Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние R-плазмиды S. derby на физико-химические свойства мембран клеток S.derby

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние R-плазмиды S. derby на физико-химические свойства мембран клеток S.derby"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

Пепоян Астгик Завеновна

ВЛИЯНИЕ Я - ПЛАЗМИДЫ НА ФИЗИКО -

ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН КЛЕТСК

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1990

Работа выполнена в Институте экспериментальной биологии АН Республики Армении в лаборатории биохимии липидов и группе репарационных систем клетки, в г. Ереване.

Научные руководители:

член - корр. АН Республики Армении, доктор

биологических наук, профессор К.Г.КАРАГЕЗЯН

кандидат биологических наук К.А.КЦ0ЯН

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор К.И.Акопян

Кандидат медицинскинаук

К.Г.Манунян

Ведущая организация - Институт микробиологии АН

Республики Армении

Защита диссертации состоится "Ж" t/fdin^ 1990 г в часов на заседании специализированного совета Д 005.15.01 по присуждению ученой степени кандидата наук"в Институте биохимии АН Республики Армении С 3^5044, Ереван - 44, ул. П.Севака 5/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Республики Армении

Автореферат разослан " 1990 г.

Ученый секретарь

специализированного совета

доктор биологичеоких наук, ^

профессор • А.А.Симонян

Актуальность проблемы. Изучение вопросов плазмидного контроля на процессы, лежащие в основе функционирования клетки, является одним из важных направлений современной молекулярной биологии. Участие плазмид в генетических процессах бактерий, является частью проблемы взаимодействия продуктов, кодируемых хромосомными и плазмидными генами, определяющие суммарный фенотип плазмидосодержащих клеток.

Исследование форм участия плазмид в метаболизме хромосомы .бактерий хозяина и всей клетки в целом, идентификация соответствующих генов и их продуктов раскрывают сформировавшиеся у бактерий функциональные связи различных репликонов /плазмид и хромосом/ в одной клетке, способствуя также пониманию сущности фундаментальной общебиологической проблемы ядерно - цитоплазматичес-ких отношений у эукариот, прообразом которых являются плазмидно -хромосомные взаимодействия у бактерий /Чернин, 1985/.

Актуальность изучения затронутой проблемы определяется также участием плазмиды в бактериальных популяциях в качестве фактора, детерминирующего массовое распространение лекарственной устойчивости и ряда признаков, вносящих вклад в патогенность /токсичность, гемолитическая актаЕНОсть и др./. В связи с отмеченным распространение плазмид приводит к изменению ряда чрезвычайно ваг.ных в медицинском отношении характеристик патогенных и условно - патогенных бактерий, что затрудняет эффективность лечения инфекционных заболеваний.

Особенность изучения системы плазмидного контроля в клетке заключается в способности различных плазмид оказывать свое влияние на один и тот не процесс внутриклеточного метаболизма через различные механизмы его регуляции. Плазмиды, как своеобразные факторы эволюции играют важную роль в метаболизме ^Нд, Г-НК и

клетки в целом / O-Ani&ßy fy , 1980/. Они могут нести гены, ответственные за разнообразие признаков клетки - хозяина, включая их рост /ЛМс/исА A.f , 1983/, метаболизм углеводородов / Fen-.ntwA Ы , 1978/ углеводов /ivra. туК, 1970/, образование пигментов / MetCanct > 1979/ и антибиотиков /Чернин, 1981/.

Плазмиды бактериальных клеток, придающие им устойчивость к антибиотикам, могут влиять также на липидный состав клеточной стенки, меняя физико - химическую характеристику липидов, их антирадикальную активность /Алесенко A.B., 1985/. Они могут расширять адаптивные возможности клетки - хозяина. В тоже время плазмиды являются фактором изменчивости и эволюции бактерий. Изучение каздой новой плазмиды - потенциальный вклад в плазмидологию.

£ - фактор $■ cle-t^y играет существенную роль в молеку-лярно - биологических и генетических основах функционирования клетки - хозяина /Слркисля^в&5;Кцоли, JSM;K4fAH,d3&9 /. Выявлено также, что настоящая Я - плазмида участвует в формообразовании клеток, влияя на их жизнедеятельность в целом /Кцоян, *

1989/.

Цель и задачи исследования. Выяснение участия R. - плазмиды Jeiij в регуляции генетической стабильности мембранных структур клеток UimcAtiCa c/eify играющей важную роль в метаболизме и жизнедеятельности клетки в целом.

Для осуществления поставленной цели в плазмидосодержащих и бесплазмидных клетках с/е-г./^ , потребовалось разрешение следующих задач:

1. Определение структурной организации мембран в их водных суспензиях.

2. Выявление качественного и количественного состава фосфо-t липидов и <Х - токоферола.

3. Изучение интенсивности течения реакции свободнорадикаль-ного окисления липидов.

4. Определение качественного и количественного состава жирных кислот фосфолипидов.

5. Выяснение роли Ц - плазмиды $■ с(егёу в росте этих клеток при изменении РН окружающей среды.

Научная новизна и практическая ценность. Проведенные исследования проливают свет на современное понимание роли R, - плазмиды в самоорганизации клеточных стенок бактерий.

Впервые продемонстрирована детерминирующая роль внехромосом-ных генетических элементов -г Я - плазмиды $■ Jetêy в физико -

развитию изменений в филогенетически стабилизированном постоянстве липид - липидных соотношений биологической мембраны с дестабилизацией структуры /изменения толщины, "жидкостности", упорядоченности, заряженности, уменьшения степени кристалличности/. Структурные изменения мембран характеризуются развитием мемОрано-литических процессов, нарушениями метаболизма клетки в целом, замедлением роста и размножения.

К - плазмида может быть применена в микробио-

логических работах в исследовании морфологически гетерогенных клеток с целью изучения эволюции геномов эу-и прокариот и роли экспериментальной добавочной ДНК в адоптивной стратегии организмов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены и доложены: на 3 конференциях молодых ученых' Института экспериментальной биологии АН АрмССР /г. Ереван, 1989/, ученых Советах института, конференции СССР - ГДР /Ташкент, 1989/,

химической организации мембран, клеток Отсутствие И- плазмиды в клетках

приводит к

2и - <*>£ЬС /ьудапешт, 1990/, 6-ой Научно - технической конферен-. ции молодпх ученых и специалистов р-на 26 коммисаров /г.Ереван, 1990у

Работа апробирована на заседании Ученого совета Института экспериментальной биологии АН Республики Армении 5 октября.

Публикации. Но теме диссертации опубликованы научных работ в республиканской, союзной и международной печати.

Объём и структура работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и включает 13. рис ,9таблиц, 2 схемы. Библиографический указатель включает 211 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

диссертация состоит из введения /общей характеристики работы/, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой, литературы.

Материалы и методы

Работа выполнена на природном, условно - патогенном, глуто-генном штамме ScyCmoní с!ел,6у rígg( выявленном в клинических изоляторах больных детей в качестве основного возбудителя сальмонеллеза в Армении /Вартанян М.л., 197и/, на бесплазмидном производном К82, полученном обработкой 2$-км этилметаносульфона-том /ЭМС/ и трансформанте, полученном путем трансформации изолированной плазмидной дНгС клеток C^etéy ;{82. Штамм £ cíe i. К8Э несет И ~ фактор длиной около 100 т.п.н., придающш бакте-риальнкм клеткам множественную устойчивость к антибиотикам: хлор-амфениколу /От/, пенициллину /Рп/, стрептомицину /5п/ /Саркисян Н.Н., 1985/.

Питательными средами для выращивания бактериальных культур служили мясопептонный агар /мПА/, в качестве минимальной среды -1Л - 9 / 1Wi¿(et$ // , 19?о/. Антибиотики использовали в следующих концентрациях /мкг/мл/: тетрациклина гидрохлорид /'iс/— 20, стрептомицин сульфат /£т/ - 200, пенициллин натриевая соль /Рп/ - 20, хлорамфеникол /Ст/ - 20.

I. методика выделения клеточных стенок и рентге-

ноструктурный анализ их суспензий.

Выделение клеточных стенок проводилось пс методу АГ.ноэ / Inoyí OH.iW-.Xnotft DH,£4Z д 0бразЩ! ДЛЯД1дац;:и рентгеновских лучей готовили согласно нижеприведенной методике: мембранную суспензию соответствующей концентрации вводили в капилляр или ячейку типа "сэкдвкч" и оставляли в г?жегически закрыто,-* виде при комнатной температуре /t =-25"С/. Образцы имели цилиндрический или плоский вид с диаметром или толокно!. 0,4 - I мм. Съемки образцов проводили па рентгеновских аппаратах лС - 60, УН; -2 с камерами типа дРОН, РаОО, аредназкачешшх для съемок на плоскую пленку, и для исследования .ттоуглоготчэ г-ассеквялия счиг мо-

дифицированы при расстояниях образец - плешса 100 'и 150 rai. Ь исследованиях были использованы также трубки ЬСБ - 23 г: ьСЬ - 24В, дающие излучение в области I.54Â* .длины волны с напряжением па аноде 40 мВ при анодном токе 20 мА. Время экспозиции длилось в пределах 10 - 14 часов. Для приготовления.образца использовались кварцевые тонкослойные капилляры /производства ФРГ/ с толиданой стенок 0,01 мм и диаметром 0,4 - I мм, а также ячейки "сэндеич" с плоскими окнами из бериллия.

2. Поляризационно - микроскопический анализ жидкокристаллических структур мембранной суспензии клеток Je г

Эксперименты проводили при комнатной температуре /25'С/ на поляризационном микроскопе 1.1ИН - 4 с призмой Бертрана и увеличением х 300. Определение размеров структурных единиц проводили стандартным способом при помощи окуляр - микрометра, источником света служила галогеновая лампа мощностью +150 вт.

3. Метод определения йосфолипидов бактериальных клеток

£д Zmcnetta deity

Экстракцию ФЛ производили из ацетоновых порошков клеток ¿> citièy с помощью хлороформ - метаноловой смеси /2:1/ по Фол-чу / F о £сА t al •» 1957/ в модифпр:г.цг:' Карагезяна /Караге-зян л.Г., 1972/.

Фракционирование ФЛ производили в системе растворителей: хлороформ - метанол - концентрированный аммиак /65:35:5/. Количественное определение липидного фосфора осуществляли спектрофо-томе'трически /СФ - 26/ при длине волны 830 нм /лграгезян К.Г., 1969, Зубер В.Л., 1982/.

4. Методы определения малонового диальдегида в клетках

S- Jç-iSy в аскорбат- и НАДФ.Н - зависимой системах переокисления

Количество малонового диальдегида /ЩА/ определяли по интенсивности цветной окраски комплекса МДА с тиобарбитуровой кислотой.

Спектрофотометрирование /СФ - 2б/ производили при длине волчы 535 нм /Владимиров ю.А. и др., 1972/ количество белка определяли по Лоури //.ovriy О Я- &t 1951/и Яковлеву /Яковлева В.-.

и др., 1979/ и содержание ЩА выражали в нМ/I мг белка i: nwl/l мг фосфора.

5. методика определения жирнокиолотного состава юосфолипи-дов клеток £ c/f*-^ с помощью газожидкостной хроматографии.

Метиловые эфиры ¿пл. ФЛ получали по методу Штоффеля /лод р^у Прохорс^сО,13Ц/, Идентификацию полученных эфиров лК проводили методом ШХ /псу pe<j РрсмрсёсйЩй/яа хроматографе марки ").ром - Ь" /Ч - ССР/ с пламенноионизационным детектором.

6. Методика количественного определения витамина Е /¿с -токоферола/. Свободный X - токоферол определяли по Дагану /

дал <0-iS I 1359/ с использованием флуоресцентного спектрофотометра фирмы Ц(t &cAi /модель .ЛРГ - 2А/ при максимуме флуоресценции 330 нм и максимуме возбуждения 295нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛ^ОБАииИ «i ИХ ОЬСУйдШМ!

Т. Рентгеноструктурный анализ клеточных мембран штамма_

£ cleitftf ¡{39 и его бесплазмидного производного К82.

Рефлексы, выявленные на рентгенограммах /рис.1/ при дифракции рентгеновских лучей под малыми углами мембран клеток £.

, позволяют сделать вывод о жидкокристаллической структуре суспензии мембран плазмидосодержащих и бесплазмидных клеток .

При фотометрических измерениях под косым и прямым углагш 1Ъ% водных суспензий мембран плазмидосодержащих и бесплазмидных клеток установлено присутствие мембран /включая межмембранное водное пространство/ толщиной 42А! , 78Ае , ЮЗА" и 44А° , 92А" , I36A" Известно, что толщина "жидкого" бислоя для природных мембран при

предельной гидратации составляет примерно 49 - 5IA0 /М£хсС,ВГ,13%/ в состав клеточных стенок грамотрицательных бактерий входят клеточная оболочка, состоящая из наружной мембраны и пептидоглккано-вого слоя, и плазматическая мембрана. Б связи с отмеченным .можно полагать, что в данном случае обнаружение трех различных рефлексов под малыми углами обусловлено самоорганизацией мультислоев отдельных плазматических мембран и клеточных оболочек.

В литературе отсутствуют данные, свидетельствующие о наличии в плазматической мембране белков, специфически взаимодействующих с пептидогликановым слоем, что, возможно и является причиной нечеткости рефлексов обнаруженных на рентгенограммах при дифракции рентгеновских лучей под малыми углами.

Известно, что при упорядоченной структуре внутренней части мембраны, с расположенными в ней углеводородными цепочками молекул М, на рентгенограммах должны появляться рефлексы при 4, ЗА" , их отсутствие говорит о жидкоподобной структуре внутренней углеводородной части мембран как плазмидных, так и■бесплазмидных клеток. Однако появление двух четко выраженных рефлексов /8Af, IIA0/, окружной формы, /рис.1а/ для мембранной суспензии плазмидосодер-жащих клеток S deißj При дифракции рентгеновских лучей под большими углами свидетельствует о его более упорядоченной структуре. Поскольку-величины 8Ä\ и IIA" совпадгиот с размерами полярных групп ФЗ /8А'/ и uä. /II Ас/, не исключено, что полярные "головки" этих ФЛ играют стабилизирующую роль в мембранах плазмидных клеток.

а/ плазмидосодержащие клетки б/ бесплазмидные клет-

К89 ки ,2. ¿>£ЛвК

Рис.1. Дифракционные картины 1Ъ% мембранных суспензий клеток &аЫом1£& ¿/е-г.^

Учитывая, что параметры бислоя /толщина, средняя площадь на молекулу, и др./ в значительной степени определяются распределением зарядов на полярной части молекул 5>Л /Бол^иреЛШЩ, мы занялись изучением влияния РН мембранной суспензии на физико -химические параметры 15%-ных мембранных суспензий плазмидных клеток . Как и следовало ожидать, при переходе как в кислую, так и в щелочную сторону имеет.место полное исчезновение рефлексов, обусловленных упорядоченностью структуры мембран плазмидных клеток.

Результаты проведенных наблюдений /табл.1/ свидетельствуют, что с уменьшением степени ионизации /РН=7,0/ имеет место переход бислоя из жидкого в упорядоченную структуру. Этот эффект характеризуется уменьшением толщины мембраны и ещё раз подтверждает возможность возникновения рефлексов под большими углами рентгеновских лучей в ответ на взаимодействие полярных групп ФЛ на поверхности мембраны.

Таблица I.

Зависимость суммарной толщины мембраны и межмембранного расстояния /с/ / от изменения РН среды 1Ъ% мембранной суспен- . зии плазмидосодержащих клеток БаСтспе а с/г-г. £у

РН среды 2,5 7,0 10,9

о/ суммарное /а" / 40,69 . 39,28 49,142

Из рис. 2 видно, что с увеличением концентрации воды в мембранных

суспензиях имеет место проникновение её в межмемб-

ранное пространство. При этом толщина клеточной стенки с межмембранным расстоянием /с! / для плазмидных клеток всегда оказывается меньше по сравнению с аналогичными показателями у бес-плазмидных клеток, эти самые свидетельствуют о наличии хорошо выраженных межмембранных контактов / при малых концентрациях мембран в мембранных суспензиях у бесплазмидного штамма что может быть обусловлено извилистым характером поверхности клеточной стенки.

39 X Я-3«

35 ^

эз

3 2 3 5 ~5 е СЛОИк/мгНБРМ

Рис. 2. Зависимость суммарной толщины мембраны и межмембран ного расстояния от соотношения концентрации "вода - мембрана" в исследованной системе.

х-х

Исследование 1Ъ% суспензий мембран бесплазмидных клеток ¿. о/ег-^у выявило имеющее место в капиллярах разделен! ла три фазы. Верхняя и нижняя водные фазы почти не проявлял!; тонден ции к взаимодействию с мембранами бесплазмидных клеток. При этом рентгенографически наблюдаются слабовыраженные рефлексы с межплоскостными расстояниями 40 А^ что может быть показателем пере-

хода в водную (Тазу мембранных частиц гидрофильно;! природ".

С помощью поляризационного микроскопа выявлено различно во взаимодействиях мембран клеток 5. сГ<-1 Ь'у с вотрМ в ЗУ,. мембранной суспензии этих клеток /рис. За,б/. Становится очевидным отличие мембраны бесплазмидных клеток с/ег-^' своим гидрофобным характером. В то же время, если степень кристалличности в 35% водных суспензиях мембран плазмидных меток равна то в бесплазмидных клетках она понижается до 5б£. Суммируя впв-егтж-веденные результаты по рентгеноструктурному анализу меморапи'х суспензий скЛу мояно ожидать, что мембраны бесплазчл/нмх клеток Ь- ¿с* более заряжены, чем - плазмигшну клеток.

< > ' \

г -

> / ,< о* Г •

<' ' - , - '

ч / ^ '' ^

Ч ' ^ ♦ 4 м-" 4

Л' А*4.-:

> . Ч -V V - 1'

^ Л ; -

- Л

- > * *

- * & -

а/плазмидные ¡слетки О/бесплазмцдике

5 С^^/лНЭ с/г ;

Рис.За,б. 35% мембранные суспензии клеток ХаСполе ( С с\ о\ С-Ь^у /поляризационный мшЬсскоп/

Таким образом, с помощью релтгтюструктурноге анализа ранных суспензий меток £ ск\4у , показана роль Я - ::-ас/•

3. в физико - химической оот-очизаши ут*«^?}.- • $

1-й * '

. Внутренняя углеводородная часть •дег.-.бран кгето:: Ь" скл

Ьу жидкоподобная, однако наличие Я - плазмнды £ с/с г Су, • >-

видимому, приводит к образованию упорядоченных участков мембран, обусловленных полярными головками ФЛ /по всей вероятности - ФХ и ФЭ/, что и, вероятно, играет стабилизирующую роль в плазмидосо-

мембранами бесплазмидных клеток более гидрофильна и имеет более высокую степень кристалличности. При этом межмембраннке контакты больше выракены в бесплазмидных клетках.

2. Качественный и количественный состав фосфолипидов. их жирных кислот бактериальных клеток с/У--г -ёу

Исследование качественного и количественного состава ФЛ выявило, что как в плазмвдосодержащих, так и бесплазмидных клетках процентное содержание фосфатидилхолинов /ФХ/ значительно больше, чем фосфатидилэтанолашнов /ФЭ/ /рис.4/, несмотря на то, что грам-отрицательные бактерии в основном содержат ФЭ. Наверное это обусловлено стабилизирующим действием ФХ в бислоях клеточных стенок грамотрицательных бактерий /Сго1-с[[Спе Я, йЗЗУ /. Известно, что мембраны клеток £ по сравнению с другими мембранами

грамотрицательных бактерий утолщены.

Отсутствие - плазмиды /рис.4/ приводит к резкому уменьшению количественного содержания ФЛ, в частности ФХ и ФЭ, которые при РН=7 электронейтральны, и естественно, их малое количество должно влиять на повышение степени ионизации мембран бесплазмидных клеток. Из рис.4 видно также повышение процентного содержания лизофосфатидалхолинов /ЛФХ/ в бесплазмидном штамме £ с(еъ ёу , которые в свою очередь должны участвовать в дестабилизации мембран бесплазмидной клетки.

Исследование М ФЛ /табл.2/ выявило, что отсутствие Я -плаз-миды влияет на качественный и количественный состав ФК ФЛ. Однако соотношение насыщенных и ненасыщенных ¿£К /включая и изоформы на-

держащих клетках

мембрана которых по сравнению с

- лизофосфатидилхолины

- - сфингомиелинн

- - фоспатидилсернлш

--фосфатидилшюзкды

-- фосфатидилхолины

,5 К?

"И

--(Т;ос (Тв'гидк л э т ан олами н ы

---йосфатидилглицерины

Л 'Г J

Рис.4. Хроматографическое разделение фосфолипидов клеток

Примечание: а -5. ¿е.-1-&уК89, б - 82•

в - трансформант К82 а,в-25мкл с». ФЛ, б-75мнл см. ФЛ

сыщенных &К/ ФЛ, в связи с'наличием в клетках Я- плазмиды, не меняется.

Таблица 2.

Жирнокислотный состав фосфолипидов клеток с1е"ь&4

Процентное содержание индивидуальных жирных кислот фосфолипидов к общему количеству

Штаммы 16 : 0 16 : I 18 : 0 18 : 0 18 : I 18 : 2 18 :

К89 дикий плазмидосо- держащий '32,35+ 8,65 11,26+ 0,97 25,33+ 4,81 0,73+ 0,15 22,17+ 2,29 0,53+ 0,16 6,47 0,99

К82 бес-плазмид-н ый 51,8+ 6,76 9,46+ 4,97 10,8* 1,25 1,53+ 0,82 9,66+ 2,75 3,72+ 1,82 11,3 2,16

Тр82 транс-форнант плазмидосо-держащий 36,2+ 5,57 10,9+ 0,54 26.4+ 2,95 0,77+ 0,15 18,9+ 3,05 0,43+ 0,11 5,6+ 0,77

В состав липидов клеток входят также витамины группы Е. Известно, что они не только способствуют стабилизации липидного бислоя, но и играют определенную структурнообразующую роль /родное "яя, 4377, А1а591оо, 4 3?6/. Сравнительное изучение количественного состава

- токоферола в клетках £>. о1е-связи с наличием в них К - плазмиды, показало, что в бесплазмидных клетках с!е его количество при подсчете на I мг влажных клеток в 2, 3 раза больше, а при подсчете на фосфора в 82,5 раза больше, чем в плазмидосодержащих клетках. Учитывая более неупорядоченное состояние внутримембранкой организации бесплазмидных клеток с/е-г-^у , интересно было изучение ПОЛ, поскольку, с другой стороны, ос- токоферол является ингибитором процесса пероксидации липидов'.

■ 3. Изучение интенсивности течения процесса перекисеобразо-вания в аскорбат - и НАД^.Н - зависимой системах переокисления липидов клеток ¿лСтопе £(а с!и&у

Поскольку межмембранные и межклеточные контакты могут влиять яа процессы выделения МДА из мембраны в межклеточное пространство, и характер межмембранных взаимодействий плазмидных клеток отличается от таковых бесплазмидного штамма, мы задались целью до эпределения точного .количества МДА выявить роль межклеточных п лежмембранных контактов при определении количества МДА.

Окисление липидов мембран, как показано многочисленными экспериментами /йлл^ил«^ / подчиняется законам жидко-разного окисления органических веществ. Если процесс протекает в диффузионной области, то не исключено, что скорость выделения МДА в межклеточное пространство должна зависеть в первую

г/

эчередь от площади свободной поверхности клеток / к /'• тогда для клеточной суспензии получим:

с/ ±

где К0 - константа процесса переноса ЭДЦА из мембраны в межклеточ-гое пространство, /V - концентрация клеток в системе. Следовательно, для разрушенных клеток будем тлеть:

Выход МДА в межмембранное или межклеточное пространство будет зависеть от двух противоположных процессов: а/ увеличения Я I б/ уменьшения свободного от контактов поверхности клетки и мемб-

Изучетя ПОЛ проводились на клетках

, находящихся

I (од и стационарной фазе роста. Представленные в табл. 3 дан-шв давт возможность частично охарактеризовать процесс ПОЛ в клет-

ках с/г-г-^у в зависимости от фазы роста и концентрации клет<

Таблица 3

Процесс перекисного окисления липидов в клетках &а£тспе£(-о. в зависимости от фазы роста

и концентрации клеток

Логарифмическая фаза роста

Стационарная фаза роста

Штаммы Концентрация клеток

0,1 0,2 0,2 0,4 0,7

Количество малонового диальдегида на I мг белка

К89 дикий плазмидосодержащий, клеточная суспензия 140,1+ 0,02 54,32+ 0,10 36,216+ 0,34 118,54+ 0,14 54,02+ 0,01

К89 дикий плазмидосодержащий клеточный экстракт 20,05+ 0,41 30,9+ 0,2 9,9+ 1,21 26,3+ 0,23 71+ 3,06

К82 бесплазмидный, клеточная суспензия 32,011+ 0,21 32,79+ 0,91 34,66+ 0,11 36,95+ 0,81 26,005} 1,23

К82 бесплазмидный, клеточный экстракт 27+ 0,03 27+ 0,24 13,1+ 2,0 34,8+ 1,13 77,2+ 2,11

Тр82 трансформант 132.47+ ■ плазмидный, клеточная 0,44 суспензия 85,59+ 0,061 67,91+ 0,17 64,34+ 2,84 35,21+ 0,51

Тр82 трансформант плазмидосодержащий клеточный экстракт 174,2+ 10,01 101,7+ 10,25 13,5+ 1,3 34,4+ 2,3 79,6+ 10,13

Результаты экспериментов свидетельствуют, что в клетках с^ег^у кинетическая направленность реакции ПОЛ не опред< ляется й - плазмидой.

При концентрации клеток 10=0,4, для обеих типов клеток межклеточные контакты существенно не влияют на определен;

МДА, при этом выявлено, что количество МДА у клеток о/ег^у, лишенных Я - плазмиды, как в аскорбат - зависимой системе пере- -окисления, так и в НАДФ.Н - зависимой системах окисления, примерно в 18 раз больше, чем в плазмвдных клетках.

Обладая мощным мембранотоксичным действием, липидные переки- '. си в сочетанци с ЛЖ приводят к развитию мембранолитического .эффекта, в результате мембрана клеток . & К82 становится -более гидрофобной и, по всей вероятности, изменяются её проницаемость л степень кристалличности.-

Структура мембран находится,во взаимосвязи с физиологией не - -только мембраны, но и клетки в' целом. Для клеток ^-с/ег^у 'выявлено, что оптимальный РН роста окружающей среды равен-7,0 - 7-,5, при котором мембраны этих клеток находятся в наиболее упорядоченном состоянии.

Результаты экспериментов свидетельствуют, что усиление межклеточных контактов и интенсивности течения реакции ПОЛ, как и повышение степени внутримембранной неупорядоченности, обусловленной также наличием большого'количества ЛфХ, бесплазмидных ¡слеток &'. , - по всей вероятности, способствуют замедлению роста

и размножения, в то время, как высокие концентрации' ¿с- токоферола играют существенную роль в регуляции клеточного метаболизма Я- с!ел£>у л82.

Механизм эффекта й- плазмиды на структурно - функциональную деятельность мембран клеток Ь' с!е\ пока представляется гипотетическим, однако результаты наших исследований указывают на то, что изменение изученных физико - химических характеристик мембран клеток , обусловленных отсутствием я - таз--

мили, сопровождается, наверное, изменением характеристик других компонентов как мембраны, так.и клетки, в целом, включая также

изменение состояния генетического аппарата клетки.

Обсуждение результатов может лежать в основе других специальных исследований по развитию самых разных областей мембраноло-гии бактериальных клеток с целью раскрытия также путей формирования клеточных стенок бактерии, их формообразования.

Нет сомнений, что в формировании механизма показанных в работе сдвигов принимает участие арсенал многочисленных других факторов, среди которых наиболылеЕО внимания заслуживают ферментативные системы, катализирующие реакции как биосинтеза, так и распада указанных соединений, равно как и активность фосфолипидтранс-портирующих систем.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена роль Ц - плазмиды в физико - химической организации клеточных стенок ева ¿еЛу

2. Мембраны плазмидосодержащих и бесплазмидных клеток

имеют жидкокристаллическую структуру. Внутренняя углеводородная часть мембран клеток жидкоподобная. Наличие И - плазмиды приводит к образованию упорядоченных участков мембран, обусловленных полярными головками фосфатидилхолинов /11А°у и фосфатидилэтаноламинов /8А°/.

3. Отсутствие К - плазмиды приводит к изменению качественного и количественного состава фосфолипидов, их жирных кислот.

В бесплазмидных клетках наблюдается повышение процентного содержания лизофосфатидилхолинов.

4. Сдвиги фосфолипидного метаболизма в бесплазмидном производном В. с/е-г/у одновременно сопровождаются интенсификацией реакции ферментативного и неферментативного перекисеобразования на фоне установленного относительно высокого содержания Л- токо-

ферола.

5. Четко выраженные межмембранные контакты у бесплазмидного штамма.приводят к нарушению метаболических процессов, замедлению роста и размножения клеток с/е г .

6. Соответствие качественного и количественного состава фосфолипидов и их жирных кислот, а также интенсивности реакции перекисного окисления липидов клеток трансформантов и исходных плазмидосодержащих клеток & К89 свидетельствует о детерминированности fi- плазмидой структурно - функциональных свойств мембраны клеток

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

i

1. Пепоян А.З. Рентгеноструктурный анализ клеточной мембраны штамма £ с/е t К89 и его бесплазмидных производных. Тезисы III конференции Молодых Ученых Института экспериментальной биологии АН АрмССР, г. Дилижан, 1988, с. 51.

2. Пепоян А.З., Кцоян S.A., Карагезян К.Г. Особенность процесса перекисеобразования в плазмидосодержащих и бесплазмидных клетках SblmoneUo. c/eifyx - объединенный симпозиум биохимических обществ СССР - ГДР. Тезисы докладов, 1989,

М., с. 59. .

3. Рерч*п A-U Kitoy** С К К*«г«;ал К. G. The Ые ВС H-pUsmLd on Ue abanqt of pbospbo Upifs and thtU fAttu ^cids in Sadnoneka cle*ty се6&. FEBS iOtt meetCne ofUt Federation of Swicptan Bio-chemical societies. Budapest, August 13-^, i330p50b.

4. Пепоян А.З. О составе фосфолипидов в клетках ЗаСпъопеС 1а Тезисы 6-ой Научно - технической конференции . молодых ученых и специалистов р-на 26 ксштсаров, г. Ереван, 1990, с. 82.

5. Пепоян А.З., Кцоян ¡¿.А., Шагинян A.A., Осипян Л.!Л., Ка-рагезян К.Г. Роль мембранных взаимодействий в процессе образования перекисей в плазмидных и бесплазмидных клетках ь>й^тсле

tfe. tle-i&f Биофизика, 1990, в печати.

6. Пепоян А.3., Осипян Л.М., Погосян-А.Ю., Овеян Г.А., Иа-носян -А.Г.Кцоян ¿i.A., Карагез ян К.Г. Сравнительная оценка фосфолипидов и их жирных кислот в плазмидссодержала« и бесплазмидных ¡слетках SütjncneCia. Биохимия, 1990, в печати.

7. Пепоян А.З., Бадалян Г.Г., Кцоян H.A., Карагезян К.Г. Влияние £ - плазмиды на формирование клеточных контактов и процесс перекисного окисления липидов плазмилных i; осс-плазшдных клеток £аС/лсле.£Са de-lCj'/ докл. АН Респ. Армении, 1990, в печати.

8. Пепоян А.З., Кцоян i.A., Шагинян A.A., Бадалян Г.Г., Карагезян К.Г. Влияние Я. - плазмиды на структуры мембран клеток

ВайполеМб dei Су в жидкокристаллической .¡а-зе. / ¡Лолекулярная биология, в печати.

Г,

f

Сдано в производство 21.10.1990г. Бум.. 60 х 84, 1,25 печ.л. Заказ 185 ' Тиран 100

Цех Ротапринт Ереванского госуниверситста, Ереван, ул. Кравяна I