Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Объем клетки и физико-химические свойства мембраны

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Объем клетки и физико-химические свойства мембраны"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. А. А. БОГОМОЛЬЦА

. /О

На правах рукописи

СЗЛЕйМАНШ Мирик Аванеоович

УДК 577.352.5 : 577.354

ОБЪЕМ КЛЕТКИ И ФЙЗИКО-НйИЧЕЙШ СВОЙСТВА МШБРАНЫ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ даосертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

От Ж

Киев - 1990

Работа вшолнена в лаборатории биомембран Института эксперк-шмальной биологии Ж Арм.ССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корр. АН CGCP O.A. Крышталь,

доктор биологических наук, профессор, М.Д. Курский,

доктор биологических наук, профессор, З.П. Коаетиенк.

Ведущая оргеянзыщя - Институт биологии развития Ж СССР.

Завдта состоится " "_ 1930 г. в_часов

на заседании специализированного Совета Д GX6.I5.CE щи Йнстагуте фазкожети ям. A.A. Богомольца Ш 5ССР по адрэоу: 252024, г. Киев, ул. Богомольца, 4.

С дасоертавдеЁ можно ознакомиться в библиотеке Института Зазиологаи им. A.A. Богомольца /й УССР.

Автореферат разослан " "_1990 г.

Учешй секретарь оаещализнрованного Совета доктор биологаческих наук

З.А. Сорокина-Марша

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что живые клетки ведут себя как осмометры: в гипертонической среде, теряя воду, уменьшаются в размерах, а в гипотонической среде, наоборот, поглощая воду, набухают. Во всех исследованиях, которые проводились до сих пор в области изучения активных и пассивных свойств мембраны, изменениям объема и поверхности клетки уделялось мало внимания. По этой причине в литературе существовало представление, согласно которому число функционирующих белковых молекул мембраны представляет собой относительно постоянную величину и может изменяться только путем изменения скорости их синтеза, в результате которого в мембране появляются новые молекулы взамен погибших старых. С помощью такого динамического процесса белковые молекулы мембраны, имеющие ферментативные, транспортные, канальные, рецепторные и другие функции, непрерывно обновляются. При этом возможность изменения числа функционирущих.^молекул независимости от изменения объема и величины поверхности клетки никогда не рассматривалась. Такое допущение затрудняло, а в некоторых случаях и делало невозможным, объяснение некоторых противоречивых экспериментальных данных, полученных разными авторами. Одним из таких спорных вопросов является, нащямер, зависимость активности работы злектрогенного натриевого насоса от изменения объема и поверхности клетки в растворах с различной тоничностьго. В одних работах было показано, что при уменьшении объема клетки активность работы натриевого насоса увеличивается, в других - уменьшается, а в третьих не было обнаружено никакой связи между ниш.

Другой вопрос, который также не нашел свое достойное месао в цепи исследований фтко-химических свойств клетки является поток воды через клеточную мембрану. Нарушение осмотического равновесия клетки всегда приводит к возникновению потока воды через клеточную мембрану, который уравновешивает осмотические давления растворов внутри и снаружи клетки,"в результате которого происходит ее сморщивание или набухание. Таким образом при исследовании фх-зико-химических свойств мембраны следует учитывать возможный вклад потока воды в изучаемый феномен. Исследованиями Тасяки и Иваса ( Тааак! & 1*аяа, 1982 ) было показано, что в период генерации потенциалов действия аксон набухает во время восходящей к сморщивается во время нисходящей фазы потенциала действия. Это свидетельствует о том, что во время потенциала действия происходит поток воды через мембрану. Естественно предполагать, что этот

I

поток вода будет оказываться на свойствах нотендоалозашсвмых ион-шве киншш мембраны. Однако до сих. пор нет воеобъекясфх коелвдо-в&якЗ дейотвинпотока вода на оовогвые алектровозбудаше каналы, которые позволяли бы выявить специфичность этого явлети дня каждого тиля канала.

Цель работы. Целью работы явилось исследование роли изменения объема в мяпвнн поверхности клетки в регуднцаи фвзико-хвшчео-гах свовств мембраны, а такке влияния трансишбранного потока воды на веввве тост мембраны.

Осногаые задачи яоедедованкя:

1. Исследование аяшсииооти активности работы натриевого на-оооа от в8иевшхн объема и поверхности клетет. '

2. Внявяешге изменения числа й^шщЕонирушда белковых шваиул мембраны, 1Пии'1Ц11 ферментативное, транспортные в канальные свойства, во время изменения объема в повераноотв клетка.

3. Изучение изменения внутриклеточной концентрации ионов натрия в 8анггатмпоти от взмененкя объема кЬесга.

4. Исследование влияния стационарного потока вода через мембрану на ионные ток*.

5. Изучение щяроды отрицательного сопротивления мембраны идентифицированного нейрона Ша11ЩС виноградной улитки в«их ро-паиа в его зависимость от взманенвв объема в поверхности кхетки.

6. ВгйШенае роли ввменения текучести мембраны в изменении объема в поверхности кяеж нмодуляип авхвшоств работы натриевого наоооа в аяектрвчеоких ввоВотв мембраны.

Настаю ноаюна I пидгооид ценность. Диооертация представляв* бобой нервов комшюкшое, систематическое вооледоваяие по вшиавШО) роля юманеяия объема клетки в регуляда фвзвво-хижчеалх свойств мвмбрвны.

Раэрабйан метод кенреркшой региотрацки взнвненвя объема изолированного нейрона в резлгинх фрвдгавальннх состояниях, поавоя-яхядЛ црооладить за явшявА ввменевия объема клетки щн изменено вмяявт уолошй. Впервые показано, что объем клетки иаиоияотся во нецрерывно, а отуйенчаго, охачкаас.

До настоящего времени в литературе существовало представшие, согласно которому чколо буншдювирухадп балкона молекул мтфппн црсибяйвляет собс® ошоовтельно поотаяннув величину в может тпмо вяЫ* только путем шнмшпиг скорости нх овнтеза. В результате тефДОчеаца аналвов в екоперпяявлышх иослаявввиий вдерме — шмйвабо, чю число Дццщщадц»и балкпшт молекул мшАдип,

(о

имепцих ферментативные, транспортные и каналыше свойства, ыохвт изменяться просто путем механического откривавия складок мембревн в результате изменения объема в площади воверкноотв клетки, де-экранировання белковых моледо и их ввода в действие. При этом скорость синтеза к общее число белковых иоиюкул (фуыкщонищшзц. и нефуняциоиируцщц) мохет не изменяться. Это свидетельствует о той, что в мембране белковав молекулы находятся в двух различиях состояниях - функционирующем а резерва оми их соотношение при нормальной жизнедеятельности клетка вое время изменяется в зависимости от внеших условие я функционального состояния клетки. Таким образом опровергнуто прежнее представление о том, что число функцдонирупзих белковых молекул мембраны всегда постоянно в аво-периментально доказано, его изменение в результате изменения объема и площади поверхности клетки. Это вносят принципиальные изменения в предотавленио о функционировании белковых молекул мембраны, и клеток в целом и позволяет по новому интерпретировать подученные экспериментальные данные.

Впервые теоретически обосновано в эксперамгятадьно доказано, что эффект изменения объема клетки на активность алектрогенного натриевого насоса зависит от уровня внутриклеточной концентрации натрия. При низких уровнях внутриклеточной концентрации натрия, когда еще не происходило насыщение элзктрсгетного транспорта натрия ионами натрия, уменьшение объема клетки в хвпертошпескях растворах приводит к активапди работа натриевого над оса, а при высоких урощях, когда происходит наощеннэ транспортного механизма натртя иоиает натрия, уыаньшеяие обьаиа влетев приводят к инактивада натриевого насоса из-еа ушшяаяия числа функпиоанру-вдих На,к-АИ>азких молекул (насосных единиц) шмбрары.

С помощью шутриклеточной перфузии диадазированного нейрона показана тзсяая взаимосвязь между потоком воды через мембрану в мембранными ионными токами. Поток води через домбраву увеличивает трансмемброяпне ионные токи, если градиент осмотического давления и ионные традяенты совпадают по направлению, я уыевьвает их, еоли градиенты ионов и осмотического давления направлены лротявопо-лошо.

Впервые показано, что повышение осмотического дзялшщя среда уменьшает, а понижение - увеличивает, отрицательное сопротивление медбравы идентифицированного нейрона пачечного «шга Ш1а1 виноградной улитки.

Впервые обнаружена тесная взаимосвязь между тецгаветмо нам- .

драны к объемом клетки. Увеличение текучести мембраны под действием децвленовой кислоты приводит к набухённю, а уменьшение текучести под действием кетамина - к сморщиванию клетки.

Подученные в диссертации данные позволяют величину клетки рассматривать как важный параметр, определяющий ее функциональное состояние.

Практическая ценность работы заключается в том, что она открывает новые возможности для целенаправленной регуляции ферментативной, электровозбудимой и хеморецептивяоЁ функций мембран путем регуляции эффективной поверхности клеточной мембраны. Сна позволяет путем увеличения площади поверхности клеточной мембраны (например понижением осмотического давления окружающей клетку ореда) повысить ее чувствительность к фармакологическим препаратам, что очень ваяно при скрининге особенно дефицитных и дорогостоящих препаратов и биологических соединений.

Апробация работы. Материалы дассертащш неоднократно представлялись и обсуждались на международных к Всесоюзных симпозиумах: на I Всесоюзном симпозиуме "Мембранная энзимология и проницаемость мембран" (Ереван, 1977), на конференции молодых ученых, посвященной 60-летию Великой октябрской революции (Ереван, 1977), Всесоюзном симпозиуме "Транспортные АТФазы" (Тбилиси, 1978), ХШ1 Международной конгрессе по ^зиологвческим наукам (Будапешт, 1980), первом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), 5-м Всесоюзном съезде фармакологов (Ереван, 1982), II республиканской конференции, посвященной физико-химической биологии (Ереван, 1986), Всесоюзной конференции по нейронаукам, посвященной 100-чле-тию со дня рождения академика АН ЗССР Д.С .Воронцова (Киев, 1986), II Всесоюзном симпозиуме "Мембранная энзимология и проницаемость мембран (Ереван, 1986), III симпозиуме СССР-ФЕГ "Возбудимые мембраны" (Киев, 1987), заседании нейрофизиологов института психиатрии им. Какс-Планка (Мюнхен, 1988), заседании нейрофизиологов Дюссельдорфского университета (Дюссельдорф, 1988), Международном симпозиуме "Транспорт ионов и механизмы его регуляции (Тбилиси, 1989).

Структура и объем работы. Диссертация ооотоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав результатов в обсуждений, выводов и списка литературы.

Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста и включает 89 рисунков и 2 таблицы. Список литературы содержит 369 источников (22 отечественных и 247 иностранных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыта проводились на изолированной центральной нервной скотома, целостных и внутриклеточно-даализнруемшс нейронах правого паря этальяого ганглия виноградной улитки Helix pomatia , на гигантских аксонах кальмара и на овечьих сердечных волокнах Пурошье.

Изолированную центральную нервную систему улитка получали путем выделения из тела улитки ганглиев вместе с ооеданящиыи их коллективами и помещали в фззиологичеокий раствор Рингера. Ганглии предназначенные для изотопных измерений и пламенной фотометрии взвешивались и помещались в соответствующие инкубационные среды. Ганглии же предназначенные для электрофазиологических исследований, переносились в специальную камеру, где фиксировались с помощью электролитически заточенных-вольфрамовых игл. В зависимости от задачи готовили два типа препарата: нейроны в ооставо ганглия и полностью изолированные нейроны. В первом случае дня облегчения введения микроэлектродов в нейрон о поверхности ганглий удалялась соединительнотканная оболочка. Изоляция нейронов проводилась по методике Коотенко и др. (Koatenko at al., 1974) о некоторыми модификациями, применительно в нагни объектам, комбинируя ферментативную обработку с механическая приемам! дезагрегации.

Гигантские аксона дааиетром 400-700 лаш были подучены из кальмара Doryteuthis bleaker! . Метод внутриклеточной перфузии был аналогичен метода- Бекера и др. С Baker at al., 1962 ) с мода-фикащяш Кукитн (Kukita, 1S82 ).

Овечьи сердечные волокна Пуркинье доставлялись в лабораторию с соседней скотобойни в холодном растворе Тироде, насыщенном кар-богеном (95$ Og + 5% СО^).

Исходный физиологический раствор имел следувдий состав (в !.м/л): NaCl - 80, KCl - 4, СаС12 - 7, UgCl2 - 13, Трис-HCI (рН-7,8) - 10, глюкоза - 10. Во время экспериментов по изучению К-то-ков дуализированного нейрона ионы Па+ в наружном раотворе заменялась на экшколяряоэ количество ионов Tpsc+, внутренний раствор тлел состав: кг - 100, Трис-HCI (рй-7,4) - 20, глюкоза * 10. При исследовании На-токов ионы к+ в наружном и внутреннем растворах заменялись на ионы Трис+. Состав растворов при исследовании кальциевых токов мембраны был: внешний: СаС12 - 10, Mgci2 - 5, Трис-HCI (iH—7,0) - 75, ТЭА Br - 30, глюкоза - 10: внутренний: Hgci2-3, Трис-аспартат (]Я-8,2) -110, АТФ - 3, цМ» - 0,1, теофилин -2, ЗГТА - 10. Осмотический градиент на мембране создавался добав-

лением сахарозы'Сот 0 до 260 Ш) в соответствующий нарушый раствор.

Состав контрольного изотонического наружного раствора гигантского аксона кальмара был следующим: HaCi - 517, KCl - 5, сас1г -50, Na-XSUEC - 12,7 (jH-8,0). Раствор с низкой концентрацией натрия готовился заменой 300 Ш NaCi на 500 Ш глюкозы. Внутренний изотонический раствор имел состав: к? - 100, Ка-ХЕПЕС - 12 (pH -8,0), глюкоза - 888. Гипертонический и гипотонический внутренний и наружный растворы готовили добавлением или удалением 500 Ш глюкозы из соответствующих изотонических растворов.

Основным раствором при исследовании овечьих сердечных волокон Пуркинье служил раствор Тироде: Haci - 137, KCl - 5,4, caci2 -1,8, HgCl2 - 1,05, ГЛЮКОза - 5, ИаНС03 - 11,9, НаН2Р04 - 0,42. Тоничность окружающей волокна среды повышали добавлением сахарозы (от 0 до 300 Ш) в нормальный раствор Тироде.

Для регистрации изменения объема, нейроны после их изоляции переносились в специальную камеру объемом 0,03-0,05 мл (рис. I).

Рис.1. Блок-схема установки для непрерывной регистрации изменения объема изолированного нейрона улитки. I - источник света, 2 - конденсор, 3 - нейрон, 4 -перфузионная камера, 5 - система линз для увеличения нейрона, 6 -фотоэлектронный умножитель, 7 -осциллограф, 8 - самопишущий потенциометр, 9 - колба с физиологическим раствором.

В основе этой методики лежит изменение количества световых лучей проходящих через нейрон, как функция изменений его размеров,

Изменения количества световых лучей, обусловленные изменением размеров клетка; улавливаются фотоэлектронным ушсшителем, выход которого соединен с записывающими устройствами.

Внутриклеточная концентрация ионов натрия в нейронах определялась на пламенном фотометре, после выдерживания изолированных ганглиев в соответствующих средах.

В работе использовалась общепринятая стандартная методика фиксации напряжения на мембране интактного и дуализированного нейрона, гигантского аксона кальмара к овечьих сердечных волокон Пур-кинье, блок-схема которой показана на рис. 2.

Рис.2. Блок-схема установки для внутриклеточного отведения электрической активности нейронов (при открытом положении ключа) и фиксации напряжения на мембране (при закрытом положении ключа). Мх - входное устройство для регистрации мембранного потенциала, М2 - усилитель сравнения для фиксации потенциала на мембране, М3 - измеритель для регистрации ионного тока мембраны. I - двух-коордгшатяый самопишущий потенциометр для построения вольт-амперных характеристик мембраны, 2, 3 - двухлучевые осциллографы для визуального наблюдения и регистрации электричеокой активности, 4,5- электронные самопишущие потенциометры для регистрации мембранного потенциала и ионных токов.

Схема созволяет регистрировать мембранный потенциал, импульсную активность, поляризовать мембрану, измерять ее сопротивление,

контролировать температуру омыващего ганглии раствора, фиксировать мембранный потенциал на любом исследуемом уровне и инъецировать ионы внутрь НЭГфОЕОВ.

Для исследования трансмембранных ионных токов диализируемых нейронов, использовался метод разработанный Костюком и сотрудниками (Koetyuk et al., 1975 ).

Для инъекции ионов натрия в нейрон два шкроэлектрода, один заполненный 3 ы Baca, a другой - 3 и KCl были независимо введены в нейрон. Количество инъедарованного натрия-рассчитывали по следующей формуле.

я xt

q " 96500«z

где q - количество инъецированных ионов натрия, % - валентность инъедарованного иона,, I - пропускаемый через шкроэлектрода ток, t - время.

Для исследования зависимости активного выхода 22на из нейронов от осмотического давления среда ганглии удалялись из животного z оставлялись в нормальной раствора Рингера приблизительно на I час. После взвешивания ганглии распределялись в группы (5 ганглий в каадой группе) и итерировались в бескалиевом холодаом (5^) растворе Рингера, содержащем 22На J Ганглии оставались в стом растворе в течение различного периода времени от 15 мин до 6 часов. Затем после промывки радиоактивности с наружной поверхности ганглиев их переносили в пробирки с кашй-содержащиы раствором при температуре 22°С с целью накопления радиоактивности и подсчета. Радиоактивность' подсчатывалась на rama спектрометре. После подсчета радиоактивности рассчитывали константы скорости активного выхода 22Ыа из клеток.

. Для исследования процесса связывания %-оуабаина с мембраной ганглии инкубировали при 20-£2°С в растворах о различной тонич-ностью, содержащих 2,5 кюри меченого %-оуабаина плюс необходимое количество нерадаоактивного оуабаина, чтобы получить желаемую его концентрацию. Связывание измеряли после 1-2 часовой инкубации ганглиев в %-оуабаин-содеркащем растворе. Радиоактивность подсчитали на жидком сдантшшлионном счетчика SL -4221 (iatertechni-que, Prance ) по программе предусматривающей расчет абсолютной радиоактивности в пробах по методу внешней стандартизации и проведения машинной обработки полученных данных, %-оуабаин поставлялся фирмой Амершам < Aaershea Radiochemical Centre ).

Внутриклеточная концентрация ионов натрия в овечьих сердечных

волокнах Пуркинье была измерена с' помощью Яа-чувствительных внутриклеточных шкроэлектродов на основе жидкого натриевого ионофо-ра (Fluka, Neu Ulm, FRO ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Изменение объема нейрона в изотонической и анизотоничэской

среде

Известно, что клеточные мембраны высоко проницаемы для воды. По этой причине живые клетки ведут себя как осмометры: в гипертонической среде теряя воду уменьшаются в размерах, а в гипотонической среде, наоборот, поглощая воду набухают (Иост, 1975; ноиае, 1974 ). Это пассивное движение воды через плазматическую мембрану является следствием нарушения осмотического равновесия. Различают два типа регуляции клеточного объема: I) регуляция объема в изотонической среде и 2) регуляция объема в анизотонической среде. Однако в обеих случаях причиной возникновения изменения объема клетки является нарушение осмотического равновесия между внутренней и наружной средой клетки.

В начальном этапе наших исследований наш было исследовано изменение клеточного объема в изотонической среде. Было показано, что электрогенный натриевый насос является одним из основных механизмов, регулирующие клеточный объем. Активация насооа приводила к сморщиванию клетки, а ингиблрование, независимо от его способа (уменьшение температуры среды, удаление ишов калия из внеклеточного раствора, использование сердечных глшеозздов в концентрациях полностью подавляюща работу насоса) - к набуханию клетки. На pic. 3 показано изменение объема 2-х изолированных нейронов, имеющих разные размеры, после их переноса из нормального раствора Рингера в Ю-4 M оуабшш-содеряащий раствор. У нижней кривой (нейрон с малыми размерами) слева и справа изображены фотоснимки нейрона в нормальном растворе Рингера до действия оуабаина и после одночасового пребывания нейрона в оуабаин-содержащем растворе а стабилизации объема. Из рисунка видао, что объем нейрона в оуаба-ш-содержадем растворе может увеличиваться в 2-3 раза в зависимости от размеров нейрона. Это соответствует изменению радиуса нейрона на 25-455?, что является вполне приемлемым, еоли учитывать, что нейроны моллюсков имеют мембрану с очень высокой степенью складчатости. В дальнейшем о помощью методики, позволяющей проследить за данашкой изменения объема клетки (]жс. 1) нам удалось показать, что объем кл^тда изменяется не непрерывно, а ступенчато.

X

X 6 »

I

? 5

X

ш Л ш О

-I.

_1_и

_1_1

10 20 30 40 50 60 70 во 90 ВРЕМЯ (мин)

Рио.З. Изменение клеточного объема для двух нейронов после их переноса из нормального раствора Рингера в оуабаин-содержащий раствор в концентрации ОД Ш. Нижний график: слева: фотография нейрона в нормальном растворе Рингера. Справа: фотография нейрона поела стабилизации в оуабаин-содержащем растворе.

Рис.4. Ступенчатое изменение объема изолированного нейрона в растворах с различной тоничностью. Цифры между стрелками обозначают концентрацию сахарозы в ммоль/л в физиологическом растворе. 63 - изотонический раствор (Р=1), 252 - гипертонический раствор (Р=2), 0 - гипотонический раствор (Р=0,75).

Ступенчатый характер изменения объема изолированного нейрона в растворах с различной тоничностью показан на рис. 4. Аналогичная картина наблюдалась при активации и инактивации натриевого насоса. Ступенчатый характер изменения объема сохранялся как при сморщивании клетки, так и при ее набухании. Каждая ступень изменения объе-

ма примерно соответствовала изменению диаметра нейрона на 3-5 мкм. При шогократном изменении тошгчности среда ступенчатость постепенно сглаживалась. Ступенчатое изменение объема клетки, по-видимому, можно объяснять складчатостью мембраны, которая выпрямляется при набухании и складывается при сморщивании. Возможно каждая ступень соответствует открытию или закрытию одной или нескольких складок, выпрямляющихся или складывающихся одновременно, соответственно при набухании или сморщивании клетки. В пользу такого предположения свидетельствует и различный размер ступеней, они различаются в несколько раз. Если допустить, что указанная ступенчатость обусловлена наличием в цитоскелете шозиноподобных белков, структуры которых при набухании клеток нарушаются ступенчатым образом, то трудно объяснять сморщивание ступенчатым восстановлением этих же белков. Об этом свидетельствует и тот факт, что значения отдельных ступеней заметным образом не зависят от наружной концентрации кальция, хотя при ее увеличении изменение объема клетки существенно замедляется под действием тоничности среды, то есть увеличивается продолжительность каздой ступени.

Здесь после того, как нами было установлено, что электрогенный натриевый насос является одним из основных механизмов регулирующих клеточный объем и что объем клеток изменяется не непрерывно, а ступенчато, нам предстояло делать выбор: либо продолжать углублять исследования по выяснению других механизмов (особенно оуабаин-независимых) , участвующих в регуляции клеточного объема и выяснить природу ступенчатого изменения объема, либо пойти по другому пути: а именно, выяснить функциональное значение изменения объема клетки и исследовать каким образом изменение объема отражается на основных функциях мембраны - ферментативных, транспортных, канальных и т.д. Выбор был остановлен на втором пути, хотя первый не менее интересен .

Первый вопрос за решение которого мы взялись, это исследование зависимости активности работы Na.K-яасоса от изменения объема клетки. Данные в литературе относительно этого вопроса противоречивы. В одних работах было показано, что при уменьшении объема клетки активность работы натриевого насоса увеличивается (Keynes, 1965 ), в других - уменьшается (Venosa, 1978 ), а в третьих не было обнаружено какой-либо закономерной связи между активностью работы натриевого насоса и изменением объема клетки ( Mullins & Avad, 1965 ). При тщательном анализе этих данных мы обнаружили, что в этих работах уровень внутриклеточной концентрации ратрия был

различным. Например в работе Кейнеса (Кеупев, 1965) мышпу имели низкое содержание натрия, в то время как данные Ванозы ( venosa, 197в) получены при высоком содержании натрия в мышцах. Так как существует пропорциональная зависимость между изменением внутриклеточной концентрации Натрия и активностью электрогенного натриевого насоса (при не очень высоких внутриклеточных концентрациях натрия), то мы столкнулись со значительны»«! труда остьями при объяснении активации натриевого насоса в гипотонических растворах. Ведь ясно, что если в гипертонических растворах внутриклеточная концентрация натрия увеличивается, что приводит к активации насоса, то обратный процесс в гипотонических растворах - уменьшение внутриклеточной концентрации натрия - должен привести к уменьшению активности наоооа. Однако, чем го объяснить активадаю работы насоса в гапотоничеоких растворах? Естественно было предполагать о существовании второго механизма (или фактора) регуляции активности натриевого насоса, который приводит к изменению активности работы натриевого насоса в обратном направлении, чем направление обусловленное изменением внутриклеточной концентрации натрия. Мы предполагали, что в роли такого фактора может выступить число функцаонн-руицих На.к-АТФаадых молекул мембраны, которые являются рабочими молекулами На,к-наоооа (наоошые единицы). Исхода из всего оказанного наш была высказана следующая гипотеза: при изменении объема в клетке одновременно разшваотся два процесса, от которых зависит активность злектрогеннаго натриевого насоса: изменение внутриклеточной концентрации натрия к изменение числа фунгарюнирупдос Не,к -АТФазнюс молекул мембраны. Однако при изменении объема клетки независимо от направления изменения оба эти процесса развиваются в противоположных направлениях и противоположным образом вла-яют-на активность злектрогенного натриевого насоса. Бели первый увеличивается и приводит к повышению активности наоооа, то второй непременно уменьшается и щяводат к понижению активности, и наоборот. Поэтому суммарное изменение активности наоооа будет зашоеть от соотношения изменений обусловленные этнш двумя фактораш.

Для подтверждения навей хипотезы нам следовало выяснить следующие вопросы: I) при изменении объема клетки происходит ли изменение числа функционирующих Иа,к-АТФазных молекул мембраны, 2) изменением уровня внутриклеточной концентрации натрия можно ли добиться того, чтобы зависимость активности работы На.к-яаооса от объема клетки изменяла свое направление ж 3) ори уменьшении или увеличении объема клетки в талер- или пшотоничеоких растворах

всегда ли происходит соответственное увеличение или уменьшение внутриклеточной концентрации натрия или в некоторых случаях могут произойти обратные к ожидаемым изменения, то есть уменьшение концентрации в гапертонических растворах и увеличение в гипотонических растворах, что может стать причиной уменьшения активности работы натриевого насоса в гипертонических растворах или увеличения активности в гипотонических растворах.

2. Изменение числа функционирующих На.к-ЛЗФазных молекул мембраны

Для того чтобы выяснить зависит ли число функдаоаирущих на,к-ЛТФазных молекул мембраны от изменения объема и площади поверхности клетки, было исследовано связывание %-оуабаина с мембранаш клеток в растворах с различной тоничностьо. На рве. 5 показаны результаты этих экспериментов.

.0«

«f

10е

ю»

2 «

а>

иг" кг'

10Г* Г7 Ю"6 [У«8«нн] (М)

КГ'

Рис.5. Зависимость связывания %-оуабаина с мембранами нейронов от концентрации оуабаина в среде, в растворах о различной тшичностьв. Связывание бшю измере-пооле 2-х часовой инкубации нейронов в %-оу-абаин-содержащем растворе при 22°С. (О) - в тапотоническом растворе, который содержал только половину концентрации натрия (4Q кМ) нормального раствора Рингера без сахарозы №0,75). (О) - в изотоническом сахарозном растворе с 40 Ш натрия и 65 Ш сахарозы (Р=1). (#) -в гипертоническом растворе о 40 Ш натрия и 195 Ш сахарозы (Р=Г,5). Обе координаты логарифмические.

Из рисунка ясно вндао, что при всех кокдеятраадях оуабаина число связанных молекул оуабаина с мембранами в гипотонической среде больше, чем в изо- и гипертонической среде. Согласно данным

Бекаре в Виллиса (вакег & wiliia, 1972 ) каждая молекула оуабаина связывается с одной молекулой ка.к -АТФазы. Это означает, что число связанных (функционирующих) молекул Ыа,к -АТФазы в гипотонических растворах всегда больше, чем в изо- или гипертонических растворах. Бекер а Виллис обнаружили 2 формы связывания %-оуабаина в клетках Hela и срезах почки морской свинка; нелинейный К-чувстви-тельннй компонент, насыщающийся при низких концентрациях (Ю-6 М) оуабаина и линейный К-нечувствительный компонент, доминирующий ара высоких концентрациях оуабаина. По мнению Бекера и Виллиса К-не-чувствигельный компонент представляет собой не связывание оуабаина, а его проникновение внутрь клетки. В наших экспериментах мы получили 2 насыщаемых компонента связывания оуабаина - один щи концентрациях оуабаина между КГ10 и Ю-9 М, а другой - между Ю-9 и 1СГ' U. Выше 1СГ* М вплоть до I0""3 М кривые связывания представляют ообой прямые линии (линейные компоненты). В гипотоническом растворе увеличивались как насыщаемые, так и линейный компонент связывания. 2 насыщаемые компоненты были получены также в работе Г0ДЙ>еЙНД и Гизал-Бартш ( Godfraind & Ghyeel-Burton, 1977) на предсердиях морской свинки. Эти данные показывают, что в мембране могут существовать 2 участка связывания для оуабаина - с высоким и низким сродством. Возможно это 2 различных состояния (конформа-даи) одного к того, же рецептора или два типа рецептора оуабаина сосуществуют одновременно, вероятно локализованные ka различных глубинах мембраны. Наблюдения (не иллюстрирован), что высокие кон центрапци оуабаина инга&рут выход 2гя&, тогда как низкие концентрации активируют его ыаходятся в соответствии о предположение о существовании двух связывающих участков для оуабаина. Таким образе» пргуведочвнии обьеца и площади поверхности клетки в гипотс наческих растворах число функционирующих Na,к -АТФазных молекул мембрены также увеличивается, а при уменьшении объема и шйщада поверхности клетки в гипертонических растворах происходит обратш процесс -уменьшение, числа функционирующих на.к-АТФазных молеку: Изменение числа. Ка,К-£ГФазных молекул мембраны не зависело от т< г о каким' образом происходило изменение объема клетки и площади ni верхностй мембраны ¡ Как было отмечено выше при шгибировании Яа,1 насоса в бескалиевои растворе происходит набухание клетки и увел чаше площади поверхности мембраны. Значительное увеличение связ вания %-оуабаина (числа фунюдаонирующих На,к-АТФазных молекул) наблюдалось также в формальном изотоническом бескалиевом раствор по сравнению с нормальным к&лий-содержащим раствором Рингера. Ан

логичные данные были получены Бекером и Виллис ( Baker & «lilis, 1972) в клетках Hela и сердечных клетках Girardi. Они объясняли этот эффект ионов калия на связывание оуабаина влиянием исагрв калия на чувствительность насоса к оуабаину. Однако наш данные о набухании клеток в бескалиевых растворах в результате инактиващи чатриевого насоса ( Ayrapetyan & Suleymanian, 1979) В сочетании О данными об увеличении числа Зушщионирутачих Ыа,к-АТФазных молекул в гипотонических растворах, которые по существу являются рецепторами для оуабаина, позволяют наблюдаемое увеличение связывания оуабаина в бескалиевых растворах рассматривать как результат увеличения числа функционирующих Иа,К-АТФазных молекул мембраны при набухании клеток в бескалиевых растворах.

3. Зависимость активного выхода 22На от тоничности окружающей клетку среды и внутриклеточной концентрации натрия

Для исследования зависимости активного выхода 22На от тоничности окружающей среды и внутриклеточной концентрации натрия ганглии инкубировали в холодном (5°С) бескалиевом растворе Рингера в течение разного периода времени от 15 мин до 6 часов. После 15 мин промывания в холодных бескалиевых растворах, несодеркавдх 22На, и с тоничностями равными тоничностям растворов, где впоследствии накапливали радиоактивность, ганглии переносили в калий-содержащий раствор при 22°С без изменения тоничностей и накашивали радиоактивность для измерения.

На рис. 6 показана зависимость констант скоростей выхода 22ыа из нейронов от времени в растворах с различной тоничностью. Из рисунка видно, что константы скоростей выхода 22На из нейронов в гипертонических растворах больше, чем константы скоростей в гипотонических растворах (по крайней мере в первые 10 мин) для нейронов, период инкубации которых составлял меньше 4 часов (кривые А-Д на рис. 6). Однако для нейронов, инкубационное время которых составляло 6 часов, константы скоростей выхода 22на в гипотонических растворах были больше, чем в гипертонических растворах (кривые Е на рис. 6). Этот переход более наглядно иллюстрирован на рис. 7, где показана зависимость констант скоростей выхода 22На из нейронов, определенные в начале эксперимента (в начальный период накопления радиоактивности) от тоничности окружающей среды. Интересно отметить, что кривые, показывающие зависимость констант окоростей от времени в растворах с различной тоничностью по мере увеличения . времени инкубации, становятся более близкими друг к другу. То есть

г

I

Ь'Г

I,

а

Г

Рис.6. Зависимость константы скорости выхода 22На из нейронов от времени в растворах с различной тсйичностью. Измерения выхода 22на из нейронов производили после 0,25; 0,5; I; 2; 4 и.6 часовой инкубации (А, Б, В, Г, Д и Е соответственно) нейронов в холодной (543) бескалиевом растворе содержащем 22Ка. О-в гипертоническом растворе (Р=2): Э - в изотоническом растворе (Р=1):# - в гипотоническом растворе (Р=0,75).

Рис.7. Зависимость начальной константы скорости выхода 22яа из нейронов от тотписли окружающей среды для клеток инкубированных в холодном (5%) бескалиевом растворе содержащем 22Ка в течение различного периода времени от 15 мин до 6 часов (сверку вниз: 0,25; 0,5; I; 2; 4 и 6 часов).

О Я 1Я 189 Концвнтрвция сахарозы [нМ)

складывается такое впечатление, что по мере увеличения времени инкубации происходит как-бы постепенный переход от активации к инактивации работы натриевого насоса в гипертонических растворах, по сравнению с гипотоническими: растворами. Это явление хорошо видно на рис. 6 и 7. Из рис. 7 видно, что наклон кривых падает сверху вниз по мере увеличения времени инкубации нейронов в холодном бескалиевом растворе,. Кроме того необходимо отметить также, что абсолютное значите констант скоростей уменьшается по мере увеличения времени инкубации. Таким образом эти данные показывают, что мы можем получить активацию или инакгиващш натриевого насоса в ответ на увеличение тоничности окружающей среды в зависимости от времени инкубации в холодном бесвалиевом растворе. Одаако хорошо известно, что в холодном бескалиевом растворе натриевый насос ингибируется и нейроны начинают аккумулировать натрий. Следовательно, чем больше будет время инкубации в холодном бескалиевом растворе, тем больше будет и уровень внутриклеточной концентрации натрия. Это свидетельствует о том, что в зависимости активности натриевого насоса от тоничности окружающей среда решающую роль играет уровень внутриклеточной концентрации натрия.

Зги данные были подтверждены также электрофлзиологяческюла исследования!® с инъекцией ионов натрия внутрь клетки Известно, что На,к-насос является насыщаемой функцией от внутриклеточной концентрации натрия и щи очень высоких его концентрациях кривая зависимости активности натриевого насоса от внутриклеточной концентрации натрия переходит в область насыщения и перестает зависеть от изменения концентрации натрия внутри клетки ( Kostyvüc et al., 1972). Этот вопрос детально был исследован наш с помощью внутриклеточной ионофоретической инъекции ионов натрия и регистрации величины гаперполяразации, обусловленной активацией натриевого насоса (рис. 8). Как видно из рисунка при увеличении количества инъецированного натрия гиперполяризация мембраны сначала линейно увеличивается, а затем насыщается и перестает зависеть от количества инъецированного натрия. Об этом свидетельствует и тот факт, что после насыщения прекращение инъекции натрия не вызывает уменьшение амплитуды насос-вызваяной гиперполяризации мембраны в первые 1-2 мин после прекращения инъекции (pic. 8д), несмотря на уменьшение внутриклеточной концентрации натрия, обусловленное работой насоса. Только после начального периода постоянства, когда кривая выходат из зоны насыщения, гиперполяризация начинает уменьшаться. Это также видно из формы кривых. Если посмотреть сверху вниз на рис. 8,

по направлению которого постепенно увеличивается количество инъецированного натрия, задержка уменьшения величины гиперполяризации □осле прекращения инъеквди увеличивается.

-«лВ

6_

-UmB г—

Рис.8. Зависимость гиперполкриза-даи мембраны, вызванная активацией электрогенного натриевого насоса, от количества инъецированных ионов натрия внутрь клетки в гипотоническом растворе. Время инъекции составляли I; 2; 3; 4 и 5 мин от "а" до "д" соответственно. Слева от кривых указаны величины мембранного потенциала до инъекции. Самопишущий потенциометр был выключен во время инъекции и включен (указано стрелкой) после завершения инъекции.

Пооле определения насыщающей концентрации ионов натрия мы исследовали зависимость типерполяризации мембраны, обусловленной активацией злектрогенного натриевого насоса, от тоничности окружающей среды при низких ненасыщающих и высоких насыщающих внутриклеточных концентрациях натрия. На рио. 9 доказана зависимость пшер-поляризации мембраны, обусловленная активацией насоса, от уровня внутриклеточной концентрации натрия в гало- и гипертоническом растворах. При инъекции 0,062 нЫ натрия шутрь клетки, которая намного ниже насыщающей концентрации, таперполяризагоая мембраны в гипертоническом растворе, содержащем 189 Ш сахарозы, была больше (кривая "в"), чем в гипотоническом растворе (кривая "а"). Однако, цри инъекции 0,37 яЫ натрия, которая находится в области насыщения, активность работы натриевого насоса (вызванная активацией насоса гапертодкризацЕЯ мембраны), наоборот, быта больше в гипотоническом растворе (кривая "6м), чем в гипертоническом растворе (крв-вая/"г"). Конечно увеличение таперполяризацин мембраны при перехо-

ц

де с гипертонического раствора в гипотонический и наоборот может быть следствием также увеличения сопротивления мембраны. Однако специальные исследования показали, что увеличение сопротивления мембраны имеет какой-то вклад в увеличении насос-вызванной гиперполяризации мембраны только при переходе с гипотонического в гипертонический раствор. При обратной замене растворов с гипертонического в гипотонический сопротивление мембраны, наоборот, уменьшается, что может привести только к уменьшению ишерполяризации.

-51мВ

Рис.9. Вызванная активацией электрогенного натриевого насоса гиперполяризация мембраны в гипо- и гипертоническом растворах, "а" и "б" - в гипотоническом растворе; "в" и "г" - в гипертоническом растворе; "а" и "в" - при инъекции 0,062 нМ натрия внутрь клетки, что намного ниже насыщавдей концентрации; "б" и "г" - при инъекции 0,37 нМ натрия, когда механизм активного транспорта натрия был насыщен ионами натрия. Слева от кривых цифры показывают мембранный потенциал до инъекции. Стрелки указывают моменты включения самопишущего потенциометра

4. Изменение внутриклеточной концентрации ионов натрия в овечьих сердечных волокнах Пуркинье в гипертонических растворах

Для подтверждения нашей гипотезы очень важным является полное исключение других факторов, которые могут стать причиной разнохарактерной зависимости активнооти натриевого насоса от тоничности окружающей среды. Одним из таких возможных факторов может быть изменение внутриклеточной концентрации натрия в растворах о различ-

ной тоничаоста®. Вопрос заключается в следующем: всегда ли внутриклеточная концентрация натрия увеличивается в гипертонических растворах или в некоторых случаях могут выявляться какие-то компенсаторные механизмы, активирующиеся в гипертонических растворах, способные компенсировать, а в некоторых случаях.и обращать увеличение внутриклеточной концентрации натрия, обусловленное осмотическими процессами, и таким образом становиться причиной инактивации наооса в гипертонических растворах. По этой причине с помощью Na -чувствительных внутриклеточных микроэлектродов наш исследовалось изменение внутриклеточной концентрации натрия в овечьих сердечных волокнах Пуркшье в гипертонических растворах. Мы обнаружили, что увеличение тоничности окружающей среды от Р=3 до Р=2 непременно вызывает увеличение внутриклеточной концентрации натрия ( с*а). На рис. 10 показаны непрерывные кривые эффекта гипертонического раствора, содержащего 150 Ш сахарозы (Р=1,5), на мембранный потенциал, мембранный ток и с|а. Изменение мембранного потенциала в гипертонических растворах не имело какую-либо закономерность. Хотя в подавляащем большинстве экспериментов мы наблюдали гиперполяризадаю мембраны щи замене изотонического раствора на гипертонический, однако деполяризация и постоянство мембранного потенциала также имели место. Однако во всех случаях повышение осмотического давления среды вызывало увеличение , независимо от направления изменения мембранного потенциала. Это свидетельствует о том, что увеличение с^а не является следствием изменения мембранного потенциала, а обусловлено осмотическим уменьшением объема волокна. Это заключение подтверждается также экспериментами в условиях фиксации напряжения на мембране.

Таким образом при уменьшении объема в клетке одновременно развиваются два процесса противоположным образом влияющие на активность алектрогенного натриевого насоса - увеличение с*а активирующее насос и уменьшение числа функционирутацих На.к-АМазяых молекул мембраны ингибирующее насос. Аналогично - при увеличении объема клетки. Однако с|а является объемным фактором и поэтому изменяется проподарнально й3 (н - радиус клетки), а число Не,к -АТФ-азных молекул является фактором, зависящим от величины поверхности мембраны, и поэтому изменяется пропорционально в2. Из этого следует, что при низких ci , когда система активного транспорта еще далека от насыщения, изменение с£а всегда будет преобладать над изменением числа функционирующих гга,"-АГФазных молекул мембраны, поэтому в этой области изменения с^а электрогенный натриевый на-

сос должен активироваться при. уменьшении объема ктеткн в гипертонических растворах. При высоких уровнях когда происходит насыщение системы активного транспорта, насос перестает зависеть от изменения . В этих условиях решающим фактором становится число функционирущих На,К -АТФазных молекул мембраны, которое в гипертонических растворах меньше, чем в- гипотонических. Поэтому в этой области изменения активность электрогенного натриевого насоса в гипертонических растворах долина быть меньше, чем в гипотонических растворах. Именно этим - разным уровнем с|а - можно объяснять стимуляцию активного транспорта ионов натрия в гяпертоничеокнх растворах у одних авторов и ингибирование - у других.

Тир +150 сах Тир * ISO сак

Тир [ | Тир | 1 Тир

А

Ttv__/ГТТТХ.

Рис.Ю. Эффект гипертонического раствора содержащего 150 гМ сахарозы на мембранный потенциал, мембранный ток и Сда . В этом эксперименте раствор Тироде содержал 10,8 мМ калия. А - влияние гипертонического раствора на мембранный потенвдал (а) и с§а (б). Б - влияние гипертонического раствора на мембранный ток (а) и cjL (б) того же волокна в условиях фиксации напряжения на мембране. Стрелка показывает момент, когда токовый микроэлектрод выходил из волокна. Пунктирные с точкой линии представляют собой не реальные кривые, а только апроксимнровашше от руки кривые тока и ciL. "Тир" означает раствор Тироде, а "сах" означает сахарозу.

Гипотетическая схема изменения числа функционирующих на,к-АТФазаых молекул (насосных единиц) показана на рис. II.

Рио.П. Гипотетическая схема изменения числа фундционируодих На,к-АГФазных молекул (наоосных единиц или оуабаиновых рецепторов) мем-бранн щи изменении объема клзтяи. А - гипертонический раствор; Б - изотонический раствор; В - гипотонический раствор, э и V -площадь поверхности и объем клетки соответственно. & - представляет число функционирующих На,к -АГФазных молекул мембраны. Заполненные треугольники указывают участки мембраны где АГФазные молекулы функционируют. Полые треугольники указывают участки мембраны, где активные центры АГФазных молекул экранированы складчатостью мембраны и не функционируют. В процессе увеличения объема клетки в гипотонических растворах или.при ингибирозании натриевого насоса число функционирующих Яа,к-А1Фазных молекул увеличивается за счет нефунадиоаирующих.

Ща предположении об изменении числа функционирующих На,к-АСФааншс молекул мембраны мы опять же исходили от наличия высокой степени складчатости у мембран моллюсков. Идея следующая: вое молекулы Ва,к-АЕФазы ориентированы в мембране радиально, через вою ее толщу, о актишым центром для ионов натрия внутри клетки и для ионов калнянаружу. Для функционирования Яа,к-АТФазы в роли транс сортного механизма (иасооа) выкачивающим ионы натрия из клетки и аккумулирующим ионы калия снаружи необходимо, чтобы эти ионы имелз доступ к своим активным центрам. Очень возможно, что часть На,к-АТФазных молекул мембраны экранирована ее складчатостью. Следовательно все процессы, приводящие к увеличению окладчатооти мембраны

В

8,<8а< в, У4<У8* V,

П1<Па< ГЦ

(например уменьшение объема клетки в гипертонических растворах), должны привести к экранированию вое больших количеств Яа,к-АТФаз-ных молекул и их выключению из действия. Процессы приводящие к обратному явлению - уменьшению окладчатооти или выпрямлению мембраны (например увеличение объема в гипотонических растворах), наоборот, должны привести к деэкранированию Ыа.К-АГФазйых молекул и их вводу в действие.

Участки мембраны, где активные центры На,к -АГФазннх молекул экранированы складчатостью мембраны ионы натрия и калия не могут достичь своих активных центров и активировать их. Поэтому эти молекулы выключены из действия и находятся в резервном состоянии. А участки мембраны, где активные центры На,к-АГФазных молекул открыты ионы натрия и калия в состоянии активировать их. Поэтому эти молекулы находятся в функционирующем состоянии. В нормальном изотоническом растворе функционирует минимально необходимое число На.к-АМазных молекул для поддержания стационарного состояния клетки. Увеличение объема клетки при ее переноое с изотоничеокого раствора (Б) в гипотонический раствор (В) приводит к открытию новых На,к -АТФазных молекул, которые начиная функционировать увеличивают число функционирующих На,к-АТФазных молекул мембраны. Перенос клетки с изотонического раствора (Б) в гипертонический раствор (А) приводит к обратному процессу - уменьшению объема, увеличению складчатости мембраны и экранированию новых молекул, которые до переноса функционировали. Этот процесс приводит к уменьшению числа функционирующих На,к-АТФазных молекул в гипертонических растворах. При всех этих изменениях числа функционирующих На,к-АТФазных молекул в результате изменения объема и площади поверхности клетки общее число На.к-АТФазных молекул (функционирующих и нефункцнонируюцих) остается постоянным, изменяется только отношение функционирующих и нефункцяояиругацах молекул, в хипотонических растворах оно увеличивается, а в гипертоничеоких - уменьшается.

5. Эффект потока воды на трансмембранные ионные токи.

Ионные токи через нейрональную мембрану при выходящем потоке воды через нее

Целью настоящих исследований было выяснение аффекта выходящего потока вода на ионные токи штатного нейрона. На рис. 12 представлены семейства кривых трансмембранных ионных токов в отсутствие и присутствии выходящего потока воды через мембрану. Ив рисунка ясно видао, что выходящий поток воды почти не влиял на вход-

ящие токи, ко существенно увеличивал выходящие токи. После стабилизации объема нейрона в гипертоническом растворе пиковые значения входящих токов значительно меньше, чем в контроле и при наличии потока воды через мембрану, тогда как выходящие токи существенно не изменились относительно контроля.

Рис.12. Семейства кривых трансмембранных ионных токов нейрона улитки в нормальном физиологическом растворе СА), через 2 мин (Б) и через 25 мин (В) после замены нормального физиологического раствора гипертоническим раствором, содержащим 252 Ш сахарозы. В (Б) имел место выходящий поток воды через мембрану. В (А) и (В) поток воды отсутствовал, но в (В) объем нейрона значительно меньше, чем в (А). Потенциал фиксации -70 мВ, температура 220С. Калибровка 25 НА и 10 мс.

На рис. 13 представлено семейство кривых трансмембранных ионных токов в ответ на стандартный, прямоугольный деполяризующий импульс амплитудой +50 мВ н длительностью 75 мс. Это семейство кривых получено в условиях нормального изотонического раствора '(кривая I) и фазу после его замены гипертоническим раствором (кривые 2-5), то ^сть в условиях выходящего потока воды через мембрану. Ыожно заметить, что начиная с 30-й секунды после замены раствора калиевый ¡ток увеличивался несмотря на то, что амплитуда командного импульса сохранялась постоянной. Через 2,5 мин выходящий ток достиг своего максимального значения, а потом начал уменьшаться' (кривые 5-9). Такое уменьшение калиевого тока* продолжалось вплоть до 10-й минуты, то есть до стабилизации объема в растворах с 252 Ш сахарозы. Необходимо отметить, что кинетика калиевого тока также значительно изменилась, то есть процесс достижения пикового значения существенно ускорился. Зависимость пиковых значений калиевого тока от времени инкубации в гипертоническом растворе более четко видна на рис. 14. Из этого рисунка очевидно, что к 10-й мин инкубации ганглиев в гипертоническом растворе калиевый ток стабилизировался на постоянном уровне, который значительно ниже,, чем в 2*

Рис.13. Семейство кривых выходящего калиевого тока соответствующего тестирующему потенциалу длительностью 75 мс и амплитудой ПО ьВ (от -60 до +50 мВ). Кривая I - в нормальном изотоническом физиологическом растворе. Крике 2-9 - через 0,5; I; 2; 2,5; 3; 5; 6 и 10 мин после замены нормального изотонического раствора гипертоническим раствором, содержащим 252 М сахарозы. Потенциал фиксащш -60 мВ. Калибровка 40 нА и 10 мс.

нормальном изотоническом растворе. На этом рисунке также показано восстановление тока при возвращении нейрона в изотонический раствор после 10 мин инкубащщ в гипертоническом растворе.

6. Действие градиента осмотического давления через мембрану на ионные токи даализированного нейрона

Исследование влияния потока воды на трансмембранные ионные токи на интактных нейронах ограничено рядом факторов: невозможностью создания постоянного потока воды через мембрану в течение длительного времени, невозможностью создания входящего потока водя без изменения ионных градиентов, трудностью создания значительных градиентов осмотического давления, направленного внутрь клетки (гипотонического раствора). Кроме того во время работы на интактных .нейронах очень трудно разделить чисто эффект только потока води от эффекта изменения клеточного объема. Этих недостатков лишена мёто-

<

о

X

20

Рис.14. Изменение амплитуды калиевого тока со временем по мере пребывания нейрона в тапертоничеоком растворе (тот же нейрон, что и на рис.13). О - по данным представленным на рис.13. О - данные не представлены на рис .13.

дика внутриклеточной перфузии или диализа изолированного нейрона.

Выходящий поток воды создаваемый увеличением осмотического давления наружной среда, вызывал увеличение амплитуды выходящего калиевого тока до некоторого уровня, который в отличие от калиевого тока на интактных нейронах оставался постоянным в течение длительного времени (рис. 15). Входящий поток воды создаваемый уменьшением осмотического давления наружной среды, наоборот, вызывал уменьшение амплитуды калиевого тока (рис. 15Г). Это уменьшение было обратимо, если поток воды поддерживался не более 5-10 мин. Поддержание входящего потока воды в течение более длительного времени приводило к резкому ухудшению состояния мембраны и в конечном счете к ее гибели. Мы исследовали также эффект градиента осмотического давления на "быстрый" калиевый ток. Эксперименты показали, что "быстрый" калиевый ток зависит от выходящего потока воды так же, как и задержанный.

На рис. 16 показано семейство кривых натриевого тока, полученных при максимальной проводимости мембраны для ионов натрия при различных концентрациях сахарозы в наружном растворе. Как видно из

А

Б

Рис.15. Действие градиента осмотического давленая на выходящий калиевый ток. А - семейство калиевых токов в нормальном изотоническом наружном растворе. Б,В - в гипертонических растворах, содержащих 130 и 260 Ж сахарозы соответственно. Г - в гипотоническом наружном растворе, содержащем на 65 Ш Трио-НС1 меньше изотонического. Потенциал фиксации -60 мВ. Тестируйте потенциалы от -30 до +50 ыВ с шагом 10 мВ.

рисунка, по мере увеличения градиента осмотического давления на мембране происходило уменьшение амплитуды натриевого тока и замедление его кинетики. На рве. 16Б приведена зависимость амплитуды натриевого тока от концентрации сахарозы в наружной среде, из которой видно, что зависимость линейная. Существует также линейная зависимость между постоянны!® времени активации ^ а инактивации и градиентом осмотического давления среды. Замедление кинетики активации и инактивации практически происходит одинаково.

Исследования показали, что вышеупомянутые изменения пиковых значений натриевого тока в растворах с различное тоничностью в равной степени имеют место и при любых уровнях теотирувдего потенциала в не зашеят от уровня деполяризации. Порог активации натриевого тока л положение максимума проводимости- ыембрени относитель-

А

Б

65 130 195 260 L I I I

[сахароза],мМ

Рис.16. Действие градиента осмотического давления на входящий натриевый ток. А - пиковый натриевый ток в растворах с различной то-ничностыэ. Цифры возле кривых соответствуют следующим концентрациям сахарозы в наружном растворе (в Ш) : 1 - 0; 2 - 65; 3 - 130; 4 - 195; 5 - 260. Б - относительное изменение амплитуды натриевого тока в зависимости от концентрации сахарозы в наружном растворе (п=5 ). По оси ординат отложены 1сЛо» где 1о - амплитуда натриевого тока в изотоническом растворе, 1С - амплитуда натриевого тока в растворах с соответствующей концентрацией сахарозы.

но оси напряжения для ионов натрия в гипертоническом растворе остались прежними, изменились только амплитуда и кинетика токов.

При наличии выходящего потока воды через мембрану, поведение-кальциевого тока было схоясе с поведением натриевого тока, уменьшалась его амплитуда и замедлялась его кинетика (рис. 17). Добавление 130 tivl сахарозы в наружный раствор не приводило ни к изменению порога активации кальидевых токов, ни к сдвигу максимума проводимости мембраны душ ионов кальция относительно оси напряжения.

По сравнению с натриевыми токами кальциевый ток оказался более чувствителен к градиенту осмотического давления. Увеличение тонич-ности наружной среды в 1,5 раза привело к уменьшению амплитуды кальциевого тока в 1,5-2 раза. Дальнейшее увеличение осмотичкости наружного раствора в 2 раза привело к еще большему падению амплитуды, однако в этом случае восстановление после отмывки сахарозы было неполным. Добавление 130 ыМ сахарозы в наружный раствор привело к увеличению постоянной времени активации "£т в 1,6-1,8 раза и постоянной времени инактивации в 1,2-1,4 раза.

Рис.17. Действие градиента осмотического давления на кальциевые тоет мембраны нейрона. А - в изотоническом раствора. Б - в растворе содержащей 130 Ш сахарозы. Потенциал фиксации -60 мВ. Цифры рядом о кривит токов обозначает теотириухщий потенциал.

Эффект потока вода на ионные тока мембраны ясно можно наблюдать на перфузированном аксоне. При нормальных наружных концентрациях натри (517 tái) входянгий поток воды вызывал уменьшение калиевого тока без существенного изменения натриевого входящего тока. Эти данные совпадают о двннши, полученными Кукита и Ямагаии (кита & Yeaagishi, 1983 ). При сниженной до 217 Ш наружной концентрации натрия результаты для входящих токов были совсем иные, чем при нормальной наружной концентрации натрш. В этих условиях пиковые значения входящих натриевых токов при наличии выходящего потока вода были меньше, чем в его отсутствие.

Возможны 5 механизмов, с помощью которых поток воды через мембрану может воздействовать на мембранные токи. Эти механизмы следующие: сам поток воды, изменение числа функционирующих ионных каналов мембраны, изменение внутриклеточных концентраций ионов , изменение локальных концентраций ионов у внутренних и наружных устьев ионных каналов и выпрямление ионных каналов подобно гидродинамическим процессам. Второй и третий механизмы* в основном справед-

29

давы для целых нейронов.

Очевидно, чзо щи помещении нейрона в гипертонический раствор первым начинает действовать выходящий поток воды. Затем по мере потери воды из клетки и уменьшения ее объема и площади поверхности мембраны начинают действовать два других механизма, которые влияют на калиевый ток противоположным образом: уменьшение числа функционирующих калиевых каналов, приводящее к уменьшению калиевого тока и увеличение внутриклеточной концентрации калия, приводящее к увеличению калиевого тока. Увеличение калиевого тока в начальной стадии после помещения нейрона в гипертонический раствор по всей вероятности и связано с выходящим потоком воды. Однако дальнейшая судьба калиевого тока ухе зависит от того изменение какого фактора является преобладающим. Если будет преобладать увеличение внутриклеточной концентрации калия, то мы получим увеличение калиевого тока, а если будет преобладать уменьшение числа функционирующих калиевых каналов, то мы получим уменьшение калиевого тока. В случае приведенном на рис. 12 определяющий вклад в изменение калиевого тока по-видимому вносило изменение внутриклеточной концентрации калия, а в- случае,- приведенном на рис. 13 - изменение числа функционирующих калиевых каналов. Поэтому в последнем случае вслед за первоначальным увеличением калиевого тока, связанного с выходящим потоком воды, последовало постепенное его уменьшение, и через 10 мин пребывания в гипертоническом растворе калиевый ток стал заметно меньше его исходного уровня в изотоническом растворе (рис. 13 и 14). Возвращение нейрона в изотонический раствор вызывало увеличение объема и площади поверхности клетки, что приводило к разглаживанию складок мембраны, увеличению числа функционирующих калиевых каналов и восстановлению исходной амплитуды калиевого тока (рис. 14). В том случае когда преобладающим стало увеличение внутриклеточной концентрации калия уже трудно судить об изменении числа функционирующих калиевых каналов, так как оно (изменение) остается замаскированным более сильным изменением внутриклеточной концентрации калия.

Более запутанная картина наблюдается для натриевых токов. Дело ь том, что для натриевых токов действие изменения всех трех факторов в гипертоническом растворе - выходящий поток воды, увеличение внутриклеточной концентрации натрия и уменьшение числа функционирующих натриевых каналов - одноналравленно и все они уменьшают натриевый ток. Поэтому очень трудно учитывать вклад каждого из них в уменьление натриевых токов в гипертонических растворах. Через 2

мин после начала инкубации нейрона в гипертоническом растворе изменение натриевого тока было выражено очень слабо (рис. 12), так что очень трудно было судить влияет ли сам выходящий поток воды на натриевый ток или нет. Однако через 25 мин пребывания нейрона в гипертоническом растворе, когда его объем стабилизировался и выходящий поток воды через мембрану отсутствовал, мы всегда наблюдали уменьшение пиковых значений входящего натриевого тока (рис. 12В). Учитывая то, что в гипертоническом растворе после стабилизации объема нейрона в^ существенно не изменился (не иллюстрирован) по сравнению о изотоническим раствором, можно смело предполагать, что основное уменьшение пиковых значений натриевого тока в гипертоническом растворе происходило за счет уменьшения числа функционирующих натриевых каналов. Таким образом при изменении объема клетки включаются в действие сразу несколько механизмов, эффект которых на трансмембранные ионные токи трудно идентифицировать при исследованиях на целых нейронах. Поэтому действие потока воды через мембрану на ее ионные токи мы изучали используя метод внутриклеточного диализа нейрона и аксона, позволяющий выделить эффект потока воды в чистом виде.

Эксперименты показали, что выходящий поток воды через мембрану увеличивает калиевый ток мембраны как дуализированного нейрона (рис. 15), так и перфузированного аксона (не иллюстрирован). Эффект выходящего потока воды через мембрану на выходящие калиевые токи Кукита а Ямагиши (Кик11;а & ХаиавЬвМ, 1983) объясняли накоплением ионов калия у внутренних устьев калиевых каналов и удалением накопленных у наружных устьев калиевых каналов ионов калия, в результате чего калиевые каналы становятся более чувствительными к ионам калия в наружном растворе.

Таким путем мы можем объяснять также уменьшающий эффект выходящего потока воды на входящие натриевые токи (рис. 16). Однако в этом случае выходящий поток вода имеет обратный эффект на чувствительность натриевых каналов. Накопление иснов натрия у внутренних устьев натриевых каналов и удаление накопленных у наружных устьев натриевых каналов ионов натрия делает натриевые каналы менее чувствительными к ионам натрия во внутреннем растворе. Поэтому изменение локальных концентраций ионов у устьев ионных каналов приводит к увеличению ионных токов мембраны, если ионные и осмотические градиенты имеют одинаковое направленна, и - уменьшению ионных токов, если они имеют обратное направление.

Зависимость натриевого тока от градиента осмотического давле-

ния на мембране нейронов сшнальных ганглиев крыс достаточно подробно изучалась в работах Крышталя и др., Чтамакова и Сорокиной (Крышталь и др., 1981; Чижыаков, Сорокина, 1986). Было показано, что выходящий поток вода уменьшает амплитуду натриевого тока и замедляет его кинетику. При этом проводимость одиночного канала не меняется. Общие закономерности, выявленные при исследовании зависимости натриевого тока от градиента осмотического давления на мембране нейронов опинашшх ганглиев крыс, справедливы и для нейронов улитки. Однако при исследовании влияния потока воды на натриевые токи на нейронах улитки были выявлены и некоторые особенности отличавшие нейроны моллюсков от нейронов млекопитающих. На сигнальных ганглиях крыс было показано (Чшшаков, Сорокина, 1986), что при создании выходящего потока воды постоянная времени активации натриевого тока "&т растет значительно быстрее, чем постоянная времени инактивалди , тогда как для нейронов улитки <ЬЕ и увеличиваются одинаково. Поэтому на нейронах улитки падение пиковых значений натриевых токов щи выходящем потоке воды нельзя объяснять разницей в изменениях и . Приходится предполагать о непосредственном взаимодействии между потоком воды и потоком ионов в натриевом канале. Хотя измерения проведенные на одиночных натриевых каналах нейронов опинальных ганглиев крыс (Осипчук, 1983) показали, что их проводимость не меняется под действием градиента осмотического давления на мембране, но по-видмязу здесь все зависит от индивидуальных свойств ионных каналов на различных объектах. Воли взаимодействие ионов со своим каналом (селективным центром) более сильное, чем с потоком воды, тогда по всей вероятности лимитирующим фактором является первое взаимодействие и в этом случае проводимость одиночного канала и следовательно общая проводимость могут не изменяться щи действии потока вода. А если преобладающим является взаимодействие ионов с водным потоком, тогда проводимость одиночного канала и общая проводимость для данного типа ионов могут изменяться при действии потока воды. Когда молекулы воды протекают через ионные каналы, в канале возможны два типа взаимодействия между молекулами воды и ионов. Первое - это взаимодействие между водным и ионным потоками в результате трения между ними. Молекулы воды при "столкновении" с ионами в канале будут передавать часть своей кинетической энергии (количества движения) ионам и таким путем будут способствовать или тормозить прохождение ионов через каналы. Второй тип взаимодействия имеет электрическую природу. Поток воды по существу представляет собой поток водных молекул.

которые являются диполями и обладают дипольным моментом. Когда молекулы воды протекают через ионные каналы они взаимодействуют электрически с ионами в канале. Эти два типа взаимодействия будут способствовать прохождению ионов через канал, если ионный и осмотический градиенты имеют одинаковое направление. Потому что в этом случае взаимодействия приведут к уменьшению времени' прохождения ионов через канал. Исходя из определения тока как числа зарядов, протекающее в единицу времени через сечение проводника, можно утверждать, что в результате потока воды через ионный канал в направлении градиента йотов эффективность каждого канала увеличится. В результате общий ионный ток через мембрану возрастет. Когда ионный и осмотический градиенты имеют противоположные направления, тогда поток воды тормозит прохождение ионов через канал и приводит к уменьшению ионного тока через мембрану.

Как и на входящий натриевый ток, выходящий поток воды имел сходное действие и на кальциевый ток. При выходящем потоке воды происходило сильное уменьшение амплитуды кальциевых токов и замедление его кинетики (рис. 17). Все механизмы, рассмотренные при обсуждении влияния выходящего потока воды на натриевые токи, справедливы и для кальциевых токов, хотя могут быть некоторые различия в отношении влияния потока воды на постоянные времени активации и инактивации кальциевого тока.

Таким образом данные полученные на интактных нейронах показыва-~ что при изменении объема и площади поверхности клетки число

кционирутацих белковых молекул мембраны, имеющих ферментативные (транспортные) и канальные свойства, изменяется. По-видимому такое изменение числа функционирующих белковых молекул мембраны при изменении объема и площади поверхности клетки носит универсальный характер, так как в нашей лаборатории было показано изменение числа функционирующих белковых молекул мембраны, имеющих реце ггорные свойства, при изменении объема и поверхности клетки в растворах с различной ТОНИЧНОСТЬЮ (Аугарегуап & Агтапоу, 1979; АугареЪуап,

7. Действие изменения объема клетки на В-А характеристики, возбудимость и проводимость мембраны. Ритеоводящая активность нейронов и "отрицательное" сопротивление мембраны

Одной,из задач в наших исследованиях было изучение влияния из-. Инёнения объема и площади поверхности клетки на "отрицательное" со-

1981)

противление (ОС) мембраны. Однако перед тем как приступить к исследованиям такого рода нам необходимо было выявить те механизмы, которые ответственны за возникновение ОС. Прежде всего необходимо было выяснить, какие процессы лежат в основе ОС - активные или пассивные, чтобы исходя из этого акцентировать внимание именно на зависимость этих процессов от изменения объема и поверхности клетки. Воктел и Вилсон (Wachtel & Wilson, 1973 ) исходя из своих экспериментальных данных заключили, что в клетке существует какой-то источник гиперполяризационного тока, по всей вероятности связанный с метаболизмом, то есть активной природы, который активируясь ги-перполяризащонными командами дает начало ОС на В-А характеристике мембраны. Гола ( Gola, 1976 ) предполагает, что возникновение ОС на В-А характеристике связано с проводимостью мембраны для ионов натрия и кальция,"то есть оно связано с пассивными процессами в клетке. Для выяснения этого вопроса мы сняли В-А характеристики мембраны в условиях, когда натриевый насос находится в активном сое-. тоянии и когда он ингибирован. Для ингибирования насоса мы использовали специфический блокатор Na,к -насоса - оуабаин в различных концентрациях и бескалиевый раствор (при 25°С и 5°С).

Во всех случаях ингибирование На,к-«acoca привело к подавлению ОС мембраны. Степень подавления зависала от степени интабиро-вания Na,к-насоса. Например при сравнительно низких концентрациях оуабаина (Ю~®-10*"^ М) подавление ОС мембраны не всегда было полным, что было обусловлено неполным ингибированием Na,к -насоса. Об этом свидетельствует тот факт, что увеличение концентрации оуабаина до 5'Ю-4 М, а в некоторых случаях и до Ю-3 М, всегда приводило к полному подавлению ОС мембраны.

На рис. 18 показано влияние 5 «Ю-4 М оуабаина на ОС мембраны. Как видно из рисунка в норме ОС присутствует как на восходящей, так и на нисходящей фазах В-А характеристики (рис. 18А,В,Д). При действии 5'Ю-4 М оуабаина (Б и Г) ОС на восходящей фазе В-А характеристики полностью исчезало обратимым образом, хотя видно, что на рис. 18Б источник, вызывающий ОС, через 3 мин после первого действия оуабаина еще не полностью блокирован, однако его мощность уже недостаточна, чтобы создавать ОС, он только отклоняет (задерживает) В-А характеристику от линейности. ОС на нисходящей фазе совсем не изменилось. Промывка нормальным раствором Рингера в течение 20 мин полностью восстанавливала ОС на восходящей фазе. Повторное действие оуабаина в той же концентрации через 3 мин полностью устраняло ОС и Б-А характеристик делало линейной (Г), не ос-

тавалось и "следа" о кааичии источника, вызывающего ОС. ОС на нисходящей фазе уменьшилось на 50£. После промывки через 25 мин ОС на восходящей фазе восстанавливалось полностью, а на нисходящей фазе - частично.

-9о А -го -во Б -го -90 8 -го

Рис .18. Подавление ОС мембраны нейрона ППа1 виноградаой улитки под действием 5-Ю-4 М оуабаина. В-А характеристики мембраны построены с помощью линейно-в^эраотаицего с мВ до -90 мВ, а затем линейно-падающего до исзеодаого уровня командных потенциалов (стрелка вниз - восходящая фаза;Тотрелка вверх нисходящая фаза). Здесь и ...на следующем рисунке 'Пересечение восходящей фазы В-А характеристики с осью абсцисс при положительном сопротивлении мембраны (второе пересечение при Наличии- ОС) соответствует потенциалу покоя. А -В-А характеристика в нормальном,растворе Рингера. Б - через 3 мин "" после действия оуабаина» В - после 20- -мин промывки в нормальном '.растворе Рингера. Г - через 3 шн^посте повторвого действия оуаба-гина. Д.- после 25 глин прощвга>внормальном растворе Рингера.

Аналогичная ситуация наблюдалась и при ингибировании На,к-насоса удалением ионов калия из наружного раствора. При кошатной " температуре (25°С) удаление ионов калия из наружного раствора вызывало неполное подавление, ОС. Однако снижение температуры среды в

этих же условиях до 5°С приводило к полному подавлению ОС. Следовательно можно предполагать, что неполное ингибирование ОС мембраны в бескалиевых растворах при кошатной температуре было обусловлено неполным ингибированием натриевого насоса.

Исходя из этих данных нами было сделано заключение, что источником тока, вызывающим ОС на восходящей фазе В-А характеристики мембраны, является либо непосредственно электрогенный натриевый насос, либо другой механизм, тесто связанный с ним. Вопрос источника тока, являющийся причиной возникновения ОС на нисходящей фазе В-А характеристики, остается открытым. Если исходя из наших данных о том, что в некоторых случаях оуабаин и бескалиевый холодный раствор Рингера частично или полностью подавляют ОС на нисходящей фазе В-А характеристики, предполагать, что электрогенный натриевый насос вовлечен в этот процесс, то приходится предполагать и о другом механизме, отличном от натриевого насоса, так как не всегда ингибирование насоса приводило к подавлению ОС ка нисходящей фазе В-А характеристики.

8. Влияние изменения объема клетки и выходящего потока воды на ОС мембраны \

После того, как нами было выяснено, что ингибирование натриевого насоса приводит к устранению ОС мембраны, мы исследовали влияние изменения объема клетки и выходящего потока воды на ОС. На рис. 19 показано влияние уменьшения объема .клетки в гипертоническом растворе и трансмембранного выходящего ¡потока воды на ОС. В норме ОС присутствовало как на восходящей фазе, так и на нисходящей. Увеличение осмотического давления среды в 2 раза относительно нормы вызывало выходящий поток воды через мембрану и объем нейрона стал уменьшаться. Этот процесс - выходящий поток воды через мембрану и уменьшение объема клетки - обычно длится 10-15 мин, после чего поток воды прекращается и объем клетки стабилизируется, оставаясь меньше его контрольного значения в нормальном растворе. Снятие В-А характеристик мембраны сразу после замены нормального раствора Рингера раствором с осмотическим давлением в 2 раза превышающим нормальное, когда имеет место трансмембранный выходящий поток Вода, не выявило какие-либо существенные изменения ОС ни на восходящей, ни на нисходящей фазах (рис. 19Б). После продолжения инкубайки нейрона в растворе с повышенным осмотическим давлением ОС полностью исчезало на обеих фазах (рис. I9B). При обратной замене растворов с гипертонического на изотонический, когда имел

Рис.19. Отсутствие влияния трансмембранного потока воды на ОС мембраны и подавление ОС в растворе с осмотическим давлением в 2 раза превышающим нормальное. В-А характ ери стили мембраны построенные с помощью линейно-возрастающего с -30 мВ до -100 кВ, а затем линейно-падащего командных потенциалов. А - В-А характеристики мембраны в нормальном растворе Рингера. Б - при наличии выходящего потока воды через мембрану. В - после 15 мин пребывания в растворе о осмотическим давлением в 2 раза превышающим нормальное. Г - при наличии входящего потока воды через мембрану. Д - после 15 мин промывки в нормальном растворе Рингера.

место входящий поток воду, опять форма В-А характеристики не изменилась относительно предыдущего состояния (рис. 19Г): ОС как отсутствовало в гипертоническом растворе в отсутствие потока воды, так н не появилось во время входящего потока воды. По мере восстановления объема клетки в нормальном растворе Рингера через 20 мин промывки ОС мембраны восстанавливалось на 80-9055. Однако необходимо отметить, что не во всех клетках однозначно повторялась аналогичная хронология. Примерно в 10£ проверенных клетках ситуация была совсем другая - ни поток воды, ни уменьшение объема клетки в гипертонических растворах не имели сколько-нибудь существенного влияния на ОС мембраны. Уменьшение ОС мембраны в пшертоничеоких

растворах с первого взгляда кажется противоречивым. Действительно, если ОС обусловлено активацией натриевого насоса, то в гипертонических растворах, в которых наш было показано, что активность насоса больше, чем в изотонических растворах, ОС должно было быть больше, так как активность насоса больше. На самом деле здесь никакого противоречия нет. Для проявления ОС при гиперполяризационных сдвигах мембранного потенциала для клетки гораздо важен не уровень активности натриевого насоса, а способность насоса далее активироваться при гиперполяризапцонных сдвигах мембранного потенциала. Ясно, что максимальная активность, до которого может активироваться насос при гиперполяризационных сдвигах, конечная величина. И надо полагать, что щи прочих равных условиях она одинакова в гипо—, изо- и гипертонических растворах, то есть не зависит от тояичности окружающей среды. Следовательно чем ниже будет исходный уровень активности насоса, тем больше он будет в состоянии активироваться дальше гиперполяризациошгши командами. Так как в гипертонических растворах уровень активности насоса больше, чем в изо- и гипотонических растворах, то он меньше и способен активироваться дальше гиперполяризационныш командами. Поэтому в гипертонических растворах ОС меньше, чем в изо- и гипотонических.растворах.

9. Действие изменения объема клетки на возбудимость и проводимость мембраны

Влияние повышенного осмотического давления среды на возбудимость мембраны было неоднозначным. Увеличение осмотического давления среды простым добавлением сахарозы без изменения концентрации натрия в наружной среде приводили в основном к двум формам изменений электрической активности нейрона. Оно либо, превратило пачечную активность нейрона сразу в ритмическую, либо вначале приводило к увеличению как-количества потенциалов действия в пачке, так и меж-пачкозого интервала, который затем постепенно уменьшался, и нейрон стал работать в режиме ритмической активности. В последнем случае переход с пачечной активности в ритмическую сопровождался также постепенным уменьшением межпачковой гиперполяризации. В очень редких случаях увеличение осмотическою давления среды приводило к увеличению межпачковой гиперполяризап-иг.

Для исследования зависимости возбудимости мембраны от тояичности окружающей сроды в полном объеме, то есть в гипо-, изо- и гипертонических растворах, нам пришлось уменьшить наружную концентрацию натг'.ш на половину (40 Ш), чтобы получить гипотонический

раствор, а затем добавить соответствующую концентрацию сахарозы для получения изо- и гипертонических растворов. Выяснилось, что зависимость возбудимости и мембранного потенциала клетю: от тонич-ности окружающей среды зависит от наружной концентрации натрия. Если при увеличении тшичности среда при нормальной наружной концентрации натрия в подавляющем большинстве экспериментов происходила деполяризация мембраны и увеличение возбудимости, хотя были и противоположные случаи, то при уменьшении наружной концентрации натрия на половину как раз наоборот - повышение тоничности среда в большинстве случаев приводило к гиперполяризацш мембраны и уменьшению ее возбудимости. Чтобы исключить влияние изменения мембранного потенциала на зозбудимость щи изменении тоничности среды, мы фиксировала мембранный потенциал на уровне потенциала покоя. На pic. 20 показаны результаты одного из таких экспериментов.

а б g

AA/l

л/w

50 сек

ш

Рис.20. Изменение частоты потенциалов действия в зависимости от осмотического давления. На рисунке представлены токи в цепи обратной связи, соответствующие потенциалам действия нефиксированного нейрона, а - в гипотоническом растворе, содержащем 40 Ш натрия и 0 мМ сахарозы, б - в нормальном изотоническом растворе, содержащем 40 М натрия и 65 М сахарозы, в - в гипертоническом растворе, содержащем 40 Ш натрия и 195 Ш сахарозы.

Из рисунка видно, что количество спайков в пачке уменьшается по мере ув(ш;чен«£ тоничности раствора. Если в гипотоническом растворе нейрон работал в режиме пачечной активности, то при переходе в изотони-тсскяй сахарозный раствор число- потенциалов действия

в пачке становилось равным уже одному и частота спайков уменьшилась. Б гипертоническом растворе частота спайков уменьшилась еще больше.

Понижение возбудимости мембраны с повышением осмотического давления среды можно объяснить уменьшением числа функционирующих электровоз будимых каналов в гипертонических растворах.

Для изучения действия изменения объема клетки на проницаемость мембраны для ионов калия как тест боло использовано деполяризаци-онное действие высокой наружной концентрации калия (20 Ш) на мембранный потенциал. При повышении тоничности окружающей среды увеличивались деполяризавдонное действие высокой наружной концентра-щи калия на мембранный потенциал и скорость деполяризации как при кодаатной температуре, так и при 5°С. Детальный анализ изменения проницаеыостей мембраны для ионов калия (Рк) и натрия (PNa) показал, что в гипертонических растворах Рк и РНа понижаются, однако степень уменьшения РВв больше, чем Pp., поэтому при повышении тоничности окружающей среды деполяризавдонное действие высокой наружной концентрации калия на мембранный потенциал увеличивается.

10. Влияние изменения текучести мекбраны на электрические характеристики интактного нейрона

Существуют два основных подхода для изучения изменения объема клетки, влияющее на физико-химические свойства мембраны. Первый подход это использование агентов, подавлодих метаболизм клетки и нраводяпях к ее набуханию в иаотоначооких средах, а второй - это изменение оекотичности окружающей клетку среды, приводящее к изменению объема клетки в анизотонической среде и потоку воды через мембрану. Однако первый подход не позволяет непосредственно изучать влияние изменения объема клетки на фзаако-химяческие свойства мембраны в чистом виде, так как все используемые агенты, щмводя-вде к набуханию клетки, сами непосредственно влияют на физико-химические свойства мембраны и щетки в целом. Зачастую это влияние бывает нашого сильнее, чем влияние изменения объема клетки и они маскируют эффект изменения объема. Поэтоцу для изучения влияния изменения клеточного объема и пото*& воды через мембрану на физико-химические свойства мембраны мы всегда использовали второй подход. В этом параграфе мы представим эксперименты, в которых мы изучали влияние изменения объема клетки и потока воды через мембрану на мембранные характеристики используя третий подход. Это -изменение объема клетки с помощью изменения текучести мембраны.

Дело в том, что в клетках обычно внутреннее осмотическое давление немного выше, чем осмотическое давление окружающей клетку среды (Пост, 1975; Не8епйапк, 1982$ РгивЬ, 1983} 31вЪвпа, 1985 ).

В качестве агентов изменяющих текучесть .мембраны были использованы дедаленовая кислота (ДК) - ненасыщенная жирная кислота, содержащая 10 атомов углерода в углеводородной цепи и повышающая текучесть мембраны (Такепака е* а1., 1983 ) и кеташн - внутривенный анестетик, повышающий жесткость мембраны (РааШагЗ., 1977). В некоторых экспериментах была использована валериановая кислота (ВК)-тоже жирная кислота, имеющая 5 атомов углерода в углеводородной цепи и не влияющая на текучесть мембраны (ЕакепаЗса е* а1., 1983 )• Кроме этих агентов для изменения текучести мембраны мы использовали также действие повышенной температуры. Под действием ДК происходило увеличение, а под влиянием кеташна - уменьшение объема клетка. После установления того факта, что увеличение текучести мембраны приводит к набуханию клетки, а уменьшение - к сморщиванию клетки, мы исследовали влияние изменения текучести мембраны на активные и пассашые свойства мембраны - активность электрогенного натриевого насоса, возбудимость и В-А характеристики мембраны.

ДК в концентрации 1,5 Ш подавляла обусловленную активацией насоса гиперполяразацию мембраны и активный выход 22На из клеток по сравнению с контролем. Под действием Ю-4 М кеташна активный выход 22Ка из клеток увеличивался. Эти результаты указывают на то, что под действием ДК активность насооа подавляется, а под действием кеташна - стимулируется. Подавление активности электрогенного натриевого насоса при действии ДК можно объяснить увеличением объема клетки и уменьшением внутриклеточной концентрации натрия, а стимулирование насоса под действием кеташна, наоборот, уменьшением объема клетки и увеличением внутриклеточной концентрации натрия. Однако это не исключает участие других механизмов в изменении активности насоса, например: изменения фосфолишдного окружения и белок-лтшд взаимодействия или конформации молекулы На.к-АТФазы.

При исследовании действия ДК и кеташна на возбудимость мембраны выявились следующие особенности. ДК имела ингибирующий эффект на возбудимость пачечного нейрона ШИ, однако эффект на возбудимость ритмически активных нейронов был неоднозначен. В некоторых нейронах Ж имела такой же ингибирующий эффект на возбуда-мость, как и в пачечных нейронах. В других нейронах потенциалы действия продолжали существовать в течение, по крайней мере, 1,5 часа после начала действия ДК.

Изучение влияния кетамина на зозбудашость мембраны пачечных нейронов ПЕаТ показало, что этот препарат имоот двоякое влияние на электрическую активность. Под влиянием кетамина вначале происходило увеличение как частоты пачек, так и числа спайков в пачке, которое сопровождалось незначительным увеличением межпачковой гипер-поляркзадаи, а затем через 5-7 мин после действия кетамина электрическая активность клетки прекращалась, однако при этом мембрана гиперполяркзовалась до уровня пика межпачковой гилерполяризации и начала давать своеобразные колебания мембранного потенциала, состояние из деполяризаодонной и ишерполяризациишой фазы. Подавление возбудимости под действием ДК по всей вероятности связано с блокированием натриевых каналов, что было показано Такенака с со-авт. ( Такепака еъ а1., 1931). А подавление возбудимости в кэта-мин-содержащем растворе обусловлено другим: механизмами. Установлено ( КооХта е* а1., 1984), что активация натриевого насоса шкот приводить к торможению спонтанной электрической активности двумя способами: потенциал-зависимым механизмом - путем гиперполяризадаи мембраны, при котором происходит повышение порога генерации потенциала действия, и потенциал-независимым механизмом - в результате уменьшения объема клетки, при котором происходит уменьшение числа функционально активных ионных канатов мембраны. Подученные наш данные показывал?, что кетамин подавляет возбудимость мембраны через оба механизма.

Другое различие в действиях ДК и кетамина проявлялось при действии этих агентов на В-А характеристики мембраны пачёчн о-актишых нейронов. ДК уменьшало ОС мембраны, тогда как кетамин всегда увеличивал его. ДК также уменьшала электрическое сопротивление мембраны в несколько раз, в то время как кетамин существенно не повлиял на этот параметр.

Подавление ОС мембраны при действии ДК и его увеличение при действии кетамина легко объясняется влиянием этих агентов на активность натриевого насоса. Как было сказано выше, ДК ингибирует насос, а кетамин активирует его. Эти изменения активности натриевого насоса и обуславливает уменьшение ОС в ЛК-содержащем растворе и его увеличение в кеташн-содераащем растворе.

II. Влияние изменения текучести мембраны на ионные токи даатазированнс 1'0 нейрона

В экспериментах на дуализированных нейронах мы лепользозала более низ то концентрации ДК, обычно 0,025 г.15 и. ниже, так как ДК

даже в концентрации 0,05 Ш, -что в 30 раз меньше, чем была использована в экспериментах на целых нейронах, выводила клетку из строя в течение 5 мин, то есть через 5 мин клетка переставала реагировать на электрические стимулы. Добавление ДК в наружный раствор в концентрации 0,0125 Ш вызывало замедление кинетики активации калиевого тока и уменьшение его амплитуда. Двукратное повышение концентрации ДК еще больше снижало калиевый ток, однако оно сопровождалось также увеличением тока утечки, что приводило к дестабилизации мембраны. При отмывке ДК амплитуда калиевого тока при любом времени отмывки восстановливалось неполностью.

При исследовании натриевых токов было обнаружено, что ДК уменьшает также их аглшштуду и замедляет кинетику, однако отмывка препарата в течение 20 мин была достаточной для полного восстановления тока. Инкубация нейрона в растворе, содержащем IO"4 M кета-мина, приводила к уменьшению амплитуды как калиевого, так и натриевого тока без существенных изменений их кинетики.

Как было сказано выше, на дуализированных нейронах улитки поток воды выходящего направления увеличивает К-ток, а входящий поток, наоборот, уменьшает его. При добавлении в наружный раствор 0,0125 iM ДК эффект выходящего потока воды на калиевый ток уменьшился в 2 раза. Если в отсутствие ДК выходящий поток воды созданный добавлением 130 ыМ сахарозы в наружную среду увеличивал амплитуду калиевого тока на 20?? (рис. 21, кривые I и 2), то в присутствии 0,0125 Ш ДК это увеличение составляло всего 8-10$ (кривые 3 и 4). При отмывке препарата, если даже амплитуда калиевого тока не восстанавливалась вообще, эффект активации калиевого тока выходящим штоком воды восстанавливался полностью и составлял 20-25$ (кривые 5 и 6). Кроме ДК для исследования влияния повышенной текучести мембраны на эффект потока воды через мембрану на ионные токи мы использовали повышенную температуру омывающих клетку растворов (с 20°С до 35°С). ДК и повышение температуры сходным образом действовали на эффект штока вода.

В следующих экспериментах наш было исследовано действие кета-мина и понижения температуры, которые уменьшают текучесть мембраны, на эффект потока воды на ионные токи. Как в предыдущих экспериментах сначала определяли активацию К-тока выходящим потоком воды в отсутствие кетамина - она составляла 2С$ от исходной амплитуда (pic. 22, кривые I и 2). Добавление в наружный раствор Ю-4 M кетамина увеличивало активацию К-тока выходящим потоком воды до 275? (кривые 3 и 4). Понижение температуры омывающих растворов до

Рис.21. Влияние увеличения текучести мембраны нейрону на эффект градиента осмотического давления на К-ток. А - кривые I и 3 получены в изотоническом растворе, 2 и 4 - в гипертоническом (130 ж сахароз*! снаружи); I и 2 - при температуре 20°С, 3 и 4 - щи 35°С. Б - кривые 1, 3 и 5 получены в изотоническом растворе, 2, 4 и 6 - в гипертоническом (130 Ш сахарозы снаружи); кривые 3 и 4 получены в растворе, содержащем 0,0125 Ш ДК. Потенпяал фиксации -60 мВ. Тестирующий, потенциал +20 мВ.

Рпс.22. Влияние снижения текчеети мембраны нейрона на эффект града-ента осмотического давления на , К-токи. А - кривые I и 3 получены в изотоническом растворе, 2 и 4 -в гипертоническом (130 Ш сахарозы снаружи); кривые I и 2 - в отсутствие кетамина, 3 и 4 - в его присутствии (I0-4 М). Б - кривые I и 3 подучены в изотоническом раствора, 2 и 4 - в гипертоническом (130 № сахарозы снаружи); кривые 1 и 2 - при температуре 20°С, 3 и 4 - при Ю°С. Потенпяал фиксащш -60 мВ. Тестирующий потенциал +20 мВ.

«ГИ

10^ приводимо к уменьшении амплитуда К-тока и замедлению его кинетики, а увеличение (в процентах) К-тока в гипертоническом холодном растворе стало больше относительно К-тока в холодном изотоническом растворе

Таким образом и кетамин и понижение температуры раствора усаливали эффект градиента осмотического давления на К-токи.

Нами также было исследовано влияние изменения текучести мембраны на эффект потока воды на иа-токи. Оказалось, что ни повышение, ни понижение текучести мембраны о помощью ДК и кетамина, а также изменением температуры омывающего клетку раствора, не влияет на эффект выходящего потока воды на иа-токи.

Полученные экспериментальные результаты на диализированннх нейронах позволяют сделать некоторые выводы относительно локализации водного потока. Основываясь на результате, что эффект градиента осмотического давления на На-токи не зависит от текучести мембраны, можно сказать, что на На-токи оказывает влияние тот компонент потока воды, который идет через пору белкового канала для натри. Эти данные совпадают с данными других авторов (Чижмаков, Сорокина, 1986), полученными для На-токов нейронов спинальных ганглиев крыс.

Более сложная ситуация с К-токами. Увеличение текучести мембраны ослабляло эффект градиента осмотического давления, а уменьшение текучести, наоборот, усиливало его. Различное влияние увеличения текучести на эффект градиента осмотического давления на К- и На-токи, вероятнее всего, обусловлено различным составом липидно-го окружения К- и На-каналов и различной способностью этих липи-дов изменять свою текучесть при действии различных агентов. Возможно, что ослабление эффекта градиента осмотического давления при увеличении текучести липидной фазы мембраны обусловлено более высокой способностью липидного окружения К-каналов изменять свою текучесть. Это может привести к деформации К-каналов при движении воды через липидаый бислой, изменению стеричэского фактора К-кана-ла и уменьшению числа функционирующих К-каналов. Возможно, что различный характер влияния изменения текучести на эффект градиента осмотического давления на калиевые и натриевые токи обусловлены изменением белок-липид взаимодействия, которое также может иметь различную зависимость от изменения текучести мембраны. Можно также предполагать, что На-канал представляет собой либо более жесткую структуру, чем калиевый, либо на него слабее влияет изменение липид-белок взаимодействия.

Таким образок эта результаты показываю:, что I) текучесть мембраны может выступить как один из факторов, с помощью которого можно регулировать объем и поверхность клетки и тем самым физико-химические свойства мембраны и 2) мембранные белки, имеющие фер~ 'мвнтатишые, транспортные, канальные и другие свойства могут иметь раздгиое липидаое окружение и различную зависимость от физико-химического состояния ¡этих лшидов.

ВЫВОДЫ

1. Изменение объема клетки происходит не непрерывно, а ступенчато. Связанное с изменением объема клетки сморпдаваяие и выпрямление мембраны сопровождаются изменением числа функционирующих белковых молекул мембраны, имещих ферментативные (транспортные), канальные и рецепториые свойства.

2. Эффект изменения объема клетки на активность электрогенного На-насоса зависит от уровня внутриклеточной концентрации натрия. При низких уровнях внутриклеточной концентрации натрия, когда еще не происходило насыщение электрогенного транспорта натрия ионаш натрия, уменьшение объема клетки в гипертонических растворах приводит к активации работы натриевого насоса, а щи высоких уровнях, когда происходит насыщение транспортного механизма натрия ионаш натрия, уменьшение объема клетки приводит к инактивации на-насоса из-за уменьшения числа функционирующих £&,к-.ДОазных молекул (насосных единиц) мембраны.

3. Насыщение электрогенного транспорта натрия ионаш натри происходит щи увеличении внутриклеточной концентрации натрия в 2-4 pesa. В гипо- и гипертонических растворах насыщение происходит при различных количествах натрия, инъецированных внутрь клетхи, в гипертонических растворах насыщение наступает при инъекции меньшего количества натрия. ,

4. Поток воды через мембрану увеличивает трансмембранные ионные токи, если градиент осмотического давления и ионные градиенты совпадают по направлению, и уменьшает их, если градиенты ионов и осмотического' давления направлены противополояны.

5. Выходящий поток воды через мембрану увеличивает число функционирующих Каляевых в уменьшает число функционирующее натриевых

и кальвдевых каналов к одновременно замедляет кинетику активащи и инактивации входящих натриевых и кальциевых токов мембраны.

6. Источником тока, вызывающим ОС на восходящей фазе В-А характеристики мембраны пачечного нейрона Ш, при гиперполяризада-

ошшх сдвигах мембранного потенциала является либо непосредственно На-яасос, либо другой механизм, тесно связанный с На-насосем. Уменьшение ОС щи сморщивании клетки в гипертонических растворах обусловлено повышением исходной активности элахтрогевного натрно-Bord насоса, что ограничивает способность насоса актншроваться дальше при гиперяолярвзадаошшх сдвигах мембранного потенциала.

7. В условиях фкксаппи напряжения на мембране возбудимость клеток в пгпотонячаских растворах увеличивается, а в гипертонических растворах, наоборот, - уменьшается.

8. Изменение текучести нейрональной мембраны не влияет на эффект градиента осмотического давления на натриевые токи. Однако увеличение текучести мембраны уменьшает эффект потока воды на калиевые токи, а уменьшение текучести, наоборот, увеличивает его. Это свидетельствует о том, что эффект градиента осмотического дав-ления_ на ионные токи создается потоком воды, идущим через глобулу -белкового канала.

СПИСОК РАБОТ, ОТУБЖКСВАННЫХ ПО ТЙЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сулейкааян U.A., Айрапетян СЛ. Модуляторная роль натриевого насоса в изменении объема клетки // Тез. докл. конф. молодых ученых. Ереван, 1977. С. 13.

2. Сулейманян U.A. О действии осмотического давления н&аиактри-чэскую активность мембраны гигантского вейрока улитки // ДЯ Арм.ССР. 1979. Т. LXYIII, * 5. С. 286-290.

3. Айрапетян СЛ., Сулейманян U.A. Натриевый насос как регулятор объема клетки // Деа. в ВИШПИ 24.12.79. Л 4382-79.

4. Айрапетян СЛ., Сулейманян U.A., Геворкян А.Ы., Аракелов Г.М. Набухание как защитная реакция клетки // ДАН Арм.ССР. 1980. Т. ЬШ, * 2. С. Ш-П6.

5. Айрапетян СЛ., Сулейманян U.A., Арванов В .Д. Натриевый насос как регулятор объема и хемо чувствительности клетки // Биофизика мембран. U.: Наука, 1981. С. 168-183.

6. Сулейманян U.A., Айрапетян СЛ., Сагиян A.A. Зависимость активности работы натриевого насоса от объема клетки // Тез. докл. Воессюз. биофизкч. съезда. Москва, 1982. * 2638.

7. Айрапетян СЛ., Стамболцян Х.В., Сулвйыанян U.A. О дискретаtw жзменевяж оОмма нейронов улитка в растворах с различной тонич-НООТЫ) // Д/Н СССР. 1984. Т. 278, Л 5. С. 1238-1240.

8. СулвЯквнян H.A., Сахияя A.A., Айрапетян СЛ. Зависимость актив-воехх работы натриевого насоса от осмотического давления среды

//Биофизика. 1984. Т. ШХ, вып. 5. С. 822-826.

9. Сулейманян М.А., Такекака Т. Действие короткоцепочечных жирных кислот и осмотического давления среда на отрицательное сопротивление мембраны идентифицированного нейрона ППа1 виноградной улитки //Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам. Киев, 1986. С. 46.

10. Бакунц И.О., Сулейманян М.А., Дадалян С.С. О мембранном механизме действия кетамина //Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам. Киев, 1986. С. 16.

11. Сагиян A.A., Дадалян С.С., Сулейманян М.А. Действие короткоце-почечных жирных кислот на оуабаин-чувствительный и оуабаин-не-чувствительный выход 2%а из нейронов виноградной улитки // Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам. Киев, 1986. С. 39.

12. Стамболцян Х.В., Сулейманян М.А., Григорян Х.В. Дискретный характер изменения объема нейронов виноградной улитки // Тез. докл. Всесоюз. конф. по нейронаукам. Киев, 1986. С. 45.

13. Сулейманян М.А., Стамболцян Х.В. Метаболическая регуляция объема клетки // Тез. докл. II Реоп. конф. по фаз.-хим. биологии. Ереван, 1986. С. 86.

14. Сагиян A.A., Дадалян С.С., Сулейманян М.А. Саморегуляция электрогенного натриевого насоса.// Тез. докл. II Респ. конф. по фнз.-хим. биологии. Ереван, 1986. С. 80.

15. Бакунц И.С., Сулейманян М.А., Такенака Т., Сагиян A.A., Дадалян С.С., Айрапетян С.Н. Влияние кетамина на возбудимость и противоградаентный выход ионов натрия из клеток // Деп. в ВИНИТИ 4.10.86. № 7СЕ5-В.86.

16. Айрапетян СЛ., Такенака Т., Сулейманян М.А., Арванов В.Л. О роли лишдаого компонента мембраны в определении функциональных свойств нейронов ЩС виноградной улитки // ДАН СССР. 1987. Т. 294, № 3. С. 699-703.

17. Айрапетян С.Н., Егорова Е.Г., Сагиян A.A., Дадалян С.С., Дворецкий А.И., Сулейманян М.А. О механизме действия облучения на работу На,к -насоса нейронов виноградной улитки // ДАН СССР. 1987. Т. 294, № 4. С. 977-980.

[8. Айрапетян С.Н., Рычков Г.Е., Сулейманян М.А. Модуляция кальциевых токов мембраны нейронов улитки осмотическим градиентом //ДАН СССР. 1988. Т. 300, Я 4. С. 983-985.

19. Рычков Г.Е., Сулейманян М.А., Айрапетян С.Н. Зависимость действия потока воды на ионные токи дуализированного нейрона от текучести соматической мембраны // Биологические .мамбганы.

1939. Т. 6,'й 7. С. 733-739.

20. Сулейманян М.'А., АЙрапетяя В.Е., АЙрапетяя С.Н. Об отрацаталь-ном солрогиаяэяни мембраны идштЕфищрованного нейрона пачечного типа ШШ виноградаой улитки // Тез. докл. Меяд. симпозиума "Транспорт ионов и механизмы его регуляции. Тбилиси, 1989. С. 71-72.

21. Ayrapetyan S.N., Suleymanian М.А. On the pump-induced cell volume changes // Сотр. Biochem. Physiol. 1979. Vol. 64A. P. 571575.

22.. Suleymanian M.A., Salanki J., Ayrapetyan 3.H. Bffect of call volume changes on the passive properties of ths membrane // 2XVIII Int. Cong, of Physiol. Sci. Budapest, 1380. Vol. ОТ, Ко. 3289.

23. Suleymanian И.A., Salanki J., Ayrapetyan 3.11. The dependence of puap-induced hyperpolarisation on ths tonicity of the surrounding raadiua and intracellular sodium concentration // Сотр. Biochera. Physiol. 1984. Vol. 78A. P. 591-595.

24. Ayrapetyan S.N., Suleymanian H.A., Saghyan A.A., Dadalyan S.S. The autoregulation of eleotrogenic sodiun pump // Cell. Hoi. Neurobiol. 1985. Vol. 4, Ho. 4. P. 367-334.

25« Suleymanian. M.A., Такепака I., Stssaboltsyan Kh.V., Ayrapetyan S.U. The effects of short-chain fatty acids on the neuronal membrane functions of Helix¡pomatia. I. Electrical properties // Cell. Mol. Beurobiol. 1986. Vol. 6, No. 2. P. 151-163.

26. Saghyan A.A., Badalyan S.S., Takeriaka Т., Suleymanian M.A., Ayrapetyan S.H. The effects of short-chain fatty acids oa the • neuronal membrane functions of Helix pomatia. XII. 22Яа efflux iron the cells // Cell. Uol. Ueurobiol. 1986; Vol. 6, Ho. 4. P. 397-405.

27* Suleymanian Ц.А., Saghyan A.A., Ayrapetyan S.U. 2he dependence of sodium pump activity on the tonicity of the surrounding medium // Cambridge Sci. Biochem. Abstr. 1986. Vol. 14, No. 2. P. 65.

28. Ayrapetyan S.H., Rychkov O.Y., Suleymanian H.A. Effects of water flow on transmembrane ionic currents in neurons of Helix pomatia and squid giant axon // Сотр. Biochem. Physiol. 1988. Vol. 89A, No. 2. P. 179-186.

29* Suleymanian M.A., Ayrapetyan S.N. The changes in of eheep cardiac Purkinje fibres in hyperosmotic solutions // Сотр. Biochem. Physiol. 1989.