.В., Nesterova T.B., Protopopov A.I., Sabli-na O.V., Adkinson L.R., Graphodatsky A.S., Zakian S.M. Organization and chromosomal localization of'the Bl-like containing repeat of Micro tus subarvalis // Marmialian Genome (в печати).