Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение транспорта Ti-плазмида pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Великов, Владимир Александрович, Пущино

j

ПУЩИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Учебный центр физико-химической биологии и биотехнологии ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

БЕЛИКОВ ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ТРАНСПОРТА Ti-ПЛАЗМИДЫ pGV3850 ИЗ AGROBACTERIUM TUMEFACIENS В ESCHERICHIA COLI

На правах рукописи

03.00.07 - микробиология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор Я.И.Бурьянов

Пущино - 1995

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Взаимоотношения фитопатогенных агробактерий с растениями. 10

1.1.1. "Генетическая колонизация". 10

1.1.2. Структурно-функциональная организация Тьплазмид. 11

1.2. Гены коньюгационного переноса Тьплазмид и регуляция

их экспрессии. 13

1.2.1. Перенос Тьплазмид при конъюгации бактерий. 13

1.2.2. Организация генов коньюгационного переноса Тьплазмид. 14

1.2.3. Экспрессия генов коньюгационного переноса Тьплазмид. 15

1.2.4. Гомология системы коньюгационного переноса Тьплазмид

с другими системами. 17

1.3. Хромосомные гены вирулентности агробактерий. 18

1.3.1. Хромосомные мутации, влияющие на патогенность микроорганизма. 18

1.3.2. Сходство ранних этапов взаимодействия Agrobacterium и ЯкггоЫит с растениями. 19

1.4. Ть и Ил-плазмидные гены вирулентности агробактерий и регуляция их экспрессии. 20

1.4.1. Организация у/У-генов Тьплазмид. 20

1.4.2. Экспрессия угУ-генов Тьплазмид. 21

1.5. Процессинг Т-ДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений. 24

1.5.1. Формы процессированной Т-ДНК. 24

1.5.2. Конъюгативная модель переноса Т-ДНК. 26

1.6. Структурно-функциональное сходство vir- и /га-генов как доказательство конъюгативной модели. 30

1.7. Взаимодействие систем переноса ДНК Ti-плазмид. 31

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы. 34

2.1.1. Оборудование. 34

1.1.2. Реактивы и ферменты. 34

2.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды. 35

2.1.4. Растения. 37

2.1.5. Среды, растворы. 37

2.2. Методы. 42

2.2.1. Проведение скрещиваний между Agrobacterium tumefaciens и Escherichia coli. 42

2.2.2. Проведение скрещиваний в условиях, индуцирующих экспрессию v/л-генов. 43

2.2.3. Анализ трансконъюгантов. 44

2.2.4. Быстрое выделение небольших количеств плазмидной

ДНК методом щелочного лизиса. 45

2.2.5. Модифицированный метод скрининга плазмид в геле

по Секару. 46

2.2.6. Модифицированный метод выделения плазмидной ДНК

по Бирнбойму и Доли. 47

2.2.7. Скрингинг плазмид в геле по Экхардту. 48

2.2.8. Выделение тотальной ДНК из клеток E.coli. 49

2.2.9. Приготовление компетентных клеток E.coli и их трансформация препартами плазмидной ДНК. 49

2.2.10. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 50

2.2.11. Приготовление ДНК-зондов и и блот-гибридизация ДНК. 51

2.2.12. Введение векторных плазмид в Erwinia carotovora и эксперименты по трансформации растений. 52

2.2.13. Клонирование ДНК. 53

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Конъюгационный перенос Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. 54

3.2. Перенос Ti-плазмиды pGV3850 из Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli в условиях, индуцирующих экспрессию уг>-генов. 57

3.3. Анализ трансконъюгантов. 59

3.4. Рестрикционный и гибридизационный анализ плазмид, полученных при скрещиваниях в условиях экспрессии Wr-генов. 61

3.5. Клонирование у/>-области Ti-плазмиды pGV3850. 65

3.6. Введение Wr-генов Agrobacterium tumefaciens в Erwinia carotovora и использование эрвинии в экспериментах по трансформации растений. 70

3.7. Способ предотвращения размножения клеток Agrobacterium и Erwinia на среде для культивирования трансформируемых тканей растений. 76

3.8. Скрещивания штаммов Agrobacterium tumefaciens, содержащих плазмиды бинарной векторной системы трансформации растений, с Escherichia coli. 82

ОБСУЖДЕНИЕ 84

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94

ВЫВОДЫ 96

ЛИТЕРАТУРА 97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОБ - додецилсульфат натрия;

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат;

Трис - трис(оксиметил)аминометан;

БФС - бромфеноловый синий;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

1РТО - изопропилтиогалактозид;

Х-ва1 - 5-бром-4-хлор-3-индолил-{3-галактозид;

Ьр, п.н. - пар нуклеотидов;

кЬ, т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов;

МЮА - мегадальтон;

кОа - килодальтон;

РНКаза - рибонуклеаза;

ДНКаза - дезоксирибонуклеаза;

АТР - аденозинтрифосфат.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы. Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений корончатогалловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-156 MDa) конъюгативных плаз-мид - Ti-плазмид (tumor-inducing plasmid). В процессе инфицирования растений часть генетического материала Ti-плазмиды - Т-ДНК (transferred DNA) - переносится в растительные клетки и интегрируется в хромосомы, становясь частью наследственного аппарата высшего растения. Гены Т-ДНК, экспрессирующиеся в трансформированных растительных клетках, нарушают их фитогормональный статус, что приводит к развитию опухоли, и детерминируют синтез растениями необычных для них соединений - опинов, которые катаболизируются агробактериями. Опины выступают также в качестве стимуляторов экспрессии генов транспорта плазмиды (/га-генов) между клетками Agrobacterium при конъюгации, происходящей в природе в тканях корончатого галла (in planta). В отсутствии опинов дерепрессия tra-генов может произойти в результате спонтанных мутаций.

Перенос Т-ДНК в растительные клетки контролируют vzr-гены Ti-плазмиды, экспрессирующиеся в присутствии специфических индукторов - соединений фенольной природы из экссудатов механически поврежденных тканей растений. Транспорт Т-ДНК в растения осуществляется по механизму, сходному с механизмом транспорта ДНК при конъюгации бактерий. Получены данные о значительном структурном сходстве между белками и функциональными участками ДНК, вовлеченными в процесс передачи Т-ДНК и в процесс конъюгационного транспорта некоторых плазмид. Так, уг>-гены проявляют значительную гомологию ДНК с rra-генами конъюгативных плазмид широкого круга хозяев, а границы Т-ДНК являются структурно-функциональными

аналогами опТ. КгУ-гены Ti-плазмид проявляют гомологию также с собственными г/чз-генами, хотя и значительно менее выраженную.

Вопрос о взаимодействии этих двух родственных систем переноса ДНК в клетках агробактерий изучен мало. Мало известно о том, как экспрессия генов одной системы влияет на экспрессию другой. Не известно, способна ли система транспорта Т-ДНК в растения обеспечивать ее перенос в клетки бактерий. Нет полной ясности в вопросе о том, возможен ли транспорт Т-ДНК в растения из бактерий, не родственных Agrobacterium. В связи с широким использованием Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes в генной инженерии растений актуален также вопрос об опасности переноса элементов агробактери-альной системы трансформации растений в другие бактерии с приобретением ими трансформирующей способности.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение переноса Ti-плазмид и их Т-ДНК из клеток A.tumefaciens в клетки E.coli при конъюгации. Для этого в работе использовали векторную Ti-плазмиду для трансформации растений pGV3850 со встроенной в область Т-ДНК плазмидой pBR322. Структура pGV3850 позволяет следить за ее переносом (или переносом ее Т-ДНК) в кишечную палочку по спасению маркера ампициллин-резистентности плазмиды pBR322. Способность к автономному поддержанию в энтеробактериях позволяет исследовать возможность функционального выражения ген етического материала Ti-плазмид в неродственных бактериях. Структура этой векторной Ti-плазмиды позволяет также изучить влияние экспрессии vir-генов на процесс переноса плазмиды и выяснить вопрос об их способности обеспечивать транспорт Т-ДНК в бактерии.

В число основных задач входило:

1) Изучение транспорта Ti-плазмид в клетки неродственных бактерий при конъюгации.

2) Исследование влияния экспрессии у//--генов на процесс переноса Ti-плазмид.

3) Выяснение вопроса о возможности транспорта Т-ДНК в бактерии.

4) Клонирование wV-области Ti-плазмиды pGV3850 в клетках E.coli в высококопийной плазмиде на основе Со1Е1-репликона.

5) Введение v/У-генов A.tumefaciens в клетки взаимодействующих с растениями бактерий Erwinia carotovora и Erwinia herbicola и выяснение вопроса об их функциональном выражении в неродственных бактериях-хозяевах. Оценка риска распространения генов агробактериальных систем вирулентности среди бактерий.

6) Разработка способа предотвращения размножения A.tumefaciens на среде для культивирования трансформированных тканей растений.

Научная новизна работы. Впервые получена представительная коллекция производных векторной Ti-плазмиды pGV3850 с протяженными делециями генетического материала. Показано, что, несмотря на структурно-функциональную общность, система конъюгационного переноса Ti-плазмид и система транспорта Т-ДНК в растения работают независимо друг от друга и не взаимозаменяемы. Установлено, что система транспорта Т-ДНК в растения не способна обеспечить ее перенос в бактерии. Выделены методами "клонирования in vivo" гены у/>-области Ti-плазмиды pGV3850 в составе единого кластера в высококопийной плазмиде на основе Со1Е1-репликона. KzV-гены Agrobacterium tumefaciens введены в клетки взаимодействующих с растениями бактерий Erwinia carotovora и Erwinia herbicola; показано их стабильное поддержание в новых хозяевах и отсутствие способности трансформировать растения. В связи с этим оценена как незначительная опасность распространения генов вирулентности агробактерий среди микроорганизмов.

Практическое значение работы. В ходе работы получен широкий набор делеционных производных Ti-плазмиды pGV3850, в том числе

содержащих все у/г-гены. Разработан способ предотвращения размножения АЛите/а&ет на среде для культивирования растений при проведении их генетической трансформации. Предложенный метод позволяет устранить нежелательное стрессовое воздействие высоких доз антибиотика на трансформированные экспланты. Описанное явление делетирования 'Птплазмид, содержащих ориджин репликации опУ плазмиды Со1Е1, в результате переноса из клеток почвенных бактерий в клетки кишечной палочки предлагается использовать для клонирования фрагментов ДНК мегаплазмид.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Взаимоотношения фитопатогенных агробактерий с растениями 1.1.1. "Генетическая колонизация"

В природе растения постоянно контактируют с огромным количеством различных микроорганизмов. Однако, лишь небольшое число их видов способны формировать с растениями сравнительно стабильные ассоциации. В первую очередь это относится к бактериям, находящимся с растениями в отношения симбиоза, паразитизма или ассоциативного взаимодействия.

Изучение на молекулярном уровне патогенеза, вызванного у растений фитопатогенными агробактериями, выявило совершенно особый тип паразитизма. Патогенное начало Ti-плазмид бактерий вида Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмид бактерий вида Agrobacterium rhizogenes заключается в том, что их фрагмент, так называемая Т-ДНК (transferred DNA), переносится в растительную клетку и интегрируется в ядерную ДНК, становясь частью наследственного аппарата высшего растения (Chilton et al., 1977). Трансформированные клетки растений начинают производить необычные для них соединения - опины, которые усваиваются бактериями (Petit et al., 1978). Такой тип взаимоотношений между организмами был назван "генетической колонизацией". Грамотрицательные почвенные бактерии вида Agrobacterium tumefacies вызывают у растений опухоли, называемые корончатыми галлами (Zaenen et al., 1974). Причиной неоплазии у растений является интеграция в их геном части генетического материала агробактериаль-ной Ti-плазмиды - Т-ДНК (Van Larebeke et al., 1974; Chilton et al., 1977). Экспрессирующиеся в трансформированных растительных клетках гены Т-ДНК нарушают их гормональный статус, приводящий к развитию опухоли (гены синтеза фитогормонов), и детерминируют синтез растениями опинов (гены опин-синтетаз). Опины представляют собой

конъюгаты некоторых аминокислот с оксикислотами (Klapwijk et al., 1978). Эти соединения катаболизируются агробактериями, выступая в качестве единственного источника углерода, азота и энергии, и, кроме того, служат индукторами экспрессии ira-генов, контролирующих перенос Ti-плазмид между клетками агробактерий при конъюгации, происходящей в природе в тканях корончатого галла (Kerr et al., 1977). Для микроорганизма это имеет приспособительное значение. В случае инфицирования растения в месте его механического повреждения и появления опинов в тканях развивающейся опухоли, размножившиеся клетки бактерий приобретают способность переносить Ti-плазмиды в клетки других штаммов агробактерий, которые тех не содержат.

1.1.2. Стуктурно-функциональная организация Ti-плазмид

На рис.1 приведена карта-схема нопалиновой плазмиды штамма A.tumefaciens С58 (Holsters et al.,1980), поражающего различные двудольные растения.

Т-ДНК

КБ

Рис. 1. Функциональная организация плазмиды pTiC58. VIR - область вирулентности,Noc - область, обеспечивающая катаболизм нопалина, LB, RB - левая и правая границы Т-ДНК, Tra,Trb - области ira-регулона, контролирующие конъюгацию, oriT - область инициации репликации при конъюгационном переносе, oriV - область вегетативной репликации плазмиды.

Т-ДНК Ti-плазмиды ограничена несовершенными 24-членными прямыми повторами нуклеотидов - границами Т-ДНК, правая из которых является абсолютно необходимой для ее нормального процессинга и переноса (Wang et al., 1984). Различия в пограничных повторах составляют несколько нуклеотидов. Процессинг Т-ДНК в бактериальных клетках и ее транспорт в клетки растений осуществляется в результате экспрессии у/>-генов Ti-плазмид. F/V-регулон, за исключением генов virA и virG, в норме зарепрессирован и его гены экспрессируются только в присутствии специфических индукторов -соединений фенольной природы типа ацетосирингона (4-ацетил-2,6-диметоксифенол) из экссудатов механически поврежденных тканей растений. Эти гены экспрессируются при особых условиях - низком значении рН и фосфатном голодании.

Перенос Ti-плазмиды между бактериями при конъюгации контролируется генами ira-регулона, картируемого в двух независимых регионах. Стимуляторами экпрессии генов конъюгационного переноса являются опины. Их катаболизм также контролируется особым регионом Ti-плазмиды.

Таким образом, обе системы переноса генетического материала природных Ti-плазмид (для транспорта Т-ДНК в растения и для переноса плазмиды в агробактерии при конъюгации) экспрессируются только в присутствии сигнальных молекул, поступающих из контактирующих с бактериями растительных клеток. Первая - в присутствии фенольных соединений из поврежденных растительных клеток, восстанавливающих клеточную стенку, вторая - в присутствии опинов, продуцируемых трансформированными клетками опухоли. Описаны спонтанные мутанты агробактерий с конститутивным транспортом Ti-плазмид (Holsters et al., 1980; Ellis et al., 1982).

1.2. Гены конъюгационного транспорта Ti-плазмид и регуляция их экспрессии

1.2.1. Перенос Ti-плазмид при конъюгации

Ti-плазмиды Ag'robacterium tumefaciens относятся к конъюгативным плазмидам и способны передаваться при скрещиваниях от одних клеток Agrobacterium к другим, бесплазмидным (Genetello et al., 1977; Kerr et al., 1977; Beck von Bodman et al., 1989). Экспрессия генов ¿ra-регулона (среди которых у агробактерий различают tra- и //-¿-гены (Cook at al., 1997; Alt-Moerbe et al., 1996) стимулируется, как уже отмечалось, специфическими растительными метаболитами - опинами, появляющимися в клетках растений в процессе формирования и развития опухоли. Опины представляют собой конъюгаты аргинина с кетокислотами - а-кето-глютаровой (нопалин) и пировиноградной (октопин). Тип катаболизи-руемого опина определяется типом плазмиды. Активация генов катаболизма опинов и индукция экспресии /га-генов происходит сопряженно (Fuqua and Winans,1994; Habeeb et al., 1991). Как показывают работы последних лет гены конъюгационного транспорта плазмиды могут быть активированы в результате автоиндукции при наличии в среде "агробактериального автоиндуктора" - N-ацил-гомосерин-лакто-на, продуцируемого arpo бактерия ми (Piper et al., 1993; Zhang et al., 1993; Hwang et al.,1995; Cook et al., 1997). Синтез бактериями этого автоиндуктора также зависит от появления опинов в среде. Как только по мере увеличения плотности бактериальной популяции в корончатом галле накапливается достаточно много автоиндуктора в среде обитания бактерий, Ti-плазмиды приобретают способность к эффективной передаче между бактериальными клетками. Конъюгация происходит только при достаточно большом количестве донорных клеток (система quorum sensing). Подобные регуляторные системы, реагирующие на ацилированный лактон гомосерина, описаны у различных бактерий.

Регион, ответственный за конъюгационный перенос, для ряда Ti-плазмид картирован и определенные мутации, возникающие спонтанно в этом регионе с частотой 10-8, обуславливают дерепрессированный транспорт Ti-плазмид между агробактериями (Von Bodman et al., 1989).

1.2.2. Организация генов конъюгационного переноса Ti-плазмид

Гены конъюгационного переноса наиболее типичных представителей октопиновых и нопалиновых Ti-плазмид картированы, клонированы и секвенированы. Для передачи нопалиновой Ti-плазмиды pTiC58 в клетки бактерии-реципиента необходимы два ее региона (Cook at al., 1997). Один кластер генов, обозначаемых как /га-гены, к�