Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностические возможности молекулярно-генетических маркеров в систематике млекопитающих (на примере грызунов и копытных)

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Диагностические возможности молекулярно-генетических маркеров в систематике млекопитающих (на примере грызунов и копытных)"

На правах рукописи

с-, УДК 577.21 : 599.323.4 : 735

О;

с? о.

."э

■ _ сэ

ПОТАПОВ Сергей Георгиевич

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В СИСТЕМАТИКЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ (на примере грызунов и копытных)

(03.00.26.— молекулярная генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН и Институте проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН А. П. Рысков,

доктор биологических наук, профессор В. Н. Орлов.

доктор биологических наук, профессор Д. А. Крамеров,

доктор биологических наук, профессор В. Г. Митрофанов.

Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН.

Защита диссертации состоится « Ь-У.» ноября 1998 года в «. . .» час. на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «. и » октября 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук сГрабовская Л. С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Все разнообразие живых организмов, населяющих нашу планету, и их индивидуальность обусловлены в конечном итоге феноменом полиморфизма ДНК, определяемого различиями в строении молекул ДНК на уровне индивидуумов и таксономических групп. Поэтому возникает проблема выявления полиморфизма на всех уровнях биологической организации, особенно на генетическом ■ уровне. В качестве генетических маркеров могут быть использованы любые устойчиво наследуемые и сохраняющиеся в ряду поколений признаки и свойства, индивидуализирующие отдельный организм или группы организмов (линии, популяции, виды, таксоны надвидового ранга), а также конкретные участки генома: отдельные хромосомы, их наборы, внехромосомные структуры, повторяющиеся последовательности ДНК, индивидуальные генетические локусы.

Цитогенетические методы не всегда могут быть использованы для целей систематики из-за возможности аналогичных совпадений морфологии хромосом и трудности их функционального анализа (Орлов, 1974). Методы биохимической генетики ограничены уровнем структурных генов, составляющих лишь часть генома. Применение для таксономических целей молекулярно-генетических методов, основанных на использовании феномена геномного полиморфизма, создает объективные предпосылки для более полного установления систематического положения и филогенетических связей живых организмов.

В данной работе использованы методы анализа структуры генома, такие как "таксономический фингерпринт ДНК" (Федоров и др., 1992; Grechko et al., 1997) и полимеразная цепная реакция с использованием случайных праймеров (RAPD PCR - random amplified polymorphic DNA, polymerase chain re'action) (Welsh, McClelland. 1990; Williams et al., 1990), которые нашли применение для

решения актуальных проблем систематики и филогении различных групп организмов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является поиск и применение подходящих молекулярно-генетических маркеров для генетической дифференциации различных видов млекопитающих и оценка диагностических возможностей получаемых маркеров для уточнения филогенетических отношений таксонов в пределах систематических групп.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Оптимизация условий и проведение "таксономического фингерпринта ДНК" и RAPD-анализа представителей грызунов и копытных животных.

2. Поиск и определение диагностической ценности ДНК-маркеров, применимых для идентификации различных видов млекопитающих.

3. Использование молекулярно-генетических маркеров для дифференциации видов и таксонов надвидового ранга млекопитающих и уточнения их филогенетических отношений.

Научная новизна. Впервые проведено молекулярное маркирование геномов грызунов (Rodentia), представленных родами Phoäopus, /Ipodemus, Microtus и парнокопытных (Artyodactila) с помощью "таксономического фингерпринта ДНК" и метода RAPD PCR, позволившее успешно идентифицировать и дифференцировать виды и таксоны надвидового ранга. Продемонстрированы диагностические возможности таксонопринтных и RAPD-маркеров для определения внутри- и межвидовой генетической изменчивости в исследованных таксономических группах. При анализе межвидовых гибридов представителей рода Phoäohus (Р.campbelli и Р. sungorus) показан кодоминантный характер наследования таксонопринтных маркеров и

менделевский характер наследования РАРО-маркеров. По данным геномного маркирования построены дендрограммы генетического сходства. Обнаружено, что с систематическим положением таксонов в наибольшей степени коррелируют дендрограммы генетического сходства, полученные при помощи данных РАРО-маркирования. По результатам молекулярного маркирования подтверждена видовая и родовая самостоятельность отдельных таксонов: СаргеоШэ саргеоШэ и С.руяат^из; Бухаете и АроИетиз. МгсгоЬиз и 1азгорос1отуз.

Практическая ценность работы состоит в разработке оптимальных условий таксонопринтного и ИАРБ-маркирования геномов изученных групп животных, характеристике выявляемых маркеров, определении их возможностей для анализа внутри- и межвидовой изменчивости и установления или уточнения филогенетических отношений.

Аппробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIII рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов", XXIV международной конференции по генетике животных (Прага, 1994), международном совещании "Состояние териофауны в России и ближнем зарубежье" (Москва, 1995), Евро-Американском

маммологическом конгрессе (Сантьяго де Компостелла, 1998) и конкурсе печатных работ Института биологии гена РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает в себя 383 источника. Работа проиллюстрирована 21 рисунком и 8 таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Таксономический фингерпринт ДНК.

Таксонопринтный анализ. основанный на фракционировании радиоактивно меченных продуктов гидролиза ДНК короткощепящими рестриктазами, позволяет выявлять анонимные фрагменты повторяющихся элементов генома, которые отличаются значительной консервативностью, и могут быть использованы как видоспецифические молекулярные маркеры, открывающие возможности изучения родства групп животных и их таксономических отношений.

В настоящей работе был впервые применен метод таксономического фингерпринта ДНК для анализа вариабельности повторяющихся элементов геномов млекопитающих на примере грызунов. Для дифференциации видов из таксономических групп различного ранга был проведен таксонопринтный анализ образцов ДНК джунгарского хомячка (Phodopus sungorus), полевой мыши (Apodemus agrarius), лесной мыши (A.sylvaticus) и домовой мыши (Mus muscutus) с использованием рестриктаз Hín/I, Taql и laql+MspI (рис. 1а). На примере рестриктазы Hinfl было показано, что наибольшие отличия наблюдаются между ДНК животных, _относящихся к разным семействам - Crlcetiâae (Phodopus sungorus) и Muriclae (Apodemus agrarius, A.sylvaticus и Mus muscutus), a различия между представителями одного рода (Apodemus agrarius и A. sylvaticus) минимальны. Отсутствие индивидуальных различий между особями в пределах вида было показано на примере двух особей A.silvaticus из различных географически удаленных популяций, таксонопринты которых были идентичны, что подтвердило данные Федорова и соавторов (Федоров и др., 1992) об идентичности таксонопринтов особей в пределах вида и позволило в дальнейших

экспериментах по таксонопринтному анализу характеризовать вид по препарату ДНК, выделенному из единственной особи.

Для таксонопринтного анализа ДНК представителей рода мохноногих хомячков Phodopus Miller, 1910 были использованы рестриктазы Ягп/I, MspI и TaqI. Как видно из результатов эксперимента, представленных на рис.16, каждый из исследованных видов имеет собственный характерный спектр выявляемых высокоповторяющихся последовательностей ДНК. Наиболее насыщенный спектр фрагментов ДНК был получен при использовании рестриктазы Taql (14-17 электрофоретических полос), наиболее бедный - при использовании iïtn/I (4-5 полос), а в спектрах Mspl-таксонопринтов насчитывается 8-12 полос. Следует отметить отсутствие различий между таксонопринтными спектрами представителей двух популяций Р.сатрЪеШ и высокую степень сходства между таксонопринтами Р.сатрЪеШ и P.sungorus. При сравнении таксонопринтов прямых и обратных гибридов между P.sungorus и Р.сатрЪеШ вне зависимости от направления скрещивания было обнаружено, что они наследуют все имеющиеся в электрофоретических спектрах обоих родителей фрагменты высокоповторяющихся последовательностей ДНК; при этом интенсивность общих полос остается прежней, а интенсивность отличающихся - ослабляется, что свидетельствует о равном вкладе геномов обоих родителей в геном гибрида.

Для таксономического фингерпринта ДНК мышиных также были использованы рестриктазы Hin/I, MspI и TaqI. Результаты экспериментов показывают, что выявляемие маркеры хорошо дифференцируют роды Rat tus, Mus и Apodetnus между собой. Внутри рода Apodems полевая мышь A.agrarius сильно отличается от остальных видов лесных мышей, причем эти отличия сопоставимы с

межродовыми. Близкие виды лесных мышей внутри рода Apodemus, объединяемые в подрод Silvaemus, дифференцируются с большим трудом. Так, рестриктаза Hinfl не позволяет различить эти виды; при помощи рестриктазы MspI не удается отличить A. silvaticus от A.microps и A.falzfeini от A.ponticus, а обе пары видов отличаются друг от друга только наличием у A.falzfeini и A.ponticus одной дополнительной минорной полосы. Несколько лучше дифференцирует виды подрода Silvaemus рестриктаза Taql (рис.26). Несмотря на то, что виды /Lmícrops и A.falzfeini данная рестриктаза дифференцировать также не способна, все же с ее помощью достаточно успешно удается отличить данную пару видов от A.silvaticus и A.ponticus. которые в свою очередь различаются благодаря наличию в таксонопринтном спектре A.ponticus дополнительного мажорного фрагмента ДНК размером около 170 п. н. Полученные результаты суммированы при построении дендрограммы генетического сходства (рис.7а), основанной на матрицах попарного сходства таксонопринтов с использованием всех трех рестриктаз.

В экспериментах по таксонопринтному анализу полевок были использованы рестриктазы MspI и Taql, которые позволили получить информативные спектры фрагментов ДНК размером от 40 до 500 п. н. (рис.2). Спектры таксонопринтных фрагментов ДНК для каждого вида состоят из ряда мажорных полос, число которых варьирует от 6 до 21 для Taql и от 8 до 20 для Hspl. Наиболее богато представлены спектры фрагментов повторяющихся последовательностей ДНК у таких видов, как М. arvalis и M.irani. При анализе Taql-таксонопринтов кроме видоспецифических полос и полос, характерных лишь для части изученных видов, можно выделить две общие для всех исследованных видов полосы - мажорную размером около 67 п.н. и несколько менее

выраженную размером около 200 п.н. Фрагмент ДНК размером около 320 п.н. характерен только для представителей рода Microtus и отсутствует у представителей родов Lasiopodomys и Clethrlonomys. В Mspl-таксонопринтах общей для всех изученных видов является мажорная полоса размером около 160 п.н., полоса же размером около 240 п.н. имеется у всех полевок, кроме L.brandti. Следует отметить, что выявляемый на Mspl-таксонопринтах фрагмент ДНК размером около 160 п.н.. возможно, соответствует недавно охарактеризованной сателлитной ДНК, выделенной из генома скальной полевки M.chrotorrhinis и названной MSAT-160 (Modi, 1993). Полученные результаты суммированы при построении дендрограммы генетического сходства (рис.76), основанной на матрицах попарного сходства таксонопринтов с использованием обеих рестриктаз. Попарно кластеризуются представители подрода Sumeriomys, а также M. transcaspicus с М.majori и M.fortis с M.gregalis. Представители же родов Clethrlonomys и Lasiopodomys кластеризуются отдельно от представителей рода Microtus.

В результате таксономического типирования ДНК копытных животных для всех видов были получены спектры повторяющихся элементов генома в виде набора мажорных рестриктазных фрагментов ДНК, имеющих размеры от 40 до 650 п.н. Их число в геномных спектрах изученной группы животных варьирует от 6 до 15 для TaqI и от 3 до 18 для Mspl. При анализе Taql-таксонопринтов (рис.3) можно выявить фрагменты ДНК, имеющие одинаковые размеры практически у всех исследованных копытных (190 и 240 .п.н., а также 120 п.н. - кроме косуль). Наряду с полосами, общими для представителей всех изученных видов оленьих (220 п.н., а также 155 п.н. - кроме оленей и 95 п.н. - кроме лося), выявляются также

фрагменты ДНК, специфичные только для отдельных видов, например, фрагменты длиной 150, 310 и 430 п.н. для настоящих оленей; 85, 110, 145 и 235 п.н. - для косуль; 280 п.н. - для лося и 70 п.н. -для кабарги. Для Mspl-таксонопринтов копытных удается обнаружить некоторую общность спектров фрагментов ДНК только в пределах подсемейства Cervlnae, таксонопринты других исследованных копытных носят более выраженный индивидуальный характер. С помощью таксономического фингерпринта ДНК не удалось обнаружить качественных отличий между европейской и сибирской косулями, а также между благородным и пятнистым оленями. Полученные результаты отражены на дендрограмме генетического сходства, построенной по данным суммирования спектров таксонопринтов с использованием обеих рестриктаз (рис.7в). На дендрограмме в отдельные кластеры выделяются представители семейства оленьих и кабарга, а также представители семейства бычьих и рода косуль. Обособленное положение от оленьих и бычьих занимает кабан, что согласуется с его систематическим статусом представителя другого подотряда (Suiformes). Ни по одной из использованных рестриктаз не удается обнаружить отличий между близкородственными видами Cervus elaphus и С.nippon, а также Capreolus capreolus и C.pygargus.

Отдельно изучались представители семейства полорогих, чьи таксонопринты обладают самыми богатыми спектрами фрагментов ДНК среди изученных копытных. Сравнение таксонопринтов представителей родов Bos и Bison показывает большое сходство в спектрах рестриктазных фрагментов ДНК, однако наблюдаются и характерные отличия. В частности, на Taql-таксонопринтах на уровне маркера длиной 76 п.н. у зубра и бизона выявляются две минорные полосы.

а.

123456789 10 12 14 M

* л

б.

1 3 5 M 9 11 13 15 17 19

<? "i

« ##

vi

• - *<*■)

Рис.1. Таксономический фингерпринтинг ДНК грызунов: 1 - Phodopus sungorus; 2, 6, 11 - Apodems agrarius: 3, 4, 7, 8. 12, 13 -A. sylvattcus: 5, 9, 10, 14, 15 - Mus musculus; ДНК гидролизовали рестриктазами Hinfl (1 - 5), Taql (6 - 10) и TaqI+MspI (11-15)(а) и представителей рода Phodopus: 1, 8, 14 - P.roborovskii; 2, 9, 15 - Р.сатрЪеШ (Монголия); 3, 10, 16 - P.campbeUi (Тува); 4, 11, 17 - P. sungorus; 5, 12, 18 - гибрид P. sungorus x P.campbeUi; 6. 13, 19 - гибрид Р.сатрЪеШ x P. sungorus: M - маркерные фрагменты (п.н.): ДНК плазмиды pBR322, гидролизованная рестриктазой Mspl. ДНК гидролизовали рестриктазами Hinfl (1 - 6). Mspl (8 - 12) и Taql (13 - 19) (б).

а. б.

M 1 3 6 8 И 14 18 22 25 29 M 1 3 6 8 И 14 17 20 24 27

Рис.2. Таксономический фингерпринтинг ДНК представителей трибы Arvicolini и подсемейства Murlnae: 1, 2 - Microtus arvaUs форма arvalis; 3, 4 - M. arvalis форма obscurus; 5, 6 - M. transcaspícus; 7, 8, 9 - M. Sortis; 10 - M. socialis; 11. 12 - M. iraní; 12, 13 -M.gregalis; 15, 16 - L.brandti; 17, 18 - M.majori; 19, 20 -C.glareolus; 21. 22 - Rattus norvegicus; 23, 24 - Mus musculus; 25 - Apodemus agrarius; 26 - A. sylvaticus; 27 - A.microps; 28 -A.falzfeini; 29 - A.ponticus; M - маркерные фрагменты (п.н.): ДНК плазмиды pBR322, гидролизованная рестриктазой Mspl. ДНК гидролизовали рестриктазами Mspl (а) и Taql (б).

110

90 76 67

1 3 5 8 11 14 18 21

:

i

662 404 309 242 180 147 122 90 76 67

34

M 23 26 29 32 35 M

ГТ ■ Л||ЦТ ГЯг

-•-^jjb

"«а». *т*гшт*

Рис.3. Таксономический фингерпринтинг ДНК представителей отряда Artlodactyla: 1. 12 - Cervus elaphus; 2. 13 - Cervus nippon; 3. 14 - Dama dama; 4. 15 - Capreolus capreolus; 5. 16 - Capreolus pygargus; 6, 17 - Alces alces; 7, 18 - Moschus moschiferus; 8. 19 29. 36 - Bison bonasus; 9, 20. 28. 35 - Bison bison; 10. 21. 27. 34 - Bos taurus; 11, 22 - Sus scro/a; 23. 30 - Bos indicus; 2426, 31-33 - гибриды В. taurus х ß. indicus; M - маркерные фрагменты (п.н. ): ДНК плазмиды pBR322, гидролизованная рестриктазой Mspl. ДНК гидролизовали рестриктазами Taql (1-11, 23-29) и MspI (12-22, 30-36).

10 12 14 16 M

Г>:ГГГ| ')

3530 2027 1904 1584 1330

983

831

564

Рис.4. ИАРЭ РСй полиморфизм геномов представителей Бра1ах еПгепЬегвг, выявляемый праимером Р29; хромосомные формы с 2п = 52 (1-3), 54 (4-6), 58 (7-9) и 60 (10-12) (а) и рода Ph.odob.us, выявляемый праймером НМ13; Р.гоЪогоизкИ (1, 2), Р.сатрЬеШ (Монголия) (3, 4, 12, 13), Р.сатрЬеШ (Тува) (5, 6). Р.зи^огив (7, 8, 9, 16). гибриды Р-эи^ог^ х Р.сатрЬеШ (10. 11). гибриды Р. сатрЬеШ х Р.Бипвогив (14, 15) (б): М - маркерные фрагменты: ДНК плазмиды рВК322, гидролизованная рестриктазой Муа1 (п.н.) (а); ДНК фага X, гидролизованная рестриктазами ШМШ и ЕсоН1

(Т. П.Н. > (б).

тогда как у представителей рода Bos хорошо различима одна мажорная полоса. На уровне маркера длиной 242 п.н. также видны различия: у представителей рода Bos можно наблюдать по две полосы, в то время, как у зубра - три полосы, а у бизона - только одна (рис.3). Определенные отличия между представителями Bos и Bison наблюдаются и на Mspl-таксонопринтах выше маркера 242 п.н.

Полимеразная цепная реакция с использованием.случайных

праймеров (RAPD PCR).

Метод полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров позволяет амплифицировать анонимные участки ДНК и получать специфические паттерны продуктов реакции при электрофорезе в геле. Такой подход сегодня широко используется для филогенетической идентификации видов.

В предварительных экспериментах было протестировано более тридцати праймеров, различающихся по нуклеотидной последовательности, GC-содержанию и размеру. Было отобрано восемь праймеров, шесть из которых (FM13, ' RM13, НМ13, СЗ, С17'иС47) были использованы для дифференциации видов мохноногих хомячков рода Phodopus, пять (FM13, RM13, Р29, СЮ и С47) позволили получить стабильно воспроизводимые видоспецифические картины для всех изученных видов полевок трибы Arvicolinae, по четыре были применены для выявления уровня внутривидового полиморфизма у палестинского слепыша Spalax ehrenbergi (FM13, RM13, Р29 и С47) и для дифференциации представителей подсемейства Murinae (FM13, Р29, СЮ, С47), а три (Р29, НМ13 и RM13) оказались наиболее информативными при дифференциации изученных видов копытных. Каждый праймер дает свою специфическую картину амплифицированных

фрагментов ДНК. Число полос в спектрах RAPD PCR-продуктов для различных праймеров у исследованных видов колеблется в пределах от 3 до 25. Варьирует также степень выраженности (мажорность или минорность) отдельных фрагментов ДНК в спектре, что может быть связано как со степенью повторяемости (копийностыо) исходной нуклеотидной последовательности в геноме, так и с наложением различных типов ДНК одного размера.

Для выявления уровня внутривидового полиморфизма при использовании RAPD-маркеров были исследованы с помощью четырех олигонуклеотидных праймеров представители четырех хромосомных форм палестинского слепыша Spalax ehrenbergi из различных районов Израиля, каждая из которых была представлена, индивидуумами из центральной популяций, из экологически окраинной популяции и из районов вблизи гибридной зоны с другими хромосомными формами. RAPD-спектры представителей различных популяций слепышей идентичны или очень похожи между собой; по каждому из использованных праймеров индивидуальные различия наблюдаются как правило не более чем по 2-4 фрагментам ДНК из 16-22 (рис.4а). С помощью использованных праймеров не удалось выявить молекулярных маркеров, которые были бы специфичны исключительно для какой-либо одной хромосомной формы. Внутривидовия изменчивость по RAPD-маркерам для Spalax ehrenbergi не превышает 5%.

Для генетической дифференциации мохноногих хомячков рода Phoäopus и межвидовых гибридов между Р.сатрЪеШ и P.sungorus, и выявления характера наследования амплифицированных фрагментов ДНК у полученных гибридов были проведены эксперименты с использованием праймеров RM13 и С47, результаты которых представлены на рис. 46. RAPD-спектры представителей Р. сатрЪеШ

из Тувы и Монголии были практически идентичны, а спектры ■амплифицированных фрагментов ДНК Р. campbelli и P.sungorus более сходны между собой, чем каждый из них с RAPD-спектрами Р. roborovslcu по всем использованным праймерам, что свидетельствует о более близком родстве этих видов по сравнению с P.roborovskii. Спектры амплифицированных фрагментов ДНК гибридов между Р. campbelli и P.sungorus являются либо суммой RAPD-спектров их родителей, что характерно скорее всего для мономорфных локусов и повторяющихся последовательностей ДНК, либо наследуется фрагмент ДНК только от одного из родителей,' что, вероятно, связано с гетерозиготностью данного уникального полиморфного локуса.

Для генетической дифференциации представителей подсемейства Murinae было использовано четыре различных олигонуклеотидных праймера. Количество фрагментов ДНК в RAPD-спектрах разных видов варьирует от 3 до 25 в зависимости от особенностей праймера, причем суммарно по всем четырем праймерам число амплифицированных фрагментов ДНК колеблется от 26 у Apodemus ponticus до 59 у Rattus поrvegicus. При использовании большинства праймеров наиболее богатые спектры амплифицированных фрагментов ДНК наблюдаются у домовой мыши и серой крысы, а самые бедные спектры - у Apodemus agrarius и A.ponticus (рис.5). Максимальное сходство в спектрах амплифицированных фрагментов ДНК по большинству изученных праймеров наблюдается внутри подрода Sylvaemus между близкими видами A. ponticus и A.microps, а также между A.silvaticus и A.falzfeini. RAPD-спектры амплифицированных фрагментов ДНК M.msculus и R.norvegicus имеют большее сходство между собой, чем с любым из представителей рода Apodemus.

Наблюдаемые особенности RAPD-спектров мышиных нашли отражение в дендрограмме ■ (рис.7г), построенной на основании суммарной для всех, четырех праймеров матрицы сходства. Интересным является тот факт, что представители -подрода Sylvaemus образуют один компактный кластер, а относящаяся к тому же роду Apodemus полевая мышь A. agrarius кластеризуется отдельно от них и вместе с представителями родов Mus и Rat tus.

Для десяти изученных видов полевок количество фрагментов ДНК в RAPD-спектрах варьирует от 6 до 19 (рис.5), причем суммарно по всем пяти ' праймерам число амплифицированных фрагментов ДНК колеблется от 53 у JH. soclalis до 74 у M.fortis. Максимальное сходство в спектрах амплифицированных фрагментов ДНК по большинству изученных праймеров наблюдается для хромосомных форм M.arvalis (формы arvaus и obscurus), а также для близких видов M:soctaUs и М.iraní, относящихся к одному подроду Sumeriomys. Сходство между более отдаленными видами полевок по RAPD-маркерам варьирует в разной степени в зависимости от выбранного праймера, но во всех случаях спектры амплифицированных фрагментов ДНК C.glareolus в наибольшей степени отличаются от спектров представителей рода серых полевок. Наблюдаемые особенности в изменчивости геномов полевок нашли отражение в дендрограмме (рис.7д), построенной на основании суммарной для всех пяти праймеров матрицы сходства. Отдельно от всех представителей рода серых полевок выделяется представитель рода лесных полевок C.glareolus. Следующий уровень кластеризации отражает разделение трибы на виды с восточнопалеарктическим типом ареала (M.fortis, M.gregalis и L.brandit) и с западнопалеарктическим типом ареала. Последние, в свою очередь, разделяются на два кластера, один из

M 1 3 5 7 9 И 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Рис.5. RAPD PCR полиморфизм геномов представителей полевок и мышиных, выявляемый при помощи праймера Р29: 1, 2 - Micro tus arvalis форма arvalts; 3, 4 - M.arvalis форма obscurus; 5, 6 -M. transcaspicus; 7-9 - M.fortis; 10 - lt. socialís; 11, 12 -M.irani: 13. 14 - M. gregalis; 15, 16 - L. brandtí; 17, 18-M. majori; 19, 20 - С.glareotus; 21, 22- Rattus norvegicus; 23. 24 - Mus msculus; 25 - Apoáemus agrarius; 26 - A. sylvaticus: 27 -4.mtcrops; 28 - A.falzfeini; 29 - A. pon «cus; M - маркерные фрагменты (п.н.): ДНК плазмиды pBR322, гидролизованная рестриктазой Hínfl.

а. б. в.

123456789 10 123456789 10 123456789 ЮМ

Рис. 6. RAPD PCR полиморфизм геномов представителей отряда Artiodactyla, выявляемый праймерами: а) НМ13, б) RM13 , в) Р29; 1 - Cervus elaphus; 2 - Cervus nippon; 3 - Dama âama: 4 - Capreolus capreolus; 5 - Capreolus pygargus; 6 - Alces alces; 7 - Moscîms moschí/erus; 8 - Bison bonasus; 9 - Bos taurus: 10 - Sus scrofa; M - маркерные фрагменты (п.н.): ДНК плазмиды pBR322, гидролизованная рестриктазой Mval.

__Г А,

J 1 А

I I-А

1-A.J

Am. f.

Б.

Ар. R.n.

M.mus. Ао.

M.s. M.i. M.a.a.

_,С.е.

'С. п.

— D.d. —А.а/с. —M.mos. _.Се.

~1с.р.

ЕВ.Ьоп.

B.bis.

B.t.

— s.S.

£

4=Е

д

гСЕ

J4=E

•А.т.

-Ар.

-As.

-А. f.

-R.n.

-M.mus.

-Ао.

-M.s.

■M.i.

-M.m.

-M.a.a.

-M.a.o.

-M.t.

■M.t.

■ Lb.

-M.g.

-C.g.

E.

О П.5 1.0 0 0.5 1.0

Рис.7. Дендрограммы генетического сходства представителей подсемейства Murinae (а, г), трибы Arvicolini (б, д) и отряда Artyodactila (в, е), построенные с помощью метода UPGMA по суммарным матрицам сходства фрагментов ДНК. полученных методом таксонопринтного анализа (а, б. в) и RAPD PCR-анализа (г, д, е); R.n. - Rattus norvegicus; M.mus. - Mus muscutus; A.a. - Apodemus agrarius; A.s.- A. sylvaticus; A.m.- A.microps: A.f.- A. falzfeini; A.p. - A.ponticus; M.a.a.- Mlcrotus arvalis форма arvaIis: M.a.o. - M. arvalis форма obscurus; M.t.- M. transcaspicus; M.f.-M.fortis; M.s. - M. socialis; M.i. - M.i rani; M.g. - M.gregalis; M.m. - M.majori; L.b.- Lasiopodomys brandti; C.g. - Clethrionomys glareolus; C.e. - Cervus elaphus; C.n. - Cervus nippon; D.d. -Dama dama; C.c. - Capreolus capreolus; C.p. - Capreolus pygargus; A.als. - Alces alces; M.mos. - Moschus moschiferus; ß.bon. -Bison bonasus; ß. bis. - ßtsori bison; B.t. - Bos taurus; S.s.- Sus scrofa.

которых включает в себя представителей подрода Microtus M.arvalis и М. transcaspicus, а другой содержит представителей подродов Terrícola (U.majori) и Suneriomys (M.socialis и U. iraní). У кариоформ M.arvalis и .видов подрода Sumeriomys уровень выделения кластера практически совпадает. Следует отметить, что общая топология дендрограммы генетического сходства, основанной на данных RAPD-анализа в значительной степени коррелирует с фенограммой генетических дистанций, полученной при анализе биохимических данных (Межжерин и др., 1993) и с их современной систематикой, основанной на комплексе морфолого-экологических, физиологических, цитогенетических и генетико-биохимических критериев. Интересным является также тот факт, что на всех дендрограммах виды с восточнопалеарктическим типом ареала образуют один кластер, что свидетельствует о генетической близости подродов Alexandromys и Stenocranius, а размещение внутри данного кластера L.brandti подтверждает обоснованность сомнения в правомерности выделения брандтовых полевок в самостоятельный род Lasiopodomys Lataste. 1887. Вместе с тем, отмеченные нами различия в таксонопринтах между брандтовыми и другими серыми полевками, в систематическом плане можно интерпретировать как родовую обособленность Lasiopodomys. Уровень генетического сходства между M.majorí и другими представителями этого рода по данным обоих методов (таксонопринт и RAPD) не дает оснований для выделения подземных полевок в отдельный род. Два близких вида общественных полевок (подрод Sumeriomys) - M.socialis и M.irani - достаточно хорошо различаются при помощи таксонопринта, что свидетельствует о значительном изменении качественного состава повторяющихся

последовательностей ДНК в их геномах. Их видовой статус подтверждается также тем, что несмотря на сходство в числе и форме хромосом и незначительность морфологических различий в природных условиях они не скрещиваются. Таксонопринтный анализ не выявил различий по двум исследованным рестриктазам между двумя хромосомными формами обыкновенной полевки, arvails и obseurus. Состав повтояющихся последовательностей ДНК, выявленный использованными в настоящем исследовании рестриктазами, у данных кариоформ не претерпел качественных изменений. Однако по данным RAPD-анализа уровень различий между кариоформами обыкновенной полевки и близкими видами общественнях полевок вполне сопоставим, что подтверждает мнение о возможном видовом ранге формы obseurus (Загороднюк, 1991).

Количество амплифицированных фрагментов ДНК в RAPD-спектрах у десяти исследованных видов копытных составляло 4-17 для праймера RM13 и 7-14 для праймеров НМ13 и Р29 (рис.6). Значительное сходство в спектрах амплифицированных фрагментов ДНК по каждому из изученных праймеров наблюдается для Cervus elaphus и С. nippon, Capreolus capreolus и С. pygargus, а также для Bison bonasus и Bos taurus; сходство же между более отдаленными видами отряда парнокопытных по RAPD-маркерам варьирует в разной степени в зависимости от выбранного праймера, но во всех случаях спектры амплифицированных фрагментов ДНК кабана в наибольшей степени отличаются от спектров остальных видов копытных. Эти особенности в изменчивости геномов нашли отражение в дендрограмме (рис.7е), построенной на основании суммарной для всех трех праймеров матрицы сходства. Помимо указанных выше закономерностей при кластерном анализе изученные виды копытных животных разделяются

на группы, соответствующие семействам Cervidae, Bovidae и Moschidae, а также отдельно - Suidae. При этом Moschus moschíferus стоит гораздо ближе к Bovidae, нежели к Cervidae. Внутри Cervidae четко обособляются кластеры, соответствующие подсемействам Cervinae (Cervus elaphus, С. nippon. Dama dama) и Odocoileinae [Alces alces, Capriolus capreolus, C. pygargus). Дендрограмма генетического сходства, построенная на основе данных анализа RAPD-полиморфизма геномов представителей отряда Artiodactyla (рис.7е), в наибольшей степени коррелирует с их современной систематикой, основанной на комплексе морфолого-экологических, физиологических, цитогенетических и генетико-биохимических критериев, которая предложена Гровесом и Груббом (Groves, Grubb, 1987). Однако на дендрограмме генетического сходства, построенной на данных таксонопринтного анализа кабарга кластеризуется вместе с представителями семейства оленьих, а представители семейства бычьих кластеризуются вместе с представителями рода Capreolus, что может быть связано со своеобразием таксонопринтных спектров косуль, которые значительно отличаются от таксонопринтов других оленьих. У представителей рода Capreolus наблюдается повышенная геномная вариабельность по RAPD-маркерам и данным фингерпринтных исследований, что подтверждает правомерность разделения рода Capreolus на два близкородственных вида - С. capreolus и С.pygargus. Во всяком случае по RAPD-маркерам различия между сибирской и европейской косулей сопоставимы с различиями между такими "хорошими" видами, как благородный и пятнистый олени.

В заключение следует отметить особенности каждого метода. Таксонопринтный анализ, выявляя повторяющиеся последовательности ДНК, позволяет дифференцировать виды, в геномах которых произошли процессы, сопровождающиеся резкими изменениями количества повторов (амплификация отдельных последовательностей ДНК и хромосомные перестройки), но не дает возможности наблюдать накопление точковых мутаций в их составе. Метод RAPD PCR позволяет проводить случайный скрининг любых типов нуклеотидных последовательностей, выявляя менее крупные изменения в геноме (инсерции, делеции, инверсии и т.д.), в чем он сопоставим с изучением полиморфизма белков и ферментов. Поэтому таксонопринтный анализ не выявляет индивидуальной специфичности организмов, а метод RAPD во многих случаях эффективен для оценки внутривидовой вариабельности ДНК. Исходя из вышеизложенного, становятся более ясными расхождения в топологии дендрограмм генетического сходства, построенных на основе данных каждого из методов, которые скорее всего отражают различия в скорости накопления постепенных изменений в геноме и возникновении крупных его перестроек в процессе эволюционного развития видов.

Одной из главных задач при использовании различных молекулярно-генетических маркеров является установление их диагностических возможностей, то есть способности с их помощью идентифицировать и дифференцировать различные таксономические группы, начиная с отдельной особи, популяции и вида и кончая такими таксонами надвидового ранга как род, семейсто и отряд. Использованные в данном исследовании два типа геномных маркеров: (таксонопринтные и RAPD-маркеры), очевидно, различаются по диагностической ценности при решении таксономических проблем.

Таксонопринтные маркеры позволяют дифференцировать таксоны как видового, так и более высокого ранга: роды, семейства, отряды. Но при этом в ряде случаев с помощью таксонопринта не удается дифференцировать некоторые близкородственные виды по всем использованным рестриктазам (Cervus elaphus и С.nippon, Capreolus capreolus и C.pygargus, Bos taurus и Bos indicus) или только по некоторым (виды подрода SyIvaems при использовании рестриктазы HinfI). При помощи таксонопринта оказалось невозможным также выявить различия между двумя хромосомными формами обыкновенной полевки Microtus arvalis - arvalis и obseurus, хотя различия между ними по другим критериям близки к видовым. RAPD-маркеры дают возможность дифференцировать не только таксоны видового и надвидового ранга, но и диагностировать внутривидовую изменчивость. Именно с их помощью обнаруживаются значительные различия между представителями близкородственных видов (виды подрода Sylvaemus, Cervus elaphus и С.nippon, Capreolus capreolus и C.pygargus) и хромосомных форм Microtus arvalis (формы arvalis и obseurus). причем различия между видами и кариоформами оказались сопоставимы по -величине, в то время как таксонопринтный анализ не смог их дифференцировать.

Полученные в настоящем исследовании результаты наглядно демонстрируют возможности молекулярно-генетических подходов к проблемам идентификации и дифференциации таксономических групп млекопитающих, а также их систематики и филогении.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые методами "таксономического фингерпринта ДНК" и RAPD PCR проведено молекулярное маркирование геномов некоторых грызунов (Rodentia), представленных родами Phodopus, Apodemus,

Microtus, и парнокопытных (Art.yodactila), позволившее идентифицировать и дифференцировать виды и таксоны надвидового ранга.

2. Продемонстрированы диагностические возможности таксонопринтных и RAPD-маркеров для дифференциации видов и таксонов надвидового ранга млекопитающих и уточнения филогенетических отношений в исследованных таксономических группах.

3. Показано, что таксонопринтные маркеры позволяют различать таксоны как видового, так и более высокого ранга (роды, семейства); RAPD-маркеры кроме вышепречисленных возможностей способны выявлять внутривидовую генетическую изменчивость.

4. Обнаружен кодоминантный характер наследования таксонопринтных маркеров и преимущественно менделевский характер наследования RAPD-маркеров при молекулярно-генетическом маркировании геномов межвидовых гибридов представителей рода Phodohus (Р. сатрЪеШ и Р. sungorus).

5. Показано, что дендрограммы генетического сходства, построенные на основании данных RAPD-маркирования, в наибольшей степени коррелируют с систематическим положением изученных таксонов.

6. Показано, что различия по представленным молекулярным маркерам между подродами Apodemus (A.agrarias) и Sytvaemus сопоставимы с межродовыми.

7. По представленным молекулярным маркерам не найдено оснований для выделения подрода Terrícola, в самостоятельный род. Таксонопринтный анализ трибы Arvicolini показал возможную родовую самостоятельность Lastopodomys.

8. Показано, что различия между европейской и сибирской косулями по данным RAPD-маркирования сопоставимы с межвидовыми.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Потапов С.Г., Рысков А.П. Анализ вариабельности повторяющихся элементов генома грызунов на таксономическом уровне // Генетика. 1993. Т. 29. N. 5. С. 859-862.

2. Рысков А.П.. Кудрявцев И. В.. Васильев И. А., Потапов С. Г., Кудрявцев П.И., Сипно Т.П. Молекулярно-генетические подходы к анализу генетического разнообразия у представителей Bison и Bos: геномная дактилоскопия и таксономическое титрование ДНК // В сб. "К вопросу о возможности сохранения зубра в России". Пущино.

1993. С. 74-81.

3. Потапов С.Г., Васильев В.А., Самарина О.П., Рысков А.П. Молекулярно-генетическое маркирование геномов представителей рода Pftodopus //Генетика. 1994. Т.30. W.5. С. 615-621.

4. Потапов С.Г., Кудрявцев И.В., Рысков А.П. Использование таксономического типирования ДНК для анализа геномной вариабельности представителей Bovidae Gray, 1821 // Генетика.

1994. Т. 30. N. 6. С. 858-860.

5. Рысков А.П., Кудрявцев И. В., Васильев И. А.. Потапов С. Г., Кудрявцев П.И., Сипко Т.П. Диагностические возможности молекулярно-генетических подходов к таксономии трибы Bovini // Зоол.журн. 1994. Т. 73. N. И. С. 115-123.

6. Потапов С.Г., Токарская О.Н., Семенова С.К., Данилкин A.A., Марков Г.Г., Рысков А.П. Диагностические возможности мультилокусных маркеров ДНК в систематике диких копытных животных (Artiodactyla) // Генетика. 1997. Т.33. N.7. С. 961-966.

7. Potapov S.G., Kudryavtsev I.V., Ryskov A.P. On the use of taxonomic DNA fingerprinting for study of genome variability in Bovidae representatives // In. XXIV International Conference of

Animal Genetics. Praque. 23-29 Iuly 1994. P. 67. 8. Kan N., Potapov s., Semenova S., Efremova D., Danilkin A., Markov G.. Tokarskaya 0. Use of molekular methods for study of systematics of wild hoofs (Artiodactyla) // Euro-American Mammal Congress. Santiago de Compostela. 19-24 July 1998. P. 355-356.