Анализ структурно-функциональных свойств комплексов белка вирулентности агробактерий VirE2

Мазилов, Святослав Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ структурно-функциональных свойств комплексов белка вирулентности агробактерий VirE2
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурно-функциональных свойств комплексов белка вирулентности агробактерий VirE2"

На правах рукописи

Мазилов Святослав Игоревич

АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКА ВИРУЛЕНТНОСТИ АГРОБАКТЕРИЙ У1гЕ2

03.01.02 - биофизика

005007573

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯНВ 2012

Воронеж - 2011

005007573

Работа выполнена на базовой кафедре биофизики факультета нелинейных процессов Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования (ФГБОУ ВПО) Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чумаков Михаил Иосифович

доктор биологических наук, профессор Попова Татьяна Николаевна

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт Цитологии и Генетики Сибирского Отделения РАН (ИЦиГ СО РАН)

Защита состоится «13» января 2012 г. в 13 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу 394006, г. Воронеж, Университетская пл., д.1.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университет.

Автореферат разослан «/р1л> декабря 2011 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Агробактериальная Т-ДНК является уникальным природным вектором для переноса генов в геном растительных клеток, поскольку любой ген, размещенный между правой и левой границей Т-ДНК, может быть перенесен и встроен при участии белков VirE2 и VirD2 в геном растений и дрожжей. Белок VirE2 обладает несколькими важными для этого процесса функциями, в том числе он участвует в процессе перемещения Т-ДНК через мембрану и в цитоплазме растительной клетки, связываясь с белками-кариофилинами. Т-комплекс, управляемый пилотирующим белком VirD2, может перемещаться в цитоплазме клетки с помощью импортина а/р, который взаимодействует с микротрубочками и микрофиламентами цитоскелета клетки.

Лечение заболеваний с помощью генов (генотерапия) является перспективным направлением в медицине. Одним из критических этапов для данной технологии является перенос экзогенных ДНК-конструкций через мембрану клетки-мишени. В 2004 г. была показана принципиальная возможность переноса T-flHK-VirE2-VirD2 белкового комплекса (Т-комплекса) в животную клетку (Kunik et al., 2001), однако потенциал переноса ДНК в животную клетку в целях генотерапии с участием белка VirE2 пока не изучен.

Считается, белок VirE2 может формировать комплекс (пору) для переноса коротких олигонуклеотидов через эндоплазматическую клеточную мембрану (Dumas et al., 2001). Однако доказательств возможности формирования поры и переноса Т-ДНК через \%Е2-зависимую пору пока не представлено.

Таким образом, исследование механизма переноса белкового комплекса Т-ДНК-УкЕ2 через эндоплазматическую мембрану в растительную и животную клетки при участии белка VirE2 представляет теоретический и практический интерес для изучения, поскольку с одной стороны, эту систему можно использовать в качестве удобной модели для изучения структуры и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов, а с другой стороны, этот природный механизм переноса ДНК-белкового комплекса можно использовать в медицинских технологиях генотерапии для доставки целевых генов в эукариотическую клетку.

Учитывая, что трансгенные растения в настоящее время занимают площадь более ста миллионов гектаров в мире, актуальной является и задача определения биобезопасности встроек агробактериальной Т-ДНК в геном растений. Поэтому актуальной задачей является анализ геномов растений на наличие вставок Т-ДНК.

Целью данной работы было изучение роли белка VirE2 и его комплексов в переносе одноцепочечной ДНК через искусственные и природные мембраны.

Для достижения данной цели в работе решались следующие задачи:

1. Провести компьютерный анализ вторичной, третичной структур

белка VirE2 и его комплексов.

2. Оценить размеры рекомбинантного белка VirE2 и комплексов in vitro.

3. Изучить взаимодействие белка VirE2 с мембранами, оцДНК.

4. Изучить влияние белка VirE2 на перенос олигонуклеотидов в растительные и животные клетки.

5. Провести компьютерный анализ присутствия фрагментов Т-ДНК из Ti-, Ri-плазмид агробактерий в геномах растений и низших животных.

Научная новизна работы:

Впервые смоделирована вторичная структура всего белка V¡rE2 и установлено, что на TV-конце VirE2, не вошедшем в рентгеноструктурную модель, имеется одна а-спираль.

Впервые показано, что белок VirE2 в буферном растворе может образовывать комплексы из двух и четырёх индивидуальных белков.

Впервые показано, что комплекс из двух и четырёх белков V¡rE2 может быть встроен в мембрану и формировать поры с диаметром до 2 и 4,6 нм соответственно.

Впервые установлено, что белок VirE2 способствует переносу олигонуклеотидов в клетки HeLa.

Впервые методом in silico показано, что в расшифрованных геномах растений Catharanthus, Linaria, Kalanchoe, Kleinia, обнаруживаются фрагменты Т-ДНК, включающих гены roIA, rolB, rolC, mis, or/8, orfl3, orfl3a, orfl4.

Научно-практическая значимость работы

Установлено, что белок VirE2 способствует попаданию олигонуклеотидов в животную клетку, что может дать основу для разработки безвирусных технологии доставки генов в животную клетку для технологий генотерапии.

В ходе работы получены доказательства инсерции в геном различных растений фрагментов Т-ДНК агробактерий в ходе природной эволюции растений, что представляет практический интерес при разработке концепций безопасности ГМО.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Смоделированы in silico вторичная, третичная структуры всего белка VirE2 и его комплексы из двух, четырёх субъединиц.

2. Рекомбинантный белок VirE2 в буферном растворе образует комплексы из двух, четырёх индивидуальных белков и при взаимодействии с оцДНК может формировать ДНК-белковый комплекс, уменьшая длину оцДНК.

3. В модельной структуре, состоящей из двух и четырёх молекул VirE2, расположенной в бислойпой мембране возможно образование пор с диаметром капала 2 и 4,6 нм, соответственно.

4. Белок VirE2 является порофомером и способствует попаданию олигонуклеотидов в животные клетки HeLa и увеличивает электропроводность плоских мембран.

5. Фрагменты Ri-, Ti-плазмид агробактерий обнаружены in silico в геномах некоторых растений и беспозвоночных.

Работа выполнена на базовой кафедре биофизики ФНП СГУ в течение 2006-2011 гг. в рамках плановой темы НИР «Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки», № гос. регистрации 01200606182; научный руководитель - д. б. п. Чумаков М. И. Исследования поддержаны грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2) шифр «2007-2-1.2-09-01-137» по теме: «Разработка технологии переноса Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы» (рук. Чумаков М. И.) и грантом РФФИ 11-04-01331а «Изучение механизма переноса Т-ДНК агробактерий в генеративные клетки кукурузы (20112013 гг.)» (рук. Волохина И. В.).

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с

другими исследователями

Личный вклад соискателя состоит в получении всех представленных данных по анализу встройки Т-ДНК геномы различных растений, компьютерном моделировании двумерных и трехмерных структур белка VirE2 и его комплексов in silico, а также в описании и обработке полученных данных. Опыты по анализу роли белка VirE2 в переносе через искусственные и природные мембраны, оценке ДНК белковых комплексов методами динамического рассеяния света (ДРС), трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), биоинформатики проведепы при участии сотрудников лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН И. В. Волохиной, Ю. С. Гусева, сотрудника лаборатории нанобиотехнологии Н. Г. Хлебцова, что отражено в публикациях. Планирование экспериментов, интерпретация экспериментальных и компьютерных данных, подготовка результатов к публикации проводились под руководством и при участии М. И. Чумакова.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на международной конференции 4-th Intern. Conf. on Bioinformalics of Genome Regulation and Structure, BGRS'2006) (Новосибирск, 2006), на научной школе-конференции "Нелинейные дни в Саратове для молодых - 2006" (Саратов, 2006), на ШМежрег. конф. молодых учёных "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2006), на междунар. конф. Moscow Conf. on Computational Molecular Biology MCCMB'07 (Москва, 2007), на Всеросс. конф. с междунар. участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), на междунар. конф. "S.P. Kostychev and Contemporary Agricultural Microbiology" (Ялта,. Украина, 2007), на междунар. конгрессе XX Intern. Congress of Genetics (Берлин, Германия, 2008), па междунар. конф. 6-th Intern. Conf. on Bioinfonnatics of Genome Regulation and Structure, BGRS'2008) (Новосибирск, 2008), на X Всеросс. конф. "Биомеханика-2010" (Саратов, 2010), на междунар. конф. Intern. Conf. Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology (Новосибирск, 2010), на XIV Intern. School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics "Saratov Fall Meeting

SFM'10" (Саратов, 5-8 октября 2010), на 2-ой ежегодной науч.-технич. конф. Нанотехнологического общества России "Перспективы развития в России НБИК-технологий как основного научного направления прорыва к шестому технологическому укладу", (Москва, 14-15 октября 2010), на III Междунар. форуме по нанотехнологиям "RUSNANOTECH 2010" (Москва, 1-3 ноября 2010), на междунар. конф. Intern. Moscow Conf. on Computational Molecular Biology MCCMB'l 1 (Москва, 21 -24 июля 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы с изложением и обсуждением собственных результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 250 источников. Диссертация изложена на 135 печатных страницах, содержит 33 рисунка и 12 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы, в котором рассмотрены основные механизмы мембранного транспорта различных веществ, включая ДНК. При этом особое внимание уделено строению белковых пор. Отдельно рассмотрены ядерные поровыс комплексы, проанализированы современные сведения об их строении и функционировании. Также освещена проблема горизонтального переноса генов, подробно изложены влияющие на его эффективность и способствующие ему факторы. Также отмечены и ограничения на перенос генов между отдалёнными таксонами. Приведены множественные примеры явления переноса генов среди вирусов, прокариот и эукариот. Рассмотрены способы выявления факта произошедшего переноса генов и отмечена важная роль процессов горизонтального переноса в изменчивости, видообразоваиии и эволюции прокариот, а также эукариот. Внимание уделено также опасениям в биобезопасности этого явления. Механизм горизонтального переноса генов с участием агробактерий рассмотрен отдельно и более подробно. При этом особое внимание уделено переносу ДНК через мембраны растительной клетки и роли белка VirE2 в этом процессе. В заключительной части 1-й главы сформулированы нерешенные проблемы и задачи исследования.

Сведения об использованных материалах и методах изложены в главе 2. В ней перечислены использованные в работе реактивы, оборудование, среды, буферные растворы, микроорганизмы и культуры клеток. Приведены методики выделения и очистки белка VirE2, получения оцДНК, получения липосом и плоской липидной мембраны. Отдельно описаны процедуры определения размеров белков методом динамического лазерного рассеяния света и трансмиссионной электронной микроскопии. Подробно изложена методология измерения флуоресценции эукариотических клеткок после инкубации с белком

VirE2 и мечеными олигонуклеотидами. Описана методика статистической обработки множественных данных. Также описаны использованные в работе компьютерные программы и базы данных, перечислены использованные

белковые структуры.

В работе использовали культуру клеток HeLa, любезно предоставленную О. А. Бибиковой и С. А. Староверовым (ИБФРМ РАН).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Компьютерный поиск гомологов белка VirE2

Поскольку на момент начала работ вторичная и третичная структура белка VirE2 была неизвестна, они были нами смоделированы. Точность моделирования структуры белка существенно повышается, если оно опирается на структуры его гомологов. Поиск гомологов белка VirE2 производился по его первичной последовательности (UniProt ID Р08062) при помощи программ семейства BLAST (blastp и tblastn) в базах как аминокислотных, так и нуклеотидных последовательностей RefSeq, GenBank, PDB, SwissProt, EMBL, DDBJ, PIR. Все содержащиеся в базах записи, обнаруживающие с заданной последовательностью высокую гомологию (£«1), ссылаются на агробактериальные белки (вирулентные и ДНК-связывающие) и фрагменты плазмид бактерий Agrobacterium íumefaciens, Agrobacíerlum vitis и Rhizobium etli, кодирующие разные варианты белка VirE2, которые выполняют одинаковые функции: участвуют в переносе ДНК, могут связываться с однонитчатой ДНК. Остальные белки не гомологичны белку VirE2 (£>1).

Таким образом, из проведенных поисков видно, что белок VirE2 не имеет гомологов.

3.2 Компьютерное моделирование и анализ вторичной структуры

белка VirE2

Чтобы понять возможные функции, нами при помощи программы PROFsec была смоделирована вторичная структура белка VirE2. Построенная модель обладает большей полнотой, по сравнению с экспериментальной структурой (Dym et al., 2008). В частности, можно предположить, что на N-копце VirE2, не вошедшем в рентгеноструктурную модель, имеется также ещё одна а-спираль на участке 91-104.

Общее число аминокислотных остатков, для которых вторичная структура была предсказана правильно, составило 252 из 376, структура которых определена, то есть 2/3 всей известной в настоящее время структуры было предсказано верно. Причем противоречие структур спираль-складка возникло лишь в 19 случаях (5%). Данный результат позволяет независимо от тестеров программы PROFsec заявить о том, что представляемые ей результаты вполне достоверны.

Таким образом, при помощи PROFsec была смоделирована вторичная структура полной последовательности белка VirE2, содержащая 20 а-спиралей и 16 /?-складок.

3.3 Измерение размера белка VirE2 методом динамического рассеяния света

Известно, что белок VirEl Таблица 1

формирует комплекс с белком VirE2 Размеры комплексов,

в агробактсриальной клетке, взаи- формируемые белками БСА и модействуя с ним по сайтам связывания, одновременно служащим для контакта с одноцепочечной Т-ДНК при образовании Т-комплекса в цитоплазме растительной клетки (Abu-Arish et al., 2004; Dym et al., 2008). Без белка VirEl белок VirE2 склонен к агрегации (Frenkiel-Krispin et al., 2007).

Средний гидродинамический диаметр (ГДД) рекомбинантного белка VirE2 в растворе с концентрацией 200 мкг/мл был измерен методом динамического рассеяния света (ДРС) сразу после его выделения, а также при различных условиях хранения. Чистоту белка определяли с помощью Ds-Na-ПААГ электрофореза.

В растворе белка VirE2, сошедшего с колонки с Ni-NTA-агарозой, и затем обессоленного на колонке с сефадексом G-25, половину (51%) составляли частицы с размерами 12 нм, 47% всех частиц были представлены агрегатами с размерами 115 нм, и лишь небольшая часть (2%) агрегатов имела размер 2800 нм (табл.1). В качестве контроля был измерен гидродинамический диаметр белка БСА, сходного с белком VirE2 по молекулярной массе. Полученный результат совпадает с данными рентгеноструктурного анализа. Результаты измерений приведены в табл. 1.

Таким образом, с помощью метода динамического светорассеяния установлено, что очищенный рекомбинантный белок VirE2 в буферном растворе существует в виде комплексов белка VirE2 размером 12 и 115 нм.

3.4 Измерение комплексов из белков VirE2 и одноцепочечной ДНК

методом ДРС и методом ТЭМ

Рекомбинатный белок, использованный в работе, имеет искусственно введённые шесть остатков гистидина на jV-копце, которые нужны для его селективного выделения, но теоретически они могут вызвать изменение конформации и свойств белка. Поэтому была проверена сохранность функций выделенного рекомбинатного белка.

Средний размер дцДНК длиной 550 н.о., измеренный с помощью метода ДРС, составил 220 нм, при размахе колебаний длины двуцепочечной ДНК от 180 до 250 нм (табл.2). При взаимодействии очищенного и обессоленного

VirE2 в растворе

Варианты ГДД (нм) Доля (%)

БСА 8 93

68 7

VirE2 12 51

115 47

2800 2

VirE2 12 28

(двукратная 115 70

заморозка- 2800 2

оттаивание)

VirE2 после 18 37

16 ч при 4°С 151 60

3000 3

Таблица 2

Размеры гидродинамического диаметра (ГДД) комплексов, формируемых VirE2 с оцДНК,

Образец ГДД(нм) доля

(%)

дцДНК (550 п.н.) 220 180 92 6

250 2

оцДНК (550 н.о.) 140 94

с VirE2 21 6

рекомбинантного белка VirE2 (2 мкг) с оцДНК длиной 550 н.о. (0,2 мкг) спустя 30 мин после начала совместной инкубации были зарегистрированы комплексы с размером 140 нм (94%), а 6% составили частицы с размерами 17-30 нм (табл. 2). Исходя из этих данных, можно видеть, что присутствие белка VirE2 приводит к значительному уменьшению первоначальной длины оцДНК на 63%, что может свидетельствовать об образовании ДНК-белковых комплексов.

Для формирования \%Е2:оцДНК-комплекса in vitro использовали два соотношения УкЕ2:оцДНК - 10:1 и 30:1 в буфере состава 0,02 М Tris-HCl, 5 мМ MgCl2, рН 7,2. При длине одного нуклеотида 0,34 нм, размер оцДНК из 700 оснований должен составлять 238 нм. Размер наблюдаемого методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) оцДНК-комплекса зависел от соотношения белок:ДНК. Так при соотношении \%Е2:оцДНК 10:1 средняя длина оцДНК-комплекса составила 208 ± 10 нм (при колебании размеров от 198 до 210 нм) (рис. 1). При соотношении \%Е2:оцДНК как 30:1 длина комплекса составила 150 нм± 10% (30 измерений). Что составляет 63% первоначальной длины оцДНК (700 н.о.). В работе Абу-Ариш с соавторами при образовании оцДНК-комплекса происходило уменьшение длины оцДНК в 7 раз (Abu-Arish et al, 2004).

wimmmsL^-■ - ■

11 ii I 111 ■ wM

40 нм

20 нм

Рис.1, а) однопитчатая ДНК (1300 и.о.); б) оцДНК (700 ii.(>)-VirE2-KOMiuicKc:

соотношение оцДНК:VirE2 (1:10), ТЭМ, контрастирование 1% уранилацетатом

Ширина оцДНК-белкового комплекса в наших экспериментах колебалась в пределах 15-25 нм и составляла в среднем 15,8 нм (50 измерений). По данным, представленным в работе Абу-Ариш с соавторами, диаметр комплекса составил 15,4нм (АЬи-АпвЬ е! а1., 2004). Т.е. ширина образцов оцДНК-белкового комплекса, измеренная ТЭМ в экспериментах Абу-Ариш с соавторами хорошо коррелировала (АЬи-АшЬ е1 а1„ 2004).

Таким образом, рекомбинантный белок У1гЕ2 в буферном растворе при взаимодействии с оцДНК может формировать ДНК-белковый комплекс, значительно уменьшая длину оцДНК.

3.5 Экспериментальное исследование взаимодействия У1гЕ2 с липосомами

Оценка взаимодействия \%Е2 с липосомами проводилась методом ДРС по изменению исходного ГДД молекул в растворе до и после совместной инкубации. Измеряли ГДД водного раствора липосом и тестируемых белков с исходной концентрацией \%Е2 180мкг/мл и белка БСА- 200 мкг/мл. Результаты измерений представлены в табл. 3. Белки \ЧгЕ2 и БСА смешивали с липосомами в соотношениях 3:2, 9:1 (по объёму исходных растворов) и оставляли на 1, 2 и 18 часов, а затем проводили измерения. При добавлении к раствору липосом белка БСА, диаметр липосом не увеличивался, что свидетельствует об отсутствии опосредованной белком БСА агрегации липосом (табл. 3).

В отличие от белка БСА ко-инкубация белка УиЕ2 с липосомами (при соотношении липосомы:белок 3:2) приводила к изменению соотношения частиц с различным размером уже через 2 часа (табл. 3). Количество агрегатов с размером 58 нм уменьшалось с 75% до 40%, при увеличении количества агрегатов с размером свыше 700 нм более чем в два раза, и агрегатов с размером более 5000 нм в три раза, а через 1 8 часов выпадал осадок, видимый глазом.

При изменении соотношения липосомы:УпЕ2 (9:1) крупные агрегаты с размером более 5000 нм отсутствовали, но количество агрегатов с размером свыше 1000 нм увеличивалось более чем в пять раз после 2-х часовой коинкубации, по сравнению с процентным соотношением таких агрегатов после 1-часовой инкубации (табл. 3).

Таблица 3 Оценка ГДД комплексов, формируемых липосомами с белками

Варианты ГДД Доля

(нм) (%)

Липосомы 63 99

2000 1

Липосомы с 62 99

БСА (3:2) 1 ч 2100 1

Липосомы с 62 99

БСА (3:2) 2 ч 1980 1

Липосомы с 58 . 75,4

УцЕ2 (3:2) 1 ч 760 16

5298 8,6

Липосомы с 58 40

УцЕ2 (3:2) 2 ч 920 34

5076 26

Липосомы с 59 92

Уи-Е2 (9:1) 1 ч . 1037 8

Липосомы с 60 56

Уп-Е2(9.Т)2ч 1442 44

Таким образом, можно видеть, что при совместной инкубации липосом и белка VirE2 происходит их взаимодействие, которое регистрируется по образованию агрегатов после двух часов инкубации.

3.6 Компьютерная оценка размера комплекса из двух белков VirE2,

построенного с помощью программ Hex и GRAMM-X

Так как в трёхмерной структуре белка VirE2 (Dym et al., 2008) при помощи программы MOLE канальных структур нами не обнаружено, сделано предположение о том, что поры формируются в комплексах из нескольких субъединиц VirE2.

Комплекс двух белков VirE2 был построен с помощью программы Hex. Его размеры, с учётом отсутствующих в модельной структуре а.о. на С- и //-концах для каждого из белков, не превышают размеры 10x8x6 нм ячейки. В комплексе двух симметрично расположенных белков VirE2, построенном с помощью программы Hex, область контакта между белками составляет -30 а.о. Контактируют Leu182-Tyr194 и Gln2l6-Arg234 С-домена первого белка с Glu463-Val480, Lys507-Ala517 //-домена второго белка VirE2. Так как комплекс двух белков VirE2 симметричен, то на другом конце контактируют аналогичные аминокислотные остатки.

Размер аналогичного комплекса, построенного с помощью программы GRAMM-X с учётом отсутствующих в модели (Dym et al., 2008) на С- и /V-концах а.о., составляет 9 х 8 х 6 нм. Область контакта между двумя белками VirE2 в одном из двух пятен контакта составляет -10 аминокислот у каждого белка: Asp233-Ile246 С-домена первого белка контактируют с Glu500-Leu5'6 jV-домена второго белка VirE2. Так как комплекс симметричен, то в другом контактном пятне контактируют аналогичные аминокислоты.

Таким образом, модели комплексов двух белков VirE2 с двумя пятнами контакта по оценке двух программ (GRAMM-X и Hex) имеют размеры 9-10 х 8 х 6 нм, что меньше, чем размеры белка VirE2, измеренные методом ДРС (см. раздел 3.3).

Среди моделей, построенных с помощью программы GRAMM-X, получен комплекс двух белков VirE2 с одним пятном контакта. С учётом того, что на отсутствующем //-конце 3-D структуры белка VirE2 (PDB ID: ЗВТР) 111 а.о., по нашим данным моделирования, могут быть представлены в виде «-спирали, размер комплекса может составить 15x7x6 нм.

Таким образом, размер комплекса двух белков VirE2 с одним пятном контакта в большей степени соответствует данным измерения гидродинамического диаметра VirE2 методом ДРС.

3.7 Компьютерная оценка размера комплекса из четырёх белков VirE2,

построенного с помощью программы GRAMM-X

Ранее было сделано предположение о возможности формирования мембранного порового комплекса четырьмя субъединицами белка VirE2 (Duckely, Hohn, 2003). Методом ТЭМ экспериментально подтверждено формирование тетрамеров белка VirE2 в комплексе оцДНК-УпЕ2 (Abu-Arish

й а!., 2004). Комплекс четырёх белков УиЕ2, построенный нами с помощью программы С11АММ-Х на основе данных РСА комплекса белков УпЕ2-УпЕ1 (Бут е1 а1., 2008), представляет собой замкнутую структуру в виде кольца (бублика, тора), размеры которого представлены на рис. 2.

Рис. 2. Комплекс m четырёх белков VirE2, построенный в программе GRAMM-X.

29S 298

Расстояние 15 им измерено между Lys белка 3 и Lys"" белка 1, расстояние 11 нм измерено между Glu232 белка 2 и Arg22'' белка 4. Расстояние 6 нм измерено между Lys189 и G1u4IS белка 1

Размеры комплекса молекул четырёх белков VirE2 с учётом отсутствующих в модельной структуре аминокислотных остатков на С- и TV-концах не превысят размеров 17 х 13x8 нм.

Таким образом, размеры модели комплексов двух белков VirE2 с одним пятном контакта и четырёх белков VirE2 близки к размерам частиц из белка VirE2, измеренных с помощью метода ДРС (см. раздел 3.3).

3.8 Компьютерное моделирование положения в мембране белка VirE2 и

его комплексов

Компьютерный поиск траисмембранныхучастков

Ранее с помощью программы предсказания трансмембранных сегментов MEMSAT2 для белка VirE2 не было предсказано трансмембранных сегментов (Chumakov et al., 2004). Усовершенствованный алгоритм актуальной версии MEMSAT3 обнаруживает в структуре белка VirE2 короткие трансмембранные участки в Абдомене белковой молекулы на отрезках Pro61-Gln79 и His252-Thr267 таким образом, что фрагмент Ser8C)-Glu251 расположен на внешней стороне мембраны, а вся остальная молекула внутри клетки.

Комплекс из двух белков VirE2 в мембране был построен в среде CHARMM-GUI Membrane Builder из модели комплекса из двух белков VirE2, построенной при помощи GRAMM-X. Для того, чтобы отверстие в мембране оказалось сквозным, исходная модель была развернута следующим образом. Положение, при котором отверстие внутри комплекса из двух белков VirE2 оказалось бы сквозным в мембране, было подобрано вручную при помощи программы Swiss-PdbViewer. Для этого комплекс был развернут на 90°, т. е. ориентирован таким образом, чтобы его отверстие лежало в плоскости XY.

Далее были подобраны две аминокислоты Asp"0 и Arg"6, через которые можно провести прямую, перпендикулярную плоскости XY. Они и были указаны при выборе опции Align a Vector (Two Atoms) Along Z. Для достижения того же эффекта можно выбрать любые другие 2 аминокислоты, через которые можно провести прямую, перпендикулярную плоскости XY.

Анализ полученной модели показал, что в ней возможно образование канала между спиралями диаметром 2 нм. Однако, в просвете этого канала экспонированы концы подвижной междоменной петли (аминокислотные остатки 341-345), что суживает просвет канала до 0,7 нм, что недостаточно для прохождения однонитчатой ДНК. Также для данной модели комплекса белков в мембране при помощи программы Swiss-PdbVicwcr был оценен электростатический потенциал и показано, что потенциал внутри предполагаемого канала отрицательный.

Модель комплекса из четырёх белков VirE2 в мембране была получена аналогичным образом по построенной ранее модели комплекса из четырёх белков VirE2 при помощи программы Membrane Builder среды CHARMM-GUI. Ось, выбранная в качестве перпендикулярной мембране, проведена через аминокислотные остатки Ala129 и Cys149.

Программа Membrane Builder моделирует положение белковой молекулы в липидном бислое, но не может предоставить информации о том, какая её сторона лежит на внутренней стороне клеточной мембраны, а какая на внешней. Недостаточные сведения об ориентации трансмембранного участка были дополнены программой MEMSAT3.

В работе (Duckely, Hohn, 2003) сделано предположение о возможности формировании поры из четырёх субъединиц белка VirE2. Построенная из четырёх белков VirE2 модель имеет трансмембраниые участки и обладает каналом в мембранной части комплекса диаметром около 3,8 нм... Анализ распределения зарядов на внутренней поверхности пор из двух белков VirE2 показал преобладание отрицательного заряда при положительном заряде поверхности комплекса. Электростатический потенциал комплекса четырёх белков, также оцененный при помощи программы Swiss-PdbViewer, внутри отверстия положительный.

3.9 Компьютерный анализ канальных структур, образуемых белком

VirE2

Для нахождения местоположения и характеристики туннелей и каналов в биомолекулярных структурах служит программа MOLE. Для проверки её работы в структуре пороформирующего белка альфа-гемолизина (UniProt ID Р09616) был найден канал с внутренним диаметром, принимающим значения от 1 до 3,2 нм на различных участках (данные не приведены).

Из результатов РСА известно, что С-домен молекулы белка VirE2 формирует структуры, подобные TIM бочкам, состоящим из a-спиралей на наружной стороне и /?-складок на внутренней (Dym et al., 2008). Что может указывать на возможные каналы внутри белка. Однако при помощи программы MOLE

внутри единичного белка VirE2 обнаружить канальные структуры не удалось даже в областях, указанных в работе (Dym et al., 2008) в качестве TIM бочек.

Внутри ранее построенной нами модели структуры, состоящей из двух белков VirE2 при помощи программы MOLE нами обнаружен канал со средним внутренним диаметром 1,2 нм и перетяжкой до 0,5 нм, а внутри модели структуры, состоящей из четырёх белков VirE2 обнаружен канал с внутренним диаметром от 1,4 до 4,6 нм.

Глубина туннеля, нм

Рис. 3. Диаметр туннели внутри комплекса из двух (слева) и четырёх (справа) белков VirE2, построенного при помощи программы MOLE. Внутренний диаметр туннеля, образуемого комплексом из двух белков VirE2 в средней своей части имеет диаметр 1,2-1,6 нм и имеет перетяжку диаметром 0,5 нм, диаметр туннеля, образуемого комплексом из четырёх белков VirE2 принимает значения от 1,4 до 4,6 нм

По оценке программы SwissPDB Viewer потенциал внутри предполагаемого канала комплекса двух VirE2 отрицательный. Отрицательный заряд характерен для катион-селективных каналов. Потенциал внутри отверстия в комплексе четырёх VirE2 положительный, характерный для анион-селективных каналов. Заряд одноцепочечиой ДНК отрицательный, поэтому можно предположить, что возможно её перемещение через пору, состоящую из четырёх белков VirE2.

3.10 Экспериментальное исследование взаимодействия У1гЕ2 с плоской липидной мембраной

В результате проведенных биофизических экспериментов, направленных на исследование устойчивости мембран без воздействия электрического поля и препарата белка УпЕ2, было установлено, что соотношение фосфатидилхолин - 63,5%, фосфатидилэтаноламин - 30%, фосфатидилглицерол - 6,5% позволяет получать устойчивые в течение 20 мин бислойные мембраны. При наложении на мембрану внешнего поля от 10 до 300 мВ без внесения препарата белка УпЕ2 проводимость мембраны сохранялась неизменной до уровня 100 мВ, а при повышении до 120-200 мВ, мембрана, в большинстве случаев, разрушалась. После внесения препарата рекомбинантного белка УпЕ2 скачки проводимости мембраны происходили спустя 1 мин при достаточно малых (10-50 мВ) напряжениях и имели вид ступенек с резким фронтом и относительно стабильным уровнем электропроводности (рис. 4). Длительность существования ступенек проводимости варьировала от 1,5 до 7 секунд, при величине

скачка проводимости от 0,2 до 2,1 иСм. При внесении белка \%Е2 в концентрации выше 16 нг/мкл мембрана теряла устойчивость и распадалась.

Известно, что при наложении электрического поля в липидной мембране могут формироваться долгоживущие липидные поры, время жизни которых может составлять около 10 с (Меликов с соавт., 1999), что сопоставимо со временем, затрачиваемым для транспорта плазмидной ДНК, переносящейся через белковую пору в ходе конъюгации бактерий (Гринюс, 1986). Размер цилиндрических липидных пор (около 1 нм), не приводящих к разрыву мембраны при проводимости мембраны в районе 650 пСм, рассчитанный авторами статьи (Меликов с соавт., 1999) к значению, которое может быть достаточным для прохождения одноцепочечной Т-ДНК, диаметр которой составляет 1,2 нм. Однако, при наложении постоянного поля на мембрану до 100 мВ в наших экспериментах скачки электропроводности в отсутствии белка \%Е2 не зарегистрированы. При наложении поля до 100 мВ не было зарегистрировано скачка электропроводности у плоских липидных мембран и в работе (Меликов с соавт., 1999). Однако, уже через минуту после внесения белка \%Е2 в наших экспериментах наблюдались скачки электропроводности, даже при более низких (10-50 мВ) значениях наложенного поля (рис.4).

Таким образом, установлено, что электропроводность плоских бислойных искусственных липидных мембран после внесения рекомбинантного белка УкЕ2 при наложенном на мембрану поле 10-50 мВ скачкообразно увеличивалась, что свидетельствует о формировании одиночных долгоживу-щих пор.

3.11 Экспериментальная оценка интенсивности флуоресценции

корневых волосков пшеницы и клеток Не1.а при добавлении меченых

олигонуклеотидов и белка У1гЕ2

В качестве модельного растительного объекта использовали корневые волоски пшеницы, флуоресцентно-меченые белок УцЕ2 и олигонуклеотиды, меченные БАМ. Была также измерена интенсивность флуоресценции смеси, где проводилась инкубация корней пшеницы. Данные представлены в табл. 4. Было выявлено, что экстракт из корня пшеницы не оказывает влияния на флуоресценцию корней, обработанных белком \Л'гЕ2, меченного ТРИТЦ, и олигонуклеотидов, меченных ИАМ. Интенсивность флуоресценции корня после

Рис. 4. Изменение электропроводности искусственной плоской мембраны после внесения препарата белка \4rE2. Мембрану формировали путем нанесения кисточкой раствора липидов в скволанс в концентрации 10мг/мл на отверстие (015Омкм) в тефлоновой плёнке. Приложенная разность потенциалов составляет 40 мВ. Скачок проводимости через 1 минуту после добавления белка УнЕ2

инкубации в вариантах с \%Е2-ТРИТЦ (1:20) в ПБС (буфере следующего состава: 1,72 г На2НР04х2Н20, 0,5 г КН2Р04, 7,2 гЫаС1, рН 7,5), корня с олиго-нуклеотидами-РАМ (1:50) и корня с У1гЕ2-ТРИТЦ (1:20) совпадает с интенсивностью флуоресценции самого корня в ПБС (отрицательный контроль).

Таблица 4

Интенсивность флуоресценции буфера с У1гЕ2-ТРИТЦ и олигонуклеотиды-РАМ после инкубации с корнем пшеницы

Образцы Интенсивность флуоресценции, (СЕФ) хЮ3

Фильтр РАМ (520 нм) Фильтр ТРИТЦ (580 нм)

ПБС с УпЕ2-ТРИТЦ(1:20) 90 62

ПБС и олигонуклеотиды-РАМ (1:50) 1700 250

ПБС с У1гЕ2-ТРИТЦ (1:20) и олигонуклеотиды-РАМ (1:50) 1800 250

ПБС с У1гЕ2-ТРИТЦ (1:20) и олигонуклеотиды-РАМ (1:100) 830 120

ПБС (отрицательный контроль) 84 15

СЕФ - стандартные единицы флуоресценции

Интенсивность флуоресценции ПБС с У1гЕ2-ТРИТЦ (1:20) была выше примерно в 4 раза интенсивности флуоресценции ПБС (отрицательный контроль). При этом концентрация белка У1гЕ2-ТРИТЦ составила 9 мкг/мл. Интенсивность флуоресценции ПБС с олигонуклеотидами-РАМ (1:50), ПБС с УпЕ2-ТРИТЦ (1:20) и олигонуклеотиды-РАМ (1:50), ПБС с УкЕ2-ТРИТЦ (1:20) и олигонуклеотиды-РАМ (1:100) выше примерно на порядок интенсивности флуоресценции ПБС (отрицательный контроль).

Таблица 5

Интенсивность флуоресценции связавшегося белка У1гЕ2 _с корнем пшеницы_

Образцы Интенсивность флуоресценции, (СЕФ) х103

Фильтр РАМ (520 нм) Фильтр ТРИТЦ (580 нм)

Корень с У1гЕ2-ТРИТЦ (1:20) в ПБС 6,9 2,5

Корень и олигонуклеотиды-РАМ (1:50) 7,0 3,3

Корень с У1гЕ2-ТРИТЦ (1:20) и олигонуклеотиды-РАМ (1:50) 7,7 2,4

Корень в ПБС (отрицательный контроль) 7,0 4,2

Таким образом, из полученных данных видно, что присутствие белка УпЕ2 не влияет на флуоресценцию корневых волосков пшеницы после добавления РАМ-меченых олигонуклеотидов (25 и.о.).

Перенос флуоресцентно-меченой одноцепочечной ДНК, с участием белка У1гЕ2 в клетки НеЬа в наших экспериментах оценивали по измерению интенсивности флуоресценции клеток.

Т-комплекс, может перемещаться в цитоплазме клетки с помощью импортина а/р, который взаимодействует с микротрубочками и микрофиламен-тами цитоскелета клетки. Цитоскелет также задействован при неспецифическом эндоцитозе крупных частиц в клетки.

Чтобы определить роль белка УкЕ2 в поглощении олигонуклеотидов и отделить от процесса поглощения олигонуклеотидов путем эндоцитоза, процесс эндоцитоза блокировали ингибиторами дыхания - азидом натрия и СССР (карбонил цианид ш-хлорофенилгидразон). После инкубации с азидом натрия клетки дважды отмывали в среде Хэнкса центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин и ресуспендировали в среде Хэнкса. Затем к клеткам добавляли ТРИТЦ-меченый фаг М13 К07 из расчета 125-500 фагов на клетку и оставляли инкубироваться в течение 1 часа. После инкубации клетки дважды отмывали от не связавшегося с клетками фага в среде Хэнкса центрифугированием при 1000 g в течение 10 минут, снова ресуспендировали в среде Хэнкса.

При проведении экспериментов клетки инкубировали в течение 1 часа с белком \%Е2 или фагом М13 К07, конъюгированных с ТРИТЦ с исходной концентрацией 1x10 кл/мл. Результаты измерений представлены в табл. 6.

Таблица 6

Интенсивность флуоресценции клеток НеЬа после инкубации _с фагом М13-ТШТС_'"

Образцы Интенсивность флуоресценции (СЕФ) хЮ3

Фильтр РАМ (520 им) Фильтр ТШТС (580 нм)

Клетки НеЬа (отриц. контр.) 0 0

Клетки с фагом-ТШТС (1:50) 1,5 9,5

Клетки с фагом-ТШТС (1:100) 0 0.1

Клетки с фагом-ТШТС (1:200) 0 0

Прединкубация клеток с 5 х 10"" М азидом натрия

Клетки НеЬа 0 0

Клетки с фагом-ТШТС (1:50) б 4,4

Клетки с фагом-ТШТС (1:100) 0,4 3,4

Клетки с фагом-ТШТС (1:200) 0 0

Интенсивность флуоресценции клеток при инкубации с ТРИТЦ-меченым фагом (1:50) в 1,4 раза выше, чем при обработке клеток азидом натрия.

Прединкубацию клеток НеЬа с СССР проводили в течение 30 минут. Результаты измерений представлены в табл. 7.

Таблица 7

Интенсивность флуоресценции клеток НеЬа после инкубации

Варианты Hela Интенсивность флуоресценции", (СЕФ) хЮ3

Клетки с олигонуклеотидами-РАМ* 139 ± 18

Клетки с олигонуклеотидами-РАМт и VirE2* 217 ± 30

Клетки с 10 мМ азидом натрия11 с VirE2 и 139 ± 16

ол и го ну кл еотидам и-F АМ *

Клетки + 5 мкМ СССР1 + VirE2 и 123 ±11

олигонуклеотиды-РАМ5

Клетки 0

Примечания: 7 повторностей по каждому среднему. t - 2 мкг/мл,' - 9 мкг/мл,1 - прединкубация 20 мин, 5 - 1 мкг/мл + фильтр РАМ,

" - среднее арифметическое ± стандартная ошибка

Как видно из табл.7, олигонуклеотиды активно накапливаются в клетках НеЬа при отсутствии белка \%Е2, что может свидетельствовать об адсорбции или поглощении олигонуклеотидов за счёт эндоцитоза. При добавлении ТШТС-меченого белка УнЕ2 к олигонуклеотидам, меченными РАМ, к клеткам наблюдается увеличение на 56% интенсивности флуоресценции клеток НеЬа, по сравнению с флуоресценцией клеток, инкубировавшимися только с олиго-нуклеотидами (р < 0,05). Как видно из табл. 7 прединкубация клеток с 5 мкМ СССР приводит к снижению флуоресценции на 43%, по сравнению с клетками без обработки. Азид натрия также снижал уровень флуоресценции (на 36% (р < 0,05)). Т. е. блокировка дыхания в значительной степени снижала активность накопления флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов в клетках НеЬа.

Таким образом, приведённые данные показывают, что белок \ZirE2 возможно является порофомером и способствует попаданию олигонуклеотидов в клетку. Чтобы исследовать способность к формированию пор в мембране эукариотических клеток нами были использованы компьютерные методы.

3.12 Компьютерный анализ присутствия фрагментов Т-ДНК в геномах

растений и низших животных

В данной работе для определения присутствия фрагментов Т-ДНК агробактерий в геномах различных организмов из полной Т-ДНК были выделены фрагменты, которые, возможно, могли быть внесены агробактериями в геномы организмов-хозяев и использовались программы Ыа$1п и Мав^.

Различия применения обоих алгоритмов оценивали на примере закодированой в Ti-плазмиде аргиназы путём поиска последовательности самого гена arc и поиска обратной трансляции аминокислотной последовательности агробактериального белка аргиназы.

Поиск blastn выявил в геномах растений очень короткие фрагменты, их сходство носит, вероятно, случайный характер, a tblastn показал высокую гомологию искомой последовательности. Поиск нуклеотидных и аминокислотных последовательностей в базах последовательностей других организмов, в т. ч. человека, показывает сходные результаты. Значит, поиск blastn обнаруживает только точные совпадения нуклеотидных последовательностей, a tblastn показывает гомологию, в том числе и отдалённую.

При проведении blastn-поиска фрагментов Т-ДНК A.tumefaciens в расшифрованных геномах растений, морских ежей Echinoideci, червей Caenorhabditis и Lumbricidae нуклеотидных последовательностей закодированных в Т-ДНК генов не обнаружено. Обнаружены лишь сходные фрагменты, своей протяжённостью не превышающие 30-40 и.о. для различных организмов.

В расшифрованных последовательностях морских ежей гомологичность фрагментам Т-ДНК обнаружили только представители S.purpuratus. Поиск показал 18 вхождений, сходных с геном tms2 (с покрытием от 39% до 97% с Е от 6x10"10 до 8x10"30) и множество коротких фрагментов, гомологичных гену tmsl (с покрытием до 10% и £ до 2хЮ"5). Расшифрованные последовательности червей Lumbricidae не обнаружили никакой существенной гомологии, а в последовательностях червей Caenorhabditis выявлены гомологи трём генам Т-ДНК masl, tms2 и tmsl.

Проведённый при помощи tblastn поиск последовательностей, гомологичных закодированным в Т-ДНК генам, показал широкое распространение последовательностей, кодирующих белки, гомологичные продукту бактериальных генов masl, tmsl и tms2 у растений 15-22 родов (в зависимости от гена). Совместная деятельность продуктов генов tmsl и tms2 обусловливает появление в растениях несвойственного им пути образования природного ауксина, что в целом приводит к изменению количества ауксина в клетках растения.

Последовательности, кодирующие продукты, гомологичные белку С, производимому по гену rolB A.tumefaciens, обнаружены в расшифрованных геномах растений родов Catharantus, Linaria, Nicotiana, Plumbago и Withania. Присутствие агробактериальных го/-генов в геномах ряда растений рода Nicotiana было показано и ранее (Aoki, Syo, 1999; Intrieri, Buiatti, 2001; Suzuki etal., 2002; Кулаева с соавт., 2006). Также в расшифрованных геномах различных растений выявлены последовательности, обнаруживающие некоторые сходства с локусами AtuóOOl, Atu6004, Atu6005, Atu6009 и Atu6014 Т-ДНК A.tumefaciens. За правой границей Т-ДНК Ti-плазмиды A.tumefaciens присутствуют гены hyuA и ИуиВ, кодирующие а- и Р-субъединицы N-метилгидантоиназы А (ацетон карбоксилазы) и arc, кодирующий аргиназу, гомологи которых также широко представлены в растительных геномах.

Таким образом, в расшифрованных геномах различных растений (более 15 родов), морских ежей S. purpura/us и червей рода Caenorhabditis, обнаружены последовательности, кодирующие белки, гомологичные продуктам агробактериальных генов mas/, tmsl и tms2. Присутствие в рассмотренных геномах последовательностей, сходных с генами masl, tmsl и tms2 может являться следствием горизонтального переноса генетической информации от агробактерий.

При проведении blasln-поиска фрагментов Т-ДНК A. rhizogenes в расшифрованных геномах морских ежей, червей Caenorhabditis и Lumbricidae достоверных вхождений нуклеотидных последовательностей закодированных в Т-ДНК генов не обнаружено. Обнаружены лишь фрагменты, своей протяжённостью не превышающие 39 н.о. для морских ежей и 40 н.о. для червей Caenorhabditis. Достоверной гомологии поиск при помощи tblastn также не выявил.

Поиск фрагментов Т-ДНК Ri-плазмиды A.rhizogenes в расшифрованных геномах растений также проводился при помощи blastn. Различные локусы Ri-плазмиды, исключая область, прилегающую к левой границе Т-ДНК, обнаружены в расшифрованных геномах растений родов Catharanthus, Kalanchoe, Kleinia, Nicotiana, Populus и Withania. Особое сходство обнаружено с последовательностями табака Nicotiana tabacum и катарантуса Catharanthus roseus, поэтому они были рассмотрены дополнительно. Растительные последовательности в порядке их следования в соответствующих геномах были попарно выровнены с фрагментом Ri-плазмиды между 15 000 и 27 000 н.о. и графические представления выполненных выравниваний сведены на рис. 5.

16 К 18 К 20 К 22 К 24 К 26 К

.....I ■ ■ • "" "I.........I.........I.........I............

Последовательность _

плазмиды pRi 1724 I ......... '"'"Г"!"'"""".'.'''.'. Ц ....." El 83 ■ Ей ПК» II

A.rhizogenes 0rfS rolA rolB rolC orf13orf13a orf14 mis y4hR

Nicotiana tabacum ШШШШШШЖ ■—* I H—il—Ml ■■ ■■■

Catharantus roseus ■^■■■■■■■■■■i---------- —......—

Pue. 5. Результаты blastn-выравиивания Ri-плазмиды pRi!724 A.rhizogenes с нуклеотпднмми последовательностями N.tabacum и C.roseus. На верхней линейке отмечены номера нуклеотидных остатков в последовательности плазмиды. На самой j плазмиде отмечены составляющие её гены. Горизонтальные полосы показывают участки сходства растительных нуклеотидных последовательностей с последовательностью Ri-плазмиды

Высокая степень сходства не только функциональных, но и некодирующих фрагментов Ri-плазмиды с последовательностями табака и катарантуса, которые можно наблюдать на рис. 5, могут свидетельствовать об их внесении в геномы этих растений агробактериями в процессе эволюции.

Также был проведён менее специфичный поиск фрагментов Ri-плазмиды pRi 1724 в расшифрованных геномах растений методом tblastn. В результате обнаружено присутствие сходных с Ri-плазмидой последовательностей, в расшифрованных геномах растений родов Catharanthus, Linaria, Kalanchoe,

Kleinia и Nicotiana. Поиск программой tblastn выявил очень широкое распространение в геномах указанных растений последовательностей, сходных с геном rolC, а также выявил присутствие в расшифрованных геномах некоторых растений фрагментов Т-ДНК, включающих гены го/А, В, С, mis, or/8, 13, 13а, 14. Также в геномах табака и льнянки обнаружены гомологи локусов riorf22 - riorf23, расположенных в Ri-плазмиде за правой границей Т-ДНК.

Присутствие в расшифрованных геномах некоторых растений (Kalanchoe, Kleinia, Linaria, Populus и Withania) последовательностей, сходных с фрагментами Т-ДНК Ri-плазмиды A.rhizogenes (гены rolA, В, С, mis, or/8, 13, 13а, 14) может являться следствием горизонтального переноса этих фрагментов от агробактерий. В рассмотренных геномах беспозвоночных (морских ежей, червей Caenorhabditis и Lumbricidae) наличия сходных с Т-ДНК A.rhizogenes не выявлено.

Таким образом, высокая степень сходства не только функциональных, но и некодирующих фрагментов Ri-плазмиды с последовательностями табака и катарантуса, которые можно наблюдать на рис. 5, могут свидетельствовать об их внесении в геномы этих растений агробактериями в процессе эволюции.

ВЫВОДЫ

1. Впервые смоделирована вторичная структура полной последовательности белка VirE2 и установлено, что на //-конце VirE2, не вошедшем в рентгено-структурную модель, имеется одна a-спираль на участке 91-104.

2. Рекомбинантный белок VirE2 в буферном растворе образует комплексы из двух-четырёх белков.

3. Молекула белка VirE2, с учётом отсутствующих в РСА модели 139 а.о. в С- и N-доменах может быть описана ячейкой размерами 9 х 7 х б пм. Размеры модели комплексов двух белков VirE2 с одним пятном контакта и четырёх белков VirE2 близки к размерам частиц из белка VirE2, измеренных с помощью метода ДРС и составляют с учётом отсутствующих в модельной структуре аминокислотных остатков на С- и //-концах 15x7x6 нм и 17 х 13 х 8 нм соответственно.

4. Белок VirE2 является порофомером, поскольку: а) способствует попаданию олигонуклеотидов в клетки HeLa, б) увеличивает электропроводность плоских мембран, в) внутри комплекса из четырёх белков VirE2 in silico обнаружен канал внутренним диаметром от 1,4 до 4,6 нм с положительным зарядом.

5. Впервые методом in silico показано: 1) в расшифрованных геномах растений Catharanthus, Linaria, Kalanchoe, Kleinia, обнаруживаются фрагменты Т-ДНК A.rhizogenes, включающих гены rolA, rolB, rolC, mis, or/8, or/13, or/13a, or/14; 2) в расшифрованных геномах представителей более 15 родов растений, морских ежей (S. purpuratus) и червей (рода Caenorhabditis), обнаружены фрагменты Т-ДНК A.tumefaciens, включающие гены masl, tmsl и tms2.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чумаков М.И., Мазилов С.И., Гусев Ю.С., Волохина И.В. Исследование способности агробактериального белка VirE2 к образованию пор в мембранах // Биомембраны. - 2010. - Т.27, №5. - С.449-454.

2. Волохина И.В., Гусев Ю.С., Мазилов С.И., Чумаков М.И. Надмолекулярные комплексы белка вирулентности VirE2 Agrobaclerium tumefaciens II Биохимия. - 2011. - Т.76, №11. - С. 1576-1682.

3. Chumakov M.I., Mazilov S.I., Zotova T.V. Searching for agrobacterial T-DNA fragments in plant genomes //In.: Proc. The Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia, July 16-22, 2006 / ed. N.Kolchanov, R.Hofestadt, Novosibirsk. - 2006. - Vol.3. -P.130-132.

4. Мазилов С.И. Оценка способности агробактерий изменять стабильность генома растений как открытой системы в ходе эволюции // Нелинейные дни в Саратове для молодых 2006: сборник материалов научной школы-конференции. - Саратов: РИО Журнал Известия вузов. Прикладная нелинейная динамика. - 2007. - 224 с. - С.216-219.

5. Chumakov M.I., Mazilov S.I. Computing searching for nucleotide sequences like agrobacterial T-DNA fragments in plant genomes // Proc. Moscow Conference on Computational Molecular Biology Moscow, Russia, July 27-30, 2007. - P.64-66.

6. Мазилов С.И., Зотова Т.В., Чумаков М.И. Оценка возможности участия агробактерий в эволюции растений // Мат. III Межрег. конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой", Саратов, Россия, 10-12 октября 2006. - С.53.

7. Волохина И.В., Богданов В.И., Мазилов С.И., Чумаков М.И. Участие агробактериального белка вирулентности VirE2 в переносе Т-ДНК из бактерий в растение // Мат. Ш-ей Межрегиональной конф. молодых ученых "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой", Саратов, Россия, 10-12 октября 2006. - С.23.

8. Volohina I.V., Mazilov S.I., Chumakov M.I. Molecular-genetic aspects of T-DNA transfer from Rhizobium radiobacter across plant cell membrane // Abstrats. Int. Sc. Conf. "S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology", Yalta, Ukraine, October 8-12, 2007. - P.19.

9. Волохина И.В., Мазилов С.И., Чумаков М.И. Исследование свойств белка VirE2 из Rhizobium radiobacter II Всеросс. конф. с международным участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем", Саратов, Россия, 11-13 сентября 2007. - С.69.

10.Mazilov S.I., Chumakov M.I. Searching for nucleotide sequences like agrobacterial gene fragments in plant genomes // Abstr. XX International Congress of Genetics, Berlin, Germany, July 12-17, 2008. - No.P015/l 1/B.

11.Mazilov S.I., Chumakov M.I. 3-D model for agrobacterial T-DNA-binding VirE2 protein // Proc. 6-th International Conference on Bioinformatics of

Genome Regulation and Structure (BGRS'2008), Novosibirsk, Russia, June 22-28, 2008. -P.l56.

12.Гусев Ю.С., Мазилов СМ., Чумаков М.И. Перенос Т-ДНК через мембрану: роль белка VirE2 // Биомехаиика-2010. Тезисы докладов X Всеросс. конф. / под ред. проф. Л.Ю. Коссовича. - Саратов. - 2010. - С.65.

13.Mazilov S.I., Chumakov M.I. Searching for nucleotide sequences like agrobacterial gene fragments in plant genomes// Intern. Conf. Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology, Novosibirsk, Russia, June 07-10, 2010. -P.68.

M.Chumakov M.I., Gusev Yu.S., Mazilov S.I. 3-D complexes originated from Agrobacterium tumefaciens and evaluation of his pore-forming ability. // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, Moscow, Russia, July 21-24,2011. - P.81-82.

Статьи №1-2 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Формат 60x84/16. Печать цифровая электрографческая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл. печ. л. - 1,5. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мазилов, Святослав Игоревич

Список сокращений и обозначений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Мембранный транспорт.

1.1.1 Простая диффузия.

1.1.2 Транспорт, обусловленный белками.

1.1.2.1 Белковые поры.

1.1.2.1.1 Складочные трансмембранные структуры.

1.1.2.1.2 Спиральные трансмембранные структуры.

1.1.2.1.3 Т1М-бочки (К+-канал).

1.1.2.2 Белки переносчики.

1.1.2.3 Активный транспорт.

1.1.3 Транспорт крупных молекул и частиц.

1.1.3.1 Эндоцитоз.

1.1.3.2 Экзоцитоз.

1.2 Ядерные поры.

1.3 Горизонтальный перенос генов.

1.4 Горизонтальный перенос генов с участием агробактерий.

1.4.1 Перенос ДНК через мембраны растительной клетки.

1.4.2 Роль УкЕ2-белка в переносе Т-ДНК агробактериями.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Использованные приборы и материалы.

2.1.1 Реагенты.

2.1.2 Материалы.

2.1.3 Среды.

2.1.4 Состав буферов.

2.1.5 Использованные штаммы и плазмиды.

2.1.6 Культуры животных клеток.

2.1.7 Растительный материал.

2.1.8 Приборы и аппаратура:.

2.2 Выделение белка VirE2.

2.3 Определение размеров белков методом динамического лазерного рассеяния света.

2.4 Получение оцДНК.

2.5 Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) Т-комплекса.

2.6 Исследование взаимодействия белка VirE2 с липидной мембраной.

2.7 Получение липосом.

2.8 Измерение флуоресценции эукариотических клеткок после инкубации с белком VirE2 и олигонуклеотидами.

2.9 Использованные базы данных.

2.9.1 GenBank.

2.9.2 RefSeq.

2.9.3 EMBL.

2.9.4 DDBJ.

2.9.5 PIR.

2.9.6 UniProt.

2.9.7 PDB.

2.9.8 Pfam.

2.10 Использованные белковые структуры.

2.11 Использованные компьютерные программы.

2.11.1 BLAST.

2.11.2 PROFsec (PredictProtein).

2.11.3 Phyre.

2.11.4 Swiss-PdbViewer (Deep View).

2.11.5 MEMSAT (PSIPRED).

2.11.6 GRAMM-X.

2.11.7 Hex Protein Docking.

2.11.8 Membrane Builder (CHARMM-GUI).

2.11.9 МОЬЕОпНпе.

2.12 Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Компьютерный поиск гомологов белка УкЕ2.

3.2 Компьютерное моделирование и анализ вторичной структуры

- белкаУ1гЕ2.-.-.

3.3 Измерение размера белка У\хЕ2 методом динамического рассеяния света.

3.4 Измерение комплексов из белков У1гЕ2 и одноцепочечной ДНК методом динамического рассеяния света.

3.5 Измерение комплексов из белков У1гЕ2 и одноцепочечной ДНК методом трансмиссионной электронной микроскопии.

3.6 Экспериментальное исследование взаимодействия У1гЕ с липосомами.

3.7 Компьютерная оценка комплекса из двух белков УкЕ2, построенного с помощью программы Нех.

3.8 Компьютерная оценка размера комплекса из двух белков УкЕ2, построенного с помощью программы ОЯАММ-Х.

3.9 Компьютерная оценка размера комплекса из четырёх белков У1гЕ2, построенного с помощью программы ОЯАММ-Х.

3.10 Компьютерный поиск трансмембранных участков.

3.11 Компьютерное моделирование положения в мембране комплексов из двух и четырёх белков Уп*Е2.

3.12 Компьютерный анализ туннельных структур, образуемых белком У1гЕ2.

3.13 Экспериментальное исследование взаимодействия У1гЕ2 с плоской липидной мембраной.

3.14 Экспериментальная оценка интенсивности флуоресценции корневых волосков пшеницы при добавлении меченых олигонуклеотидов и белка У1гЕ2.

3.15 Экспериментальная оценка интенсивности флуоресценции клеток HeLa при добавлении меченых олигонуклеотидов и белка VirE2.

3.16 Компьютерный анализ присутствия фрагментов Т-ДНК в геномах растений и низших животных.

3.16.1. Поиск последовательностей аргиназы.

3.16.2. Анализ присутствия фрагментов Т-ДНК A.tumefaciens в геномах растений и низших животных.

3.16.3. Анализ присутствия фрагментов Т-ДНК A.rhizogenes в геномах растений и низших животных.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ структурно-функциональных свойств комплексов белка вирулентности агробактерий VirE2"

Актуальность проблемы

Агробактериальная Т-ДНК является уникальным природным вектором для переноса генов в геном растительных клеток, поскольку любой ген, размещенный между правой и левой границей Т-ДНК, может быть перенесен и встроен при участии белков VirE2 и VirD2 в геном растений и дрожжей. Белок VirE2 обладает несколькими важными для этого процесса функциями, в том числе он участвует в процессе перемещения Т-ДНК через мембрану и в цитоплазме растительной клетки, связываясь с белками-кариофилинами. Т-комплекс, управляемый пилотирующим белком VirD2, может перемещаться в цитоплазме клетки с помощью импортина а/(3, который взаимодействует с микротрубочками и микрофиламентами цитоскелета клетки.

Лечение заболеваний с помощью генов (генотерапия) является перспективным направлением в медицине. Одним из критических этапов для данной технологии является перенос экзогенных ДНК-конструкций через мембрану клетки-мишени. В 2004 г. была показана принципиальная возможность переноса Т-ДНК-VirE2-VirD2 белкового комплекса (Т-комплекса) в животную клетку (Kunik et al., 2001), однако потенциал переноса ДНК в животную клетку в целях генотерапии с участием белка VirE2 пока не изучен.

Считается, белок VirE2 может формировать комплекс (пору) для переноса коротких олигонуклеотидов через эндоплазматическую клеточную мембрану (Dumas et al., 2001). Однако доказательств возможности формирования поры и переноса Т-ДНК через У1гЕ2-зависимую пору пока не представлено.

Таким образом, исследование механизма переноса белкового комплекса Т-ДНК-\%Е2 через эндоплазматическую мембрану в растительную и животную клетки при участии белка VirE2 представляет теоретический и практический интерес для изучения, поскольку с одной стороны, эту систему можно использовать в качестве удобной модели для изучения структуры и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов, а с другой стороны, этот природный механизм переноса ДНК-белкового комплекса можно использовать в медицинских технологиях генотерапии для доставки целевых генов в эукариотическую клетку.

Цели и задачи исследования

Для достижения данной цели в работе решались следующие задачи:

1. Провести компьютерный анализ вторичной, третичной структур белка VirE2 и его комплексов.

2. Оценить размеры рекомбинантного белка VirE2 и комплексов in vitro.

3. Изучить взаимодействие белка VirE2 с мембранами, оцДНК.

4. Изучить влияние белка VirE2 на перенос олигонуклеотидов в растительные и животные клетки.

Научная новизна работы:

Впервые смоделирована вторичная структура всего белка VirE2 и установлено, что на iV-конце VirE2, не вошедшем в рентгеноструктурную модель, имеется одна а-спираль.

Впервые показано, что комплекс из двух и четырёх белков VirE2 может быть встроен в мембрану и формировать поры с диаметром до 2 и 4,6 нм соответственно.

Впервые установлено, что белок VirE2 способствует переносу олиго-нуклеотидов в клетки HeLa.

Впервые методом- in silico показано, что в расшифрованных геномах растений Catharanthus, Linaria, Kalanchoe, Kleinia, обнаруживаются фрагменты Т-ДНК, включающих гены rol A, rolB, rolC, mis, orfô, orfl3, orfl3a, orfl4.

Научно-практическая значимость работы

Установлено, что белок VirE2 способствует попаданию олигонуклеоти-дов в животную клетку, что может дать основу для разработки безвирусных технологий доставки генов в животную клетку для технологий генотерапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

3. В модельной структуре, состоящей из двух и четырёх молекул VirE2, расположенной в бислойной мембране, возможно образование пор с диаметром канала 2 и 4,6 нм, соответственно.

5. Фрагменты Ri-, Ti-плазмид агробактерий обнаружены in silico в геномах некоторых растений и беспозвоночных.

Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями

Личный вклад соискателя состоит в получении всех представленных данных по анализу встройки Т-ДНК геномы различных растений, компьютерном моделировании двумерных и трехмерных структур белка УкЕ2 и его комплексов 4п бШсо, а также в-описании и обработке полученных данных. Опыты по анализу роли белка У1гЕ2 в переносе через искусственные и природные мембраны, оценке ДНК белковых комплексов методами динамического рассеяния света (ДРС), трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), биоинформатики проведены при участии сотрудников лаборатории биоинженерии ИБФРМ РАН И. В. Волохиной, Ю. С. Гусева, сотрудника лаборатории нанобиотехнологии Н. Г. Хлебцова, что отражено в публикациях. Планирование экспериментов, интерпретация экспериментальных и компьютерных данных, подготовка результатов к публикации проводились под руководством и при участии М. И. Чумакова.

Работа выполнена на базовой кафедре биофизики ФНП СГУ в течение 2006-2011 гг. в рамках плановой темы НИР «Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки», № гос. регистрации 01200606182; научный руководитель - д. б. н. Чумаков М. И. Исследования поддержаны грантом Федерального агентства по науке и инновациям в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» «Технологии биоинженерии» (мероприятие 1.2) шифр «2007-2-1.2-09-01137» по теме: «Разработка технологии переноса Т-ДНК в генеративные клетки кукурузы» (рук. Чумаков М. И.) и грантом РФФИ 11-04-01331а «Изучение механизма переноса Т-ДНК агробактерий в генеративные клетки кукурузы (2011-2013 гг.)» (рук. Волохина И. В.).

Апробация результатов

Материалы диссертации были представлены на международной конференции 4-th Intern. Conf. on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, BGRS'2006) (Новосибирск, 2006), на научной школе-конференции "Нелинейные дни в Саратове для молодых - 2006" (Саратов, 2006), на III Межрег. конф. молодых учёных "Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой" (Саратов, 2006), на междунар. конф. Moscow Conf. on Computational Molecular Biology MCCMB'07 (Москва, 2007), на Всеросс. конф. с междунар. участием "Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), на междунар. конф. "S.P. Kostychev and Contemporary Agricultural Microbiology" (Ялта, Украина, 2007), на междунар. конгрессе XX Intern. Congress of Genetics (Берлин, Германия, 2008), на междунар. конф. 6-th Intern. Conf. on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, BGRS'2008) (Новосибирск, 2008), на X Всеросс. конф. "Биомеханика-2010" (Саратов, 2010), на междунар. конф. Intern. Conf. Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology (Новосибирск, 2010), на XIV Intern. School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics "Saratov Fall Meeting SFM'10" (Саратов, 5-8 октября 2010), на 2-ой ежегодной науч.-технич. конф. Нанотехнологического общества России "Перспективы развития в России НБИК-технологий как основного научного направления прорыва к шестому технологическому укладу", (Москва, 14-15 октября 2010), на III Междунар. форуме по нанотехнологиям "RUSNANOTECH 2010" (Москва, 1-3 ноября 2010), на междунар. конф. Intern. Moscow Conf. on Computational Molecular Biology MCCMB'll (Москва, 21-24 июля 2011).

Публикации

Объём и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мазилов, Святослав Игоревич

ВЫВОДЫ

1. Впервые смоделирована вторичная структура полной последовательности белка VirE2 и установлено, что на TV-конце VirE2, не вошедшем в рентгеноструктурную модель, имеется одна «-спираль на участке 91-104.

2. Рекомбинантный белок VirE2 в буферном растворе образует комплексы из двух-четырёх белков.

3. Молекула белка VirE2, с учётом отсутствующих в рентгеноструктурной модели 139 а.о. в С- и Абдоменах может быть описана ячейкой размерами 9 х 7 х 6 нм. Размеры модели комплексов двух белков VirE2 с одним пятном контакта и четырёх белков VirE2 близки к размерам частиц из белка VirE2, измеренных с помощью метода динамического рассеяния света и составляют с учётом отсутствующих в модельной структуре аминокислотных остатков на С- и TV-концах 15x7x6 нм и 17 х 13x8 нм соответственно.

5. Впервые методом in silico показано: 1) в расшифрованных геномах растений Catharanthus, Linaria, Kalanchoe, Kleinia, обнаруживаются фрагменты Т-ДНК A.rhizogenes, включающих гены rolA, rolB, rolC, mis, orfô, orfl3, orfl3a, orfl4\ 2) в расшифрованных геномах представителей более 15 родов растений, морских ежей (S. purpuratus) и червей (рода Caenorhabditis), обнаружены фрагменты Т-ДНК A.tumefaciens, включающие гены masl, tmsl и tms2.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор признателен сотруднику лаборатории Биоинженерии ИБФРМ РАН с.н.с., к.б.н. И.В. Волохиной за помощь в проведении экспериментов. Асп. Ю.С. Гусеву и A.B. Бурматову выражаю признание за сотрудничество, обсуждение результатов и помощь. В.А. Фролову и Ю.А. Чизмаджеву автор благодарен за предоставленную возможность проведения экспериментов по измерению электропроводности плоских мембран в лаб. биоэлектрохимии ИФЭХ РАН и поддержку.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мазилов, Святослав Игоревич, Саратов

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд., перераб. и доп. Т. 1. / Пер. с англ.-М.: Мир. 1994.-517 с.

2. Алехина Н.Д., Балконин Ю.В., Гавриленко В.Ф, Жигалова Т.В., Мейчик Н.Р., Носов A.M., Полесская О.Г., Харитонашвили Е.В., Чуб В.В. Физиология растений: учебник для студ. вузов / под ред. Ермаков И.П. М.: Издательский центр "Академия". - 2005. - 640 с.

3. Антонов В.Ф. Мембранный транспорт // Соросовский образовательный журнал. 1997, №6. - С. 14-20.

4. Волохина И.В., Сазонова И.А., Беликов В.А., Чумаков М.И. Выделение, очистка и идентификация белка вирулентности VirE2 из Agrobacterium tumefaciens II Микробиология. 2005. - Т.74, №1. - С.1-7.

5. Голденкова И.В., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. Бифункциональные репортерные гены: конструирование и экспрессия в клетка про- и эукариот // Молекулярная биология. 2003. - Т.37. -С. 356-364.

6. Гринюс J1.J1. Транспорт макромолекул у бактерий. М: Наука, 1986. -240 с.

7. Кагава Я. Биомембраны / Пер. с яп. Селищевой A.A.; Предисл. и общ. ред. Кагана B.B. М.: Высшая школа. - 1985. - 303с.

8. Калаптур О.В., Соловова Г.К., Панасенко В.И., Чумаков М.И. Колонизация агробактериями корней пшеницы // Изв. РАН. Сер. биол. -2004. Т.6. - С.1-10.

9. Крылов B.M. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий // Генетика. 2003. - Т.39, №5. -С.595-620.

10. Кулаева O.A., Матвеева Т.В., Лутова Л.А. Горизонтальный перенос генов от агробактерий к растениям // Экологическая генетика. 2006. -Т.4, №4. - С.10-19.

11. Кулаева О.Н. Как регулируется жизнь растений // Соросовский Образовательный Журнал. 1995. -Т.1.-С. 20-27.

12. Лузиков В.Н. Экзоцитоз белков. М.: Академкнига. - 2006. - 253 с.

13. Лутова Л.А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды // Соросовский Образовательный Журнал. 2000. - Т.6, №10. - С.10-17

14. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. - Т.34, №2. - С. 165-182.

15. Марков A.B. Горизонтальный перенос генов и эволюция. Доклад в ИОГен., 13 ноября 2008 г. http://www.evolbiol.ru/lgt2008/lgt2008.htm

16. Меликов К.Ч., Самсонов A.B., Пирутин С.К., Фролов В.А. Исследование индуцированных электрическим полем малых флуктуаций проводимости бислойных мембран // Биол. мембраны. 1999. - Т. 16. -С.95-102.

17. Мухина И.В. Физиология и биофизика возбудимых систем. Учебно-методические материалы по программе повышения квалификации «Хранение и обработка информации в биологических системах». -Нижний Новгород: Издательство ННГУ. 2007. - 105 с.

18. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии высших растений.1. M.: Наука.- 1988.-304 с.

19. Прозоров A.A. Горизонтальный перенос генов у бактерий: лабораторное моделирование, природные популяции, данные геномики // Микробиология. 1999. - Т.68, №5. - С.632-646.

20. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Изд. 3-е, испр. Минск: Вышейшая школа. - 1973. - 320 с.

21. Рубин А.Б. Биофизика: Учебник для вузов в 2т. Т.2. Биофизика клеточных процессов М.: Книжный дом "Университет". - 1999. -464 с.

22. Саляев Р.К. Поглощение веществ растительной клеткой. М.: Наука. -1969-21 с.

23. Северин Е.С. Биохимия: Учеб. для вузов / под ред. Северина Е.С. М.: ГЭОТАР-МЕД. -2003. - 779 с.

24. Сорокин A.B., Ким Е.Р., Овчинников Л.П. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков // Успехи биологической химии. 2007. - Т.47.1. С.89-128.

25. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК / Пер. с англ. -М.: Мир, 1986.-286 с.

26. Финкельштейн А.И., Птицын О.Б. Физика белка. М.: Книжный дом "Университет". - 2002. - 373с.

27. Чумаков М.И., Курбанова И.В. Локализация VirBl белка на поверхности агробактерий // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15, №6.1. С.719-721.

28. Шестаков C.B. Горизонтальный перенос генов у эукариот // Вестник ВОГиС. 2009. - Т.13, № 2. - С.345-354.

29. Шестаков C.B. Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий // Экологическая генетика. 2007. - Т.5, № 2. -С. 12-24.

30. Шестаков С.В. Роль горизонтального переноса генов в эволюции. Доклад на семинаре «Происхождение живых систем». 15-20 августа 2003 г. http://macroevolution.narod.ru/shestakov.htm

31. Abu-Arish A., Frenkiel-Krispin D., Fricke Т., Tzfira Т., Citovsky V., Wolf S., Elbaum M. Three-dimensional Reconstruction of Agrobacterium VirE2 Protein with Single-stranded DNA // J. Biol. Chem. 2004. - Vol.279. -P.25359-25363.

32. Akey C.W., Radermacher M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy // J. Cell Biol. 1993. - Vol.122, №1. - P.l-19.

33. Akiba Т., Koyama K., Ishiki Y., Kimura S., Fukushima T. On the mechanism of the development of multiple-drug-resistant clones of Shigella// Jpn. J. Microbiol 1960. - Vol.4. - P.219-227.

34. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. New York: Garland Science. - 2008. - 1725 p.

35. Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. Basic Local Alignment Search Tool // J.Mol.Biol. 1990. Vol.215, №3. - P.403-410.

36. Andersson J.O. Lateral gene transfer in eukaryotes // Cell. Mol. Life Sci. -2005. Vol.62. - P.l 182-1197.

37. Aoki S., Syono K. Horizontal gene transfer and mutation: Ngrol genes in the genome of Nicotiana glauca II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96, №23. - P.13229-13234.

38. Atmakuri K., Ding Z., Christie P.J. VirE2, a Type IV secretion substrate, interacts with the VirD4 transfer protein at cell poles of Agrobacterium tumefaciens II Mol. Microbiol. 2003. - Vol.49. - P. 1699-1713.

39. Ballas N., Citovsky V. Nuclear localization signal binding protein from Arabidobsis mediated nuclear import of Agrobacterium VirD2 protein 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol.93. - P.10723-10728.

40. Batthey N.H., James N.C, Greenland A.J., Brownlee C. Exocytosis and endocytosis // The Plant Cell. 1999. - Vol.11. - P.643-659.

41. Bayley H. Pore-forming proteins with built-in triggers and switches // Bioorganic Chem. 1995. - Vol.23. - P.340-354.

42. Bayliss R., Littlewood T., Stewart M. Structural basis for the interaction between FxFG nucleoporin repeats and importin-beta in nuclear trafficking // Cell. 2000. - Vol.102. - P.99-108.

43. Beijersbergen A.A., Dulk-Ras R., Schilperroort R.A., Hooykaas P. Conjugative transfer by the virulence system of Agrobacterium tumefaciens II Science. 1992. - Vol.256. - P.1324-1326.

44. Belanger C., Loubens I., Nester E.W., Dion P. Variable efficiency of a Ti plasmid-encoded VirA protein in different agrobacterial host // J. Bacteriol. -1997. Vol.179, №.7. - P.2305-2313.

45. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D., Sayers E. GenBank // Nucleic Acids Res. 2011. - Vol.39. - P.32-37.

46. Benson D.A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D., Ostell J., Sayers E.W. GenBank // Nucleic Acids Res. -2009. Vol.37. - P.26-31.

47. Benson D.A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank // Nucleic Acids Res. 2008. - Vol.36. - P.25-30.

48. Benveniste R.E., Todaro G.J. Evolution of type C viral genes: Evidence for an Asian origin of man//Nature. 1976. - Vol.261. - P. 101-108.

49. Berger B.R. Christie P.J. Genetic complementation analysis of the Agrobacterium tumefaciens virB operon: virB2 through virB 11 are essential virulence genes // J. Bacteriol. 1994. - Vol.176,№.12. - P.3646-3660.

50. Berman H.M. The Protein Data Bank: a historical perspective. // Acta Crystallogr A. 2008. - Vol. 64. - P.88-95.

51. Bishop J.M. Enemies within: The genesis of retrovirus oncogenes. 11 Cell. -1981.-Vol.23.-P.5-6

52. Boulo S., Akarsu H., Ruigrok R.W., Baudin F. Nuclear traffic of influenza virus proteins and ribonucleoprotein complexes // Virus Res. 2007. -Vol.124.-P.12-21.

53. Bränden C.I. The TIM barrel the most frequently occurring folding motif in proteins // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1991 - Vol.1. - P.978-983.

54. Breeuwer M., Goldfarb D.S. Facilitated nuclear transport of histone HI and other small nucleophilic proteins // Cell. 1990. - Vol.60, №6. - P.999-1008.

55. Post C.B., Pu J.Z., Schaefer M., Tidor B., Venable R.M., Woodcock H.L., Wu X., Yang W., York D.M., Karplus M. CHARMM: the biomolecular simulation program // J Comp. Chem. 2009. - Vol.30. - P.1545-1614.

56. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M. CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations // J. Comp. Chem. 1983. - Vol.4. - P. 187-217.

57. Bulgakov V.P., Odintsova N.A., Plotnikov S.V., Kiselev K.V., Zacharov E.V., Zhuravlev Y.N. Ga/4-gene-dependent alterations of embryo development and cell growth in primary culture of sea urchins // Marine Biotech. 2002. - Vol.4, №5. - P.480-486.

58. Bundock P., Hookaas P.J.J. Integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA in Saccharomices cerevisiae genome by illegitimate recombination // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. - Vol.93. - P.15272-15275.

59. Canchaya C., Fournous G., Chibani-Chennoufi S., Dillmann M.L., Brüssow H. Phage as agents of lateral gene transfer // Current Opin. Microbiol. 2003. - Vol.6. - P.417-424.

60. Caplan A., Herrera-Estrella L., Inze D., Van Hauter E., Van Montagu M., Schell J., Zambryski P. Introduction of genetic material into plant cells // Science. 1983. - Vol.222. - P.815-821.

61. Charles T.C., Nester E.W. A chromosomaly encoded two component sensory transduction system is required for virulence of Agrobacterium tumefaciens // J.Bacteriol. 1993.-Vol.175.-P.6614-6625 ----

62. Chen I., Dubnau D. DNA uptake during natural transformation // Nature Rev. Microbiol. 2004. - Vol.2. - P.241-249.

63. Chen L., Li C., Nester E. Transferred DNA (T-DNA)-associated proteins of Agrobacterium tumefaciens are exported independently of virB // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. - P.7545-7550.

64. Chilton M.-D., Drummond M.H., Merlo D.J., Sciaky D., Montoya A.L., Gordon M.P., Nester E.W. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis // Dept. Bioch. -1977.-Vol.11.-P.263-271.

65. Chou A.Y., Archdeacon J., Kado K. Agrobacterium transcriptional regulator Ros as a prokaryotic zink finger protein that regulates the plant oncogene ipt //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.95. - P.5293-5298.

66. Christie P.J. Agrobacterium tumefaciens T-complex transport apparatus: a paradigm for a new family of multifunctional transporters in eubacteria // J.Bacteriol. 1997. - Vol.179. - P.3085-3094.

67. Christie P.J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems // Biochim Biophys Acta. 2004. - Vol.1694. -P.219-234.

68. Christie P.J., Ward J.E., Winans S.C., Nester E.W. The Agrobacterium tumefaciens vz>E2 gene product is a sinle-stranded-DNA-binding protein that associates with T-DNA // J.Bacteriol. 1988. Vol.170, №.6. - P.2559-2667

69. Citovsky V., Guralnik B., Simon M.N., Wall J.S.J. The molecular structure of Agrobacterium VirE2-single DNA complexes involved in nuclear import // Mol. Biol. 1997. - Vol. 272. - P.718-727.

70. Citovsky V., Warnick D., Zambryski P. Nuclear import of Agrobacterium VirD2 and VirE2 proteins in maize and tobacco // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P.3210-3214.

71. Citovsky V., Zupan J., Warnick D., Zambryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells // Science. 1992. - Vol.256. -P.1802-1805

72. Citovsky V.C., Wong M.L., Zambryski P. Cooperative interaction of Agrobacterium VirE2 protein with single-stranded DNA: implications for the T-DNA transfer process // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol.86. -P.1193-1197

73. Conti E, Muller C.W., Stewart M. Karyopherin flexibility in nucleocytoplasmic transport // Curr Opin Struct Biol. 2006. - Vol.16. -P.237-244.

74. Gopley S.D., Dhillon J.K. Lateral gene transfer and parallel evolution in the history of glutathione biosynthesis genes // Genome Biol.- 2002. -Vol.3.-P.25.1-25.16.

75. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structures explain functional properties of two E.coli porins // Nature. 1992. - Vol.358, №6389. -P.727-733.

76. Cronshaw J.M., Krutchinsky A.N., Zhang W., Chait B.T., Matunis M.J. Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex // J. Cell Biol. -2002. Vol.158, №5. - P.915-927.

77. De Groot M.J., Bundock P., Hooykaas P.J., Beijersbergen A.G. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi // Nat Biotechnol. 1998. - Vol.16, №9. - P.839-842.

78. De Koning A.P., Brinkman F.S.L., Jones S.J.M., Keeling P.J. Lateral gene transfer and metabolic adaptation in the human parasite Trichomonas vaginalis II Mol. Biol. Evol. 2000. - Vol.17. №11. - P. 1769-1773.

79. Devos D., Dokudovskaya S., Alber F., Williams R., Chait B.T., Sali A., Rout M.P. Components of coated vesicles and nuclear pore complexes share a common molecular architecture // PLoS Biol. 2004. - Vol.2, №12. - E380.

80. Duckely M., Hohn B. The VirE2 protein of Agrobacterium tumefaciens: the Yin and Yang of T-DNA transfer // FEMS Microbiol. Lett. 2003. -Vol.223.-P.l-6.

81. Dumas F., Duckely M., Pelczar P., Van Gelder P., Hohn B. An Agrobacterium VirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol.98. - P.485-490.

82. Durrenberger M.B., Villiger W., Bachi Th. Conjugation junction: morphology of specific contact in conjugating Escherichia coli bacteria // J. Struct. Biol. 1991. -Vol.107. -P.146-156.

83. Eisenmann G., Dani J.A. An introduction to molecular architecture and permeability of ion channels // Ann Rev Biophys Chem. 1987. - Vol.16. -P.205-226.

84. Engstrom P., Zambryski P., van Montague M., Stachel S. Characterization of Agrobacterium tumefaciens virulence proteins induced by the plant factor acetosyringone // J.Mol. Biol. 1987. - Vol.197. - P.635-645.

85. Farber G.K., Petsko G.A. The evolution of a/p barrel enzymes // Trends Biochem. Sci. 1990. - Vol.15. - P.228-234.

86. Fenn K., Conlon C., Jones M., Quail M.A., Holroyd N.E., Parkhill J., Blaxter M. Phylogenetic relationships of the Wolbachia of nematodes and artropods // PLoS Pathol. 2006. - Vol.2. - P.e94.

87. Finn R.D., Tate J., Mistry J., Coggill P.C., Sammut S.J., Hotz H.R., Ceric G., Forslund K., Eddy S.R., Sonnhammer E.L., Bateman A. The Pfam protein families database // Nucleic Acids Res. 2008. - Vol.36. - P.281-288.

88. Frost L.S., Leplae R., Summers A.O., Toussiant A. Mobile genetic elements: the agents of open source evolution // Nature Rev. Microbiol. -2005,-Vol.3.-P.722-732.

89. Frundt C., Meyer A. D., Ichikawa T., Meins F. A tobacco homologue of the Ri-plasmid ORF13 gene causes cell proliferation in carrot root discs // Mol.Gen.Genet. 1998. - Vol.259, №6. - P. 559-568.

90. Fullner K.J, Nester E.W. Temperature affects the T-DNA transfer machinery of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 1996. - Vol.178.1. P.1498-1504.

91. Fullner K.J. Role of Agrobacterium virB genes in transfer of T complexes // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180, №.2. - P. 430-434.

92. Fullner K.J., Lara J.C., Nester E.W. Pilus assembly by Agrobacterium T-DNA transfer genes // Science. 1996. - Vol.273. - P. 1007-1009.

93. Garavito R.M., Hinz U., Neuhaus J.M. The crystallization of outer membrane proteins from Escherichia coli II J Biol Chem. 1984. - Vol.259. -P.4254-4257.

94. Gelvin S.B. Agrobacterium VirE2 protein can form a complex with T strand in the plant cytoplasm // J. Bacteriol. 1998. - Vol.181. - P.4300-4302.

95. Gilbert C., Schaack S„ Pace J.K. II, Brindley P.J., Feschotte C. A role for host-parasite interactions in the horizontal transfer of transposons across phyla // Nature. 2010. - Vol.464. - P. 1347-1350

96. Gladyshev E.A., Meselson M., Arkhipova I.R. Massive horizontal gene transfer in bdelloid rotifers // Science. 2008. - Vol.320. - P.1210-1213.

97. Gogarten J.P., Doolittle W.F., Lawrence J.G. Prokaryotic evolution in light of gene transfer // Mol. Biol. Evol. 2002. - Vol.19. - P.2226-2238.

98. Gorlich D., Kutay U. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1999. - Vol.15. - P.607-660.

99. Guex N, Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. -Vol.18. -P.2714-2723.

100. Guex N., Peitsch M.C. Swiss-Pdb Viewer: A fast and easy-to-use PDB Viewer for Macintosh and PC // Protein Data Bank Quaterly Newsletter. 1996. -Vol.77. -P.e7.

101. Gulbis J.M., Mann S., MacKinnon R. Structure of a voltage-dependent K+ channel p-subunit // Cell. 1999. - Vol.97. - P.943-952.

102. Henderson R., Unwin P.N.T. Three-dimensional model of purple membrane obtained by electron microscopy // Nature. 1975. - Vol.257. - P.28-32.

103. Henderson R., Baldwin J.M., Ceska T.A., Zemlin F., Beckmann E., Downing K.H. Model for the structure of bacteriorhodopsin based on highresolution electron cryo-microscopy // J. Mol. Biol. 1990. - Vol.213. -P.899-929.

104. Herrera-Estrella A., Chen Z.M., Van Montagu M., Wang K. VirD proteins of Agrobacterium tumefaciens are required for the formation of a covalent DNAprotein complex at the 5' terminus of T strand molecules // EMBO J. -1988. Vol.7. - P.4055-4062.

105. Higgins N. P., Hillyard D., Primary structure and mapping of the hupA gene oí Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1988. - Vol.170. - P.5751-5758.

106. Hille B. Ionic Channel of Excitable Membranes, 1st Edition. Sunderland: Sinauer Associates. - 1984. - 617 p.

107. Hinshaw J.E., Carragher B.O., Milligan R.A. Architecture and design of the nuclear pore complex // Cell. 1992. - 69, №7. - P.l 133-1141.

108. Ho M.-W., Ryan A. Cummins J. Cauliflower Mosaic Viral Promoter

109. A recipe for disaster? //Microbial Ecology in Health and Disease. 1999. -Vol.11.-P.194-197.

110. Hoenger A., Pages J.M., Fourel D., Engel A. The orientation of porin OmpF in the outer membrane of Escherichia coli II J Mol Biol. 1993. -Vol.233. -P.400-413.

111. Huang Y. VirA, coregulator of Ti-specified virulence genes, is phosphorylated in vitro II J. Bacteriol. 1990. - Vol.172. - P.l 142-1144.

112. Huang Y-S. Ultrastructure of bacterial penetration in plants // Ann. Rev. Phytopathol. 1986. - Vol.24. - P.141-157.

113. Intrieri M.C., Buiatti M. The horizontal transfer of Agrobacterium rhizogenes genes and the evolution of the genus Nicotiana II Molecular Phylogenetics and evolution. 2001. - Vol. 20, №1. - P. 100-110.

114. Jäkel S, Görlich D. Importin beta, transportin, RanBP5 and RanBP7 mediate nuclear import of ribosomal proteins in mammalian cells // EMBO J. -1998. Vol.17. - P.4491-4502.

115. Jo S., Kim T., Im W. Automated builder and database of protein/membrane complexes for molecular dynamics simulations // PLoS ONE. 2007. -Vol.2.-P.e880.

116. Jones D.T. Improving the accuracy of transmembrane protein topology prediction using evolutionary information // Bioinformatics. 2007. Vol.23. -P.538-544.

117. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 292. - P. 195-202.

118. Jones D.T., Taylor W.R., Thornton J.M. A model recognition approach to the prediction of all-helical membrane protein structure and topology // Biochem. 1994. -Vol. 33. - P.3038-3049.

119. Keeling P.J., Palmer J.D. Horizontal gene transfer in eykaryotic evolution // Nature Rev. Genet. 2008. - Vol.9. - P.605-618.

120. Kelley L.A., Sternberg M.J.E. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server //Nat. Protoc. 2009. - Vol.4. - P.363 - 371.

121. Keminer O., Peters R. Permeability of single nuclear pores // Biophys. J. -1999. Vol.77, №1.-P.217-228.

122. Kiseleva E.V., Goldberg M.W., Allen T.D., Akey C.W. Active nuclear pore complexes in Chironomus: visualization of transporter configurations related to mRNP export // J. Cell Sci. 1998. - Vol.111, №2. - P.223-236.

123. Koncz C., Kreuzaler F., Kalmen Z.S., Schell J.A simple method to transfer, integrate and study expression of foreign genes, such as chicken ovalbumin and alpha-actin in plant tumors // EMBO J. 1984. - Vol.3. - P. 1023-1037.

124. Kondo N., Nikoh N., Ijichi N., Shimada M., Fukatsu T. Genome fragment of Wolbachia endosymbyont transferred to X-chromosome of host insect // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. - Vol.99. - P. 14280-14285.

125. Kosugi S., Hasebe M., Matsumura N., Takashima H., Miyamoto-Sato E., Tomita M., Yanagawa H. Six classes of nuclear localization signals specific to different binding grooves of importin alpha // J Biol Chem. 2009. - Vol.284, №1. - P.478-485.

126. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol.98. - P.1871-1876.

127. Kyte J. Molecular considerations relevant to the mechanism of active transport // Nature. -1981.- V.292. P.201 -204.

128. La Cour T., Gupta R., Rapacki K., Skriver K., Poulsen F.M., Brunak S. NESbase version 1.0: a database of nuclear export signals. // Nucleic Acids Res. 2003. - Vol.31, №1. - P.393-396.

129. La Scola B., Desnues C., Pagnier I., Robert C., Barrassi L., Fournous G., Merchat M., Suzan-Monti M., Forterre P., Koonin E., Raoult D. The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus //Nature. 2008. -Vol.455.-P. 100-104.

130. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - Vol. 227, №5259. - P. 1680-1685.

131. Lai E.M., Chesnokova O., Banta L.M., Kado C.I. Genetic and environmental factors affecting T-pilin export and T-pilus biogenesis in relation to flagellation of Agrobacterium tumefaciens II J. Bacteriol. 2000. - Vol.182. -P.3705-3716.

132. Lai E.M., Kado C.I. Processed VirB2 is the major subunit of the promiscuos pilus of Agrobacterium tumefaciens II J.Bacteriol. 1998. - Vol.180. -P.2711-2717.

133. Lang D., Thoma R., Henn-Sax M., Sterner R., Wilmanns M. Structural evidence for evolution of the (3/a barrel scaffold by gene duplication and fusion // Science. 2000. - Vol.289. - P. 1546 1550.

134. Lange A., Mills R.E., Lange C.J., Stewart M., Devine S.E., Corbett A.H. Classical nuclear localization signals: definition, function, and interaction with importin alpha // J Biol Chem. 2007. - Vol.282, №8. - P.5101-5105.

135. Lanyi J.K. Understading Structure and Function in the light-driven Proton pump bacteriorhodopsin // Journal of Structural Biology. 1998. - Vol.124. -P. 164 178

136. Leslie D.M., Zhang W., Timney B.L., Chait B.T., Rout M.P., Wozniak R.W., Aitchison J.D. Characterization of karyopherin cargoes reveals unique mechanisms of Kapl21p-mediated nuclear import // Mol. Cell Biol. 2004. -Vol.24, №19.-P.8487-8503

137. Lessl M., Balzer D., Pansegrau W., Lanka E. Sequence similarities between the RP4 Tra2 and the Ti-VirB region strongly support the conjugation model for T-DNA transfer // J.Biol.Chem. 1992. - Vol.267. -P.20471-20480.

138. Lessl M., Lanka E. Common mechanisms in bacterial conjugation and Ti-mediated transfer to plant cells // Cell. 1994. - Vol.77. - P.321-324.

139. Lippincott B.B., Lippincott J.A. Bacterial attachment to a specific wound site as an essential stage in tumor initiation by Agrobacterium tumefaciens II ¿Bacterid. 1969. - Vol.97, №.2. - P.620-628.

140. Lorenz M.G., Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the invironment // Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 58. -P.563-602.

141. Macindoe G., Mavridis L., Venkatraman V., Devignes M.-D., Ritchie D.W. HexServer: an FFT-based protein docking server powered by graphics processors // Nucleic Acids Research. 2010. - Vol.38. - P.445-449.

142. Malvern Instruments Ltd. Zetasizer Nano series user manual (MAN0317 Issue 1.1) United Kingdom. 2004. - 270 p.

143. Menestrina G., Dalla Serra M., Prevost G. Mode of action of beta-barrel poreforming toxins of the staphylococcal alpha-hemolysin family // Toxicon. 2001. - Vol.39. - P.1661-1672.

144. Meyer A.D., Ichikawa T., Meins F. Horizontal gene transfer: regulated expression of a tobacco homologue of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene // Mol. Gen. Genet. 1995. - Vol. 249. - P.265-273.

145. Mikosch T.S., Lavrijssen B., Sonnenberg A.S., van Griensven L.J. Transformation of the cultivated mushroom Agaricus bisporus (Lange) using T-DNA from Agrobacterium tumefaciens II Curr Genet. 2001. - Vol.39. -P.35-39.

146. Miller W., Lefkowitz R.J. Expanding roles for beta-arrestins as scaffolds and adapters in GPCR signaling and trafficking // Curr. Opin. Cell Biol. -2001. Vol.13, №2. - P.139-145.

147. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation // Biol. Rev. Cambridge Phil Soc. 1966. - V.41. - P.445-502.

148. Montoya M., Gouaux E. Beta-barrel membrane protein folding and structure viewed through the lens of alpha-hemolysin // Biochim Biophys Acta. -2003.- Vol.1609. -P.19-27.

149. Morona R., Klose M., Henning U. Escherichia coli K-12 outer membrane protein (OmpA) as a bacteriophage receptor: Analysis of mutant genes expressing altered proteins // J. Bacteriol. 1984. - Vol.159. - P.570-578.

150. Mosammaparast N., Guo Y., Shabanowitz J., Hunt D.F., Pemberton L.F. Pathways mediating the nuclear import of histones H3 and H4 in yeast // J. Biol. Chem. -2002. Vol.277, №1. - P.862-868.

151. Mosammaparast N., Jackson K.R., Guo Y., Brame C.J., Shabanowitz J., Hunt D.F., Pemberton L.F. Nuclear import of histone H2A and H2B is mediated by a network of karyopherins // J. Cell Biol. -2001. Vol.153, №2. - P.251-262.

152. Miihlhausser P., Miiller E.C., Otto A., Kutay U. Multiple pathways contribute to nuclear import of core histones // EMBO Rep. -2001. Vol.2, №8.1. P.690-696.

153. Mysori R.S., Bassuner D., Deng X.B., Darfinian N.S., Motchoulski A., Ream W. Role of Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein in T-DNA transfer and integration // MPMI. 1998. - Vol.11, №.7. - P.662-683.

154. Nagano N., Hutchinson E.G., Thornton J.M. Barrel structures in proteins -automatic identification and classification including a sequence analysis of TIM barrels // Protein Sci. 1999. - Vol.8. - P.2072-2084.

155. Nagano N., Orengo C.A., Thornton J.M. One fold with many functions: the evolutionary relationships between TIM barrel families based on their sequences, structures and functions // J. Mol. Biol. 2002. - Vol.321.1. P.741-765.

156. Nikaido H. Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes // J Biol Chem. 1994. - Vol.269. - P.3905-3908.

157. Niraido H., Nikaido K., Harayama S. Identification and characterization of porins in Pseudomonas aemginosa. // J Biol Chem. 1991. - Vol.266.1. P.770-779.

158. Nugent Т., Jones D.T. Transmembrane protein topology prediction using support vector machines // BMC Bioinformatics. 2009. - Vol.10. - P.el59.

159. Ochiai K., Yamanaka Т., Kimura K., Sawada O. Inheritance of drug resistance (and its tranfer) between Shigella strains and Between Shigella and E.coli strains // Hihon Iji Shimpor. 1959. - Vol.1861. - P.34-46.на японском).

160. Ochman H., Lawrence J.G., Groisman E.A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation // Nature. 2000. - Vol.405. - P.299-304.

161. Okamoto S, Toyoda-Yamamoto A, Ito K, Takebe I, Machida Y. Localization and orientation of the VirD4 protein of Agrobacterium tumefaciens in the cell membrane // Mol Gen Genet. 1991. - Vol.228. - P.24-32.

162. Paine P.L., Moore L.C., Horowitz S.B. Nuclear envelope permeability // Nature. 1975. - Vol.254. - P.109-114.

163. Pansegrau W., Lanka E. Enzymology of DNA transfer by conjugation mechanisms // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1996. - Vol.54. -P. 197-251.

164. Pante N., Aebi U. Sequential binding of import ligands to distinct nucleopore regions during their nuclear import // Science. -1996. -Vol.273. -P.1729-1732.

165. Pante N., Kann M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm // Mol. Biol. Cell. 2002. - Vol.13. -P.425-434. "

166. Pearson H. 'Virophage' suggests viruses are alive // Nature. 2008. -Vol.454.-P.677.

167. Peralta E.G., Ream L.W. T-DNA border sequences required for crown gall tumorigenesis // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. - Vol.82, №15.1. P.5112-5116.

168. Peters R. Introduction to nucleocytoplasmic transport: molecules and mechanisms // Methods Mol Biol. 2006. - Vol.322. - P.235-258.

169. Petrek M., Kosinova P., Koca J., Otyepka M. MOLE: A Voronoi diagram-based explorer of molecular channels, pores, and tunnels // Structure. -2007. Vol.15. - P.1357-1363

170. Pierce K.L., Premont R.T., Lefkowitz R.J. Seven-transmembrane receptors // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2002. - Vol.3. -P.639-650.

171. Piers K., Heath J., Liang X., Stephens K., Nester E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-Vol.93.-P.1613-1618.

172. Piers K.L., Heath J.D., Liang X., Stephens K.M., Nester E.W. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. Vol.93, №.4. - P.1613-1618.

173. Pouliquin P., Grouzis J., Gibrat R. Electrophysiological study with oxonol VI of passive N03" transport by isolated plant root plasma membrane // Biophys J. 1999. - Vol.76. - P.360-373.

174. Reichelt R., Holzenburg A., Buhle E.L. Jr., Jarnik M., Engel A., Aebi U. // J. Cell Biol. 1990. - Vol.110, №.4. - P.883-894.

175. Ribbeck K., Gorlich D. Kinetic analysis of translocation through nuclear pore complexes // EMBO J. 2001. - Vol.20, №6. - P. 1320-1330.

176. Richardson A.O., Palmer J.D. Horizontal gene transfer in plants // J. Exptl. Bot.-2007.-Vol.58.-P.l-9.

177. Riezman H., Woodman P.G., van Meer G., Marsh M. Molecular mechanisms of endocytosis // Cell. 1997. - Vol.91, №6. - P.731-738.

178. Rossi L., Hohn B., Tinland B. Integration of complete transferred DNA units is dependent on the activity of virulence E2 protein of Agrobacterium tumefaciens II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93. - P. 126-130.

179. Rost B. PHD: predicting one-dimensional protein structure by profile based neural networks // Meth. in Enzym. 1996. - Vol.266. - P.525-539.

180. Rost B., Sander C. Combining evolutionary information and neural networks to predict protein secondary structure // Proteins. 1994. - Vol.19. - P.55-77.

181. Rost B., Sander C. Prediction of protein structure at better than 70% accuracy // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 232. - P.584-599.

182. Rost B., Sander C., Schneider R. PHD-a mail server for protein secondary structure prediction // CABIOS. 1994. Vol.10. - P.53-60.

183. Rothman J.E., Sollner T. Throttles and dampers: controlling the engine of membrane fusion// Science. 1997. - Vol.276. - P. 1212-1213.

184. Rout M.P., Aitchison J.D. Pore relations: nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic exchange // Essays Biochem. 2000. - Vol.36. - P.75-88.

185. Salmond G.P.C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria // Ann. Rev. Phytopathol. 1994. - Vol.32. - P. 181-200.

186. Sasaki J., Brown L.S., Chon Y.S., Kandori H., Maeda A., Needleman R., Lanyi J.K. Conversion of bacteriorhodopsin into a chloride ion pump // Science. 1995. - Vol.269. -P.73-75.

187. Schroder G., Waffenschmidt S., Weiler E.W., Schroder J. The T-region of Ti plasmid codes for an enzyme synthesizing indole-3-acetic acid // Eur. J. Biochem. 1984. - Vol. 138. - P.387-391.

188. Senger B., Simos G., Bischoff F.R., Podtelejnikov A., Mann M., Hurt E. MtrlOp functions as a nuclear import receptor for the mRNA-binding protein Npl3p // Embo J. 1998. - Vol.17, №8. - P.2196-2207.1.

189. Shabala S.N., Newman I.A. Osmotic sensitivity of Ca and H transporters in corn roots: effect on fluxes and their oscillations in the elongation region // JMembr Biol. 1998,- 161, №l.-P.45-54.

190. Shaw C.H., Leemans J., Shaw C.H., Van Montagu M., Schell J. A general method for the transfer of cloned genes to plant cells // Gene. 1983. -Vol.23.-P.815-830.

191. Shirasu K., Kado C.I. Membrane location of the Ti plasmid VirB proteins involved in the biosynthesis of a pilin-like conjugative structure on Agrobacterium tumefaciens IIFEMS Microbiol. Letters. 1993a. - Vol.111. -P.287-294.

192. Siebrasse J.P., Peters R. Rapid translocation of NTF2 through the nuclear pore of isolated nuclei and nuclear envelopes // EMBO Rep. -2002. Vol.3.1. P.887-892.

193. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science. 1972. - Vol.175. - P.720-731.

194. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. Structure of staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. -1996. Vol. 274. - P.1859-1866.

195. Sorensen S.J., Bailey M., Hansen L.H., Kroer N., Wuertz S. Studying plasmid horizontal transfer in situ: a critical review // Nature Rev. Microbiol. 2005. -Vol.5. -P.700-710.

196. Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens //EMBO J. -1986.- Vol.5. -.P.1445-1454.

197. Stachel S.E., Nester E.W., Zambryski P.C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986a. - Vol.83. - P.379-383.

198. Stachel S.E., Timmerman B., Zambryski P.C. Generation of single-stranded T-DNA molecules during the initial stages of T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to plant cells // Nature. 1986b. - Vol.322. -P.706-711.

199. Stoeckenius W., Bogomolni R.A. Bacteriorhodopsin and related pigments of Halobacteria // Annu. Rev. Biochem. 1982. - Vol.51. - P.587-616.

200. Stoffler D., Fahrenkrog B., Aebi U. The nuclear pore complex: from molecular architecture to functional dynamics // Curr. Opin. Cell Biol. -1999. Vol.11, №3. - P.391-401.

201. Sugawara E., Nikaido H. Pore-forming activity of OmpA protein of Escherichia coli IIJ Biol Chem. 1992. - Vol.267. P.2507-2511.

202. Sundberg C.D., Meek L., Carroll K., Das A., Ream W. VirEl protein mediated export of the single-stranded DNA binding protein VirE2 from Agrobacterium tumefaciens into plant cells //J. Bacteriol. 1996. - Vol.178, №4.-P.1207-1212.

203. Sundberg C.D., Ream W. The Agrobacterium tumefaciens chaperone-like protein, VirEl, interacts with VirE2 at domains required for single-stranded

204. DNA binding and cooperative interaction // J. Bacteriol. 1999. -Vol.181, №.21. - P.6850-6855.

205. Suntharalingam M., Wente S.R. Peering through the pore: nuclear pore complex structure, assembly, and function // Dev. Cell. 2003. - Vol.4, №6. - P.775-789.

206. Suzuki K., Yamashita I., Tanaka N. Tobacco plants transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution // The Plant Journal. 2002. -Vol.32. -P.775-787.

207. Syvanen M. Cross-species gene transfer; implications for a new theory of evolution //J. Theor. Biol. 1985. - Vol.112. - P.333-343.

208. Tardy F., Homble F., Neyt C., Wattiez R., Cornelis G.R., Ruysschaert J.M., Cabiaux V. Yersinia enterocolitica type III secretion-translocation system: channel formation by secreted Yops // EMBO J. 1999. - Vol.18.1. P.6793-6799.

209. The UniProt Consortium. The Universal Protein resource (UniProt) in 2010 // Nucleic Acids Res. 2010. - Vol.38. - P.142-148

210. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes// Trends of Plant Science. 1996. -Vol.1. -P.178-184

211. Tommassen J. Biogenesis and membrane topology of outer membrane proteins in Escherichia coli II Membrane Biogenesis NATO ASI Series / ed. by Kamp J.O. Den. Berlin: Springer Verlag. - 1988. - P.352-373

212. Toro N., Datta A., Yanofsky M., Nester E. Role of the overdrive sequence in T-DNA border cleavage in Agrobacterium II Proc Natl Acad Sci USA. -1988. Vol.85, №22. - P.8558-8562.

213. Toro N., Datta A., Carmi O.A., Young C., Prusti R.K., Nester E.W. The

214. Agrobacterium tumefaciens virCl gene product binds to overdrive, a T-DNA transfer enhancer // J Bacteriol. 1989. - Vol.171, №12. -P.6845-6849.

215. Tzfira T., Rhee Y., Chen M.H., Kunik T., Citovsky V. Nucleic acid transport in plant-microbe interactions: The molecules that walk through the walls // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol.54. - P. 187-219.

216. Veluthambi K., Ream W., Gelvin S.B. Virulence genes, borders, and overdrive generate single-stranded T-DNA molecules from the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens IIJ Bacteriol. 1988. - Vol.170.1. P.1523-1532.

217. Vogel H., Jahnig F. Models for the structure of outer-membrane proteins of Escherichia coli. Derived from Raman spectroscopy and prediction methods // J Mol Biol. 1986. - Vol.190. - P.191-199.

218. Volokhina I.V., Sazonova I.A., Velikov V.A., Chumakov M.I. Isolation, purification, and identification of the virulence protein VirE2 from Agrobacterium tumefaciens II Mic. Res. 2005. - Vol. 160. - P. 167-173.

219. Walter A., Gutknecht J. Permeability of small nonelectrolytes through lipid bilayer membranes // J. Membr. Biol. 1986. - V.90. - P.207-217.

220. Wang K., Herrera-Estrella L., Van Montagu M., Zambryski P. Right 25 bp terminus sequence of the nopaline T-DNA is essential for and determines direction of DNA transfer from agrobacterium to the plant genome // Cell. -1984.-Vol.38.-P.455-462.

221. Ward E.R., Barnes W.M. VirD2 protein of Agrobacterium tumefaciens very tightly linked to the 5' end of T-strand DNA // Science. 1988. - Vol.242, №11. - P.927-930.

222. Weirich C.S., Erzberger J.P., Berger J.M., Weis K. The N-terminal domain of Nupl59 forms a beta-propeller that functions in mRNA export by tethering the helicase Dbp5 to the nuclear pore // Mol. Cell. 2004. - Vol.16, №5.1. P.749-760.

223. Weis W., Scheller R. Membrane fusion. SNARE the rod, coil the complex. // Nature. 1998. - Vol.395. - P.328-329.

224. Weiss M.S., Kreusch A., Schiltz E., Nestel U., Welte W., Weckesser J., Schulz G.E. The structure ofporin from Rhodobacter capsulatus at 1.8 Ä resolution // FEBS Lett. 1991. - Vol.280. - P.379-382.1

225. Welte W., Weiss M.S., Nestel U., Weckesser J., Schiltz E., Schulz G.E. Prediction of the general structure ofporin from Rhodobacter capsulatus. Orientation of porin in the membrane // Biochim Biophys Acta. 1991. -Vol.1080-P.271-274.

226. White F., Garfinkel D., Huffman G., Gordon M., Nester E. Sequence homologous to Agrobacterium rhizogenes T-DNA in the genome of uninfected plants //Nature. 1983. - Vol. 301. - P.348-350.

227. White F.F., Ghidossi G., Gordon M.P., Nester E.W. Tumor induction by Agrobacterium rhizogenes involves the transfer of plasmid DNA to the plant genome // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1982. - Vol. 79, №10.1. P.3193-3197.

228. Wilmanns M., Hyde C.C., Davies D.R., Kirschner K., Jansonius J.N. Structural conservation in parallel ß/a barrel enzymes that catalyze three sequential reactions in the pathway of tryptophan biosynthesis // Biochemistry. 1991. - Vol.30. - P.9161-9169.

229. Wilson D.B. Cellular transport mechanisms // Annu. Rev. Biochem. 1978. -V.47. - P.933-965.

230. Woolf T., Roux B. Structure, energetics, and dynamics of lipid-protein interactions: A molecular dynamics study of the gramicidin A channel in a DMPC bilayer // Proteins. 1996. - Vol.24. - P.92-114

231. Wright S.D., Silverstein S.C. Overview: the function of receptors in phagocytosis. In: Handbook of Experimental Immunology, 4th ed. / ed. by Weir D.M., Herzenberg L. Oxford: Blackwell. - 1983. - P.41-1-41-14.

232. Yang Q., Rout M.P., Akey C.W. Three-dimensional architecture of the isolated yeast nuclear pore complex: functional and evolutionary implications //Mol. Cell. 1998. -Vol.1, №2.- P.223-234.

233. Yusibov V.M., Steck T.R., Gupta V., Gelvin S.B. Association of single-strand transferred DNA from Agrobacterium tumefaciens with tobacco cells // Proc. Natl. Acad. USA. 1994. - Vol.91. - P.2994-2998.

234. Zaenen I., Van Larebeke N., Van Montagu M., Schell J. Supercoiled circular DNA in crown-gall inducing Agrobacterium strains //J Mol Biol. 1974. -Vol.86. -P.109-127.

235. Zambryski P. Chronicles from the Agrobacterium-plant cell DNA transfer story // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. - Vol.43. -P.465-490.

236. Zardoya R., Ding X., Kitagawa Y., Chrispeels M. Origin of plant glycerol transporters by horizontal gene transfer and functional recruitment // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. - Vol.99. - P. 14891-14896.

237. Zupan J.R., Citovsky V., Zambryski P. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol.93. - P.2392-2397.

Информация о работе

Мазилов, Святослав Игоревич
кандидата биологических наук
Саратов, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Анализ структурно-функциональных свойств комплексов белка вирулентности агробактерий VirE2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы