Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

О пространственной структуре вируса гриппа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федорова, Наталия Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Современные представления о структурной 8 организации вириона вируса гриппа.

1.1 Молекулярные компоненты вириона вируса 8 гриппа

1.2 Структурная организация вириона вируса гриппа.

2. Структура М 1 белка. Его основные 14 функциональные и антигенные характеристики

2.1 Первичная структура белка.

2.2 РНП-М1 взаимодействия.

2.3 Взаимодействие М1 белка с мембраной.

2.4 Взаимодействие М1 белка с поверхностными 22 белками вируса гриппа.

2.5 Антигенный анализ и внутриклеточная 24 локализация М1 белка вируса гриппа.

2.6 Кристаллографический анализ структуры М1 28 белка.

3. Новые методы в изучении пространственной структуры мембранных белков.

3.1 Возможности современных РСА и ЯМР для 35 изучения структурной организации мембранных белков.

3.2 Сканирующая и криоэлектронная микроскопия.

3.3 Методы предсказания а-спиральных структур 40 мембранных белков и их топологии.

3.4 Тритиевая планиграфия биологических 48 макромолекулярных комплексов.

3.4.1 Исследование структуры рибосом

3.4.2 Исследование структуры хромосом.

3.4.3 Топография доступной поверхности и 54 структура вируса табачной мозаики

3.4.4 Топография доступной поверхности вируса X 60 картофеля. Модель пространственной укладки белка оболочки в вирусе.

3.4.5 Тритиевая планиграфия как 66 экспериментальный метод исследования поверхности целых клеток.

Глава II. Экспериментальная часть

1. Объекты исследования.

1.1 Получение препаратов вируса гриппа.

1.2 Выделение гемагглютинина с помощью 71 протеазы бромелаин.

1.3 Получение и очистка малых однослойных 71 везикул

1.4 Получение больших моноламеллярных 72 липосом с включенным нигерицином в липидной мембране.

1.5 Встраивание нигерицина в мембрану 73 больших моноламеллярных липосом.

1.6 Получение малых лецитиновых липосом.

1.7 Характеристика препаратов липосом.

2. Методы исследования.

2.1. Ультрацентрифугирование.

2.2. Электронномикроскопический анализ вируса.

2.3. Анализ размера вирусных частиц и 75 липосом с помощью метода динамического светорассеяния.

2.4 Электрофорез в полиакриламидном геле с 76 ДСН.

2.5 Методы электроэлюции из ПААГ.

2.6 Высокоэффективная жидкостная 78 хромотография в обращенной фазе.

2.7 Ферментативный гидролиз М1 белка.

2.8 Кислотный гидролиз.

2.9 Аминокислотный анализ

2.10 Аминокислотный сиквенс пептидов.

2.11 Электрофорез в полиакриламидном геле с 81 ДСН.

2.12 Определение гемагглютинирующей (ГАЕ), 81 гемолизирующей (ГЛ) активности и инфекционности в препаратах вируса гриппа.

3. Методы выделения матриксного М1 белка.

3.1 Метод кислотной солюбилизации.

3.2 Метод хлороформ-метанольной экстракции.

4. Введение тритиевой метки в исследуемые 84 объекты.

5. Контроль за сохранением нативности меченых 86 препаратов вируса.

5.1 Анализ меченных тритием вирусных белков.

Глава

Анализ включения метки в структурные 88 компоненты липосом.

Ковалентное связывание М1 белка с тиопропилсефарозой - 6В.

Расщепление иммобилизованного М1 белка и 89 разделение пептидов.

Определение удельного мечения пептидов.

Результаты и обсуждение.

Оптимизация методов выделения основных структурных белков вируса гриппа. Модель для изучения молекулярных механизмов мембран-белковых взаимодействий.

Получение меченных тритием вирионов вируса гриппа и анализ включения метки в основные структурные белки. О локализации М1 белка в вирионе вируса гриппа.

Определение внутримолекулярного распределения метки в М1 белке. Моделирование укладки М1 белка в вирусе гриппа

Введение Диссертация по биологии, на тему "О пространственной структуре вируса гриппа"

Оболочечные вирусы представлены большим числом представителей, к ним относятся значительное количество патогенных вирусов животных и человека. Это макромолекулярные многокомпонентные высокоупорядоченные биологические системы, включающие в свой состав бислойную липидную мембрану, поверхностные и внутренние белки и нуклеиновую кислоту. Весьма многообразны и механизмы их жизненного цикла, включающие проникновение в клетку, высвобождение РНП, репродукцию и др., каждый из которых сопряжен с определенными изменениями конформации и структуры как целого вириона, так и отдельных его компонентов.

М1 белок- один из основных структурных белков вируса гриппа. Исключительная функциональная значимость его в поддержании структуры вириона, репликации вируса, вовлечении его в процессы сборки и выпочковывания зрелых вирусных частиц сделали его предметом детального изучения.

К настоящему времени накоплены достаточно обширные данные по функциональному и антигенному картированию белка, его внутриклеточной локализации. Используя криоэлектронную микроскопию высокого разрешения, была изучена тонкая структура вириона, позволившая предложить современную модель мембраны активных (инфекционных) вирусных частиц с локализацией в ней М1 белка. В 1997 г. удалось закристаллизовать фрагмент М1 белка (остатки 2158) и, исходя из данных РСА и данных криоэлектронной микроскопии, предложить гипотетическую модель укладки этого фрагмента в вирионе. Необходимость в дальнейшем изучении пространственной организации как вириона вируса гриппа, так и отдельных его компонентов, в частности М1 белка, вполне очевидна.

Представлялось целесообразным использовать метод тритиевой планиграфии, как прямой экспериментальный подход, позволяющий получать из данных тритиевого мечения объекта информацию о всей его доступной поверхности, а через нее и структурную информацию.

Можно было также думать, что тритиевая планиграфия окажется весьма результативным инструментом исследования строения различных мембран и мембран-белковых систем. Отдельные положительные примеры подобного рода работ были известны, но серьезного исследования такого рода систем с помощью метода тритиевой планиграфии еще не проводилось.

Целью настоящей работы было изучение структурной организации вируса гриппа и прежде всего пространственной укладки М1 белка в составе вируса. Необходимые этапы работы включали оптимизацию метода получения основных структурных белков, проведение контрольных экспериментов по введению метки в модельные липосомы и анализ их сохранности в условиях опытов, разработку модельной системы для изучения мембран-белковых взаимодействий, получение меченных тритием вирусных препаратов в условиях сохранения их интактности и биологических свойств, определение внутримолекулярного распределения метки по полипептидной цепи М1 белка и моделирование его пространственной структуры в составе вириона.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Федорова, Наталия Викторовна

выводы

1. Показана возможность приложения метода тритиевой планиграфии к исследованию строения мембран и мебран-белковых систем. Произведены предварительные оценки коэффициента ослабления потока атомов трития при прохождении ими липидного бислоя.

2. Получены экспериментальные данные о топографии поверхности М1 белка в составе вируса. Анализ внутримолекулярного распределения метки по белку в сочетании с известными из РСА данными о топологии фрагмента М1 белка (остатки 2-158) и теоретическими методами предсказания топологии С- концевого фрагмента белка позволили предложить модель укладки М1 белка в вирусе.

3. Получены предварительные оценки степени погруженности М1 белка в толще мембраны вируса.

4. Предложена экспериментальная модель для изучения мембран- белковых взаимодействий и, в частности, для изучения механизма индуцируемого низким рН взаимодействия вирусных сливающих белков и клеточных мембран. Для визуализации структурных перестроек белков использован метод тритиевой планиграфии.

5. Оптимизированы методы выделения основных структурных белков вируса гриппа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова, Наталия Викторовна, Москва

1. Krug, R.M., The influenza viruses. Plenum Press, New York, N. Y. (1989).

2. Schulze, I.T. The structure of influenza virus. II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology,47,181-196(1972).

3. Meier-Ewert, H., Herrler, G., Nagele, A., and Compans, R.W. In Structure and variations in influenza viruses (Laver and Valentine, Eds.),pp.357-366. Elsevier-North Holland/New York,1980.

4. Laver, W.G., and Valentine, R.C. Morphology of the isolated hemagglutinin and neuraminidase subunits of influenza virus. Virology,38,105-119 (1969).

5. Hewat, E.A., Cusack, S., Ruigrok, R.W.H., and Verwey, C., J.Mol.Biol., 175,185-193 (1984).

6. Inglis, SC., Carrol, A.R., Lamb, R.A., and Mahy, B.W.J. Polypeptides specified by the influenza A genome. Virology,74,489-503 (1976).

7. Yamashita, M., Krystal, M., and Palese, P. Evidence that the matrix protein of influenza С virus is coded for by a spliced mRNA. J.Virol.,62,3348-3355 (1988).

8. Breidis, D.J., Lamb, R.A., and Choppin, P.W. Influenza В virus RNA segment 8 codes for two nonstructural proteins. Virology, 116,581-588( 1982).

9. Surgue, R.J., and Hay, A.J. Structural characteristics of the M2 protein of influenza A viruses: evidence that it forms a tetrameric channels. Virology, 180,617-624 (1991).

10. Dubois-Daleq, M., Holmes, K.V., Rentier, B., Kingsbury, D.W. (ed.).,1984. Assembly of enveloped RNA viruses. Springer-Verlag KG, Vienna, Austria, pp.66-82.

11. Lamb, R.A., and Choppin, P.W. The gene structure and replication of influenza virus. Ann.Rev.Biochem.,52,467-506(1983).

12. Compans, R.W., Jones, L.V., and Melsen, L B. Organization and assembly of influenza virus proteins. Options for the control of influenza, p.23-38, 1986. Alan R. Liss, Inc.

13. Oxford, J.S., and Hockley, D.J.(1987) In Nermut, M.V. and Steven, A.C.(eds),Animal Virus Structure Orthomyxoviridae. Elsevier, Amsterdam, pp. 213-232.

14. Wrigley, N.G., Broun, E.B., and Shekel, J.J. (1986) In Harris, J, and Home, R. (eds.), Electron Microscopy of Proteins -Virus Structure. Academic Press, London, Vol.5, pp. 103-164.

15. Stanley, P., and Halsam, E.A. The polypeptides of influenza virus. V. Localisation of polypeptides in the virion by iodination tech niq ues. Virology,46,764-773(1971).

16. Robertson, B.H., Bennett, C.J., and Compans, R.W. Selective dansylation of M-protein within intact influenza virions. J.Virol., 44,871-876 (1982).

17. Dimmock, N.J., Dolbear, H.S., and Guest, A.R. Chemical crosslinking of proteins of the influenza virion. I. Interrelationships. Arch .Virol., 108,169-182(1989).

18. Markwell, M.A.K., and Fox, C.F. Protein-protein interactions within paramyxoviruses identified by native disulfide bonding or reversible chemical cross-linking.J.Virol.,33,152-166 (1980).

19. Lecomte, J., and Reginster, M. Efficiency of proteolytic enzymes in exposing the M -protein in influenza A virus measured by a radioimmunoassay. Cong.Am.Soc.Microbiol. Dallas, 1981.132

20. Register, M., Joassin, L., and Fontaine-Delcambe, P. Ligands for antibody to M-protein are exposed at the surface of influenza virions. Effect of a proteolytic treatment on their activitiy. J.Gen.Virol.,45,283-289(1979).

21. Gregoriades, A., and Frangione, B. Insertion of influenza M-protein into the viral lipid bilayer and location of site of insertion.J.Virol.,40,323-328 (1981).

22. Murti, K.G., Brown, P.S., Bean, W.J., and Webster, R.G. Composition of the helical internal components of influenza virus as revealed by immunogold labeling and electron microscopy. Virology, 186, 294-299 (1992).

23. Schulze, I.T. Structure of influenza virion. Adv.Virus Res.,18,1-56 (1973).

24. Laver, W.G. The polypeptides of influenza viruses. Adv.Virus Res., 18,57-104 (1973).

25. Stegman, T., and Helenius, A. In: Viral Fusion Mechanisms, ed. Bentz, J. (CRC, Boca Raton, FL), pp.89-111 (1993).

26. Wilson, I.A., Skehel, J.J., and Wiley, D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. Nature,289,366-373 (1981).

27. Bullough, P.A., Hughson, F.M., Skehel, J.J., and Wiley, D.C. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature,371,37-43 (1994).

28. Bullough, P.A., Hughson, F.M., Treharne,.C., Ruigrok, R.W.H., Skehel, J.J., and Wiley, D.C. Crystals of a fragment of influenza haemagglutinin in the low pH induced conformation. J.Mol.Biol.,236,1262-1265 (1994).

29. Varghese, J.N., Laver, W.G. and Colman, P.M. Structure of the influenza virus glycoprotein antigen neuraminidase at 2.9A resolution Nature,303,41-44 (1983).

30. Watowich, S.J., Skehel, J.J. and Wiley, D.C. Crystal structures of influenza virus haemagglutinin in complex with high affinity receptor analogs. Structure,2,719-731 (1994).

31. Bizebard, T., Gigant, B., Rigolet, P., Rasmussen, B., Diat, O., Bosecke, P., Wharton, S.A, Skehel, J.J. and Knossow, M. Structure of influenza virus haemagglutinin complexed with a neutralizing antibody. Nature,376,92-94 (1995).

32. Liu, J., Lynch, P.A., Chen-ya-Chien, Montelione, G.T., Krug, R.M., and Berman, H.M. Nature Structural Biol., 4,896-899 (1997).

33. Sha, B., and Luo, M. Structure of a bifunctional membraneRNA binding protein, influenza virus matrix protein M1. Nature Struct. Biol., 4,239-244 (1997).

34. Booy, F.P., Ruigrok, R.W.H., and Brüggen, E.F.G., J.Mol.Biol., 184,667-676 (1985).

35. Fujiyoshi, Y., Uyeda, N., Yamagishi, H., Morikawa, K., Mizusaki, T., Aoki, Y., Kihara, H., and Harana, Y. Proceeding of the Xlth International Congress on Electron Microscopy,pp. 1829-1832 (1986).

36. Fujiyoshi, Y., Kume, N.P., Sakata, K., and Sato, S.B. Fine structure of influenza A virus observed by electron cryo-microscopy. EMBO J., 13,318-326 (1994).

37. Bucher, D.J., Kharitonenkow, J.A., Zakomiridin, V.B., Grigoriev, V.B., Klimenko, S.M., and Davis, J.F.Incorporation of influenza virus M-protein into liposomes. J.Virol.,36,586-590 (1980).

38. Gregoriades, A. Interaction of influenza M protein with viral lipids and phosphatidylcholine vesicles.J/Virol., 36,470-479 (1980).

39. Peeples, M. Paramyxovirus M protein: pulling it all together and taking it on the road, p.427-479. In D.W. Kingsbury (ed.), The paramyxoviruses. Plenum Press, New York, N.Y.

40. Ye, Z., Pal, R., Fox, J.W., and Wagner, R.R. Functional and antigenic domains of the matrix M1 protein of influenza virus. J.Virol., 61,239-246 (1987).

41. Ye, Z., Baylor, N.W., and Wagner, R.R. Transcription- inhibition and RNA-binding domans of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotipic antibodies and synthetic peptides. J.Virol.,63,3586-3594 (1989).

42. Melnikov, S.Y., Mikheeva, A.V., Leneva, I.A., and Ghendon, Y.Z. Interaction of M protein and RNP of fowl plague virus in vitro. Virus Res., 3.353-365 (1985).

43. Wakefield, L., and Brownlee, G.G. RNA-binding properties of influenza A matrix protein M1. Nucleic Acids Res.,17, 8569-85801989).

44. Zhirnov, O.P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxoviruses.Virology, 176,274-2791990).

45. Zhirnov, O.P. Isolation of matrix M1 from influenza viruses by acid-dependent extraction with nonionic detergent. Virology, 186,324-330(1992).

46. Zhirnov, O.P., and Grigoriev, V.B. Disassemly of influenza C viruses, distinct from that of influenza A and B viruses required neutral-alkaline pH. Virology,200,284-291 (1994).

47. Helenius, A. Unpacking the incoming influenza virus.Cell,69,577-578(1992).

48. Martin, K., and Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell,67,117-130 (1991).

49. Zvonarjev, A.Y., and Ghendon, Y.Z. Influence of membrane (M1) protein in influenza A virus virion on transcriptase activity and its susceptibility to remantidine.J. Virol.,33,583-586 (1980).

50. Watabane, K., Handa, H., Mizumoto, K., and Nagata, K. Mechanism for inhibition of influenza virus RNA polymerase activity by matrix proteins. J. Virol., 70,241-247 (1996).

51. Shapiro, G., Gurney, T.Jr., and Krug, R. Influenza virus gene expression: Control mechanisms at early and late times of infection and nuclear-cytoplasmic transport of virus-specific RNAs. J. Virol., 61,764-773 (1987).

52. Elster, C., Larsen, k., Gagnon, J., Ruigrok, R.W.H., and Baudin, F. Influenza virus M1 protein binds to RNA through its nuclear localizationn signal. J. Gen. Virol., 78,1589-1596 (1997).

53. Winter, G., and Fields, S. Cloning of influenza cDNA into M13: the sequence of the RNA segment encoding the A/PR/8/34 matrix protein. Nucleic Acids Res., 8,1965-1974 (1980).

54. Gregoriades, A., Christie, T., and Markarion, K. The membrane (M1) protein of influenza virus occurs in two forms and is a phosphoprotein. J. Gen. Virol., 49, 229-235 (1984).

55. Gazitt, Y.T Ohad, I., and Loyter,A. Phosphorylation and dephosphorylation of membrane proteins as possible mechanism for structural rearrangement of membrane components. Biophim. Biophys. Acta, 436,1-14 (1976).

56. Clinton, G.M., Burge, B.W., and Huang, A.S. Effects of phosphorylation and pH on the association of NS protein with vesicular stomatitis virus cores. J. Virol., 27,340-346 (1978).

57. Clinton, G.M., and Huang, A.S. Distribution of phosphoserine, -threonine and -tyrosine in proteins of vesicular stomatitis virus. Virology, 108,510-514(1981).

58. Lamb, R.A., and Choppin, P.W. The synthesis of Sendai virus polypeptides in infected cells. III. Phosphrylation of polypeptides. Virology, 81, 382-397 (1977).

59. Bui, M., Whittaker, G., and Helenius, A. Effect of M1 protein and pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. J. Virol., 70, 8391-8401 (1996).

60. Newcomb, W.W., Tobin, G.J., mcGowan, J.J., and Brown, J.C. In vitro reassembly of vesicular stomatitis virus skeletons. J. Virol., 41,1055-1062 (1982).

61. Ye, Z., Robinson, D., and Wagner, R.R. Nucleuc-targeting domain of the matrix protein (M1) of influenza virus. J. Virol., 69,1964-1970 (1995).

62. Hankins, R.W., Nagata, K., Bucher, D.J., Popple, S.S., and Ishihama, A. Monoclonal antibody analysis of influenza virus matrix protein epitopes involved in transcription inhibition. Virus Genes,3, 111-126(1989).

63. Hankins, R.W., Nagata, K., Kato, A., and Ishihama, A. Mechanism of influenza virus transcription inhibition by matrix (M1) protein. Res. Virol., 141,305-314 (1990).

64. Perez, D.R., and Donis, R.O. The matrix M1 protein of influenza A virus inhibits the transcriptase activity of a model influenza reporter genome in vitro. Virol., 249, 52-61 (1998).

65. Lenard, J., and Vanderoef, R. Localization of the membrane-associated region of vesicular stomatitis virus M protein at the N terminus, using the hydrophobic, photoreactive probe 125 l-TID. J. Virol., 64, 3486-3491 (1990).

66. Ye, Z., Sun, W., Suryanarayana, K., Justice, P., Robinson, D., and Wagner, R.R. Membrane-binding domains and cytopathogenesis of the matrix protein of vesicular stomatitis virus. J. Virol., 68,7386-7396 (1994).

67. Yoshida, T., Nagai, Y., Yoshii, S., Maeno, K., Matsumoto, T., and Hoshino, M. Membrane (M) protein of HVJ (Sendai virus): its role in virus assembly. Virology,71, 143-161 (1976).

68. Lyles, D.S., McKenzie, M., and Parce, J.W. Subunits interactions of vesicular stomatitus virus envelope glycoprotein stabilized by binding to viral matrix protein. J.Virol., 66,349-358 (1992).

69. Sanderson, C.M., McQueen, N.L., and Nayak, D.P. Sendai virus assembly: M protein binds to viral glycoproteins in transit through the secretory pathway. J.Virol., 67,651-663 (1993).

70. Enami, M., and Enami, K. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase glycoproteins stimulate the membrane association of the matrix protein. J. Virol., 70, 6653-6657 (1996).

71. Kretzschmar, E., Bui, M., and Rose, J.K. Membrane association of influenza virus matrix protein does not require specific hydrophobic domains or the viral glycoproteins. Virology, 220, 37-45 (1996).

72. Zhang, J., and Lamb, R.A. Characterization of the membrane association of the influenza virus matrix protein in living cells. Virology, 225,255-266 (1996).

73. Mebatsion, T., and Conzelmann, K.K. Specific infection of CD4 target cells by recombinant rabies virus pseudotypes carrying the HIV-1 envelope spike protein. Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 93,11366-11370 (1996).

74. Owens, R.J. and Rose, J.K. Cytoplasmic domain requirement for incorporation of a foreign envelope protein into vesicular stomatitus virus.J. Virol., 67,360-365 (1993).

75. Barge, A., Gaudin, Y., Coulon, P., and Ruigrokk, R.W.H. Visicular stomatitus virus M protein may be inside the ribonucleocapsid coil. J.Virol.,67, 7246-7253 (1993).

76. Jin, H., Leser, G.P., and Lamb, R.A. The influenza virus hemagglutinin cytoplasmic tail is not essential for virus assembly or infectivity. EMBO J., 13, 5504-5515 (1994).

77. Jin, H., Leser, G.P., Zhang, J., and Lamb, R.A. Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape. EMBO J., 16, 1236-1247 (1997).

78. Klein, P., Kanehisa, M., and DcLisi, C. Biochim. Biophys. Acta,815, 468-476 (1985).

79. Macosko, J.C., Kim, Ch-H., and Shin, Y-K. The membrane topology of the fusion peptide region of influenza hemagglutini determined by spin-labeling EPR. J.Mol. Biol.,267,1139-11481997).

80. Bucher, D., Popple, S., Baer, M., Mikhail, A., Gong, Y.-F., Whitaker, C., Paoletti, E., and Judd, A. M protein (M1) of influenza virus: antigenic analysis and intracellular localization with monoclonal antibodies. J. Virol., 63,3622-3633 (1989).

81. Kyta, J., and Doolittle, R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol., 157, 105-132 (1982).

82. Guiffre, R.M., Tovell, D.R., Kay, C.M., and Tyrrell, D.L.J. Evidence for an interaction between the membrane protein of a paramyxovirus and actin. J. Virol.,42, 963-968 (1982).

83. Zappacosta, F., Ingallinella, P., Scaloni,A., Pess, A., Bianchi, E., Sollazzo, M., Tramontano, A., Marino, G., and Pucci, P. Surface topology of minibody by selective chemical modifications and mass spectrometry. Protein Sci., 6, 1901-1906 (1997).

84. Hess,D., and Isenberg, G. A new fluorescence-based, hydrophobic photolabeling technique for analyzing membrane-associated proteins. FEBS Letters, 445, 279-282 (1999).

85. Knorre, D.G., and Godovikova, T.S. Photoaffinity labeling as an approach to study supramolecular nucleoprotein complexes.FEBS Letters, 433, 9-14 (1998).

86. Helenius, A., and Simons, K. Solubilization of membrane proteins by detergents. Biochim. Biophys. Acta, 415, 29-79 (1975).

87. Tanford, C., and Reynolds, J.A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim. Biophys. Acta, 457, 133170 (1976).

88. Fox, J.M., Wang, G., Speir, J.A., Olson, N.H., Johnson, J.E., Baker, T.S., and Yoyng, M.J. Comparison of the native CCMVmvirion with in vitro assembled CCMV virions by cryoelectron microscopy and image reconstruction. Virology, 244, 212-218 (1998).

89. Bottcher, B., Wynne, S.A., and Crowther, R.A. Determination of the fold of the core protein of hepatitus B virus by electron cryomicroscopy. Nature, 386, 88-91 (1997).

90. Conway, J.F., Cheng, N. Zlotnick, A., Wingfield, P.T., Stahl, S.J., and Steven, A.C. Visualization of a 4-helix bundle in the hepatitus B virus capsid by cryo-electron microscopy. Nature, 386, 91-94 (1997).

91. Trus, B.L., Roden, R.B.S., Greenstone, H.L., Vrhel, M., Schiller, J.T., and Booy, F.P. Novel structural features of bovine papillomavirus capsid revealed by a three-dimensional reconstruction to 9 A resolution. Nature Struct. Biol.4, 413-420 (1997).

92. Cheng, R.H., Kuhn, R.J., Olson, N.H., Rossman, M.G., Choi, H.-K. Smith, T.J., and Baker, T.S. Nucleocapsid and glycoprotein organization in an enveloped virus. Cell, 80, 621-630 (1995).

93. Chiu, W., and Smith, T.J. Structural studies of virus- antibody complexes by electron cryomicroscopy and X-ray crystallography. Curr. Opin. Struct. Biol., 4, 219-224 (1994).

94. Walz, T., and Grigorief, N. Electron crystallography of two-dimensional crystals of membrane proteins. J. Struct. Biol.,121, 142-161 (1998).

95. Muller, S.A., and Engel, A. Mass measurement in the scanning transmission electron microscope: A powerful tool for studying membrane proteins. J. StructBiol., 121,219-230 (1998).

96. Bottcher, В., Tsuji, N., Takahashi, H., Dyson, M.R., Zhao, S., Crowther, R.A., and Myrray, K. Peptides that block hepetitis В virus assembly: analysis by cryomicroscopy, mutagenesis and transfection. The EMBO J., 17, 6839-6845 (1998).

97. Жирнов О.П., Охучи М., Авакянц B.C., Овчаренко А.В. и Кленк Х.Д. Взаимодействие матриксного М1 белка вируса гриппа с гистонами. Молекулярная биология,31,137-143 (1997).

98. Zhirnov, О.Р., and Klenk, H.-D. Histones as a target for influenza virus matrix protein M1.

99. Grobner, G., Taylor, A., Williamson, Ph.T.F., Choi, G., Glaubitz, C., Watts, J.A., de Grip, W.J., and Watts, A. Macroscopic orientation of natural and model membranes for structural studies. Anal. Biochem., 254,131-138 (1997).

100. Гедрович A.B., Гольданский В.И., Румянцев Ю.М., Унукович М.С. и Шишков А.В. Получение меченых полипептидов и белков с использованием термически активированных атомов трития. Радиохимия, 26, 485-494 (1984).

101. Шишков А.В. и Баратова Л.А. Тритиевая планиграфия биологических систем. Успехи химии, 63, 825-841 (1994).

102. Гедрович А.В., Юсупов М.М., Шишков А.В., Гольданский В.И. и Спирин А.С. Мечение белков 30 S субчастицы рибосомы Е. coli in situ атомарным тритием.Докл. АН СССР, 267,12551257 (1982).

103. Agafonov, D.E., Kolb, V.A., and Spirin, A.S. Proteins on ribosome surface: measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique. Proc. Natl. Acad. Sci.USA,94,12892-12897( 1997).

104. Yusupov, M.M., and Spirin, A.S. Hot tritium bombardment technique for ribosome surface topography. Methods Enzymol., 164,426-439 (1988).

105. Yusupov, M.M., and Spirin, A.S. Are there proteins between the ribosomal subunits? FEBS Letters, 197,229-233(1986).

106. Спирин A.C., Агафонов Д.Е., Колб B.A., Коммер А. Топография рибосомных белков: пересмотр карты распределения белков на малой рибосомной субчастице. Биохимия,61,1928-1930 (1996).

107. Колб В.А., Коммер А. и Спирин А.С. Рибосомный канал для растущего пептида. Докл. АН СССР, 296,1497-1501 ((1987).

108. Колб В.А. и Спирин А.С. Существует ли канал для синтезируемого на рибосоме пеетида? Успехи биологической химии, 33,312 (1993).

109. Agafonov, D.E., Kolb. V.A., Nasimov, I.V., and Spirin, A.S. A novel protein residing at the susunit interface of the bacterial ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci., USA (in press) 1999.

110. Belayev, N.D., Budker, V.G., Dubrovskaya,V.A., Kim, A.A., Kiseleva, E.V., and Sidorov, V.N. Localization of proteins formingthe outer surface of isolated metaphase chromosomes. FEBS Letters,297,43-45 (1992).

111. Bloomer, A.C., Champness, J.N., Bricogne, G., Staden, R., and Klug, A. Protein disc of tobacco mosaic virus at 2.8Â resolution showing the interactions within and between subunits. Nature,London,276,362-368 (1978).

112. Bhyravbhalta, В., Watowich, S.J., Caspar, L.D. Refined atomic model of the four-layer aggregate of the tobacco mosaic virus coat protein at 2.4 A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 79,3111-3115(1998).

113. Numba, K., and Stubbs, G. Structure of tobacco mosaic virus at 3.6 A resolution: implications for assembly. Science, 213,14011406 (1986).

114. Numba, K., Pattanayek, R., and Stubbs, G. Visualization of protein-nucleic acid interactions in a virus. Refined structure of intact tobacco mosaic virus at 2.9Â resolution by x-ray fiberdiffraction. J. Mol. Biol., 208,307-325 (1989).

115. Altschuh, c., Lesk, A.M., Bloomer, A.S., and Klug, A. J.Mol.Biol., 193,693-707 (1987).

116. Stubbs, G., Warren, S., and Holmes, K. Structure of RNA and RNA binding site in tobacco mosaic virus from 4Â map calculated from X-ray fibre diagrams. Nature, London, 267, 216-221 (1977).

117. Нейман Л.А., Антропова Л.П., Залесская М.А. и Будовский Э.И. Введение тритиевой метки в РНК и белок бактериофага MS2. Биоорганическая химия, 12, 1070-1072 (1986).

118. Koenig, R., and Torrance, L. Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antobodies. J. Gen. Virol., 67, 2145-2151 (1986).

119. Sober, J., Jarvekulg, L., Toots, I.E., Radavsky, Yu.L., Lillems, R., and Saarma, M.J. Antigenic characterization of potato virus X with monoclonal antibodies. J. Gen. Virol., 69,1799-1807 (1988).

120. Torrance, L., Larkins, A.P., Butcher, G.W. Characterization of monoclonal antibodies against potato virus X and comparison of serotypeswith resistance groups. J. Gen. Virol., 67,57-67 (1986).

121. Koenig, R., Tremaine, J.H., Shepard, J.F. In situ dagradation of the protein chain of potato virus at the N- and C- termini. J. Gen. Virol., 38, 329-337(1978).

122. Sawyer, L., Tollin, P., and Wilson, H.R. A comparison between the predicted secondary structure of potato virus X and papaya mosaic virus coat proteins. J. Gen. Virol., 68,1229-1232 (1987).

123. Shukla, D.D., Strike, P.M., Tracy, S.L., Gough, K.H., and Ward, C.W. The N- and C- termini of the coat proteins of potyviruses are surface located and N terminus contains the major virus- specific epitopes. J. Gen. Virol., 69,1497-1508 (1988).

124. Гордеева Л.В., Баратова Л.А., Марголис Л.Б. и Шишков А. В. О возможности изучения топографии мембран клеток методом тритиевой планиграфии. Биофизика, 36, 971-9751989).

125. Островский Д.Н., Еремин В.А., Жукова И.Г., Масягин А.А. и Шишков А. В. Тритирование мембран интактных клеток бактерий. Микробиология, 57, 875-878 (1988).146

126. Castello, P.R., Gonzales Flecha, F.L., Caride, A.J., Fernandes, H.N., Delfino, J.M., and Rossi, J.P.F.C. The membrane topology of the amino- terminal domain of the red cell calcium pump. Protein Sci., 6,1708-1717 (1997).

127. Pebay-Peyroula, E., Rummel, G., Rosenbusch, J.P., and Landau, e.m. {-ray structure of bacteriorodopsin at 2.5 a from microcrystals grown in lipidic cubic phases. Science, 277, 16761681.

128. Sabra, M.C., Uitdehaag, J.C.M., and Watts A. General model for lipid- mediated two-dimensional array formation of membrane proteins: application to bacteriorodopsin. Biophys. J., 75, 11801188 (1998).

129. Booth, P.J. Folding a-helical membrane proteins: kinetic studies on bacteriorhodopsin. Folding & Disignn, 2, R85-R92 (1998).

130. Deisenhofer, J., Epp, 0., Mii, K., Huber, R., Michel, H., Structure of the protein subunits in the photosynthetic reactioncentre of Rhodopseudomonos viridis at 3A resolution. Nature, 318, 618-624 (1985).

131. Weiss, M.S., and Schulz, G.E. Structure of porin refined at 1.8 a resolution. J. Mol. Biol., 227, 493-509 (1992).

132. Gouaux., E. It is not just a phase: crystallization and X-ray structure determination of bacteriorhodopsin in lipidic cubic phases. Structure, 15, 5-10 (1998).

133. Eisenberg, D., Schwartz, E., Komaromy, M., and Wall, R. Analysis of membrane and surface proteins sequences with the hydrophobic moment plot. J. Mol. Biol. 179, 125-142 (1984).

134. Tngelman, D.M., Steitz, T.A., and Goldman, A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins. Annu.Rev. Biophys. Chem., 15, 321-353 (1986).

135. Cornette, J.I., Cease, K.B., Margalit, H., Spouge, L., Berzofsky, J.A., and Delisi, C. Hydrophobicity scale and computiational techniques for detecting amphipatic structure in proteins. J. Mol. Biol., 195, 659-685 (1987).

136. Esposti, M.D., Crimi, M., and Venturoli, G. A critical evaluation of the hydropathy profile of membrane proteins. Eur. J. Biophem., 190,207-219(1990).

137. Ponnuswamy, P.K., and Gromida, M.M. Prediction of transmembrane helices from hydrophobic characteristics of protein. Int. Peptide Protein Res., 42, 326-341 (1993).

138. Gromiha, M.M., and Ponnuswamy, P.K. Prediction of protein secondary structures from their hydrophobic characteristics. Int. Peptide Protein Res., 45, 225-240 (1995).

139. Von Heijne, G. Membrane protein structure prediction. J. Mol. Biol., 225, 487-494 (1992).

140. Sipos, L., and von Heijne, G. Predicting the topology of eukaryotic membrane proteins. Eur. J. Biochem., 213, 1333-13401993).

141. Jones, D.T., Taylor, W.R., and Thorton, J.M. A model recognition approach to the prediction of all-helical membrane protein srtucture and topology. Biochemistry, 33, 3038-30491994).

142. Person, B., and Argos, P. Prediction of transmemrane segments in proteins utilising multiple sequence alignments. J. Mol. Biol., 237, 182-192 (1994).

143. Person, B., and Argos, P. Topology prediction of membrane proteins. Protein Sci., 5, 363-371 (1996).

144. Lohmann, R., Schneider, G., Behrens, D., and Wrede, P. A neural network model for the prediction of membrane-spanning amino acid sequences. Protein Sci., 3,1597-1601 (1994).

145. Rost, B., Casadio, R., Fariselli, P., and Sander, C. Transmembrane helices predicted at 95% accuracy. Protein Sci., 4, 521-533 (1995).

146. Rost, B., Fariselli, P., Casadio, R. Topology prediction for transmembrane proteins at 86% accuracy. Protein Sci., 5, 1704-1718(1996).

147. Casadio, R., Fariselli, P., Taroni, C., and Compiani, M. A predictor of transmembrane alpha-helix domains of proteins based on neural networks. Eur. Biophys. J., 24, 165-178 (1996).

148. Manoil, C., and Beckwith, J. A genetic approach to analyzing membrane protein topology. Science, 223,1403-1408 (1986).

149. Park, K., Perczel, A., and Fasman, G.D. Differentiation between transmembrane helices and peripheral helices by thedeconvolution of circular dichroism spectra of membrane proteins. Protein Sci., 1, 1032-1049 (1992).

150. Hennessey, E.S., and Broome-Smith, J.K. Gene-fusion technique for determining membrane-protein topology. Curr. Opin. Struct. Biol., 3,524-531 (1993).

151. Wallin, E., and von Heijne. G. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean and eukaryotic organisms. Protein Sci., 7,1029-1038 (1998).

152. Pirsson, B., and Argos, P. Prediction of membrane protein topology utilising multiple sequence alignments. J.Protein Chem., 16, 453-457 (1997).

153. Cserzo, M., Bernassay, J., Simon, I., and Maigret, B. New alignment strategy for transmembrane proteins. J. Mol. Biol., 243, 388-396 (1994).

154. Cserzo, M., mallin, E., Simon, I., von Heijne. G., and Elofsson, A. Prediction of transmembrane a-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Prot. Engineering, 10, 673-676 (1997).

155. Nakashima, H., and Nishikawa, K. Discrimination of intercellular and extracellular proteins using amino acid composition and residue-pair frequencies. J. Mol. Biol., 238, 54-61 (1994).

156. Chou, K.C. A novel approach to predicting protein structural classes in a (20-1 ))-d amino acid composition space. Proteins: Struct. Funct. Genet., 21, 310-344 (1995).

157. Koshi, J.M., and Bruno, W.J. Major structural determinations of transmembrane proteins identified by principal component analysis. Proteins: Struct. Funct. Genet., 34, 333-340 (1999).

158. Tusnady, G.E., and Simon, I. Principles governing amino acid composition of integral membrane proteins: application to topology prediction. J. Mol. Biol., 283, 489-506 (1998).

159. Bowie, J.U. Helix packing in membrane proteins. J. Mol. Biol., 272,780-789(1997).

160. You, W.-M., Wimley, W.C., Gawrisch, K., and White, S.H. The preference of tryptophan for membrane interfaces. Biochem., 37, 14713-14718 (1998).

161. Nilsson, I., and von Heijne, G. Breaking the camel's back: proline-induced turns in a model transmembrane helix. J. Mol. Biol., 284, 1185-1189 (1998).

162. Nilsson. I., Saaf, A., Whiley, P., Gafvelin, G., Waller, C., and Heijne, G. Proline-induced disruption of a transmembrane a-helix in its natural environment. J. Mol. Biol., 284< 1165-1175 (1998).

163. Monne, M., Nilsson, I., Johansson, M., Elmhed, N., and Heijne, G. Positively and negatively charged residues have different effects on the position in the membrane of a model transmembrane helix. J. Mol. Biol., 284, 1177-1183 (1998).

164. Kim, K.S., Neu, J., and Oster, G. Curvature-mediated interactions between membrane proteins. Biophys. J., 75, 22742291 (1998).

165. Dan, N., and Safran, S.A. Effact of lipid characteristics on the structure of transmembrane proteins. Biophys. J., 75, 1410-1414 (1998).

166. Russ, W. P, and Engelman, D.M. TOXCAT: A measure of transmembrane helix association in a biological membrane.

167. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding. Anal Biochem.1976. V.72.P.248

168. Brandt C.M., Skehel J.J. Cristalline antigen from the influenza virus envelope.Nature New Biol.1972.V.238.P.145-147.

169. Арбатский Н.П.,Лихошерстов Л.M.Медведев С.А.,Сенчен-кова С.Н., и др. Докл. АН СССР.1983.Т.271.№5.С.1257-1260.

170. Szoka F.C., lr. and D.Papahadjopoulos. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad. Sci.USA.1978.V.75.N.9.P.4194-4198.

171. Margolis L.B., Rosovskaya I.A. and Skulachev V.P. Acidification of the interior of Ehrlich ascites tumor cells by nigericin inhibits DNA synthesis. FEBS Lett. 1987. V.220.N.2.P.288-290.

172. Huang C. Studies on phosphatidylcholine vesicles. Formation and physical characteristics. Biochemistry. 1969.V.8.P.344-359.

173. Kendall D.A.,MacDonald R.C. A fluorescence assay to monitor vesicle fusion and lysis. -J. Biol. Chem.-1982.-V.257.-N.23.-P. 13892-13895.

174. Brenner В., Hornee R.W. A negative staining method for high resolution of electron microscopy of viruses. Biochim. Biophys. Acta.1959.V.34.P.103-110.

175. Berne B.J.,Pecora R. Dynamic light scattering. NY.:lnterscience, 1976. C.164-206.152.

176. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970.1. V.227.P.680-685.

177. Porro M.,Viti S.,Antoni g. et al. Ultrasensitive silver-stain method for the detection of proteins in Polyacrylamide gels and immunoprecipitates on agarose gels. Anal. Biochem.1982. V.127. P.316-321.

178. Stralfors P., Belfrage P. Electrophoretic elution of proteins from Polyacrylamide gel slices. Anal.Biochem. 1983. V.128. N.1. P.7-10.

179. Hunkapiller M.W., Lujan E., Ostrander F., Hood L.E. In "Methods in Enzymology",L.: Acad.Press.-1983.-V.91.-P.227-236.

180. Egorov T.A., Svenson A., Ryden L. and Carlson J. A rapid and specific method for isolation of thiol-containing peptides from large proteins by thiol- disulfide exchange on a solid support. Proc.Nat.Acad.Sci. USA.1975. Vol.72.P.3029-3033.

181. Tsugita A., Schettler J.-J. A rapid method for acid hydrolysis of protein with a mixture of trifluoroacetic acid and hydrochloric acid. Eur. J. Biochem. 124 (1982) 585-588.

182. Laver W.G. Purification of influenza virus. In: "Fundamental Techniques in Virology", Ed. by K.Habel, N.P.SalzmanAcad. press., NewYourk. 1969. P. 82-86

183. Sato S.B., Kawasaki K. and Ohnishi S.I. Hemolytic activity of influenza virus hemagglutinin glycoproteins activated in mildly acidic environments. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1983.V.80. N.11.P.3153-3257.

184. Gregoriades A. The Membrane Protein of Influenza Virus: Extraction from Virus and Infected Cell with Acidic ChloroformMethanol. Virology. 1973.V.54.P.369-383.153

185. Ксенофонтов А.Л., Жирнов О.П., Данилов Л.В., Баратова Л.А. Изучение поверхностной локализации аминокислот в гемагглютинине вируса гриппа при функциональной трансформации вирионов кислым рН. Молекул. Биология. 1995.Т.29. С.635-643.

186. Shimizu Y.K., Shimizu К., Ishida N., Homma M. On the study of Sendai virus hemolysis. II.Morphological study of envelop fusion and hemolysis. Virology. 1976.V. 71.P.48-60.

187. Bonner W.M., Laskey R.A. A film detection method for tritiumlabelled proteins and nucleic acids in polyacrylamide gels. Europ.J.Biochem.1974.V.46.P.83-88

188. Egorov Ts.A. In "Methods in protein sequence analysis."Eds. H.Jornvall, J.-O. Hoog. A.-M. Gustavsson, Basel: Birkhauser Verlag. 1991.P. 177-185. J.Protein Chem.1990. V.9.P.281

189. Lim V.I. Algorithms for prediction of alpha-helical and (3-structural reqions in globular proteins. J.Mol. Biol. 1974. Vol.88.P.872-894.

190. Ptitsyn O.B., Finkelstein A.V. Theory of protein secondary structure and algorithm ofits prediction. Biopolymers.1983. Vol.22. P.15-25.