Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимная регуляция систем электрогенного натриевого насоса и хеморецепторов нейрональной мембраны

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимная регуляция систем электрогенного натриевого насоса и хеморецепторов нейрональной мембраны"

АКАДЕМИЯ НАУК УССР

ОРДЕНА ТШСВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ЙНСТШУТ ФИЗИОЛОГИИ им.А.А.БОГОМОЛЬЦА

На правах рукописи

АРВАНОВ Виктор Леонович

УДК 577.352.5

ВЗАИМНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СИСТЕМ ЭЛЕКТРОГЕННОГО НАТРИЕВОГО НАСОСА И ХЕМОРЕЦЕПТОР® НЕЙРОНАЛШОЙ МЕМБРАНЫ

(03.00.02 - Биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

кЛ.л/ОЖу

(¿)ГН

Киев - 1990

Работа выполнена в Институте экспериментальной биологии АН Арм.ССР.

Официальные оппоненты: член-корреспг;;дент АН СССР,

доктор биологических наук, КШШТАЛЬ O.A.

доктор физ.-мат. наук, зав. кафедрой биофизики физического факультета МГУ,проф. ТВЕРДИСЛОВ В.А.

доктор биологических наук, профессор КОЫЕТИАНИ З.П.

Ведущая организация - Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова АН СССР.

•Защита состоится " "_I9S0 г. в час. на

заседании специализированного совета Д 016.15.01 при Институте физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР по адресу: 252024, Киев-24, ул.Богомольца 4.

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. А.А.Богомольца АН УССР.

Автореферат разослан " "_1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

СОРОКИНА-МАРИНА З.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема метаболической регуляции функционирования хемовозбудимых структур нейрональной мембраны и мембраносвязанных ферментов является одной из центральных задач современной биофизики клетки. Существующие литературные сведения указывают на возможность модуляции функционирования электро- и хемовозбудимых структур нейрональной мембраны, опосредованной внутриклеточными цАМФ и ионами Са (Костюк, Крышталь, 1979; Чемариз, Ввприицев, 1988). Однако наши знания о триггер-ннх механизмах, лежащих з основе взашлодействия различных типов мембранных-хеморецвпторов и мембраносвязанных ферментов в ин-тактных клетках весьма ограничены. Ключевые позиции в системе мембраносвязанных ферментов занимает электрогенный натриевый (Ка) насос. Особое значение Ыа-насоса определяется тем, что от его работы зависят такие важные проявления жизнедеятельности клеток как водно-солевая регуляция, транспорт метаболитов, электрическая активность, клеточный объем САйрапетян, 1983). Очевидно, что понимание чрезвычайно важных для жизнедеятельности клетки вопросов метаболического контроля функции мембранных хеморе-цепторов и регуляции самих метаболических процессов в клетке находится в прямой зависимости от выяснения роли Ыа-насоса в этих процессах.

Выяснение механизмов, лежащих в основе взаимного действия систем На-насоса и хеморецепторов нейрональной мембраны позволит разработать новые способы эффективной регуляции хемочувстви-тельности яейрояальных мембран и ряда метаболических процессов, протекающих в клетках.

Наличие существенного сходства между явлениями переноса веществ через клеточную мембрану в различных клеточных системах позволяет данные, полученные на таких простых системах как нейроны улитки, с большой вероятностью перенести и на другие, более сложные системы, менее доступные для- изучения.

Цель и задача исследования. Цель работы состояла в разностороннем изучении взаимосвязи между системой элеотрогеиного Ыа-насоса и системой мембранных хеморецепторов в интактных нервных, клетках.

. Для достижения поставленной цели необходимо было решить

"' -- " /следующие'основные.задачи:. '

• , I, Исследовать действие актават. ов и ингибиторов Йа-н *- ' ■ • . с'оса на ."чувствительность нейрональн- мембраны к. нейромедиат ' - ; рам: на-ионные токи через хемозозег, ,,зщую' нейрональную мембра ; • * \ на.тома/Через,актвируемые нейромедааторами одиночные ионные

_ ..■ . кайалы мембраны'и'на .количество' меченых молекул агонист.ов и

- ., , .тагодистов, связавшихся.'с соответствующими. рецепторами - мемб]: ",'' /.-'■. . ' -2. Исследовать дейстше нейромедааторов на лротивоградк

. тный- транспорт -меченых ионов натрия через клеточную мембран

./ , •"• 3.' Выявить какие метаболические системы обебпечивают; вг

- ■ / '/ 1 модействие систем электрогенного Ка-насооа и хеморецепторо! / ' /. нёйрональной'-меглбраны. '.'.'.'.'■'

•,.- /, V '■ ' ''4., Выявить-возможные пути'модификации реагуляторного де} '. '-' \ ; . ■ - вия Ыа-насоса на- хемочувствительность нейронами ой шмбраш -'<-' % -'■ Научная'новизна работы. В настоящей -работе выявлены коз

- "пути метаболической регуляции/функции. хеморецепторов нейрош . /.- • -ной мембраны. .Установлена функциональная корреляция между ai

■ ■ '. ностью На-насоса и'хемочувствительиостью нейрональНой мемб] \ :.. / : . .Впервые; показано,, что воздействуя'на активность' Жа-на< \ ; можно -регулировать величину активируемых ацетилхолином, (АХ) ных токов в мембране перфузйровакнкх нейронов: инактивация ] - -' ,. Л"' ■ -' насоса вызывает подавление CI-зависимых АХ-охветов смешанно: </--/.". - : /лускариново-шгкотинового.типа.и не действует или вызывает .у: V. 4 ~ ■ . личение НаД-зависимьсс ответов никотинового типа. Обнаружь - регуляторное действие.Ыа-насоса на чувствительность нейрон. '. ■ ной мембраны и к.другим медиаторам - ГАМК,. АТФ и сербтонину

' Показано, что 'вызванное инактивацией Ыа-насоса. угнет®

: - . ■ .СТ-зависимых Al-ответов нейрональной мембраны обусловлено у " - '.ньшением вероятности активации активируемых АХ бдиночных CI

.'.'■"' i' . каналов мембраны, щи этом, среднее время открытого с'остояни -' ' - ^ элементарная,проводимость этих каналов не изменяются. ■

. / ' • ■'.;■ -Установлено, что изменение активности Ка-насоса оопро /,.;, /■■, ' дается модуляцией системы внутриклеточных вторичных посреди ' -• инактивация Н а-насоса вызывает увеличение внутриклеточной ■ центрации цАМФ, усиление входа ионов Са в клетки и стимуляп

. '.V ; '..' / ■ '; -• • '.- '-Получены эксперментальные доказательства.того,. что.!

щия функции мембранных хеморецепторов Ыа-^асосом"- осуществляв' гея как посредством изменения количества' функционально актив- ! ах хеморецепторов-в мембране в результате вызванных' Па- на- -. зеом изменений .объёма нейрона (Арванов,'1980),:так,и-путей" • ^ зменения вероятности активации хеш рецепторов н ейромедиат ораг ;' I в результате модуляторного -дейстнгя Ка-насоса'на систем1 • Ш-зажсимого фосфорилирования. '•''•'.'-' • ' - '.-'','" -Показано, что АХ оказывает двухфазнре'Дбйстшё на'-актив-, --зсть Ыа-нас'оса в интактных препаратах: стимулирует лро'тивй-.. эадиентный выход'а из клеток-при. низких 410' . '-'ХСП^И)-" '' ингибирует'-его при- более высоких койцентрагдаях..- -' - - ' • :

■Впервые установлено, что величину активируемых' АХ'-мембран-гх токов и их зависимость, от; активности;Ыачтсоса-можно щди-.; тировать'путём увеличения текучёсти липидного компонента,. , • : зйрональной мембраны 'децнленовой- жирной, кислотой,.'а 'тайке под зйствием ионизирующей радиавди-.. . .'.•'- ■.'.'," , - ■.'■'■ ••".■'

•' Выявлено, -что вызванную рентгеновским излучением,модафика-' ш АХ-ответов нейронов улитки можно частично-корректировать", знканавалином- А, который вызывает увеличение".внутриклеточной •,-знцентрадаи цПЛФ'.и стимулируёт цйЙ-яейависимое .фосфорйлиро-щие мембран. . .",'■" '-'. ' ' . . •

Теотетйчеокое-и твкигтеокое зна'теняе''работа. Обнаруженная, щкциональная- взаимосвязь можду .активностью' электрогенного Каг юоса и" системой,'мембранных хеморецепторов может .быть-исполь- -' звана.при'теоретическом обобщении данных б метаболической'рефляции хеморецептивных й ферментативных-функций нейрональвых • " Змбрал. ' / • 1 -- -

- Результаты 'настоящего исследования- могут найти • щшмадноё -'зимен ение,- поскольку отбывают возможность целенаправленного жска метаболических -путей 'контроля, й. 'регуляции- действия ней- \ ^фармакологических црейаратов й кардиоактйвных--средств-в.кли-гческих -условиях.. . - ■ . : - V ,".>,'

"Материалы"диссертационной работы могут 'быть использованы * хя целенаправленного поиска и"синтеза новых' биологически ак- '• шшх "веществ, оказывающее-модулягорное"действие на систему-геточного метаболизма и функцию мембранных хеморецепторов.

Поскольку при действии многих анестетиков имеет место изменение текучести клеточных мембран, результаты диссертационной работы о зависимости функции хслинорецепт-ров нейрональной мембраны от её текучести могут быть исподы- ваны з анестезиологии, в частности при разработке тактики кетаминового наркоза.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международном симпозиуме "Нейробиология беспозвоночных" (Тихани, ВНР, 1976), I и II Всесоюзных симпозиумах "Мембранная энзимология и проницаемость мембран" (Ереван, 1977, 1986), Всесоюзном симпозиуме "Транспортные АТРазы" (Тбилиси, 1978), ГВсесоюзном биофизическом съезде (Мооква, 1982), Всесоюзном симпозиуме "Перспективы биоорганической химии в созда- ■ нии новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982), IX Всесоюзкой конференции по биохимии нервной системы (Ереван, 1983), Международной конференции-"Физико-химические аспекты функции мембран (Балотон-фьюред, ВНР, 1983), У Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов, периферический синапс" (Казань, 1984), 1У Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиаторных процессов" {Москва, 1985), X и XII Всесоюзных совещаниях "Транспортные ДТФазы" (Алма-Ата, 1983; Иркутск, 1987), биофизическом съезде Югославии (Белград, 1986), I и II Всесоюзных конференциях по нейронаукам (Киев, 1986,1988), II конференции Армянской ССР по физико-химической биологии (Ереван, 1986), III Всесоюзном совещания "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах" {Пу-щино, 1987) , II Всемирном конгрессе по нейробиологии (Будапепгг, ВНР, 1987), Международном симпозиуме "Трансмиттеры, модуляторы, рецепторы" (Тихани, ВНР, 1987), III СССР-ЙРГ симпозиуме "Возбу-димне мэмбраны" (Киев. 1987), рабочем совещании по программе "Внутриклеточная сигнализация" (Москва, 1987), Всесоюзном совещании по проблемам молекулярной фармакологии и синаптологии (Ка зань, 1988), Международной конференции "Клеточная патология и фармакология" (Будапешт, ВНР, IS88), Международном симпозиуме "Лектшш" (Ярага, ЧССР, 1988), Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы" (Кара-Даг, 1989), Международном симпозиуме "Трап спорт ионов и механизмы его рогуляцнв" (Тбилиси, 1989), научных конференциях Института экспериментальной биологии Ail Арм.ССР.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 335 стра

ницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, состоящей из 5 глав, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 82 наименования на русском и 279 на иностранных языках. Работа.иллюстрирована 97 рисунками и 21 таблицей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

. Исследования проводились на нейронах окологлоточного ганглия виноградной улитки. Helix pomatia. .В зависимости от задачи приготавливали два типа препаратов: препарат изолированного ' нервного кольца и полностью изолированные идентифицированные (Сахаров, 1974) ЛПаЗ, ЛПа5, ППа1, ППаЗ, ППа II и ППа 15 и 'неидентифицированные нейроны. В первом случае для облегчения доступа медиаторов к нервным клеткам коротко обрезались нервы и надрезывалась соединительнотканная оболочка ганглия. Для изоляции клеток был использован метод протеолитической обработки ганглия (Костенко, 1972). Контрольные опыты проводились на нейронах, выделенных без ферментативной обработки.

Действие ингибиторов и активаторов электрогенного Ка-ка-соса на чувствительность нейрональной мембраны к нейромедиато-рам оценивали посредством электрофизиологических методов, включая методы внутриклеточной перфузии нейронов, внутриклеточного отведения биопотенциалов и точечной фиксации мембранного потенциала, а также изотопными методами определения вызванного не:'.-ромедиаторами диффузионного потока меченых ионов через клеточную мембрану и определения количества связавшихся с мембраной меченых молекул агонистсв и антагонистов. Наряду с этими в работе использовались изотопные методы определения скорости активного выхода ионоз На из клеток и входа ионов Са в клетки ' определения уровня фосфорилирования мембранной фракции и Met бран интактных клеток. Внутриклеточное содержание цА1.® и цГ-fS определялось радиоиммунным методом.

Внутриклеточная перфузия нейронов производилась в кг. чгу-рации с одной перфузионной порой (Крытталь, Пидопличпо, .jVG) двумя способами: на полиэтиленовой пленке и на пластиков ..к миг -

ротрубках. В первом случае изолированный нейрон помещался в конусообразную воронку, проделанную в перегородке, разделяющей наружний и внутренний отсеки экспериментальной камеры. Камера была модифицирована таким образом, что имелась возможность переносить- её, в частности к месту рентгеновского облучения на установке РУМ-17, не нарушая при этом непрерывную перфузию нейрона. Кроме того была предусмотрена возможность добавления меченых лигандов в один из отсеков камеры и сбора радиоактивности, прошедшей через нейрональную мембрану, в другом отсеке. В случае перфузии нейронов на пластиковых шкротрубках для быстрой аппликация к е йр оме диа т о ров использовался метод "фиксации концентрации" (Кискин к др., 1986). Капилляр с исследуемым нейроном помещали в Г-образную трубку, заполненную внеклеточным раствором с соответствующими добавками. Быстрая (10-15 мс) аппликация этого раствора осуществлялась с помощью перистальтического насоса, подключенного к концу трубки. В обоих случаях пору формировали размером примерно 10 мкм, что способствовало установлению диффузионного равновесия для низкомолекулярных компонентов между внутренней средой клетки и внутриклеточным перфузатом в течение нескольких минут. Ионный состав нормальных растворов соответствовал (в id»!): HaCI-85, CaCl2-4, bigC^^l, KCI-4, трис НИ-5 (pH=7.5) - для внеклеточного и KCI-120, HaCI-5, трис НИ-5 (рН=7.5) - для внутриклеточного соответственно. Внутриклеточную концентрацию 0а + задавали с помощью Са-ЗГГА буфера.. Вызванные нейромедиаторами трансмембранные токи регистрировали методом фиксации потенциала на базе операционных усилителей АД-225 (США).

Регистрацию активируемых АХ токов, протекающих через одиночные ионные каналы, осуществляли методом точечной фиксации мембранного потенциала ( Hamili et al. , 1981). В работе использовали два варианта отведения токов: конфигурации " cell-attached " (С.А.) и " outaide-out " (0.0.). В первом случае АХ (0,1-0,5 мкм) добавляли в раствор в микропипетке, а во втором -алшшцировали на мембранный фрагмент методом быстрой перфузии (Брежестовский и др., 1985). Трансмембракные ионные токи регистрировали с помощью усилителя ЕРС-5 (ФРГ) и записывали, на магнитограф с полосой пропускания 1.25 кГц. Данные анализировали с помощью ЭВМ Lobtam (Австралия). Пакет программ для обра-

ботки данных описан в работе (Заворонкова и др., 1987).

Для исследования процесса связывания меченых молекул %-АХ, 3Н-ГА.л1{, 3Н-АТФ, 3Н-«б-бунгаротоксина (%-£!) и ^-оуабаина, нервные ганглии улитки инкубировали в течение 30 мин. в среде, содержащей 2.5 мкКи меченых (фирма АтегзЬат ) плюс соответствующие концентрации "холодных" лигандов. Чтобы исключить вызванные Ыа-насосом изменения объема нейрона, использовались инкубационные растворы пониженной тоничности. Затем после трехкратного промывания в наружном растворе, содержащем I мМ "холодного" лиганда, ганглии растворяли б двухнормальном КОН и добавляли сцинциллятор Брея. Количество связавшихся молекул лиганда определяли на сцинциляционном спектрометре СД-4221 ('Чп-ЪехЧесх^ие ", Франция). Неспецафическое связывание определяли по параллельным пробам, содержащим I мМ "холодного" лиганда по программе, предусматривающей расчет абсолютной радиоактивности в пробах по методу внешней стандартизации (Ьеу1паоп et о1. , 1979).

Действие нейромедиаторов на скорость диффузионного выхода ионов из клеток, в которых ионы К предварительно замещались ионами 8®Вв, определяли методом (Наиег, Наш£1п , 1984). Ответы на действие медиатора определяли соотношением константы скорости выхода изотопа в растворе, содержащем медиатор, к константе скорости выхода изотопа в нормальном наруяснем растворе. Количество вышедшего из клеток подсчитывали на сцинциляционном спектрометре.

Для определения скорости активного (противоградиентного) выхода меченых ионов Ыа из клеток последние нагружались . Свободная метка из межклеточного пространства удалялась промыванием ганглий з холодном бескалиевом растворе- Константа ско-22

рости выхода Ыа определялась с помощью ^ -счетчика как доля вышедшего в наружний раствор по отношению к количеству

изотопа, содержащегося в клетках в данный момент времени.

Захват клетками ионов Са определяли с помощью изотопа ^Са. Ганглии инкубировали в течение различных промежутков времени в содержащем ^Са растворе. Затем ганглии промывались в наружном растворе при 4°С, растворялись и радиоактивную метку образцов определяли с помощью сцинциляциояного спектрометра.

Для определения, внутриклеточной концентрации цАШ и цГШ ганглии инкубировали в соответствующих тестовых растворах и затем гомогенизировали в 50 мМ трис-HCl, содержащем ЭДТА. Белки осаждали абсолютным спиртом с последующим центрифугированием и высушиванием под вакуумом. Концентрацию цАШ и цГШ определяли радиоиммунным методом ( Steiner et al., 1972), используя стандартный набор реактивов Amershaa.

Лая определения степени фосфорилирования мембранной фракции, её выделяли из нейронов по методу (Sugaya et al. , 1981). Определяемая колориметрическим методом АТФазная активность во фракциях из разных выделений составляла от 6 до 10.9 мкМ Рд/мг белка/ч. Фосфорилирование мембранной фракции определяли по методу (Кочетков и др., 1984). Инкубационная смесь содержала 50мМ трис-KCl pH 7.5, 20 мМ М&С12, 10 нМ J- 32Р-АТФ ( в I мкл 2029340 с.р.м.), 50 мкг белка. Через 5 мин. инкубации при 28°С реакцию останавливали 25 мМ ЭДТА, смесь наносили под вакуумом на мембранные фильтры "Сынпор" & 7, которые затем промывали три-хлоруксусной кислотой, спиртом и высушивали под ультрафиолетом. Радиометрирование производили в толуоловом сцинциляторе.

Для определения степени фосфорилирования мембран интактных нейронов, ганглии инкубировали в наружном растворе с 100 пкМ К^ТО^ в течение 2 ч. Далее ганглии инкубировали в растворах, не содержащих изотоп, с определенными добавками или без них. Реакцию останавливали 25 мМ ЭДТА при 5°С. Затем выделялась мембранная фракция по описанному выше методу и производилось радиометрирование образцов.

.■ Каждая точка во всех изотопных экспериментах соответствует среднему значению 5-10 одновременных экспериментов.

В целом, в работе вычисление статистических характеристик измеряемых параметров производилось на ЭВМ EC-I045 на алгоритмическом языке Ф0РТРАН-4 (Доспехов, 1979). Доверительный интервал для среднего значения X определяли как х ± t»s- , где s -стандартное.отклонение, а значение t бралось из таблицы теоретических значений критерия Стьвдента на 5% уровне значимости.

- РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОШГДДШШБ • -

I. Зависимость хемочувствительнослч;: нейрональной мембраны от активности"электрогенного Ыа-насоса

Исследуя зависимость хемочувствительности.мембраны целост-х нейронов от активности.Ыа-насоса, нами ранее было показано, о инактивация На-насоса вызывает увеличение количества функ-онально активных АХ-рецепторов ..-в мембране'в результате набухая нейронов. Однако, сравнивая виды кривых.доза-эффект для АХ-ветов в условиях ингибированного Ыа-насоса и гипотонических створов, было отглечено.,. что под действ "нем ингибиторов Ыа-на-за изменяется не только: количество функционально активных АХ-цепторов в нейрональной мембране",- но и кинетика их взаимодей-зия с,АХ (Арванов, 19Я0). Вопрос о.ток, какие клеточные про-зсы помимо вызванных Ыа-насосом изменений"объема нейронов мог лежать в основе взаимосвязи между'активностью Ыа-насоса и нсцией мембранных хеморецепторов не, был выяснен.

Удобной моделью для' изучения.зависимости АХ-ответов нейронной мембраны от активности.Ыа-насоса в условиях исключающих иенение объема нейрона является внутриклеточно перфузированны;.. грон. Установлено, что.в условиях внутриклеточной перфузии 'фонов инактивация ."Ыа-насоса оуабаином и/или бескалиевым на , ;ним раствором вызывает уменьшение АХ-ответов, условно обоз' i-шых "ответы.типа А" .(рис.1), но не действует, а в некоторь.к "чаях приводит к увелйчёвдю-амплитуды-АХ-токов, условно обменных, "ответы типа Б" (рис.2).

Показано, что оуабаин при.его одновременном добавлениг с АХ действует .на амплитуду АХ-ответов.типа А, которые угнетались мерно на" 45-70$.-после 20-30 сек.- конденции нейрона в растворе уабаином. При этом' значение Ер ,АХ ответов не изменяется под ствием оуабаина;'. ¡Максимальный ингибиторнып эффект оуабаина на токи проявляется при концентрации оуабаийа ЮМ, при которой вызывает максимальную инактивацию Ыа-насоса в нейронах улит-

Показано,' что АХ-ответы' типа А, и Б различаются не только эй чувствительностью к ингибиторам Ыа-насоса, но л ионной эодой, фармакологическими свойствам! и крутизной лпада АХ-тока

Шз.1. Действие оуабаина на зависимость-токов, вызванных быстрой аппликацией АХ, от мембранного потенциала у нейронов типа А. А - примеры АХнсоков в нормальных растворах, слева от: записей .токов обозначены значения мембранного потенциала в мв; £ -примеры АХ-токов в растворе с оуабаином] В - вольт-амперные характеристики пиковых значении амплитуд АХ-ответов в нормальных (I) и содержащих оуабаин (2) растворах.

при присутствии АХ после достижения пикового значения тока. .

Значение потенциала реверсии (Е^) АХ-ответов в "нормальных" растворах соответствует 5+3 мв для АХ-ответов типа А и ■■ 25+5 мв для ответов типа Б. Исследуя влияние уменьшения концентрации или исключения из соответствующего раствора токопе-реносящего иона на Е0 АХ ответов обоих типов, показано, что в случае ответов типа А АХ вызывает увеличение мембранной проницаемости для ионов С1 и На с соотношением коэффициентов проницаемости 1:0.2, а в случае АХ-ответов типа Б - для ионов На

Рис.2. Действие оуабаина на токи, вызванные быстрой аппликацией АХ, у нейронов типа Б. А-, Б-, В- то же, что на рис.1 соответственно.

и К в соотношении 1:0.4 соответственно. Показано, что АХ может активировать одновременно оба типа рецепторов, поэтому не исключена возможность, что Ыа-компонента в АХ-ответах типа А является результатом проявления ответов типа Б на том же нейроне.

Выявлены следующие фармакологические особенностг АХ-ответов типа А и Б:

1) бутирилхолин, специфический агонист нихогакоЕзк холино-рецепторсв в нейронах улитки Helix ( Walker, кеп-ut . IS1??) , избирательно активировал нечувствительную к действию суабвляа Па/К проводимость холинорецептивной мембраны, независимо от.типа АХ-ответов у данного нейрона;

2) метилфурмецид, агонист мускаринового типа, был неэффективен у нейронов обоих типов, а суберилхолин (Д-6), агонист К-типа (Мнджоян и др., 1954) активировал холинорецептивкые мембра-

ны обоих типов, но с.различной.эффективностью: вольт-амперны характеристики й концентрированные-зависимости ответов мембр ны на АХ и Д-6 совпадали;у'нейронов типа Б, а в нейронах ти-иа Л Д-6 активировал-хлорную проницаемость мембраны в меньше . ; ' степени, чей АХ и рассчитанное - методом Хилла значение соо ; - • , ветствекно. 3.6 мкМ для АХ'и 6.6 ,мЫ - для Д-6.'Следует.отме-- . тить, что полученные, даяние о действии Д-6.на -холянорецептив

. ную мембрану улитки.Helix отличаются от данных, полученных моллюсках Aplyoia (Kehoe, 1972) и Planorbarius coraeaua (Kachaan, Zeimal, 1982), где Д-6 избирательно активировал CI проницаемость■ холинорецептивнои мембраны нейронов,.-He-действ; -.' - '. при этом па На-, и К-проницаемости.■ Можно 'предположить, что i

;. ' '■'.; своей ионноГ природе.-и. чувствительности к Д-6 АХ-рецепторы' ti ..'-''', " па А в нейронах 'Helix'-, .близко схожи' с АХ-рецепторами в'мембр; -' -,';нах нейронов Apliaia'. и .'.Pianorbarius - , а рецепторы;типа J -.-.; ."схожи ■ с. никотиновыми рецепторами -нервно-мышечного' соединения 3) д-тубокурарйн .(д^ТК),-антагонист H-тша,-.блокировал : '•',•'* ' ' ' * оба типа АХ-ответов, но ответы 'типа-;А - "с меньшей, эффективно« ' / тыр, чем ответы типа" Б, увеличивая значение .Кд АХ-ответов. ти-

, , - ; да.А в 1,4 раза,"а ответов типа Б - в 2 раза.' Кроме того,' д-1 .-,-"-' ■. блокировал CI-зависимые.ответы по типу конкурентного ингибирс . вания, не изменяя-величины максимального- ответа,, а Ыа/К-отве .. - , . ,' - "'ты1.- по типу неконкурентного ингибирования, уменьшая'максима! . ; ' ' ное . значение АХ-тока и избирательно.'блокируя Ыа-, но -не К-п£ ■ , ," , .- ' нишемость холинорецептквной мембраны; .-.-■'

• '. v.-' '-..".' ■ 4) атропин,'антагонист М-типа, не блокировал АХ-отвёты.'т ■ / '. '.; ; - па Б, но. подавлял-ответы" типа А, вызванные аппликацией насшца

;■' ,:■"' ' -' "щих. концентраций-АХ; . ;■' ." ..

,• ." . ', - . - V : .5)-..^-бунгаротоксин,-антагонист Н-типа, блокировал обрат "• -"-' ' ' мым образом.АХ-ответы обоих типов также.с различной'эффект.ив-'',.,"-'".".",' ностью: значения концентраций токсина, вызывающих 50% блокиро .; - вание АХ-тока, соответствовали 13.3-ГО-8 и 5.6 •Ю-** г/кл для - ' Т .'-' - ответов типа А и типа, Б соответственно$ . -'■'.''.''-.->.'.;■:;■.-; " '- 6) рассчитанное значение константы п в уравнении.Хилла . .'- , равно примерно I" для;АХ-отве,тов типа А, что характерно для:. М-

• '. - - .: " ',холинорецепторов, а для-'АХ-ответов "типа Б -, примерно 2, '.-'что . : •; - - . характерно для Н-холинорецепторов;- ' ' ' • ' '•'-,'■ . : ■.'■_'•-'

7) АХ-ответы типа А гораздо более чувствительны к изменению температуры, чем ответы типа Б: понижение температуры до 5°С приводило к уменьшению на 25-30% амплитуды АХ-тока типа А и замедлению примерно в 1.5-2 раза скорости-его нарастания я спада, тогда как АХ-ответы типа Б перфузированных нейронов существенным образом не изменялись при аналогичном понижении температуры.

Полученные данные позволяют характеризовать АХ-ответы типа А как ответы смешанного мускариново-никотинового типа, а ответы типа Б - как типично никотиновые.

Установлено, что АХ может активировать оба типа ответов в одном нейроне и вероятность активации одного из этих ответов зависит от изначальной активности Ыа-насоса: инактивация На-насоса приводит к угнетению 01-проницаемости холинорецептивной мембраны типа А к оставшиеся АХ-ютветы характеризуются как Ыа/К-ответы типа Б, тогда как активация Ыа-насоса путей одновременного увеличения внутриклеточного содержания ионов Ыа и наружной концентрации ионов К, наоборот, сопровождавгоя активацией блокируемых оуабаином 01-каналов в холииореиелт.ч.'ил1. бране типа Б.

У клеток, характеризующихся блокируемыми оуабаином и бес.-калиевым наружним раствором АХ-ответами типа А, оуабаин ингкби-ровал также токи, вызванные аппликацией и друг!1>' гедлатороз -ГА.МК, серотонина и АТФ. Ингибиторное действие оуабаина на вызванные медиаторами токи в мембране перфузированных нейронов услиливалось при изменении рП наружного раствора с 7.5 до 6.5 и уменьшалось при рН = 8.6. Эти данные хорошо коррелируют с данными об увеличении ингибиторного эффекта оуабачна на Ыа, К-АТФазную активность в условиях кислых р.1 и уменьшении его эффекта при щелочных рК (Цакадзе, Кометианп, 1У70.1. ,

При понижении температуры перфузирзе./ых растворов с 24 до 14°С ингибиторное действие оуабаина на АХ--о--веты типа А уменьшается примерно з 2-2,5 раза и полностью устраняется при температуре 4°С.

Идентичность ингибиторных эффектов оуабаина и бескалиевого наружнего раствора на С1-зависимые АХ-ответы типа А и устранение их подавляющего действия на АХ-токи в условиях холода укаг-ш-

ват на то, что оуабаин оказывает модуляторное действие на АХ-ответы нейранальноГ мембраны в результат, инактивации Ыа-на-соса.

Таким образом, характеризуя вклг Ыа-насоса ^ регуляцию чувствительности хеморецепторов к но:;ромедиаторам, необходим поиск связи между Ыа-насосом и системой хеморецепторов на уровне метаболических процессов.

2. Влияние Ыа-насоса на систему вторичных мессенджеров

Поскольку известно, что процессы фосфорилирования и де-фосфорнлирования, которые регулируются внутриклеточными мессе! джер.-ш, могут лежать в основе метаболической регуляции функции хеморецепторов (Акопян и др., 1979; вгеепеага , 1983), была изучена взаимосвязь между активностью Ыа-насоса с содержании цАШ и цГ.'.'й в псионах, входом в клетки ионов Са и сге-пенью фосфорилирования клеточных мембран.

Установлено, что пнактгшаиия Ыа-насоса оуабаином и/или бескалиевда раствором сопровождается увеличением внутриклеточ ной концентрации цА?ЛФ (таб.а.1).

. Таблица-I

Действие ингибиторов Ка-насоса на внутриклеточную концентрацию цАГлф и цШФ и на фосфорилирование мембран ннтактных нейронов, инкубированных с -.

Условия цАЙЮ (пмоль/мг белка) ■ цГл'й. (пмоль/мг белка)' ■V) Включение Р в мембраны (хЮ~3 пмоль/мг белка)

Контроль 7.5+0.8 3.8+0.4 254.8+20.5

Раствор с . оуабаином II.6+0.9 ' 2,7+0.2.

Бескалиевый . раствор 19.742.6 2.6+0.2

Бескалиевый раствор с оуабаином 17.8+2.1 350.0+10.2

Р < 0.05

Известно, что соль шинство мембранных эффектов, обусловленных увеличением внутриклеточной концентрации цАЩ, связано с активацией цАР<Н?-зависимой протеинкиназы и фосфорилированием соответствующих мембранных белков. Установлено, что инактивация Ыа-насоса вызывает увеличение степени фосфо^илирования мембран интактных нейронов, инкубированных с Нд^^ТО^ на 37% в одной серии (табл.1) и на 102% - в'другой серии опытов. Различие в стимулирующем действии ингибиторов Ыа-насоса на фосфо-рилирование мембран интактных нейронов возможно объясняется тем, что опыты первой серии производились в зимне-весенний, а опыты второй серии - в летне-осенний периоды.

Данные относительно действия оуабаина на фосфорилирование мембран в условиях in vitro , проведенные на выделенных мембранных фракциях нейронов, довольно разноречивы от эксперимента к эксперименту. Так,.в одной серии опытов оуабаин снижал базовый уровень фосфорщшрования на 35$, в другой - несколько увеличивал или не влиял на него. Для выяснения причины столь противоречивых данных изучалось влияние оуабаина на степень фосфорилирования мембранной фракции в условиях различной изначальной активности На, К-АТФазы. Показано, что активация Ыа, К-АТФазы путем добавления в инкубационную среду ионов На и К приводит к уменьшению примерно в 2 раза базального уровня фосфорилирования и в этих условиях оуабаин вызывал увеличение на 30-40% включения в мембранную фракцию, уровень фосфорилирования которой уменьшался под влиянием оуабаина до активации Ыа, К-АТФазы.

Установлено также, что инактивация Ыа-насоса вызывает 45

увеличение входа Са в клетки (рис.3).

Чтобы выяснить, зависит ли эффект Ыа-насоса на вход Са^+ от внутриклеточной концентрации uAivffi, исследовалось влияние известного активатора аденилатциклазы ЫаР. Показано, что при инкубации ганглиев в растворе, содержащем ЫаР, стимулирующий эфА ^

фект ингибиторов Ыа-насоса на вход Са уменьшился примерно в 2 раза. В растворах, содержащих толбутамид, специфический ингибитор цААЙ-зависимой протеинкиназы (Kanamoni е.а., 1976), инактивация Ыа-насоса не оказывала достоверного действия на вход ^Са в клетки. Полученные данные позволяют предположить, что

I 5 И $0 (жи)

45

Рис.З. Захват Са клетками ган£лиозной массы улитки в зависимости от времени инкубации ганглиев в растворах с изотопом. (I) - б бескалиевом растворе с оуабашюм, ¡2) - в нормальном наружнем растворе. Доверительная граница для среднего, обозначенная вертикальными.линиями, нз превышала

одним из механизмов, лежащих в основе Еизванного ингибиторами Ыа-насоса усилоплл входа ионов Са в клетки является увеличение внутриклеточной концентрации цАЖ- и цАМЗ-зависимое фосфори лирование.

Тагам образом, полученные результаты говорят о том, что воз"с;1стг<уя на активность электрогенного Ыа-касоса, можно ак-Т:1В1'о вмешиваться в регуляцию активности сигнальных систем Са и цАШ в клетке.

.механизм модуляции хемочувствителыюсти нейрональ-пой мембраны электрогенным Ыа-насосом

йслучешшо данные об уменьшении амплитуда С1-зависших

АХ-отзотов мембраны перфорированных нейронов при инактивации Ыа-наеоса можно объяснить по крайней мере тремя различными способами: уменьшением количества активируемых АХ соответствующих рецепторов в мембране; увеличением скорости десенситизации АХ-тока; модифшсацией характеристик активируемых АХ GI-каналов мембраны.

Исследование действия ингибиторов Ыа-нассса на концентрационную зависимость АХ токов в нейронах типа А показало, что оуабаик вызывает уменьшение максимального АХ-ответа, вызванного аппликацией насыщанцих концентраций АХ (рис.4). Эффект оуабаина на АХ-токи типа А сопровождается изменением констант Хилла: значение и = I.I+0.03 в контроле изменялось до n = I.4+0.1 в растворе с оуабаином, а Кд увеличивалось с 2.5+0.2 мкМ до 6.7+ +0.3 мкМ соответственно.

Расчет постоянных времени нарастания и спада АХ-тока с использованием критериев■оптимального приближения и минимальной ошибки ( Ellie , 1978) показал, что кривая нарастания АХ-тока наилучшим образом аппроксимируется одноэкспоненииальной функцией, а кривая спада - двумя экспонентами, что соответствует данным, полученным на нейронах моллюска Aplyeia ( slater , 1984).

Установлено, что оуабаин вызывает замедление быстрой компоненты десенситизации АХ-тока. В частности, для тока, вызванного аппликацией АХ, оуабаин вызывал увеличение постоянной времени быстрого компонента с 5 до 18 сек. Уменьшение концентрации апплицируемого АХ в нормальном растворе до 2х10~%, при которой он вызывал ответ, примерно.равный по амплитуде ответу, вызываемому АХ в оуабаинсодержащем растворе, сопровождалось примерно таким же увеличением значения постоянной времени быстрой компоненты десенситизации АХ-тока. Аналогичные данные получены для действия оуабаина на постоянную времени нарастания тока, вызванного быстрой аппликацией АХ.

Таким образом, полученные результаты говорят о том, что вызванное оуабаином ингибирование амплитуды АХ-ответов типа А нельзя объяснять замедлением процесса нарастания или убыстрением десенситизации АХ-тока. Вызванное же оуабаином уменьшение максимального АХ-ответа указывает на,возможность уменьшения количест-

■

; а

' с

-Г'

0.5->—

1 -К

-

■'II"

" !

о - 1

» - а

„-"Г

/ / /'

К

/

/

-¿К

и

. ; ' : •..цент-рационную зависит

..- 01, - Л*на быстр':'» вшьти-

¡.;- р..-" -■синиинд. р^з,!1;;.:,: '.,--:!трацк-вш .-.X л -о.ч и 1. раст'.,:)^; о •о« соотвеготй';;п...; ¿огде ^'г'тавк^ ;;■<-•

зтуд АХ-7окоь ч'лазаяа !.-..-•

':Г'} ЛХ ь жМ.

;«я ззаязишсть АХ-ответок а ..••••кх-ро,.!'; (.!■; - оаотвоос:, соцврваком оуабапа ; '); вс!г.гг!/и';:.1'. х -.•и.Ь'й обозйачеи''доведет,ль

"нтеэв:-.:; п : ■ С-"---,оде ¡'.та 0~ С5)

для й эксперк'.^-л .-V. . .1- линии построен

а помощью ЭаК ко го дог; в^шеныаих квадоатов согл по фогагулз Хклла. йлачонля АХнгоков нормализова "лксь в соотвотствы! с ш»;симадьным током, вызва нп<. г.-ыу-,* АХ.

ва активируемых ах г&мараннык. рецепторов ''сша А ..при инактива Ыа-насоба. • •• 1 ' . •• .

Показано,^что оуабаин вызывает лнгибирозакие связывания ченых молекул ^-А*' и -"Й-ГАИК-с. соотв'Ллл^укшш чйзкбрашшш цепторами (табл.2).

Таблица 2

-е оуабаина на дозо-зависимнй захват °Н-АХ и °й-ГАНК клетями ганглиозяой массн ул>г>-к;-

^иаог" - . 'аш«.ч Да, !

10 10 10 10

--8 -7 ~5 -5

оллчоство АХ, св.'Т-мег.кЗраь'о; лзку л/мг)

за;и;агс с мембраной

нсг'.-

Количеству .ГА. Л, связанного с мембраной (х! С''мэлекул/мг)

I оуабаая ;

норм;

оуабапн

15+2.9 153+21.7 1187+151.1 11051+958.3

4+0,? 105+0.8 931439.4 12024+972.3

4-1+2.1 485+40.3 4923+229.2 45817+2285.1

30+3.7 224+14.4

3571+301.2 37151+3548.4

Р < 0.05; опыты по связыванию ГА..Й проводились в безнатриевом растворе, что исключало проникновение этой аминокислоты в ¡слетки по натриевому градиенту.

Чтобы исключить возможность проникновения Ал через нейро-нальную мембрану в клетки, что может отразиться на результатах, исследовалось влияние инг.чоиторов На-насоса на связывание

-БТ с мембранными рецепторами. Установлено, что -БТ янгионрует оба типа АХ-ответов и с<1-КГ связывается доза-за-висигкгл образом с мембранными рецепторам в ганглиях улитки с !{ - 11-10 г/мл. АХ и д-ТК, по мере увеличения их. концентраций, уменьшали количество связавшихся с мембраной молекул

ос -БТ, что у1сазнвает на взаимодействие ы. -ВТ именно с АХ-рецепторама нейрональной мембраны. Исследование влияния ингибиторов Ыа-насоса на связывание "%-БТ с мембранными рецепторами в области насыпающих концентраций токсина (5х10~'М) показало, «то оуабаин вызывает уменьшение примерно на 30'/- количества связавшихся с мембраной меченых молекул *ч1~БГ. Инкубация нейронов в бескалиевой среде до переноса их в среду с меченым лигандом, таете вызывала подавление процесса связывания %-БТ. Причем прк .милзче^'.'и временя преинкубащш нейронов в бескалиевом раствор»', п> шцгйрториый эффект на процесс связывания меченого токсин:-пег;'.бравой увеличивался. Аналогичная преинкубацкя нейрон«' • ЛС:С1ДН1'1 СС-;0С) о.(Скалл.}йоп растворе по вызывала сумесмсин'.; м» -

дифшсаюш процесса связывания.

Чтобы выяснить, обусловлено ли действие оуабаина на АХ от петы мембраны перфузировашшх нейронов только модуляцией процесса связывания ЛХ со сзоигл ронзаторает• пяи оуабаин шкет .не посредственно вдкять на :ърактетюпта АХтйктйвируеьж еоншх яакалоа,. псследойслось действие oyudauua ни параметры одиночны: /.¡C-ifciHCwOa ¡шйроиальной кокбранн д ког^-йгурацгша: '"С.Л." и "0.0 Пр1шшш1КУ«ьнор разлпчие даущ ;;о;ф;гурацйя/д; гшдалае*11ся то;;, ;ixo víp:í шбото iui ие.циоллроганких >:а кязмся. участках'

г.;л1до .но (•¿гуи'.й'гсл иглосгйосгь :.:o;:j:q ЛЙСЛВ-

доветь зош^доПстшо гт-ту p^fío-i-ci: адптз.ру»?аг: ЛХ иашк каналов с -о^'гйшк ,, которое паруг-Логся 2 случай, г г;:-г:-о:: ме - С 'Ц5т-.а .ух.аугиекш пу; :оз о;' iu-. .'лС^/м'::, с:;/\т,:. !:с:?.г- Г"'"С,.».,".

; го:.-.--;' г.-л'г.сяру üvc^ÍX:/Л з

■"■/■-¿-.i;:. . o.yi.'Wi с 2. :;::i ст r;-.::;;:'.',:;*;;^;)

/. у, % г;_ :/ .vcivj .. : ok, .¡и::/ .. 1;.=. ]; ^ ; ¿ !■;•-:;,i.e; ■''vL'..'.- . ■ : сьу ::c;;;<,J i.: üaj.y r.cu-'-л 'j; .:>"..-.;.f.'• ; v;.v--к: 'ÍS,/..'' ;■ >■:::•::.:-.} ::'w.y>u-;;:Yi \_iv:ou-,-.: .у:""-.. i::' ';г.т„ - v ::i:,!Xr, 7' ■ ■' .:'. г '•.;•. : ;.т"•, j ¡: .v i-o

o i..;.'-'./..; r: ■■>'■,'...... .Jí'.,.:.-,-//.,'1, y ;:,;

г г,.;:-;¡. ", С 'I/ÍEGj: . .. V:/;-': -'.yi-yy:; yn ¿-'Í:: ./•/

и,;,í<4~; . . >J,.v. •,.■.': . '■ . y, ..■:•..,..: .-. c;"-

o* . ÍL:-. ЛЫ-У.-; J.

^yutíiOíi-O:.;■ .. " гу, : /л; :¡T„ ú cí;:-./ ¿.

Crj.-¿L:v;- :v,;i:c t Vi'O {'¿ííiOJÍv r;'"' -i'-iX/JlllIC Г ll',í.

L-'.'íüf: .л: .-•.:'..).-.■. "-'¡: r. ■. ■■

i rmo, d) к í.^h-hü;," ; ¡■•.•ve . ■ ar1С"

Í-/I ^ i'..

i

£*SMt W - JÎ5

y i Ji

у •/> 'л Ï( Ч' .

-A/^X, w4, -/ХМ-

U i/ ■ W

.ГиЛ- -TL

>

ДдлЯ

Г"'/;..«

■'0.Ü, 1С'.;; 'îiïRao rpvcvvc; i.v:.\'7!

- гохсз'т» "О-Л. ; "Î

О) - поело /гсО'з^н'щ- ï> i'v.r.'T.'ir:;'

i;. — -'Г p-' ^ -v VI

0

"Я 'гл^-л;.; -.o.v,.-;

(Г) -'rrcobj ¿oc-ji;^-.:

.-•=;*-...... , .................

г;?г;т'5т:'т:л ■ Cr/x-ú'or^ ~ т.-

- го .'г.'."1:: " \ ' . -

-<c/:rr.:-y:ivr-ï y/:n rv'v; "7îcn-л: ; до (.-; :г ^.х" ■-■;V'iít.:-

; (-J) :: (-1)

"Ol' -ххкпя -т:'-'.VV"' соот-

: -/••■тетя; па большинстве фрагментов имела иеш-

•'••;•/?:•*---•) г: г-ггтгйя'.о?«цропзгдсь дну?.'я экспонентами с цо-• í -í!*n о о, 'i i ?QAi '»»».ß). Однако оуаблии уизнь--V -..s г 'регистрируемых

J: sX r:¡ . XC'CVV^Л Я С'Хч.Х т/хжрошщшх от

Рис.6. Гистограммы распределения времени открытого состояния (Т) активируемых АХ С1-каналов в конфигурации "0.0." до (А) и после (Б) добавления оуабаина; МП - -50 мв.

Таблица 3

Действие оуабаина на параметры активируемых АХ С1-каналов: среднее время открытого состояния (Т ), среднее значение элементарной проводимости ( з ) и вероятность активации (Р )

Параметры Конфигурация "С.А." Конфигурация "0.0."

АХ-каналов контроль (п=б) оуабаин 1п=3) к^нт^оль 0 уабаин 1п=5)

Т (мс) 5 СпСм) 8.6+0.5 9.9+0.5 8.3+0.2 8 .2+0.2

18+0.5 18+0.5 18+0.5 18+0.5

Ра (с"1) 2.6+0.5 0.4+0.1 9.5+0.6 8 .6+0.5

Значения о усреднялись для токов входящего а выходящего направления в диапазоне МП от +80 до -80 мв. Значения Р определялись как величины, обратные средне!,от времени закрытого состояния каналов при Щ =■ -70 мв.

Полученные данные указывают, что вызываемое оуабаином уменьшение величины АХ 01-тока через мембраьу аерфузированноге ирйрона типа А не обусловлено изменением элементарно;: арене -

дикости или времени открытого состояния С1-каналов холиноре-цептивной мембраны, а определяется уменьшением вероятности активации этих каналов. Данные о том, что оуабаин уменьшает вероятность активации СГ-каналов холинорецептивной мембраны нейронов только в условиях ненарушенной целостности клетки и не действует при регистрации изолированных от клетки мембранных фрагментах, указывают также на участие метаболических процессов клетки з реализации модуляторного действия На-насоса на процессы взаимодействия мембранных АХ-рецептороз с нейроквдиа-тором.

Выше (■ табл.1, рис.3) было показано, что инактивация Ыа-насоса вызывает увеличение внутриклеточной концентрации цАЬЦ и стимулирует вход ионов Са в клетки. Нами изучалась роль систем цАЙ5 и Са в реализации модуляторного действия Ла-иасоса и.а чувствительность нейрояальной мембраны к нейромедиаторам.

Установлено, что в отличие от оуабапяа, вызывающего уменьшение максимального значения АХ-тока (рис.4), увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са с Ю-' до 10"^ не внзываег уменьшения пиковых значений амплитуд АХ-тока, вызванного насыщающими концентрациями АЖ, такяе как и з нейронах хегаааса (Чемериз, 1988). Показано такге, что ингибиторное действие оуабаина на АХ-ответы типа А существенно' не модифицируется при увеличении внутриклеточной концентрации ионов Са.

Полученные данные позволяют предположить, что вызванное инактивацией На-насоса усиление входа ионов Са в клетки само по себе не может объяснить блокирование АХ-ответоз типа А оуабаин ом. '' ,

Известно, что ионы Са, помимо непосредственного эффекта, ¡югут оказывать влияние на функцию мембранных холинорецепторов путем активация Са-зависимсй протеинкиназы С ( зузоМ ДЭ87). "3 работе исследовалось действие■форбояового эфира 12-0-тетра-1Г;::п"о;ш|орбола~13-йцетата, (ТРА), специфического активатора ки-;:?.31> С, ка АХ-отзетн нейрональной мембраны и их зависимость от активности Ил-насоса. Показано, что добавление ТРА зо внеклеточный л внутриклеточный растворы вызывает уменьшение амплитуды АХ-токоз в мембране перфузированкых нейронов. Ингибиторное действие ТРА на АХ-роки усиливалось при добавлении- АТ$ во внут-

риклеточный -раствор. Действие АТФ на вызванное ТРА ингибирова-ние АХ-ответов устранялось при снижении температуры растворов до 5°С.

Показано, что добавление оуабаина в раствор, содержащий ТРА, вызывает дополнительное уменьшение амплитуды АХ-токов в нейронах типа А (рис.7).

Б В

(

(

Д

(

Ж

V

IV 9

Г

7

Рис,7. Действие 5x10 * 1Л ТРА на ингибиторный эффект оуабаина на АХ-ответы типа А. АХ-токи, вызванные аппликацией 2x10АХ регистрировались в условиях: А-, Б-, В- в нормальных растворах, после добавления оуабаина и после его отмывки соответственно; Г - через 5 и Д - через 15 мин. после добавления ТРА в наружний раствор; Е- добавление оуабаина в раствоп с ТРА, 2- после отмывки оуабаина из раствора с ТРА.

Показана также аддитивность ингибиторного действия ТРА и оуабаина на количество-связавшихся с клеточной мембраной молекул -бунгаротоксина, причем действие ТРА нивелировалось после добавления в инкубационную среду трифторперазина, ингиби-

тора протеинкиназы С, тогда как действие оуабаина на процесс связывания токсина сохранялось в трифторперазилсодержащем раст воре, но устранялось в растворе, содержащем толбутамид, ингибитор цАМ2-зависимой протеинкиназы (табл.4).

Таблица 4

Действие оуабаина на связывание ос-бунгаротоксина в зависимости от исходного уровня фссфоридировакия мембраны

Условия ■

Количество связавшихся молекул ^Н-БГ (хЮ*4 молекул/мг)

$ действия (+ увеличение) (- уменьшение)

I. Контроль 204+21.5

2. Оуабаин 141+11.8 -31 (отн. I)

3. Форб.эфир (ТРА) 154+12.2 -25 (отн. I)

4. Оуабаин + ТРА 101+8.6 -34 (отн. 3)

5. Тряфторперазин 113+3.4

6. ТФП + оуабаин 90+8.6 -20 (отн. 5)

7. ТШ + ТРА III+9.5 0 (отн. 5)

8. Толбутамид 173+12.4

9. Толб. + оуабаин 202+18.9 +1? (отн. 8)

Р < 0.05

Полученные данные позволяют предположить, что эффекты ТРА и оуабаина на чувствительность нейрональной мембраны к АХ опосредованы их воздействием на различные метаболические сиотеш в клетке.

Для того, чтобы выяснить, может ли вызванное инактавацке;! На-насоса увеличение внутриклеточного содержания гАь$ лежать в основе модуляции хемочувствительности мембраны злектрогенным Ыа-насосом, было изучено влияние цАГ»Ф, непосредотпенно добавленного во внутриклеточный раствор, а также влияние Факторов, вызывающих увеличение внутриклеточной концентрата: цАиФ на чувствительность нейрональной мембраны к АХ. Показано, что через 20 мин. после добавления цШ) во внутриклеточный раствор имеет место уменьшение амплитуды АХ-токов типа А перОузированяых ней-

ронов, которые характеризовались стабильными во времени АХ-от ветами до добавления цА®, Показано также, что после добавления цАМ£ во внутрь клетки оуабаин не влиял на АХ-ответы, коте рые блокировались оуабаином до действия цАМЗЗ (рис.8).

Рис.8. Действие внутриклеточной аппликации цА® на АХ-токи типа А и на блокирующее действие оуабаина на эти токи.

А - действие цАШ? в зависимости от'времени, прошедшего после его добавления; цифры над записями токов соответствуют времени, прошедшему после начала регистрации АХ-токов; Б- и В - действие оуабаина на АХ-токи до и после добавления во внутрь клетки цА!®, соответственно.

У нейронов типа Б, где оуабаин не влиял на амплитуду А: ответов, внутриклеточный цА№ был также неэффективен, а в с. чае нейронов этого типа, у которых оуабаин вызывал уве^лчен амплитуды АХ-токов,-добавление цШ> во внутрь клетки также :

водило к увеличению амплитуды АХ-токов, при этом потенцирующее действие оуабаина на АХ-ответы этих нейронов устранялось в растворах с цАМФ. Добавление оуабаина в наружний раствор и/или добавление" цА1® во внутриклеточный перфузат оказывало идентичное действие на вольт-амперные характеристики и концентрационные зависимости АХ-ответов обоих типов. Ингибиторное действие внутриклеточного цА1® на АХ-ответы типа А, также как и действие оуабаина, устранялось при понижении температуры перфузируеиых растворов до 4-5°С и под влиянием толбутамида.

Известно, что электрическая стимуляция паллиальнкх нервов ганглия виноградной улитки вызывает увеличение внутриклеточной концентрации цА® в нейроне ППа1 и фосфорилирование мембранных белков (Яез1;1ег, агеехщ&гб. , 1982). Установлено, что такая стимуляция нервов вызывает уменьшение примерно на 50% возбуждающей реакции нейрона ППа1 на аппликацию АХ .в условиях комнатной температуры. При понижении температуры до 7°С в камере, где располагался нейрон, стимуляция нервов уже не влияла на амплитуду АХ-ответов. Эффект стимуляции нервов на АХ-ответы восстанавливался после увеличения температуры раствора до комнатной.

Полученные данные позволяют предположить, что вызванная Ыа-насосом модуляция процессов цА1®-зависимого фосфорилирования может лежать в основе регуляторного действия Ыа-насос.а к ней-ромедиаторам в условиях, исключающих влияние Жа-насоса на объем нейронов.

Таким образом, изменение активности Ыа-насоса может оказывать двоякое действие на чувствительность нейрональной мембраны к нейромедиаторам: с одной стороны, вызывать изменение количества функционально активных хеморецепторов в мембране в результате вызванного''На-насосом изменения объема нейрона и, с другой стороны, модулировать вероятность активации соответствующих мембранных рецепторов в- результате воздействия на процессы фосфорилирования. ■

'4. Модификация модуляторного действия На-насоса.на 'хемочувствителъность нейрональной мембраны при воздействии "на её структурное состояние

Известно, что знак ответа нейрональной мембраны улитки на дей-

ствке нейромедиатора мотет изменяться в зависимости от сезона (Сахаров, 1974), когда имеют место чувствительные изменения композиции мембранных фосфолипидоо (Карагезян и др., 1985). механизм зависимости функции АХ-рецепторов от их фосфолипидно-го окружения недостаточно изучен, хотя известно, что липиды играют важную роль в структурной организации и функционировании мембранных белков (Бурлаксва, 1973).

Показано, что обработка нейрональной мембраны фосфолипа-зой А0 вызывает уменьшение чувствительности мембранных АХ-ре-цепторов обоих типоз к АХ, Так как действие фосфолипазы А2 со-провожтается увеличением пула свободных жирных кислот а ыомбра не, исследовалось их влияние на АХ-токи. Установлено, что обра ботка нейрональной мембраны дециленовой жирной кислотой, которая вызывает увеличение текучести липидной фазы нейрональной 1.'.е!дораны (Такенака, 1983), не влияла на АХ-ответы типа А, но приводила к уменьшению амплитуды АХ-тока типа Б в результате модификации функции К-каналов холинорецептивной мембраны. Вале риановая кислота, которая не действует на текучесть мембраны, не оказывала действия на АХ-ответы типа Б, однако вызывала угнетение АХ-ответов типа А. Добавление АТФ во внутриклеточный раствор приводило к устранению ингибиторного эффекта валериано вой кислоты на АХ-ответы типа А, но не действовало на ингиби-торный эффект дециленовой кислоты на АХ-ответы типа Б. Показан что после получасовой обработки дециленовой кислотой мембраны нейрона» характеризующегося нечувствительными к оуабаину АХ-от веташ типа Б, оуабаин начинал вызывать икгибирование АХ-токов через мембрану этого нейрона, которое устранялось только через 1.5 часа после отмывки дециленовой кислоты.

Полученные данные позволяют предположить, что эффект оуа-баина на АХ-ответы нейрональной мембраны можно модифицировать путем воздействия на фосфолипидное окружение АХ-рецеятора и, г частности, на текучесть лилидной фазы мембраны.

Установлено, что проявление ингибиторного эффекта оуабаш па АХ-ответы мембраны нейрона, характеризующегося АХ-ответами типа Б, можно вызвать путем облучепия нервной клетки улитки ис зирующими рентгеновскими лучами (3-10 Кл/'кг). Продемонстрировг что вызванное ионизирующей ра.диацией уменьшение АХ-ответов тш

- 29 - • • ;Л

и модификацию эффекта оуабаина на эти ответы можно'частично'• /' • корректировать дектином конканавалином• А, вызывающим■ уззеличе- ,-' ■. ние внутриклеточной концентрации цГШ?'примерно в'1,5-:раза' и стимулирующим иДи!Ф-независшое фосфорилирование мембр-- -шцх,- -' ' ;•' ■ белков. ' ' ' " - : - "

Таким образом, полученные данные позволяют предположить" .: существование тесной корреляции между функцией хемоуправляе-- , мых ионных каналов в нейрональной мембране, системами ;электро-, -. генного Ыа-насоса и' вторичных мессендаеров и структурным сос- \. тоянием нейрональной мембраны. . ■ , -

5.' Действие нейромедиаторов. на.-активность' электро- '•.'генного натриевого насоса ,'- ■-..'Для выяснения данного вопроса в работе исследовалось дей-.-'-. ствие нейромедиаторов _ на связывание'.меченых молекул .%-оуабаи'-; -на с клеточной мембраной и на скорость активного выхода понев ' ^Ыа из меток.

Известно, что связывание оуабаина с интактной"мембраной -коррелирует с его.ингибирующим -действием на активность. Ыа:К-насоса и одна молекула оуабаина связывается с одной-молекулой . На,К-АТФазы при аппликации оуабаина в концентрациях -

а при дальнейшем увеличении концентрации" оуабаина имеет место - '. проникновение его в клетку (Baker, Willis ,'■1970) . Установлено, что АХ вызывает-уменьшение-Кд обоих насыщающих-компонен-- тов связывания меченого %-оуабаина с нейрональной мембраной с 4.4x10"% до ЗхЮ"10М для первого и с 10"% до 1.4x10"*% для . второго компонента соответственно (рис,9).,

Несмотря на относительно большое число- имеющихся в, литературе" биохимических.данных-относительно действия нейромедиаторов ' на активность препарата ДМа.К-АТФазы из нервных (Кометиани,1971) и мышечных (Болдырев,.1971)-образований,- пути действия нейроме- ': диаторов на активность электрогенного Ка-насоса винтактных . клетках недостаточно выяснены. . -.".

Показано (рис.10),;что:низкие,концентраций АХ. вызывают ак-' тивацию противоградиентного ■ ¿¡¿хода^ ионов - .На', из- клеток,, предварительно загруженных этими лонамц. По мере увеллчен'/.я.концен-

10*

а «

10-

ю

О - 1

• - г

Рис.9. Действие Ю ы1 АХ на дозо-зависимое связывание ■ оуабаина с мембранами клеток ганглиозной массы улитки. На абсциссе отложены концентрации оуабаина, на ординате - количество связавшихся с

мембраной молекул %-оуабаина в контроле (I) и в растворе с АХ(2). Для исключения влияния изменения объема клеток на процесс связывания тоничность инкубационных растворов повышалась 100 мМ сахарозой. Р < 0.05.

22

трации АХ его стимулирующий эффект на активный выход ЕЕа ослабевает и при дальнейшем увеличении концентрации медиатор выше Ю-3 - 10~^М развивается ингибиторкый эффект. ГАМК в де пазонё концентраций Ю-^^ - не оказывала достоверного

действия на активный выход йонов На из клеток.

120 г-

110

100

В 90

л

к

8 80

70 Ь

10'

,-Ю

10"

1СП

10"

10

10-

(и)

Рис.10. Действие различных концентраций АХ (полные кружки) и ГАМК (пустые кружки) на активный выход ионов Г1а из клеток. На абсциссе отложены концентрации нейромедиаторов, добавленных в наружний раствор; на ординате - эффект в % каждой концентрации медиатора на скорость

выхода ^Жа из клеток по сравнению со скоростью выхода ионов На в нормальный наружний раствор, без добавок. Для расчетов использовалось суммарное значение констант скоростей активного выхода ^Ыа за 40 мин. Среднеквадра-тическое отклонение не превышало величины символов. п = 10.

Таким образом, показана близкая аналогия в действии АХ на стивность электрогенного На-насоса интактных клеток с результат, биохимических экспериментов на препаратах 11а,К-АТФазы.

Результаты проведенных исследований дают основание заклю-ятъ, что установлена двусторонняя функциональная связь между гстемами электрогенного Ыа-насоса и мембранных хедарецепторов интактных нейронах, заключающаяся, с одной стороны, в регуля-

. торном действии Ыа-насоса "на количество функционально активных хеморецепторов.в нейрональной мембране и на вероятность их активации ' нейромедиаторами . и , с другой стороны, в модуляторном ■■действии нейромедиаторов на систему активного транспорта ионов ■ :через клеточные мембраны. , .-. ; , 'Установленные'механизмы регуляторного действия Жа-насоса ' на'чувствительность нейрональной мембраны к нейромедиаторам, в ■ основе которых лежат вызванные Ыа-насо'сом изменения объема ней-,'ронов, и,,модуляция "системы вторичных,посредников, могут открыть новые возможности'целенаправленной регуляции функции мембранных ■ ■.' 'хеморецепторов. ' ■

;■;;'•: ' ■" выводы

;'.', Впервые установлено, что воздействуя на активность ■-'электрогенного Ыа-насоса,- можно'.регулировать величину хемоак-. ^тдайруешх/токов- через мембрану перфузированных нейронов в ус-•; , ; ■ ловиях исключающих- влияние. Ыа-насоса на объем нейрона.

'-'.'-.'.':2. .Дцетилхолин' (АХ) вызывает■ два. типа ответов на мембране перфузировакного нейрона виноградной улитки, первый из которых ..(А).' связан. .с увеличением.проницаемости мембраны для ионов хло-, ра к'активацией АХ-рацепторов .смешанного,. "мускариново-никотино-вого" типа, а второй (Б) - с увеличением.мембранной-проницаемости для ионов,'натрия и калия и активацией, типично "никотино-: вых";АХ-рецептОров.; Инактивация Ыа-насоса. вызывает угнетение - АХ-ответов типа А, при этом АХ-ответы типа-Б не угнетаются или : . .. увеличиваются,по амплитуде; при активации Ыа-насоса проявлянт-. ся АХ-ответы типа А у тех нейронов , которые характеризовались ответами-типа Б в условиях неактивного Ыа-насоса. .

,3. Вызванное'ингибиторами Ыа-насоса-угнетение хлор-зави-. ' симых АХ-ответов не обусловлено убыстрением десенситизации АХ-тока и,изменением среднего времени,открытого состояния и элементарной проводимости. активируемых-АХ одиночных С1-каналов, а - является результатом уменьшения количества-активируемых АХ мембранных АХ-рецепторов и соответственно - уменьшения вероятности активаций С1-каналов холинорецептивной мембраны.,

4. Внутриклеточное содержание основных вторичных посредников находится в обратной,зависимости от активности Ыа-насоса,

{активация которого сопровождается увеличением внутриклеточ-зй концентрации цА2.@ (но не цГШ), усилением входа ионов Са клетки и стимуляцией цА®-зависимого фосфорилирования, При-здены доказательства, что одним из механизмов, лежащих в ос-эве регуляторного действия Па-насоса на чувствительность зйрональной мембраны к нейромедиаторам, является регуляция ровня цА1'®-зависимого фосфорилирования мембран.

5. Обнаружено, что функцию АХ-рецепторов мембраны нейро-ов улитки и её зависимость от активности Ыа-насоса можно мо-ифицировать путем воздействия на структурное состояние липид-ого кошонента мембраны свободными жирными кислотами, увели-иваюцими текучесть мембраны, а также путем облучения нервной летки рентгеновскими лучами. Продемонстрировано, что вызван-ое ионизирующей радиацией нарушение функции АХ рецепторов одно частично корректировать лектином конканавалином А, кото-ый вызывает увеличение внутриклеточной концентрации цП® и тимулирует цАМФ-независимое фосфорилирование мембран.

6. Показана модуляция системы активного транспорта ионов Ла через мембрану интактных клеток. Установлено, что АХ в (изких концентрациях стимулирует, а в больших - ингибирует ак-'ивность электрогенного Ыа-насоса интактных клеток.

7. Доказано, что имеется тесная функциональная взаимо-:вязь между системами электрогенного Ыа-насоса и хеморецепто-юв нейрональной мембраны. Насосная регуляция функции мембран-шх хедарецептороз осуществляется как посредством изменения соличества функционально активных хеморецепторов в результате вызванных Ыа-насосом изменений объема нейрона, так и путем 1зменения вероятности активации хеморецепторов кейромедиатора-ли, з результате модуляторного действия Ыа-насоса на систему знутриклеточных мессендаеров.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Arvanov V.L., Ayrapetian. S.N. The Na,K-AWase depe dentAOh responses of Helix neurons. In: Neuron Consept Tod Tihani, 1976, 76.

2. Ayrapetian S.N., Arvanov V.L. The sodium pump acti ty and acetylcholine sensitivity of neuronal membrane. Com Biochem. Physiol., 1977, 58 C. N 2, 153-155.

3. Арванов В.JI. Роль транспортной АТФазы в регулирова хемочувствительности мембран. Тез.докл. Всесоюзного симпоз ма "Транспортные АТФазы", Тбилиси, 1973, 6-7.

4. Ayrapetyan S.N., Arvanov V.L. On the mechanism of electrogenic Na-pump dependence of membrane chemosensitivi Сотр. Biochem., Physiol., 1979, j>M, N 3, 601-604.

5. Камалян Р.Г., Авагимян Э.А., Арванов В.Л.? Айрапет G.H. Действие зтаноламина на хемачувствительность мембраны гигантских нейронов улитки. Биол.журн.Армении, 1979, 32, $ 455-459.

6. Арванов В.Л., Айрапетян С.Н. О действии уабаина на холинорецепторы мембраны гигактских нейронов улитки. Докла, АН СССР, 1980, 251, if I, 222-226.

7. Арванов В.Д., Карагезян К.Г., Айрапетян С.Н. О дей вии фосфолипазы Б на холинорецептивные свойства мембраны г: гантского нейрона улитки. Доклады АН СССР, 1980, 255, № I, 212-215.

8. Айрапетян С.Н., Сулейманян М.А., Арванов В.Л. Натр, вый насос как регулятор объема и хемочувствительности клет; В кн.; Биофизика мембран.' Москва, Наука, 1981, 168-183.

9. Арванов- В.Д.,4 Дададкн G.G., Макинян С.Б., Айрапетя С.Н; Механизм действия уабаина на холинорецептивные свойст: мембраны. Тез.докл. I Всесоюзного биофизического съезда. № ва, 1982, 211.

10. Арванов В.Л., Казарян С.А., Айрапетян С.Н,, Григор. К.П., Гевондян А.И., Мндабян О.П. Холиновые эфиры амииокис. и пептидов как инструмент для изучения механизмов холиноре цепции. 3 кн.: Перспективы биоорганической химии в создани

вых лекарственных препаратов. Рига, 1982, 94-95.

11. Арв анов В.Л., Мажи -ян С.В., Айрапетян C,i(. К+—завкси— етъ подавляющего действия уабаина на холиноредепторные свой-ва мембраны перфузированного нейрона. Тез.докл. 9 Всесоюзной нференции по биохимии нервной системы, Ереван, 1983, 131-132.

12. Арванов В.Л., Айрапетян С.Н. Метаболическая регуляция юдства холинорецепторов нейрональной мембраны к ацетилхолину. кн.: Вопросы молекулярно-клеточной биологии. Ереван, 1983, 1-54.

13. Arvanov V.L., Ayi-apetyan S.II. The mechanism of ouabain tion on cholincreaeptive properties of dialized neurona. Abatr.

Synp. "Physico-chemical aspects of membrane fanction", 1983.

14. Arvanov V.L., Sal&nki J., Ayrapetyan S.U. Modulation ACh sensitivity of neuronal membrane by presynaptic atimu-

.tion. Gen. Physiol., Biophys., 1984, 2, N 1, 483-488.

15. Арванов В.Л., Мажинян С.Б., Айрапетян С.Н. О блокирую-!М действии бескалкевого раствора на CI-зависимые ацетилхоли-шые ответы мембраны. Доклады АН Арм.ССР, 1984, 78, If 3, 14114.

16. Арванов'В.Л., Сулейманян М.А. Мажинян С.Б., Айрапетян ,Н. О действии уабаина на процессы взаимодействия АТФ с наруж-)й стороной нейрональной мембраны. Доклады АН Арм.ССР, 1984,

), J» I, 41-46.

17. Ыажинян С.Б., Азатян К.В., Арванов В.Л., Айрапетян С.Н. 1триевый насос как регулятор сродства медиаторных рецепторов ¡мбраны гигантских нейронов улитки. Материалы 5 Всесоюзного шпозиума "Физиология медиаторов, периферический синапс".- Ка-шь, 1984, I49-151.

18. Арванов В.Л., Такенака Т., Бакунц И.С. Влияние теку-!сти нейрональной мембраны на её холинорецепторные свойства. 53.докл. 4 Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия ме-»аторных процессов", Москва, 1985, 19.

19. Казарян С.А., Арванов В.Л., Григорян К.П., Дадалян С.С., даоян О.Л. Действие холиновых эфиров N-защищенных аминокис-)т на холинорецептивные свойства нейрональной мембраны. Тез. экл. 4 Всесоюзной конференции "Физиология и биохимия медиатор-íx процессов", Москва, 1985, 141,

20. Ayrapetyan S.U., Arvanov V.L., Majinan S.B., Asatyan K.V. Further study of the correlation between Ha-pump activi and membrane chemosensitivity. Cell.Molec.IIeurobiol.1985,.5,2

21. Arvanov V.L., Takenaka Т., Ayrapetian S.H. The effec of short-chane fatty acids on the neuronal membrane cholinor septive properties. Cell. Molec. Heurobiol., 1986, 6, 165-1.7

22. Арванов В.JI., Айрапетян С.Н. Исследование зависимо« проводимости, .рецепторных мембран , от работы натрий-калиевого i coca. Отчет по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и 03 по проблеме "Исследования в области биологической физики". IIj щино, 1986., 157. .

23. Арванов. В..Л. О механизме, действия ГА1.1К на чувствите; ность нейроналъной; мембраны к ацетилхолину. Тез.докл. Всесою: конференции по нейронаукам. Киев, 1986, 62.

24. Григорян л.Н., Казарян С.А., Арванов В.Л., Мнджоян ( Действие холиновых эфиров аминокислот на холинорецептивные ci ства мембраны. Тез.докл. Всесоюзной конференции по нейронаук; Киев, IS86, 79.

25. Арванов В.Л. Метаболическая регуляция хеморецепции мембран. Тез.докл. II респ. конференции по проблемам физико-х; мичеекой биологии, Ереван, 1986, 18.

26. Арванов В.Л.', лазаряв С.А. Гигантский нейрон улитки как универсальная модель для скрининга биологически активных ществ. Тез.докл. II респ.конференции по проблемам физико-хими ;-:ой биологии, ¿¡реван, 1986, 53,

27. Айрапетян С.Н., Такенака Т., Сулейшнян i.!.A., Арван и..'.. О роли липпдного кошонента мембраны в определении фукк ияльяих свойств нейронов ЦНС виноградной; улитки. Доклады АН JJ0P, 1987, 294, ,'i 23 , 699-703.

28. Арванов В.Л., Айрапетян С.Н., Мзжикян С.Б., Азатян Инактивация натриевого насоса приводит к активации калиевого инактивации хлорного канала в хеморецептивной мембране гитан ского нейрона улитки. Доклады АН СССР, 1987, 296, Л 4, 998-1

29. Арванов В.Л. Действие конканавалина А на'функционал ыую взаг&юевязь между системой Ыа;К-АТФазы и хетрецептораь мембраны. Тез.докл. ХП Всессюзн. совещания по транспортным А -Ж-. Иркутск, 1987, 74.

30. Ayrapetyan 3.11., Arvanov V.L. On the metabolic modu-.ation of neuronal membrane chainoaensitivity. Иеигозсхепсе, 987, 22S, 696.

31. Arvanov V.L. The modulation of neuronal membrane che-loaensitivity. Abstr. of Satellite Simp, of the 2 World Cong-•езэ of Neuroacienae on "Tranamittera, modulators & receptors", [ungary, 1987, 11 .

32. Dvoretsky A.I., Arvanov V.L. Modification of neuronal -eceptive properties by lectins. Abatr. of 10th International .ectin conference, Prague, 1988, 28.

33. Dvoretsky A.I., Shainskaya A.M., Ayrapetyan S.N., Ar-■anov V.L. Radiation damage of the nerve cell membranes and harmacological correction opportunity. Abstr. of International onference "Cellular pathology pharmacology", Budapest,1988,99.

34. Arvanov V.L. The metabolic regulation of membrane che-loaensitivity. In: Neurobiology of invertebrates, Hungarian cad. Sci., 1988, 669-684.

35. Ayrapetyan S.N., Arvanov V.L. Pharmacological characte-iatica of two tipes cholinoreceptors in membrane of dialized .eurons. Сотр. Biochem. Physiol., 1988, 90C, II 1, 29-39.

36. Брежестовский П.Д., Арванов В.Л. Действие оуабаина на арактеристики активируемых АХ ионных каналов в мембране кейро-ов виноградной улитки. Тез.докл. П Всесоюзной конференции по ейронаукам. Киев, IS88, 19-21.

37. Айрапетян С.Н., Арванов В.Л. Натриевый насос как регу-ятор хемочувствительности нейрональной мембраны. В кн.: Внут-иклеточная сигнализация. Ш., Наука, 1988, 41-44.

38. Арванов В.Л., Дворецкий А.Н., Зимина Е.В., Егорова .Г., Айрапетян С.Н, Действие ионизирующей радиации на хеморе-ептивные свойства гигантских нейронов улитки. Коррекция АТФ и онканавалином А. Радиобиология, 1988, 28, Л 2, 219-224.

39. Арванов В.Л., Азатян К.З., Айрапетян С.Н. Метаболичес-ие пути воздействия конканавалина А на хемочувствительность ембраны нейронов. Нейрофизиология, 1989, 21, Ji 5, 667-675.

40. Арванов В.Л. Роль системы Ыа,К-АТФазы и вторичных эссенджеров в регуляции холинэргических свойств нейрональной ембраны. Тез.докл. Международного симпозиума "Транспорт ионов

'и механизмы его .регуляции". -Тбилиси, 1989,. 7-8.

= 4-Г.' Арванов В. Л. ,Ств;ганян A.C.,, АЗагян К.В., Айрапетян ' . С.Н.- -Дейотвие »t-бунгаротоксийа на. ацетилхолиновые ответы. • ■ нейронов "улитки. Нейрофизиология, 1989," 21, № $> '731-737. • •"Арванов"В,Л. Метаболичёскай.регуляция хеморецептиз-ных свойств мембраны". В рн: Мембранная энзимология и проница- . .. ем,ос.ть.мембран:'Изд.'АН Ары.ССР, 1989,. 206-214-,

*. : 43.- А.рвайав.В.Д.-,.'Степанян-А.С., АйрапеТян С.Н.- Модуляция. .' -. форболо'вым эфиром (ТРА) ответов мембраны нейронов улитки на . V ' быструю аппликацию ацетилхолина. Доклады АН-СССР (в.печати). ■

; ' Н.-'Арванов'ВЛ.',-Брекестовск'ий Л.Д.,- Айрапе'тян С.Н.-'." --ДеЯствие оуабаина на-активируемые, ацетилхолином одиночные

хлорные каналы нейронрв, улитки. - Биологические мембраны ("в пе- • . '... чаФи)'. . • i' ' • - ",•.-■'.•• .