Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функции белка VirE2 в переносе оцДНК в эукариотические клетки

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура и функции белка VirE2 в переносе оцДНК в эукариотические клетки"

На правах рукописи

Гусев Юрий Сергеевич

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БЕЖА У1гЕ2 В ПЕРЕНОСЕ оцДНК В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

Шифр и наименование специальности: 03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 '""'I

Воронеж - 2014

005549993

Работа выполнена в лаборатории биоинженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель доктор биологических наук

Чумаков Михаил Иосифович

Официальные оппоненты: Богатырев Владимир Александрович,

доктор биологических наук; ФГБОУ ВПО «Саратовский

государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», профессор базовой кафедры биофизики факультета нелинейных процессов

Федорин Дмитрий Николаевич

кандидат биологических наук; ФГБОУ ВПО ((Воронежский

государственный университет», доцент кафедры биохимии и физиологии клетки

Ведущая организация: ФГБУН «Институт цитологии и генетики

СО РАН»

Защита состоится 4 июля 2014 г. в «/уь часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 на базе Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета и на сайте http://www.science.vsu.ru.

Автореферат разослан « Ь> » ,///?■( 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

профессор Грабович Маргарита Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Agrobacteñiim tumefaciens является широко распространенным видом почвенных бактерий, вызывающим образование корончатых галлов у растений, которые возникают в результате встраивания фрагмента Ti-плазмиды (Т-ДНК) агробактерий в растительный геном и экспрессии бактериальных генов в клетке-реципиенте. Одним из ключевых факторов в процессе переноса Т-ДНК является бактериальный белок VirE2, который взаимодействует с оцДНК и образует транспортируемый комплекс (Т-комплекс). С помощью электронной микроскопии показано, что VirE2 формирует с оцДНК Т-комплекс со спиральной структурой, хорошо подходящей для задач защиты ДНК и ядерного импорта [Frenkiel-Krispin et al., 2006]. В настоящее время установлено, что белок выполняет несколько функций: связывание с Т-ДНК, ее защита от деградации растительными эндонуклеазами, транспорт Т-ДНК через растительные мембраны. Кроме того, показано, что VirE2 взаимодействует с растительными цитоплазматическими белками-шаперонами (Roca, Roc4 и СурА) и белком VIP2, которые обеспечивают взаимодействие с хроматином и содействуют интеграции Т-ДНК [Tzfira, Citovsky, 2002]. Транспорт Т-ДНК в клетку хозяина, вероятно, может реализовываться разными путями. Одним из них может быть формирование поры из агробактериального белка VirE2 в липидной мембране. При этом имеются данные, что VirE2 способен встраиваться в искусственную мембрану и формировать в ней канал, который открывается при наложении электрического поля с напряженностью 10-100 мВ [Dumas et al., 2001; Чумаков с соавт., 2010]. Другим возможным путем проникновения Т-ДНК в животные клетки может являться эндоцитоз. [см. Чумаков, 2001]. Тем не менее, экспериментальные доказательства поглощения Т-ДНК клеткой путем эндоцитоза в настоящее время отсутствуют.

В современной литературе феномен переноса коротких олигонуклеотидов через искусственные мембраны и Т-ДНК агробактерий через мембраны животных клеток при участии белка VirE2 описан в работах [Kunik et al., 2001; Petrunia et al., 2008]. Однако, механизм попадания оцДНК в клетку, опосредованный белком VirE2, малоисследован. Целью данной работы является анализ участия белка VirE2 при доставке оцДНК через мембрану в эукариотическую клетку: а) через поровый комплекс, формируемый белком VirE2; б) с помощью эндоцитоза, опосредуемого белком VirE2.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности белка VirE2 и его комплексов участвовать в процессе транспорта оцДНК через мембраны эукариотической клетки.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Построить трехмерные компьютерные модели комплексов на основе белка VirE2 и провести их анализ на встройку в мембрану и наличие каналов.

2. Изучить надмолекулярные комплексы на основе VirE2 белка и оцДНК-VirE2 методами биоинформатики.

3. Выделить, очистить рекомбинантный белок VirE2 и провести анализ его свойств in vitro.

4. Изучить перенос олигонуклеотидов в животные клетки в присутствии рекомбинантного белка VirE2.

Научная новизна работы. Впервые проведен анализ комплексов из двух и четырёх белков VirE2 методом нормальных мод. Установлено, что в некоторых модах наблюдается возможный воротный механизм каналов у комплексов из двух белков VirE2.

Впервые смоделированы комплексы из шести белков VirE2.

Впервые проведен анализ белка VirE2 в комплексе с белком-шапероном VirEl методами молекулярной динамики. Установлено, что модель белков VirE2-VirEl находится в равновесном, стабильном состоянии при времени моделирования до 500 пс. Также установлено, что структура белка VirEl в комплексе VirE2-VirEl обладает наибольшей подвижностью.

Впервые установлено, что рекомбинантный белок VirE2 способствует накоплению коротких синтетических олигонуклеотидов в нативных клетках линии HeLa, но не в клетках СПЭВ.

Практическая значимость. Поскольку белок VirE2 способствует переносу олигонуклеотидов в животные клетки, в дальнейшем это явление может быть использовано при разработке безвирусных технологий доставки генов в животные клетки и технологий генотерапии.

Личный вклад. Вклад диссертанта заключается в получении первичных данных по моделированию комплексных структур на основе белка VirE2 in silico, анализу переноса оцДНК в животные клетки, компьютерному анализу белковых комплексов из белка VirE2, которые проведены совместно с Мазиловым В.И., Волохиной И.В. и Чумаковым М.И. на базе лаб. биоинженерии ИБФРМ РАН. Результаты опубликованы в совместных статьях. Анализ модели белка VirE2 в комплексе с белком шапероном VirEl методами молекулярной динамики, анализ комплексов из двух и четырёх белков VirE2 методами нормальных мод, а также статистическая обработка экспериментальных данных проведены самостоятельно. Планирование экспериментов, их интерпретация, анализ и подготовка результатов проводились под руководством М.И. Чумакова.

Работа выполнена на базе лаб. биоинженерии ИБФРМ РАН в 20112013 гг. в рамках НИР «Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки», № 01200606182 (научный руководитель д.б.н. Чумаков М. И). Работа поддержана грантом РФФИ №11-04-01331 «Изучение механизма переноса Т-ДНК агробактерий в генеративные клетки кукурузы» (2011-2013 гг., рук. к.б.н. Волохина И.В.), гос. контрактом № 8728 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-

2013 годы, «Разработка технологии доставки ДНК в животные клетки с помощью белка V¡rE2» (рук. к.б.н. Мазилов С.И.).

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на X Всероссийской конференции «Биомеханика-2010» (Саратов, 16-22 мая 2010 г.), V Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сент.-1 окт. 2010 г.), на XIV Международной школе-конференции для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофотонике «Saratov Fall Meeting 10» (Саратов, 5-8 октября 2010 г.), 2-ой ежегодной научно-технической конференции нанотехноогического общества России "Перспективы развития в России НБИК-технологий как основного научного направления прорыва к шестому технологическому укладу" (Москва, 14-15 октября 2010), на III Междунар. форуме по нанотехнологиям "RUSNANOTECH 2010" (Москва, 1-3 ноября 2010), на Московской международной конференции по компьютерной биологии (Int. Moscow Conf. on Comp. Mol. Biol. MCCMB'll), Москва, 21-24 июля 2011), на IV съезде биофизиков России (Н.Новгород, 20-26 августа 2012 г.), на 13-м форуме молодых ученых FEBS (YSF 2013) (г. Санкт-Петербург, 3-5 июля 2013 г.) и 38 Конгрессе FEBS (г. Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Белок VirE2 способен формировать in silico комплексы из двух, четырёх субъединиц, способных встраиваться в мембрану.

2. Модели комплексов из белка VirE2 являются стабильными и обладают каналами, а комплекс из двух белков VirE2 имеет воротный канал.

3. Белок VirE2 способствует попаданию олигонуклеотидов в животные клетки HeLa, но не в клетки СПЭВ и взаимодействует с оцДНК.

Структура и объём диссертации. Диссертация, объемом 109 страниц, имеет структуру: введение, глава с обзором литературы, глава с указанием использованных материалов и методов исследования, глава с описанием экспериментальных данных и их обсуждением, выводы, список цитированной литературы из 142 источников, из которых 130 - зарубежные, приложения. Диссертация содержит 44 рисунка и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы, в котором рассмотрены основы механизма агробактериальной трансформации растений. При этом особое внимание уделено переносу ДНК через мембраны растительной клетки и роли белка VirE2 в этом процессе. Отдельно рассмотрен перенос оцДНК в животную клетку и способность Agrobacteriam tumefaciens инфицировать клетки животных. Также освещена проблема возможного проникновения Т-ДНК в растительную клетку посредством эндоцитоза. Рассмотрены основные вида эндоцитоза ДНК и различные виды специфических ингибиторов для блокирования всех типов эндоцитоза. В обзоре рассмотрена трехмерная структура VirE2 белка по данным рентгеноструктурного анализа. Дана литература по применению метода молекулярной динамики и метода нормальных мод для исследований структуры и динамики биологических макромолекул. В заключительной части 1-й главы сформулированы нерешенные проблемы и задачи исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе экспериментальных исследований измерена флуоресценция эукариотических клеток после инкубации с белком VirE2 и мечеными олигонуклеотидами. Перечислены использованные в работе реактивы, оборудование, среды, буферные растворы, микроорганизмы и культуры клеток. Приведены методики выделения и очистки белка VirE2, выращивания культур животных клеток. Описана методика статистической обработки экспериментальных данных, а также использованные в работе компьютерные программы и базы данных.

Выделение и очистка белка VirE2. Рекомбинантный белок VirE2, имеющий на N-конце 6 остатков гистидина, выделяли методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-агарозой из штамма E.coli XL 1-blue, содержащего рекомбинантную плазмиду pQE31-virE2, как описано в работе [Volokhina et al., 2005]. Электрофорез препаратов белков проводили в 12.5% ПААГ как описано в работе [Laemmli, 1970]. Концентрация выделенного белка VirE2 с молекулярной массой 67 кДа составила 200 мкг/мл.

Выращивание культур животных клеток. Культуры человеческих раковых клеток НеЬа(Панэко, Россия) и клеток почек эмбрионов свиньи (СПЭВ), любезно предоставленные С.А. Староверовым, выращивали на среде для культуры тканей RPMI-1640 с 10% эмбриональной сывороткой телят и антибиотиком ампициллином (100 мкг/мл) в инкубаторе при 37°С и 5% содержанием СОг. После обработки 1 % трипсином, клетки трижды отмывали и ресуспендировали в растворе Хэнкса (Биолот, Россия) и

доводились до конечной концентрации 2x105 кл/мл. Подсчет количества клеток СПЭВ и HeLa проводили в камере Горяева.

Измерение флуоресценции .у животных клеток. Использовали олигонуклеотиды (23 н.о.), меченные FAM (5'-FAM-TCCTGCAGATACACTCCCACCAA-3'), с концентрацией 200 мкг/мл (Синтол, Россия). Флуоресцентно-меченную ДНК (200 н.о.) получали методом ПЦР. Для этого использовали праймеры: FAM-5'-TAAGC-TGCCG-ATGTG-CCTGC-GTCG-3' ,F АМ-5 '-CTG A A-AG AC A-GC AC A-A ATG-AGC АС -AGGC-3' при следующих условиях: предварительная денатурация — 95 °С -2 мин, цикл: 94 °С - 20 сек, 63 °С - 30 сек, 72 °С - 1 мин (35 циклов). После последнего цикла проводили окончательную достройку цепей при 72 °С в течение 2 мин.

Для получения оцДНК ПЦР-продукт нагревали в течении 5 минут до 95 °С, а затем быстро охлаждали на льду в течение 10 минут. Формирование оцДНК-\ЧгЕ2-белкового комплекса проводили в течение 20 минут при 4 °С .

150 мкл суспензии клеток HeLa или СПЭВ (2x105 кл/мл) в растворе Хенкса инкубировали в течение 1 часа с 10 мкл белка VirE2 (200 мкг/мл) и 1 мкл олигонуклеотидов (200 мкг/мл), затем дважды отмывали центрифугированием при 1000 g в течение 10 минут и снова ресуспендировали в растворе Хенкса. Флуоресценция клеток HeLa и СПЭВ измерялась прибором Applied Biosystem 7300 (фильтр А для регистрации клеток с красителем FAM, эмиссия на 520 нм).

Для блокировки дыхания клетки ЬЫа в течение 30 минут прединкубировали с 5 мМ азидом натрия (Sigm а, США) или 5 мкМ карбонил цианид м-хлорфенилгидразоном (КЦХФГ) (Sigma, США), затем дважды отмывали в растворе Хенкса при 1000 g в течение 10 мин и ресуспендировали в растворе Хенкса. Для блокировки клатрин-опосредованного эндоцитоза проводили прединкубацию клеток в течение 30 мин при 37° С 0,4 М сахарозой (Sig ша, США) или 30 мкМ хлорпромазином (Sig ma, США), а затем добавляли олигонуклеотиды, меченые FAM, белок VirE2 и инкубировали в течение 1 часа. В контроле олигонуклеотиды, меченые FAM, и белок VirE2 одновременно добавляли к клеткам и инкубировали в течение 1 часа. Затем клетки отмывали два раза в растворе Хенкса при 1000 g в течение 10 минут и снова ресуспендировали в растворе Хенкса. Для воздействия на цитоскелет проводили прединкубацию клеток СПЭВ с 5 мкМ цитохалазином Б (Sig ma, США) в течение 30 минут, а затем добавляли олигонуклеотиды, меченные FAM, и/или белок VirE2 и инкубировали в течение 1 часа. Затем клетки дважды отмывали по 10 мин при 1000 g, и оценивали флуоресценцию клеток. Аналогично проводили прединкубацию клетки с 200 мкМ генистеином (Sigma, США) для блокировки переноса оцДНК посредством кавеолярного эндоцитоза.

Статистика. Значение флуоресценции определяли как среднее арифметическое значение группы измерений одного варианта, указывая стандартную ошибку (SE - standard error) среднего арифметического. Оценку

достоверности разницы между двумя группами измерений определяли при помощи коэффициента Стьюдента (р<0.05) [Рокицкий, 1973].

Электронная просвечивающая микроскопия комплекса оиДНК- VirE2.

Формирование оцДНК-У1гЕ2-белкового комплекса проводили в течение 20 минут при 4 °С. Сформированный комплекс наносили на металлическую сеточку (300 меш) для электронной микроскопии с формваровой подложкой. Просмотр проводили на трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия) при 100 kB.

Программные средства для молекулярного моделирования.

Для построения моделей комплексов из двух, четырех, шести белков VirE2 была использована программа GRAMM-X [Tovchigrechko, Vakser, 2006] (http://vakser.bioinformatics.ku.edu/resources/gramm/grammx).

Моделирование взаимодействия белков и оцДНК осуществлялось с помощью Hex Protein Docking (http://hexserver.loria.fr) [Macindoe et al., 2010].

Встраивание белковых комплексов производилось программой Charmm-Gui Membrane Builder (http://www.charmm-gui.org/) [Jo et al., 2007, 2009]

Подвижность комплексов из белка VirE2 оценивалась методом нормальных мод с помощью программы EINemo (http://igs-server.cnrs-mrs.FR/elnemo/index.html) [Suhre, Sanejouand, 2004]

С помощью программы Mole (http://mole.chemi.muni.cz/web) [Berka et al., 2012] измерялся диаметр каналов в комплексах белка VirE2.

Молекулярная динамика белка VirE2. Моделирование молекулярной динамики осуществлялось в среде MDWeb. Расчет проводили с периодическими граничными условиями при постоянной температуре 300 К и постоянным давлением 1.01325 bar (NPT-ансамбль). Время моделирования составило 500 пс.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ПОСТРОЕНИЕ КОМПЛЕКСА ИЗ ДВУХ И ЧЕТЫРЕХ БЕЛКОВ VirE2 В ПРОГРАММЕ GRAMM-X

Так как в трёхмерной структуре белка VirE2 при помощи программы MOLE канальных структур нами не обнаружено, сделано предположение о том, что поры формируются в комплексах из нескольких субъединиц VirE2.

Комплекс двух белков VirE2 был построен с помощью программы GRAMM-X. В комплексе возможно образование канала между спиралями. Однако, в просвете этого канала экспонированы концы подвижной междоменной петли (аминокислотные остатки 341-345), что суживает просвет канала. Возможно, данные петли представляют собой воротный механизм, аналогичный механизму в ионных каналах.

С помощью программы Mole был измерен диаметр канала в комплексе из двух белков VirE2. Диаметр поры составил 1.2-1.6 нм. Вероятно, этого достаточно для прохождения коротких олигонуклеотидов через пору, образованную двумя белками VirE2 в двухслойной мембране, так как

оцДНК имеет диаметр 0.9-1.2 нм, но не достаточно для прохождения комплекса оцДНК с пилотирующим белком VirD2.

Существует предположение, что поры могут образовываться из четырех субъединиц белка VirE2 [Dumas et al., 2001; Duckely et al., 2003]. Поэтому была проверена возможность построения комплекса из 4-х белков VirE2.

Из десяти моделей была выбрана модель из четырех белков VirE2, которая образует симметричный комплекс с отверстием внутри (рис. 1). С помощью программы Mole в этом комплексе был обнаружен канал в комплексе из четырех белков VirE2 диаметром 1.4-4.6 нм [Мазилов, 2012].

Рис. 1. Комплекс из четырех белков VirE2 (вид сверху). Индивидуальные белки VirE2 изображены разными цветами.

Одним из возможных механизмов переноса Т-ДНК через пору из четырех белков VirE2 может быть наличие сайтов, распознающих Т-ДНК. Похожим механизмом обладает белковая пора системы секреции IV типа, состоящая из белков VirB7, VirB9, VirBlO, обеспечивающая экскрецию Т-ДНК через мембраны бактерии [Chandran et al., 2009]. Также механизм селективности поры из четырех белков VirE2 может быть схожим с таковым у поринов. Большинство поринов имеют широкие вход и выход, с некоторым сужением в середине канала. В нашем случае пора из четырех белков VirE2 также имеет широкие вход и выход, и сужение до 1.4 нм.

Однако как функционирует пора из четырех белков VirE2 неясно. Диаметр самой узкой части поры из четырех белков VirE2 составляет 1.4 нм, что является достаточно большим отверстием в клетке. Вода, ионы и другие небольшие молекулы могут свободно выходить или попадать внутрь клетки. Так функционирует пора, образуемая белком а-гемолизином стафилококка, диаметр которой составляет 4 нм с сужением до 2 нм [Gouaux, 1998].

Возможно, механизм функционирования поры из четырех белков VirE2 схож с потенциал-зависимыми ионными каналами, когда они открываются и закрываются в ответ на изменение мембранного потенциала, например, натриевые, калиевые каналы [Gulbiset al., 1999]. Канал диаметром 1.4-4.6 нм может обеспечить прохождение коротких олигонуклеотидов (диаметр 0.9- 1.2 нм). Однако, для того чтобы через пору переносился пилотирующий белок, необходимо, чтобы канал открылся до 4 нм.

Дальнейшей целью работы было построение модели комплекса из шести белков VirE2 в мембране, так как комплексы из шести белковых субъединиц часто встречаются в природе [Alberts et al., 1994; Kohl et al., 2012]. Среди

построенных комплексов из шести белков VirE2 не было найдено структур с порами, которые бы удовлетворяли условиям переноса оцДНК.

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ИЗ БЕЛКА VirE2 И оцДНК

С помощью программы Hex были построены модели взаимодействия оцДНК с одним и двумя белками VirE2. На рис. 2 представлена модель взаимодействия оцДНК и двух белков VirE2 в двух проекциях. Расстояние между аминокислотами Lys488 белка VirE2, изображенного желтым цветом, и Glu239 белка VirE2, изображенного красным цветом, составляет 9.2 нм.

Рис. 2. Модель взаимодействия оцДНК и 2-х белков VirE2 (Л-вид сверху, Б-вид сбоку). Расстояние между аминокислотами Lys488 белка VirE2, изображенного желтым цветом, и Glu239 белка VirE2, изображенного красным цветом, составляет 9.2 нм.

Как видно из рисунка 2, два белка VirE2 полностью покрывают оцДНК. Область контакта оцДНК и белка VirE2, изображенного желтым цветом, составляет порядка 30 аминокислот и совпадает с участком, который взаимодействует с белком шаперном VirEl [Dym et al., 2008]. Область контакта белка VirE2, изображенного красным цветом, и оцДНК составляет 10 аминокислот (Gln385-Arg395).

ПОСТРОЕНИЕ МОДЕЛЕЙ КОМПЛЕКСОВ ИЗ БЕЛКА V¡rE2 В МЕМБРАНЕ В ПРОГРАММЕ CHARMM-GUI

Белковый комплекс VirE2-VirEl в мембране был построен в среде CHARMM-GUI Membrane Builder. Программой Mole обнаружены 3 канала диаметрами 0.2, 0.3 и 0.8 нм, чего не достаточно для прохождения оцДНК. На рисунке 3 изображен комплекс белков VirE2-VirEl в мембране, визуализированный в Swiss-PdbViewer.

Рис. 3. Комплекс белков У1гЕ2-У1гЕ1 в мембране. Зеленым цветом изображена мембрана, красным комплекс белков У1гЕ2-\%Е1 (вид сверху).

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИНАМИКА БЕЛКА VirE2

В молекулярной динамике корректность структуры имеет решающее значение. Небольшие ошибки во входной структуре могут привести к нестабильной молекулярной динамике или дать нереалистичные траектории. Поэтому структура белков VirE2-VirEl анализировалась с помощью программы MDWeb для поиска возможных проблем, обнаруженных во входной структуре, которые могут повлиять на будущую молекулярную динамику. Для белков VirE2-yirEl найдены следующие проблемы: пробелы в структуре, контакты атомов.

Гибкие регионы белка могут иметь слишком низкую плотность электронов, чтобы быть обнаруженным в рентгеноструктурных экспериментах, и могут отсутствовать в PDB структурах. Эта ситуация дает нереальные структуры, где белок расщепляется на несколько не связанных белков с новыми N- и С-концевыми остатками. В структуре белков VirE2-VirEl обнаружены следующие пробелы: Ala341-Gln345, Ala439-Phe447, Leu472-Ser476.

Отсутствующие аминокислоты в структуре белка VirE2 белков VirE2-VirEl соответствуют неструктурированным участкам, что может свидетельствовать о том, что эти регионы имеют низкую электронную плотность.

Моделирование молекулярной динамики в MDWeb после проверки структуры белков VirE2-VirEl было проведено программой NAMD с применением силового поля CHARMm-27.

Расчет проводился с периодическими граничными условиями при постоянной температуре 300 К и постоянным давлением 1.01325 bar (NPT-ансамбль). Время моделирования составило 500 пс, что соответствует малым изменениям конформации в структурах белков и достаточно для приведения белка в состояние равновесия. Структура белков VirE2-VirEl, помещалась в кубический объем воды TIP3P с шагом расстояния 15 А, с добавленными ионами СГ и Nar.

Изменение в конформации структуры комплекса белков VirE2-VirEl характеризовали среднеквадратичным отклонением координат С-альфа атомов (Root Mean Square Deviation - RMSD). Эта величина измеряется в

ангстремах. На рисунке 4А приведены значения между исходной

моделью комплекса белков \ЧгЕ2-\%Е1 и моделями в динамике. Из рисунка 4А видно, что после времени моделирования 300 пс, среднеквадратичное отклонение приближается к значению 1-1.2 А и дальше не возрастает. Это свидетельствует о том, что модель белков У1гЕ2-УнЕ1 приходит в равновесное, стабильное состояние при времени моделирования до 500 пс.

Ilmu-p а.о.

Рис. 4. А - зависимость среднеквадратичного отклонения от времени моделирования для комплекса белков \ЧгЕ2-\ЧгЕ1. Б - зависимость радиуса вращения от времени моделирования для комплекса белков \%Е2-\ЧгЕ1. В - среднеквадратичное отклонение на аминокислотный остаток комплекса белков \%Е2-\%Е1.

В качестве еще одной меры, показывающей, сколько атомов перемещаются во время моделирования, был измерен радиус вращения белков VirE2-VirEl. Радиус вращения измеряет среднее расстояние между атомом и его центром масс в данный момент времени, а также эффективный размер полимера. Радиус вращения часто используется для характеристики динамической траектории молекулярной системы. Небольшой радиус вращения указывает на то, что полимер относительно компактен, то есть на протяжении всей своей траектории полимер проводит большую часть своего времени, как складчатая структура. На рисунке 4Б представлен радиус вращения комплекса белков VirE2-VirEl, из которого видно, что в точке «0» радиус вращения белков VirE2-VirEl максимальный -24.4 А, а после 100 пс радиус вращения снижается и становится относительно стабильным, колеблясь в пределах от 23.05 до 23.24 А.

Также было измерено среднеквадратичное отклонение на аминокислотный остаток (Root Mean Square deviation per Residue). Мы можем

легко определить регионы структуры, имеющие наибольшую мобильность (как правило, петли) и регионы, которые почти фиксированы на протяжении всего моделирования. Из рисунка 4В видно, что участок соответствующий структуре белка VirEl обладает наибольшей подвижностью.

ИССЛЕДОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

КОМПЛЕКСОВ ИЗ БЕЛКА VirE2 МЕТОДОМ НОРМАЛЬНЫХ МОД

Поскольку метод молекулярной динамики требует очень мощного аппаратного обеспечения, для анализа большего числа атомов, в частности, для 2-х и 4-х белков, нами был использован метод нормальных мод. Перед исследованием методом нормальных мод комплексов из белка VirE2, с помощью пакета GROMOS96 программы Swiss-PdbViewer была проведена минимизация энергии модельных комплексов белка VirE2.

Наибольшие конформационные изменения, как известно, связаны с низкочастотными модами. Были рассчитаны 11 низкочастотных нормальных мод для структурных моделей комплексов из белков VirE2-VirEl, модели из двух и четырех белков VirE2. Первые шесть режимов соответствуют глобальным движениям молекулы (сдвигов и поворотов, с нулевой частотой) и будут игнорироваться в следующих обсуждениях. Следующие 5 режимов с седьмого по одиннадцатый будут перенумерованы с первого по пятый, соответственно.

Показателем того, сколько аминокислот вовлечены в коллективные движения при нормальных колебаниях, является степень коллективности.

Карта флуктуации расстояний - это матрица, которая отображает максимальные расстояния колебаний между всеми парами атомов С-альфа атомов и между двумя максимальными изменениями конформации. Увеличение расстояния показано (рис. 6, 7, 9, 11) синим цветом, уменьшение красным цветом. Каждая клетка соответствует одному аминокислотному остатку. Серые линии проведены через каждые 10 остатков, желтые линии каждые 100 остатков (считая от верхнего левого угла). Гибкие и жесткие регионы, а также их относительное движение, могут быть легко идентифицированы с помощью таких карт.

Исследуя комплекс белков VirE2-VirEl методом нормальных мод, установлено, что первые три моды представляют собой похожие друг на друга колебательно-вращательные движения на относительно близких частотах от 1 до 1.41 см"1 для N- и С-доменов белка VirE2. Степень коллективности составляет 0.6176, 0.6626, 0.6143 для 1, 2, 3 мод соответственно. На рисунке 5 показано изменение конформации комплекса белков VirE2-VirEl для второй моды - переход из начального состояния в конечное.

Рис. 5. Изменение конформации комплекса белков \%Е2-У1гЕ1 для второй моды. Красными кругами отмечены фрагменты, изменяющие конформацию.

Для четвертой и пятой моды (частоты 1.85, 2.10) характерны не столь тривиальные движения в комплексе белков У1гЕ2-\%Е1. Помимо небольших колебаний доменов характерны колебания отдельных петель и спиралей. Степень коллективности составляет 0.1213 и 0.2317.

Ниже на рисунке 6 представлены карты флуктуации расстояний для всех 5 мод в комплексе белков У1гЕ2-У1гЕ1. Увеличение расстояния между всеми парами атомов показано синим цветом, уменьшение - красным.

Рис. 6. Карта флуктуации расстояний, полученная

методом нормальных мод для комплекса белков \ЧгЕ2-Уи-Е1.

Из рисунка 6 видно, что максимальные изменения конформации характерны для первых трех мод, причем для первых двух мод преобладает уменьшение расстояния между остатками, а для третей увеличение.

Согласно работе [Dym et al., 2008], в отсутствии белка-шаперона VirEl N- и С-домены белка VirE2 приобретают больше степеней свободы относительно друг-друга, что может соответствовать глобальным движениям доменов, полученных в 1, 2, 3-х модах.

Чтобы изучить динамические и конформационные свойства предположительного порового комплекса из двух белков VirE2, построенного нами ранее с помощью программы Gramm-X, был также использован метод нормальных мод.

Среди пяти полученных мод 1, 2, 3 и 5-я (частоты 1.00, 1.32, 1.55 и 1.77 см"1 соответственно) моды могут представлять вероятный воротный механизм. Внутренняя часть комплекса из двух белков VirE2, а именно петли

в верхней части и спирали в нижней, совершают колебания, предположительно открывая-закрывая канал. У четвертой моды (частота 1.72) внутренняя часть остается неподвижной. Степень коллективности составляет 0.6155, 0.5112, 0.4795, 0.3581, 0.6894 для мод с 1 по 5 соответственно.

На рисунке 7 представлены карты флуктуации расстояний для всех 5

мод.

Для 1-ой моды колебаний характерно уменьшение расстояния между атомами комплекса из двух белков \\rE2, для 5 моды - увеличение расстояния между атомами.

Рис. 7. Карта флуктуации расстояний, полученная метод нормальных мод для комплекса из двух белков \%Е2 (Огатт-Х).

Также с помощью программы ElNemo методом нормальных мод была проанализирована структура комплекса из двух белков VirE2, полученная ранее с помощью программы Hex. Все 5 мод похожи на возможный механизм открывания-закрывания поры.

Наиболее интересна 4-ая мода, где внутренняя часть предположительного канала совершает максимальные колебания. На рисунке 8 представлено изменение конформации в 4-ой моде внутри предполагаемой поры из начального в конечное положение. Диаметр поры, измеренный между Glu 334 обоих белков VirE2, варьирует от 2.1 нм до 2.7 нм.

Рис. 8. Изменение конформации предполагаемой поры в комплексе из двух белков \%Е2 (4-ая мода). Расстояние измерено между аминокислотами С1и334 обоих белков Уп-Е2.На рисунке 9 представлены карты флуктуации расстояний для всех 5 мод.

Рис. 9. Карта флуктуации расстояний, полученная методом нормальных мод для комплекса из двух белков VirE2 (Hex).

В работе [Duckely et al., 2003] сделано предположение о возможности формирования поры из четырех субъединиц белка V¡rE2. Одна из моделей, из четырех белков VirE2, построенная ранее нами с помощью программы Charmm-Gui, обладает каналом диаметром от 1.4 до 4.6 нм (измерено программой Mole), который достаточен для транспорта оцДНК вместе с пилотирующим белком VirD2, предположительный диаметр которого составляет 4 нм [Volokhina et al., 2012].

Методом нормальных мод с помощью программы EINemo в данной работе был исследован возможный воротный механизм комплекса из 4 белков VirE2. Среди первых 5 мод не обнаружены изменения конформации внутри поры. Все колебательно-вращательные движения приходятся на домены, отмеченные красными овалами на рисунке 10.

Рис. 10. Комплекс из 4 белков У1гЕ2 (вид сбоку). Красными овалами отмечены домены, на которые приходятся изменения конформации для всех 5 первых мод.

На рисунке 11 представлены карты флуктуации расстояний для 5 мод для четырех субъединиц белка \%Е2.

Рис. 11. Карта флуктуации расстояний, полученная методом нормальных мод для комплекса из двух белков VirE2 (Hex).

Как видно из карты флуктуаций (рис. 11), максимальное число изменений расстояний между атомами характерно для 4-ой моды.

АНАЛИЗ ПЕРЕНОСА оцДНК С УЧАСТИЕМ БЕЛКА VirE2 ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ IN VITRO

Белок VirE2 - один из мажорных белков A.tumefaciens, экспрессия которого происходит при индукции вирулентных генов, также способен неспецифически связываться с оцДНК, защищая ее от растительных эндонуклеаз [Christie et al., 1988; Citovsky et al., 1989].

Ранее установлено, что транспорт Т-ДНК из Agrobacterium с индуцированными v/'r-генами может осуществляться в ядро клеток HeLa [Kunik et al., 2001]. Однако, механизм переноса Т-ДНК при температуре 37 °С, когда заблокирована экспрессия v/r-генов, не известен. Перенос флуоресцентно-меченной оцДНК с участием белка VirE2 в клетки HeLa в наших экспериментах оценивали по измерению интенсивности флуоресценции клеток.

Перенос FAM-меченной оцДНК в клетки HeLa и СПЭВ оценивали путем измерения интенсивности флуоресценции клеток с помощью прибора Applied Biosystem 7300. Как можно видеть из таблицы 1, клетки HeLa после инкубации с FAM-мечеными олигонуклеотидами обладают повышенной, по сравнению с контролем, флуоресценцией. Добавление белка VirE2 к клеткам приводит к тому, что интенсивность флуоресценции клеток достоверно (р<0.05) увеличивается в 1,4 раза, по сравнению с флуоресценцией клеток, инкубировавшихся только с олигонуклеотидами. Т.е. белок VirE2 каким-то образом способствует накоплению олигонуклеотидов.

Эндоцитоз считается основным механизмом поглощения внеклеточного материала размером до 150 нм. Мы пытались оценить возможный вклад эндоцитоза при переносе олигонуклеотидов, меченых FAM, в клетки HeLa и СПЭВ. Для этого инкубировали клетки с веществами-ингибиторами различных типов эндоцитоза. Все виды переноса зависят от поступления энергии, которые могут блокировать ингибиторы дыхания. Известно, что азид натрия и карбонилцианид-т-хлорфенилгидразон (КЦХФГ)

используются как ингибиторы дыхания в животной клетке |7аггей ег а1., 1977; РигшсЫ й а!., 1986]. Чтобы определить возможную роль эндоцитоза в поглощении белка \%Е2 и олигонуклеотидов, мы предварительно обработали клетки НеЬа ингибиторами дыхания (КЦХФГ и азидом натрия). Как видно из таблицы 1, прединкубация клеток НеЬа с азидом натрия приводит к снижению флуоресценции на 27% (недостоверно, р>0.05), по сравнению с клетками без обработки, 5 мкМ КЦХФГ на 29% (достоверно, р<0.05) уменьшал уровень флуоресценции. Таким образом, блокировка дыхания снижала накопление флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов в клетках НеЬа.

Важно отметить, что в случае блокировки азидом натрия уровень флуоресценции снижался до уровня флуоресценции клеток, инкубировавшихся только с олигонуклеотидами. Т.е. очевидно, что накопление олигонуклеотидов не полностью зависит от процессов, которые блокируются при обработке ингибиторами дыхания в отсутствие \%Е2, но \%Е2-зависимый процесс накопления олигонуклеотидов идет с участием клеточных структур НеЬа, которые чувствительны к обработке блокираторами дыхания.

Таблица 1

Интенсивность флуоресценции клеток НеЬа после блокировки дыхания

№ Варианты Интенсивность флуоресценции клеток*, (СЕФ) хю3

1 ЖК + олиги-РАМ ** 118 ±13

2 ЖК + олиги-РАМ ** + \%Е2*** 174 ±37

3 ЖК + 10 мМ азид натрия **** + УкЕ2 + олиги-РАМ ** 127±13

4 ЖК + 5 мкМ КЦХФГ **** + УкЕ2 + олиги-РАМ ***** 123 ±18

5 ЖК 0

Примечания: 10 повторностей по каждому среднему, значения получены с использованием правила двух сигм, СЕФ - стандартная единица флуоресценции, * - среднее арифметическое значение, стандартная ошибка, **- 1 мкг/мл, *** - 9 мкг/мл, ****- прединкубация 20 мин.

Кроме клеток НеЬа, на У1гЕ2-зависимое и эндоцитоз-зависимое поглощение олигонуклеотидов также тестировались животные клетки СПЭВ. Из таблицы 4 видно, что после добавления белка У1гЕ2 интенсивность флуоресценции клеток СПЭВ по сравнению с клетками, инкубированными только с олигонуклеотидами, незначительно увеличилась на 17% (достоверно, р<0.05). Световая микроскопия клеток СПЭВ, инкубированных с меченными олигонуклеотидами и белком \%Е2, показала наличие флуоресцентного свечения (рис. 12). Для блокировки клатрин-опосредованного эндоцитоза проводили прединкубацию клеток с 400 мМ

сахарозой в течение 30 мин при 37 °С, а затем добавляли олигонуклеотиды, меченные РАМ, белок \\rE2 и инкубировали в течение 1 часа.

Б

Рис. 12. Микроскопия клеток СПЭВ (Л-световая, ¿'-флуоресцентная). Отмытые контрольные клетки, инкубированные с олигонуклеотидами и белком VirE2. Увеличение 20х.

Предобработка клеток 400 мМ сахарозой не приводила к статистически значимому снижению флуоресценции клеток, а при добавлении VirE2 интенсивность флуоресценции клеток недостоверно увеличилась на 13% (р>0.05) по сравнению с клетками с олигонуклеотидами, прединкубированными с 400 мМ сахарозой без добавления белка VirE2 (табл.2). Возможно, предварительная обработка клеток гипертоническим раствором сахарозы приводит не только к ингибированию клатрин-зависимого эндоцитоза, а оказывает негативное воздействие на клетку.

Для блокировки цитоскелета животных клеток обычно используют концентрации цитохалазина от 5 до 20 мкМ [Sanlioglu et al., 2000; Peterson, Mitchison, 2002]. Мы использовали завышенную концентрацию цитохалазина - 1 мМ для блокировки цитоскелета клеток СПЭВ. Как видно из таблицы 2, цитохолазин снижал незначительно (достоверно на 8%, р<0.05) уровень флуоресценции клеток СПЭВ, инкубировавшихся с олигонуклеотидами. Таким образом, можно заключить, что различные виды эндоцитоза не являются существенными при накоплении флуоресцентно-меченных олигонуклеотидах в клетках СПЭВ.

При добавлении VirE2 к клеткам СПЭВ, прединкубированными с 1 мМ цитохалазина, интенсивность флуоресценции клеток недостоверно увеличилась на 18% (р>0.05), по сравнению с клетками с олигонуклеотидами, прединкубированными с 1 мМ цитохалазина, соответственно.

Таблица 2

Величина флуоресценция клеток СПЭВ после блокировки эндоцитоза

№ Варианты Интенсивность флуоресценции клеток*,(СЕФ) хю3

1 ЖК + олиги-FAM 203±17

2 ЖК + олиги-FAM + VirE2 245±13

3 ЖК + олиги-FAM + 400 мМ сахароза 197±34

4 ЖК + олиги-FAM + 400 мМ сахароза +VirE2 223±28

5 ЖК + олиги-FAM + 1 мМ цитохалазин I87±15

6 ЖК + олиги-FAM + 1 мМ цитохалазин + VirE2 229±14

Примечания: данные по 6 независимым экспериментам, СЕФ -стандартная единица флуоресценции, * - среднее арифметическое значение, стандартная ошибка.

Таким образом, можно видеть, что клетки HeLa и СПЭВ по-разному накапливают нуклеотиды после блокировки дыхания. В случае клеток почек эмбрионов свиньи механизм эндоцитоза способствующих накоплению нуклеотидов незначительно.

ЭЛЕКТРОННАЯ ПРОСВЕЧИВАЮЩАЯ МИКРОСКОПИЯ КОМПЛЕКСА оцДНК-УпЕ2

Для формирования Т-комплекса были использованы препараты оцДНК и белка вирулентности VirE2. Сформированный Т-комплекс наносили на металлическую сеточку (300 меш) для электронной микроскопии с формваровой подложкой. Просмотр проводили на электронном микроскопе ЫЬго(Германия) при 100 кВ. Препаративная наработка белка вирулентности VirE2 нами описывалась ранее в работе [Volokhina et al., 2005 ].

оцДНК получали из дцДНК фага лямбда (2027 п.о. и 2322 п.о.), полученную после обработки фага лямбда рестриктазой Hindlll, затем выделенную из 1% агарозного геля, с использованием набора фирмы Ферментас (Литва). Далее дцДНК была переведена в одноцепочечную форму посредством денатурации в течение 5 минут при 95°С и быстрого последующего охлаждения на водяной бане со льдом.

Для формирования комплекса in vitro брали соотношение оцДНК:\%Е2 1:10 в буфере следующего состава: в растворе 0.02 М Tris-HCI, рН 7,2. В раствор для комплексообразования добавляли MgCI2 до конечной концентрации 5 мМ. Комплексообразование проводили в течение 15 минут при 4 °С, а затем 20 мкл препарата наносили на парафилм, помещали на

каплю сеточку на 15 минут при комнатной температуре, далее сеточку трижды отмывали в тридистилированной воде. Контрастирование препарата производили 2% водным раствором уранилацетата в течение 1 минуты, снова промывали сеточку в тридистилированной воде и высушивали на воздухе.

Рис.13. Электронная просвечивающая микроскопия ДНК-белкового

комплекса, состоящего из оцДНК фага лямбда и белка \ЧгЕ2 (в соотношении 1:10). Контрастирование 2%-ным уранилацетатом.

Длина комплекса составила около 467 нм (рис. 3.28), что в 1,5-1,7 раза меньше от теоретически рассчитанной длины ДНК без белка У1гЕ2.

Таким образом, установлено, что длина формируемого ДНК-белкового комплекса значительно уменьшается по сравнению с оцДНК без белка У1гЕ2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью методов докинга получены стационарные модели комплексов из двух, четырех и шести комплексов белков \%Е2, а также модель взаимодействия двух белков \\г¥2 и оцДНК.

С помощью метода молекулярной динамики установлено, что модель белков УнЕ2-\%Е1 достигает равновесного, стабильного состояния при времени моделирования до 500 пс. Также установлено, что структура белка \%Е1 в комплексе белков \%Е2-\ЧгЕ1 обладает наибольшей подвижностью.

С помощью метода нормальных мод оценены колебательные движения модели из белков У1гЕ2-\%Е1, комплекса из двух и четырех белков \%Е2. В модели из белков У1гЕ2-УпЕ1 обнаружены глобальные движения доменов в 1, 2 и 3-х модах, что может подтверждать предположение, сделанное в работе [Т>ут е1 а1., 2008], что в отсутствие белка-шаперона У1гЕ1 М- и С-домены белка У1гЕ2 приобретают значительные степени свободы относительно друг друга. В комплексе из двух белков \ЧгЕ2 обнаружены колебательные движения, похожие на открывание-закрывание канала. Полученные результаты позволяют получить представление о возможном механизме функционирования порового комплекса из двух белков \%Е2, представляющий собой воротный механизм, аналогичный механизму в ионных каналах. Среди колебаний комплекса из четырех белков \%Е2 не обнаружены изменения конформации внутри поры.

Однако, как происходит перенос Т-ДНК и белка У1гЕ2 внутрь растительных и животных клеток в реальных условиях не известно.

В 2001 г. были опубликованы данные по переносу Т-ДНК из агробактерий с индуцированными v/r-генами в ядро клеток HeLa [Dumas et al., 2001]. Вероятно, что в животные клетки Т-ДНК может переноситься по механизму переноса IV типа [Christie et al., 1988] или по механизму, сходному для проникновения вирусов в животные клетки.

Согласно результатам проведенного исследования, установлено, что добавление белка VirE2 к клеткам HeLa приводит к тому, что интенсивность флуоресценции клеток в 1,4 раза увеличивается, по сравнению с флуоресценцией клеток, инкубировавшихся только с олигонуклеотидами. Т.е. белок VirE2 каким-то образом способствует накоплению олигонуклеотидов.

Установлено, что блокировка дыхания азидом натрия и КЦХФГ снижала накопление флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов в клетках HeLa.

Важно отметить, что в случае блокировки азидом натрия уровень флуоресценции снижался до уровня флуоресценции клеток, инкубировавшихся только с олигонуклеотидами. То есть, очевидно, что накопление олигонуклеотидов не полностью зависит от процессов, которые блокируются при обработке ингибиторами дыхания в отсутствие VirE2, но VirE2-3aBHCHMbifi процесс накопления олигонуклеотидов идет с участием клеточных структур HeLa, которые чувствительны к обработке блокираторами дыхания.

Кроме клеток HeLa, на У{гЕ2-зависимое и эндоцитоз-зависимое поглощение олигонуклеотидов также тестировались животные клетки СПЭВ. Согласно нашим результатам, после добавления белка VirE2 интенсивность флуоресценции клеток СПЭВ по сравнению с клетками, инкубированными только с олигонуклеотидами, незначительно увеличивалась. Наряду с этим, установлено, что предварительная обработка клеток гипертоническим раствором сахарозы приводит не только к ингибированию клатрин-зависимого эндоцитоза, но и оказывает негативное воздействие на клетку. Также выявлено, что цитохолазин незначительно снижал уровень флуоресценции клеток СПЭВ, инкубировавшихся с олигонуклеотидами. Таким образом, можно заключить, что различные виды эндоцитоза не являются существенными при накоплении флуоресцентно-меченных олигонуклеотидах в клетках СПЭВ.

При проведении электронной просвечивающей микроскопии комплекса оцДНК-У1'гЕ2 установлено, что длина комплекса составила около 467 нм, что в 1,5 раза меньше от теоретически рассчитанной длины ДНК без белка VirE2. Данный факт свидетельствует о том, что длина формируемого ДНК-белкового комплекса значительно уменьшается по сравнению с оцДНК без белка VirE2.

Резюмируя данные, полученные в настоящей работе, можно сделать заключение, что белок VirE2 играет одну из ключевых ролей в процессе переноса оцДНК в клетку-хозяина. Возможно, белок VirE2 участвует в процессе переноса Т-ДНК через мембраны, формируя канал в липидной мембране.

ВЫВОДЫ

1. Компьютерные модели комплексов из двух и четырех белков VirE2 способны встраиваться в мембрану. В комплексе из двух белков VirE2 возможно образование канала между спиралями диаметром 1.2-1.6 нм с междоменной петлей, закрывающей канал. Модель из четырех белков VirE2 образует симметричный комплекс с каналом диаметром 1.4-4.6 нм.

2. Впервые методами молекулярной динамики установлено, что модель белков VirE2-VirEl достигает равновесного, стабильного состояния при 500 пс. Установлено, что структура белка VirEl в комплексе VirE2-VirEl обладает наибольшей подвижностью. Впервые методом нормальных мод показан возможный механизм открывания-закрывания поры комплекса из двух белков VirE2.

3. Рекомбинантный белок VirE2, формируя ДНК-белковый комплекс, существенно уменьшает длину оцДНК.

4. Рекомбинантный белок VirE2 способствует накоплению коротких (24 н.о.) синтетических олигонуклеотидов в клетках HeLa, но не в клетках СПЭВ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Чумаков М. И., Мазилов С. И., Гусев Ю. С., Волохина И.В. Исследование способности агробактериального белка VirE2 к образованию пор в мембранах // Биомембраны. - 2010. - Т.27. - №5. - С.449-454.

2. Волохина И.В., Гусев Ю.С., Мазилов СИ., Чумаков М.И. Надмолекулярные комплексы белка вирулентности VirE2 Agrobacterium tumefaciens // Биохимия. - 2011. - Т.76. - С. 1576-1582.

3. Volokhina I.V., Gusev Yu.S., Mazilov S.I., Chumakov M.I. VirE2-protein-dependent DNA transfer across artificial and cell membranes // J. Bioinf. Comput.Biol. -2012. - V.10. - P.1241009.

4. Волохина И.В., Гусев Ю.С., Чумаков М.И. Исследование накопления олигонуклеотидов животными клетками, опосредованное белком VirE2 // Нанотехнологии и охрана здоровья - 2013. —Т.5. —№1(14). —С.32-39.

Статьи в сборниках научных трудов

1. Gusev Yu.S., Volokhina IV., Chumakov M.I. Supramolecular complexes of the A. tumefaciens virulence protein VirE2 H Proc. Int. Moscow Conf. on Computational Molec. Biology, July 21-24 2011, Moscow, Russia. - Moscow, 2011.-P. 132-133.

2. Chumakov M. I., Gusev Yu. S., Mazilov S.I. 3-D complexes of VirE2 protein originated from Agrobacterium tumefaciens and evaluation of his pore-forming ability // Proc. Int. Moscow Conf. on Computational Molec. Biology, July 21-24 2011, Moscow, Russia. - Moscow, 2011. - P. 82-83.

3. Gusev Y., Mazilov S., Volokhina I., Chumakov M. In silico evaluation of

-у

the integration of Agróbacterium VirE2 protein into a lipid membrane // FEBS Journal. - 2013. - Vol.280 (Suppl.l). - P.542.

Тезисы докладов

1. Гусев Ю.С., Чумаков М.И., Мазилов С И., Мазилов С.И. Перенос Т-ДНК через мембрану: роль белка VirE2 // Тезисы докладов X Всероссийской конференции «Биомеханика-2010», 16-22 мая 2010 г., Саратов. - Изд-во Саратовского университета, Саратов, 2010. - С.65.

2. Гусев Ю. С. , Волохина И. В., Чумаков М. И. Самособираемые нанокомплексы из оцДНК и белка VirE2 для доставки ДНК в эукариотическую клетку // Сборник тез. докл. V Всеросс. шк.-конф. мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», 28 сент.-1 окт. 2010 г., Саратов. - Саратов, 2010. -С.113.

3. Чумаков М.И., Гусев Ю.С., Мазилов С.И., Волохина И.В. Белок VirE2 стимулирует транспорт олигонуклеотидов в клетки HeLa // Междунар. научно-практическая конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», 20-22 марта 2012, Москва. - Москва, 2012. - С. 193-194.

4. Волохлна КВ., Гусев Ю.С., Мазилов С.И., Чумаков М.И. Накопление олигонуклеотидов клетками HeLa и СПЭВ в присутствии белка VirE2 // Сборник тез. Ш междунар. научно-практическая конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», 22-24 ноября 2012 г., Казань. - Казань, 2012. - С. 200.

5. Гусев Ю.С., Волохина И.В., Чумаков М.И. Исследование опосредованного белком VirE2 накопления олигонуклеотидов клетками Ша // Материалы докладов ГУ Съезда биофизиков России. Симпозиум IV «Новые тенденции и методы в биофизике», 20-26 августа 2012 г., Н. Новгород. -Н. Новгород, 2012. - С. 88.

Подписано в печать 28.04.14. Формат 60x84/16. Бумага типографская.

Офсет. Гарнитура Times New Raman. Печ. Jl. 1.0. _Тираж 100. Заказ № 098._

Отпечатано с готового оригинал-макета

Типография «Новый Проект», Саратов, Московская, 160, тел.: 26-38-48, sar-piint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусев, Юрий Сергеевич, Саратов

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской

академии наук

На правах рукописи

04201459621

ГУСЕВ Юрий Сергеевич

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ БЕЛКА УкЕ2 В ПЕРЕНОСЕ оцДНК В ЭУКАРИОТИЧЕССКИЕ КЛЕТКИ

03.01.02 - биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д. б. н. М. И. Чумаков

Саратов 2014

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и обозначений.......................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................10

1.1 Агробактериальная трансформация..............................................................10

1.1.1 Перенос ДИК через мембраны растительной клетки...............................16

1.2 Роль белка У1гЕ2 в процессе агробактериального переноса Т-ДНК..........16

1.3 Перенос Т-ДНК в животную клетку..............................................................20

1.4 Перенос ДНК через нанопоры........................................................................21

1.5 Эндоцитоз.........................................................................................................22

1.6 Трехмерная структура У1гЕ2 белка по данным рентгеноструктурного анализа....................................................................................................................25

1.7 Метод молекулярной динамики.....................................................................31

1.7.1 Молекулярная динамика мембранных белков..........................................33

1.8 Метод нормальных мод..................................................................................39

1.8.1 Применение метода нормальных мод для анализа каналов и пор..........42

1.9 Заключение.......................................................................................................44

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................46

2.1 Выделение и очистка белка У1гЕ2.................................................................46

2.2 Выращивание культур животных клеток......................................................46

2.3 Измерение флуоресценции у животных клеток...........................................46

2.4 Статистика........................................................................................................48

2.5 Электронная просвечивающая микроскопия комплекса оцДНК-У1гЕ2....48

2.6 Программные средства для молекулярного моделирования......................48

2.7 Молекулярная динамика белка У1гЕ2...........................................................50

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................51

3.1 Построение комплекса из двух белков У1гЕ2 в программе 011АММ-Х....49

3.2 Построение комплекса из четырех белков У1гЕ2 в программе ОЯАММ-Х.......................................................................................................54

3.3 Построение комплекса из шести белков VirE2 в программе GRAMM-X.......................................................................................................56

3.4 Компьютерное моделирование комплексов из белка VirE2 и оцДНК.....58

3.5 Построение модели белков VirE2-VirEl в мембране в программе CHARMM-GUI.......................................................................................................59

3.6 Проверка белка VirE2 на корректность для работы методом МД.............61

3.7 Возможные пробелы в структуре белков VirE2-VirEl................................62

3.7.1 Контакты атомов в структуре белков VirE2-YirEl...................................64

3.8 Молекулярная динамика белка VirE2...........................................................65

3.8.1 Анализ результатов молекулярной динамики...........................................66

3.9 Исследование конформационных изменений комплексов из белка VirE2-VirEl методом нормальных мод..........................................................................69

3.9.1 Исследование комплекса белков VirE2-VirEl методом нормальных мод...........................................................................................................................70

3.9.2 Исследование комплекса из двух белков VirE2 методом нормальных мод...........................................................................................................................74

3.9.3 Исследование комплекса из четырех белков VirE2 методом нормальных мод...........................................................................................................................77

3.10 Результаты моделирования...........................................................................79

3.11 Анализ переноса оцДНК с участием белка VirE2 через

мембраны in vitro...................................................................................................80

3.11.1 Эксперименты по переносу оцДНК с участием белка VirE2 и его комплексов через мембраны животных клеток.................................................81

3.12 Электронная просвечивающая микроскопия комплекса

оцДНК-У1гЕ2..........................................................................................................86

ВЫВОДЫ...............................................................................................................88

БЛАГОДАРНОСТИ...............................................................................................89

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................90

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

Т-ДНК - транспортная ДНК

РСА - рентгеноструктурный анализ

оцДНК - одноцепочечная ДНК

дцДНК - двухцепочечная ДНК

а.о. - аминокислотный остаток

п.о. - пара оснований

н.о. - нуклеотидное основание

МД - молекулярная динамика

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СЕФ - стандартная единица флуоресценции

АТФ - аденозинтрифосфат

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Agrobacterium tumefaciens является широко распространенным видом почвенных бактерий, вызывающим образование корончатых галлов у растений, которые возникают в результате встраивания фрагмента Ti-плазмиды (Т-ДНК) агробактерий в растительный геном и экспрессии бактериальных генов в клетке-реципиенте. Одним из ключевых факторов в процессе переноса Т-ДНК является бактериальный белок VirE2, который взаимодействует с оцДНК и образует транспортируемый комплекс (Т-комплекс). С помощью электронной микроскопии показано, что VirE2 формирует с оцДНК Т-комплекс со спиральной структурой, хорошо подходящей для задач защиты ДНК и ядерного импорта [Frenkiel-Krispin et al., 2006]. В настоящее время установлено, что белок выполняет несколько функций: связывание с Т-ДНК, ее защита от деградации растительными эндонуклеазами, транспорт Т-ДНК через растительные мембраны. Кроме того, показано, что VirE2 взаимодействует с растительными цитоплазматическими белками-шаперонами (Roca, Roc4 и СурА) и белком VIP2, которые обеспечивают взаимодействие с хроматином и содействуют интеграции Т-ДНК [Tzfira, Citovsky, 2002]. Транспорт Т-ДНК в клетку хозяина, вероятно, может реализовываться разными путями. Одним из них может быть формирование поры из агробактериального белка VirE2 в липидной мембране. При этом имеются данные, что VirE2 способен встраиваться в искусственную мембрану и формировать в ней канал, который открывается при наложении электрического поля с напряженностью 10-100 мВ [Dumas et al., 2001; Чумаков с соавт., 2010]. Другим возможным путем проникновения Т-ДНК в животные клетки может являться эндоцитоз. [см. Чумаков, 2001]. Тем не менее, экспериментальные доказательства поглощения Т-ДНК клеткой путем эндоцитоза в настоящее время отсутствуют.

В современной литературе феномен переноса коротких олигонуклеотидов через искусственные мембраны и Т-ДНК агробактерий через мембраны животных клеток при участии белка VirE2 описан в работах [Kunik et al., 2001; Petrunia et al., 2008]. Однако, механизм попадания оцДНК в клетку, опосредованный белком VirE2, малоисследован. Целью данной работы является анализ участия белка VirE2 при доставке оцДНК через мембрану в эукариотическую клетку: а) через поровый комплекс, формируемый белком VirE2; б) с помощью эндоцитоза, опосредуемого белком VirE2.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение возможности белка VirE2 и его комплексов участвовать в процессе транспорта оцДНК через мембраны эукариотической клетки.

В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Построить трехмерные компьютерные модели комплексов на основе белка VirE2 и провести их анализ на встройку в мембрану и наличие каналов.

2. Изучить надмолекулярные комплексы на основе VirE2 белка и оцДНК-VirE2 методами биоинформатики.

3. Выделить, очистить рекомбинантный белок VirE2 и провести анализ его свойств in vitro.

4. Изучить перенос олигонуклеотидов в животные клетки в присутствии рекомбинантного белка VirE2.

Научная новизна работы:

Впервые проведен анализ комплексов из двух и четырёх белков VirE2 методом нормальных мод. Установлено, что в некоторых модах наблюдается возможный воротный механизм каналов у комплексов из двух белков VirE2. Впервые смоделированы комплексы из шести белков VirE2.

Впервые проведен анализ белка У1гЕ2 в комплексе с белком-шапероном \%Е1 методами молекулярной динамики. Установлено, что модель белков У1гЕ2-У1гЕ1 находится в равновесном, стабильном состоянии при времени моделирования до 500 пс. Также установлено, что структура белка \ПгЕ1 в комплексе У1гЕ2Л/1гЕ1 обладает наибольшей подвижностью.

Впервые установлено, что рекомбинантный белок У1гЕ2 способствует накоплению коротких синтетических олигонуклеотидов в нативных клетках линии НеЬа, но не в клетках СПЭВ.

Научно-практическая значимость работы

Поскольку белок У1гЕ2 способствует переносу олигонуклеотидов в животные клетки, в дальнейшем это явление может быть использовано при разработке безвирусных технологий доставки генов в животные клетки и технологий генотерапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Белок УкЕ2 способен формировать т бШсо комплексы из двух, четырёх, шести субъединиц, которые способны встраиваться в мембрану.

2. Модели комплексов из белка УкЕ2 являются стабильными и обладают каналами, а комплекс из двух белков У1гЕ2 имеет воротный канал.

3. Белок У1гЕ2 способствует попаданию олигонуклеотидов в животные клетки НеЬа, но не в клетки СПЭВ, а также взаимодействует с оцДНК.

Вклад соискателя в результаты, полученные в сотрудничестве:

Вклад диссертанта заключается в получении первичных данных по моделированию комплексных структур на основе белка УкЕ2 т вШсо, анализу переноса оцДНК в животные клетки, компьютерному анализу белковых комплексов из белка У1гЕ2, которые проведены совместно с Мазиловым В.И., Волохиной И.В. и Чумаковым М.И. на базе лаб.

биоинженерии ИБФРМ РАН. Результаты опубликованы в совместных статьях. Анализ модели белка VirE2 в комплексе с белком шапероном VirEl методами молекулярной динамики, анализ комплексов из двух и четырёх белков VirE2 методами нормальных мод, а также статистическая обработка экспериментальных данных проведены самостоятельно. Планирование экспериментов, их интерпретация, анализ и подготовка результатов проводились под руководством М.И. Чумакова.

Работа выполнена на базе лаб. биоинженерии ИБФРМ РАН в 20112013 гг. в рамках НИР «Исследование переноса ДНК-белковых комплексов в эукариотические клетки», № 01200606182 (науч. рук. д.б.н. Чумаков М. И). Работа поддержана грантом РФФИ №11-04-01331 «Изучение механизма переноса Т-ДНК агробактерий в генеративные клетки кукурузы» (20112013 гг., рук. к.б.н. ВолохинаИ. В.), соглашением № 8728 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. «Разработка технологии доставки ДНК в животные клетки с помощью белка VirE2» (рук. к.б.н. Мазилов С.И.).

Апробация результатов

Материалы диссертации были представлены на X Всероссийской конференции «Биомеханика-2010», (Саратов, 16-22 мая 2010 г.), V Всерос. школе-конф. мол. учен. «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 28 сент.-1 окт. 2010 г.), на XIV Международной школе-конференции для мол. учен, и студ. по оптике, лазерной физике и биофотонике «Saratov Fall Meeting 10» (Саратов, 5-8 октября 2010 г.), 2-ой ежегодной научно-технической конференции нанотехн. общ. России "Перспективы развития в России НБИК-технологий как основного научного направления прорыва к шестому технологическому укладу" (Москва, 14-15 октября 2010), на III Междунар. форуме по

нанотехнологиям "RUSNANOTECH 2010" (Москва, 1-3 ноября 2010), на Московской международной конференции по компьютерной биологии (Intern. Moscow Conf. on Сотр. Mol. Biol. MCCMB'll, Москва, 21-24 июля 2011), на IV съезде биофизиков России (Н.Новгород, 20-26 августа 2012 г.), на 13-м форуме молодых ученых FEBS (YSF 2013) (г. Санкт-Петербург, 3-5 июля 2013 г.) и 38 Конгрессе FEBS (г. Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объём диссертации

Диссертация, объемом 109 страниц, имеет структуру: введение, глава с обзором литературы, глава с указанием использованных материалов и методов исследования, глава с описанием экспериментальных данных и их обсуждением, выводы, список цитированной литературы из 142 источников, из которых 130 - зарубежные, приложения. Диссертация содержит 44 рисунка и 6 таблиц.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Агробактериальная трансформация

Agrobacterium tumefaciens является широко распространенной естественной почвенной бактерией, которая вызывает образование корончатых галлов у растений и способна трансформировать клетки растений при помощи Ti-плазмиды [Чумаков, 2001]. Эта естественная способность была названа агробактериальной трансформацией растений. В настоящее время агробактериальная трансформация является наиболее часто используемым методом генной инженерии растений из-за достаточно высокой эффективности.

Первоначально считалось, что A. tumefaciens заражает только двудольные растения, но позднее было установлено, что также могут быть трансформируемы однодольные растения.

С открытием бактериального происхождения опухолевых заболеваний растений [Smith, Townsend, 1907], большое количество исследований были направлены на изучение механизма этого процесса, в первую очередь с надеждой понять механизмы онкогенеза в целом, и применимости его к изучению онкологических заболеваний у животных и человека.

В 1969 г. было показано, что вирулентные свойства агробактерий могут быть перенесены от одного вида агробактерий к другому [Kerr, 1969], что было подтверждено в 1975 г. [Johansen, Boye, 1975]. В 1971 г. в работе [Hamilton, Fall, 1971] было определено, что некоторые штаммы A tumefaciens утрачивали способность к образованию опухолей на растениях при температуре 36° С. В 1977 г. было представлено доказательство того, что корончатый галл возникает" после встраивания фрагмента Ti-плазмиды агробактерий в растительный геном [Chilton et al., 1977]. Данный фрагмент Ti-плазмиды, получил название Т-ДНК (рис. 1.1).

Рисунок 1.1 Процесс агробактериальной трансформации растительных клеток [по Цитовски с соавт., 2007].

Т-ДНК содержит два вида генов: онкогенные гены, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе ауксинов и цитокининов, ответственных за формирование опухолей; гены, ответственные за синтез опинов, которые производятся и экскретируются клетками корончатого гала, а затем потребляются А. Ште/асгет в качестве источников углерода и азота. Вне Т-ДНК, на Тьплазмиде расположены гены, ответственные за катаболизм опинов, а также гены, участвующие в переносе Т-ДНК от бактерии к клеткам растений [Нооукааэ, 8сЫ1регоо11, 1992; гирап, гашЬгуэку, 1995].

Результаты исследований процесса переноса Т-ДНК в клетки растений продемонстрировали три важных факта для практического использования этого процесса для трансформации растений. Во-первых, формирование опухоли - это процесс трансформации растительных клеток в результате передачи и интеграции Т-ДНК и последующей экспрессии генов Т-ДНК. Во-вторых, гены Т-ДНК транскрибируются только в клетках растений и не

участвуют в процессе переноса. В-третьих, любая чужеродная ДНК, помещенная между границами Т-ДНК, может быть передана в клетку растения [Hooykaas, Schilperoort, 1992; Deblaere et al., 1985; Hamilton, 1997; Torisky etal., 1998].

В биоинженерии используется перенос чужеродных генов с помощью Т-ДНК для придания дополнительных свойств растениям (увеличение урожайности и устойчивость к патогенам и гербицидам). К настоящему времени с помощью генетической трансформации, осуществляемой A.tumefaciens, получены трансгенные формы многих сельскохозяйственных видов растений [Чумаков, 2001].

Перенос чужеродных генов в растения посредством агробактериальной трансформации условно разделяется на несколько этапов: прикрепление Agrobacterium к клеточной стенке или мембране растительной клетки, экспрессия белков вирулентности, вырезание Т-нити, транспортировка Т-нити через мембраны бактериальной и растительной клеток и через ядерную пору, встраивание в ДНК растения. Процесс агробактериальной трансформации растительных клеток схематично представлен на рисунке 1.1 [Citovskyet al., 2007].

Одним из первых этапов является процессинг Т-нити. Белок VirDl раскручивает ДНК в области правой границы Т-ДНК (рис. 1.1). Далее, действуя как сайт-специфическая эндонуклеаза, VirD2 белок присоединяется к раскрученной Т-ДНК и делает разрыв между третьим и четвертым нуклеотидом в области правой границы Т-ДНК. Репликация региона Т-ДНК Ti-плазмиды происходит до левой границы Т-ДНК. Процессинг Т-нити происходит путем ее вытеснения. Наряду с возможностью присоединяться к 5'-концу Т-ДНК, белок VirD2 имеет еще несколько уникальных особенностей (рис. 1.1). Он имеет две сигнальные последовательности, обеспечивающие прохождение через пору в ядерной мембране. N-конец этого белка отвечает за распознавание границ последовательности Т-ДНК,

целостность цепи ДНК и присоединение VirD2 к Т-ДНК. На С-конце располагаются сигнальные последовательности, кот