Агробактериальная трансформация эмбрионов морских ежей и нарушение хода эмбриогенеза при экспрессии растительных онкогенов rolB и rolC

Яковлев, Константин Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Агробактериальная трансформация эмбрионов морских ежей и нарушение хода эмбриогенеза при экспрессии растительных онкогенов rolB и rolC
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Агробактериальная трансформация эмбрионов морских ежей и нарушение хода эмбриогенеза при экспрессии растительных онкогенов rolB и rolC"

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНОВ МОРСКИХ ЕЖЕЙ И НАРУШЕНИЕ ХОДА ЭМБРИОГЕНЕЗА ПРИ ЭКСПРЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОНКОГЕНОВ го1В И го1С

03 00 25 -гистология, шпология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосюк - 2008

003163411

Работа выполнена в Лаборатории биофизики клегки Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН

Научный руководитель доктор биологических наук, вед н с

Одинцова Нэлия Адольфовна

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор,

Исаева Валерия Васильевна член-корреспондент РАН, Михаилов Валерий Викторович

Ведущая организация Институт цитологии РАН

Защита состоится « февраля 2008 г в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 005 008 01 при Институте биологии моря имени AB Жирмунского ДВО РАН по адресу 690041, г Владивосток, ул Пальчевского, 17 факс (4232)310-900,

e-mail inmarbio@mail pnmorye ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН Адрес 690041, г Владивосток, ул Пальчевского, 17

Отзывы просим присылать на e-mail mvaschenko@mail ru

Автореферат разослан «

января 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

^¡cu^WK^O Ващенко М А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На сегодняшний день агробактериальная трансформация растений является самым изученным примером горизонтального переноса генов от бактерий к эукариотам in vivo В ходе эволюции бактерии рода Agrobacternim (в соответствии с новой классификацией большинство видов реклассифицировано в род Rhizobmm, однако большинство ученых, изучающих агробактериальную трансформацию растительных клеток, используют старое название) приспособились к переходу от сапротрофного типа питания к своеобразному паразитическому типу Это происходит путем переноса в растительные клетки генов синтеза опинов (продуктов реакции кетосахаров и аминокислот) и генов, вызывающих неопластическую трансформацию клеток растений В результате такой трансформации у растений появляются быстро делящиеся клетки, синтезирующие опины, которые служат для агробактерий источником углерода и азота Агробактериальная трансформация нашла широкое применение в генной инженерии растений и сейчас является одним из распространенных методов генетической трансформации растений

Наличие у ряда представителей некоторых групп морских беспозвоночных (кольчатые черви, моллюски, ракообразные, иглокожие) ферментов опинового синтеза позволило сделать предположение о возможном переносе генов опинсинтетаз от агробактерий к морским беспозвоночным Вопрос о возможной агробактериальной трансформации животных клеток долгое время оставался открытым, пока в 2001 году не было показано на культуре клеток человека HeLci, что агробактерии могут трансформировать клетки млекопитающих (Kunik et al, 2001) Несколькими годами ранее было показано, что агробактерии могут трансформировать клетки грибов (Bundock, Hooykaas, 1996, Piers et al, 1996)

На сегодняшний день известно, что активация генов под контролем растительных промоторов (nos и 35S) в животных клетках возможна благодаря распознаванию их регуляторными элементами клетки-реципиента (Bailas et al, 1989, Zahm et al, 1989) Эти промоторы имеют либо вирусную природу (35S, вирус мозаики цветной капусты), либо агробактериальную (nos, бактерии рода Agrobacterium) Однако информации о функционировании именно регуляторных генов растений в клетках животных нет Это особенно касается функционирования растительных онкогенов rol из Agrobacterium rhizogenes (Rhizobmm rhizogenes) в связи с возможностью агробактериальной трансформации клеток животных

В наших экспериментах мы показали, что в условиях морской среды in vitro может происходить агробактериальная трансформация при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с агробактериями Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter), которые несут растительные онкогены rolB и rolC У части эмбрионов нарушается ход эмбриогенеза с образованием опухолеподобных структур (ОПС) Такие структуры формируются на поверхности эмбрионов и получили свое название из-за внешнего вида Подобное нарушение эмбриогенеза было описано ранее после трансформации генетическими конструкциями, несущими ген универсального активатора транскрипции gal4 (Bulgakov et al., 2002) В наших исследованиях мы изучали строение эмбрионов с ОПС после трансформации плазмидной ДНК, несущей ген gal4, и после агробактериальной трансформации генами rolB и rolC Это позволило выявить различия в строении эмбрионов с опухолеподобными структурами и в строении самих ОПС, а на основании этого установить, что возникновение опухолеподобных структур является следствием действия разных механизмов

Цели и задачи исследования. При выполнении работы мы преследовали две цели Во-первых, изучить явление агробактериального переноса Т-ДНК (transferred DNA, переносимая одноцепочечная ДНК) в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, доказать встройку чужеродной ДНК и активность перенесенных генов rolB и rolC Во-вторых, изучить влияние растительных онкогенов rolB и rolC на ход эмбриогенеза морских ежей

Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи

1 Подобрать и оптимизировать условия агробактериальной трансформации эмбрионов морских ежей в процессе их совместного культивирования со штаммами A tumefaciens, которые несут бинарный вектор pMP90RK (vir-хелперная плазмида) и pPCV002, содержащую в составе Т-ДНК один из генов rol (rolB или rolC) Определить возможные механизмы трансформации

2 Оценить эффективность агробактериальной трансформации в сравнении с полиэтиленгликоль(ПЭГ)-опосредованной трансформацией плазмидными конструкциями, несущими чужеродные гены

3 Доказать встройку Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, используя методы ПЦР и TAIL-ПЦР Определить активность генов rol В и

то/С методом обратно-транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР) после совместного культивирования эмбрионов с агробактериями 4 Провести сравнительный морфологический анализ эмбрионов с опухолеподобными структурами, возникающими вследствие трансформации генетическими конструкциями, несущими ген ga!4 и гены гоШ и то/С Определить сходство и различие в строении эмбрионов и опухолеподобных структур после трансфекции

Научная новизна и теоретическая значимость. В нашей работе впервые продемонстрирована возможность агробактериальной трансформации в условиях морской среды на примере эмбрионов морских ежей Это является подтверждением гипотезы о переносе генов опинового синтеза от агробактерий к представителям различных групп морских беспозвоночных Более того, нами зафиксирована встройка агробактериальной Т-ДНК в геномную ДНК морских ежей. Наряду с известным фактом трансформации клеток млекопитающих наши данные указывают на целенаправленный транспорт Т-ДНК в ядра клеток животных

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на I и IV Всероссийских симпозиумах по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2006), на международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2004), на Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2006» (Калининград, 2006), на X Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС, ТИБОХ, 2006) и на годичной научной конференции Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах, включая 2 статьи в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и содержит 2 таблицы Список литературы содержит 193 наименования

Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума ДВО РАН (гранты 03-3-Ж-06-096, 04-ЗА-06-047, 06-П-СО-06-025 и 06-Ш-В-06-214) и при финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет

средств фонда US CRDF (проектУЪ-ООЗ) и Министерства Образования РФ (АОЗ-2 12-524)

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Экспериментальную часть работы проводили на морской биологической станции «Восток» Института биологии моря имени А В Жирмунского ДВО РАН (Приморский край, Находкинский район) Морских ежей (Scaphechinus mirabilis, Strongylocentiotus intermedins и S nudus) собирали в заливе Восток Японского моря с июля по октябрь и держали в ваннах с проточной аэрированной водой Нерест морских ежей стимулировали инъекцией 0,5 М KCI в область аристотелева фонаря Эмбрионов получали искусственным оплодотворением

Для агробактериальной трансформации использовали штамм А tumefaciens GV3101, который несет бинарный вектор pMP90RK (vir-хелперная плазмида) и pPCV002 Плазмида pPCV002 содержит в составе Т-ДНК один из онкогенов rol из A rhizogenes (rolB либо rolC) и ген nptll, кодирующий неомицинфосфотрансферазу Агробактериальную

трансформацию проводили путем совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей с последующим добавлением антибиотика цефатоксима через 10-13 часов после начала эксперимента

Для трансформации плазмидной ДНК с генами rol использовали штаммы Escherichia coll TG2 с плазмидами pPCV002-rolC, pPCV002-rolB и pPCV002 В эксперименте по изучению влияния гена gal4 мы использовали штамм Е coli TG2 с плазмидой рМА563, любезно предоставленной доктором М Пташне (М Ptashne, Гарвардский университет, США) Гены rol в плазмидах находятся под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, гены nptll и gal4 - под контролем нопалинсинтазного промотора nos Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса Трансформацию плазмидной ДНК проводили ПЭГ-опосредованным методом (Bulgakov et al, 2002)

Для изучения влияния растительных онкогенов на ход эмбриогенеза мы использовали штамм A tumefaciens А348, несущий одну из плазмид pTi237 (мутантный ген virA), pTi243 (мутантный ген локуса virB) или pTil9 (мутантный ген virG) Данные гены инактивированы вставкой транспозона Tn3-Ho-Hol (Stachel, Nester, 1986)

ДНК из эмбриональных культур выделяли согласно Т Маниатису (Mamatis et al, 1982), с использованием буфера, содержащего р-р 7 М

мочевины Тотальную РНК выделяли из эмбрионов с помощью набора YellowSolve (Клоноген, Санкт-Петербург, Россия) с последующей обработкой ДНКазой (Amresco, США) н депротеинизацией сорбентом BlueSorb (Клоноген, Санкт-Петербург, Россия) Обратную транскрипцию проводили, используя набор фирмы Силекс M (Москва, Россия) Доказательство трансгенности и экспрессии перенесенных генов проводили с помощью генспецифических ПЦР и ОТ-ПЦР с последующим секвенированием по методике, описанной ранее (Bulgakov et al, 2002, Одинцова и др , 2003, Bulgakov et al, 2006) Доказательство встройки Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей проводили методом TAIL (thermal asymmetric interlaced)-nU,P по схеме, описанной Я Лиу с соавторами (Liu et al, 1995), с последующим клонированием продуктов реакции при помощи набора «InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit» (Fermentas, Vilnius, Литва) согласно протоколу фирмы-производителя ПЦР-продукты клонированных фрагментов после TAIL-ПЦР были секвенированы при помощи пары праймеров М13 Генспецифические ПЦР-продукты секвенировали с праймерами, которые использовали при ПЦР фрагментов этих генов Реакцию проводили, используя набор реактивов «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» V 3 1 (Perkin-Elmer Biosystems, Forster City, США) по методике производителя Последовательность фрагментов ДНК определяли на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Perkin-Elmer Biosystems, США) на базе Биолого-почвенного института ДВО РАН

Для определения изменения pH в процессе культивирования мы проводили измерения pH морской воды в совместной культуре агробактерий (A tiimefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolC) и эмбрионов морских ежей в течение 3 суток Измерения значения pH проводили при помощи рН-метра OR-211/1 с комбинированным электродом (Radelkis, Венгрия) В эксперименте ставили три параллели 1) эмбрионы без добавления агробактерий, 2) эмбрионы с добавлением агробактерий, 3) эмбрионы с добавлением агробактерий и с добавлением цефатоксима через 12-13 часов совместного культивирования Отдельно проводили измерение pH морской воды, которую брали для культивирования

Морфологию эмбрионов исследовали методами световой и трансмиссионной электронной микроскопии Эмбрионы фиксировали 2% глютаральдегидом на изоосмотичном фосфатном буфере (исходя из того, что соленость морской воды 32%о) с последующей дофиксацией 1% тетраоксидом осмия на том же буфере Материал заливали в смесь смол Эпон

и Аралдит (Fluka, Швейцария), либо в Спурр (Sigma, США) Срезы получали на ультракате Ultracut-E (Reichert-Jung, Австрия) Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим (Уикли, 1975) и изучали под световым микроскопом Polyvar (Reichert-Jung, Австрия) Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Рейнольдса (Уикли, 1975) с последующим просмотром на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ

Локализацию пролиферирующих клеток в эмбрионах определяли методом иммуноцитохимического выявления включения 5-бромо-2'-дезоксиуридина (БДУ) Для этого к эмбрионам морских ежей, культивируемым совместно с агробактериями (агробактериальная трансформация), через 24 часа после оплодотворения добавляли БДУ до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 8 часов (32 часа развития) Выявление включения БДУ проводили по протоколу Танаки и Дана (Ettensohn, Ruffins, 1993) с незначительными модификациями

Статистические данные обработаны с помощью программы GraphPadPrizm (версия 4 0) и представлены как среднее значение ± стандартная ошибка Полученные данные оценивали по спаренному t-критерию Стьюдента Уровень значимости 0,05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Жизнеспособность агробактерий в морской воде и формирование контактов между агробактериями и эмбрионами морских ежей

Возможность агробактериальной трансформации в условиях повышенной солености напрямую связана с изучением вопроса о жизнеспособности агробактерий в морской воде и способности клеток последних нормально размножаться в этой среде В данной работе мы проверяли жизнеспособность агробактерий A tumefaaens GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolC в чистой морской воде и в совместной культуре с эмбрионами морских ежей В течение 5 дней агробактерии остаются живыми в морской воде, но их количество постепенно уменьшается Однако, при культивировании с живыми эмбрионами количество агробактерий сильно возрастает, что приводит к гибели эмбрионов на 2-3 сутки совместного культивирования

Другая сторона вопроса об агробактериальном переносе в морской воде связана с рассмотрением возможности формирования первичных

контактов, активации wr-региона и сборки аппарата пилей для осуществления контактов между агробактериями и клетками-реципиентами с последующей передачей Т-ДНК Нам удалось обнаружить нитевидные контакты между бактериями и клетками морских ежей на 2-3 сутки совместного культивирования (Рис 1, А) Диаметр нитей составил около 10 нм Исходя из этого, можно предположить, что контакт сформирован агробактериальными Т-пилями, так как, согласно данным Лай с соавторами, диаметр пилей агробактерий составляет 10 нм (Lai et al, 2000) Формирование Т-пилей наблюдается также у бактерий, которые не контактируют с клетками морских ежей (Рис 1, Б) Это говорит об активации у//--региона агробактерий в культуре при совместном культивировании с эмбрионами

Встройка Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов и экспрессия растительных онкогенов rolB и rolC

Помимо встройки Т-ДНК в геномную ДНК клетки-реципиента главным критерием успешного исхода агробактериальной трансформации служит экспрессия локализованных в Т-ДНК генов Использованные нами в экспериментах штаммы A tumefaciens несут гены rolB и rolC родственной агробактерии A rhizogenes Векторы, содержащиеся в штамме GV3101(pMP90RK), являются конструкциями, разработанными для растений Однако гены rolB и rolC под промоторами вируса мозаики цветной капусты 35S и нопалинсинтазным промотором nos, исходя из литературных данных, могут быть активными в клетках животных Экспрессия генов под данными промоторами и их распознавание, как и распознавание растительных сигналов полиаденилирования, отмечены для ооцитов лягушки ксенопуса (Bailas et al, 1989) Кроме того, показано, что nos промотор активен и в клетках млекопитающих (Zahm et al, 1989) Для проверки экспрессии растительных онкогенов rol мы провели ОТ ПЦР анализ В качестве контрольной реакции ОТ ПЦР мы определяли экспрессию гена актина морского ежа Cyllh (экспрессия в оральной эктодерме и ротовой области)(Рис 2)

Экспрессия генов rolB, rolC и nptll отмечается у эмбрионов морских ежей после совместного культивирования с агробактериями (Рис 3, линии 1, 5, 6, 7) Анализ последовательностей ПЦР-продуктов показал 100% гомологию с генами rolB и tolC (GenBank, Ас No К03313) и геном неомицинфосфотрансферазы nptll (GenBank, Ас No AJ414108)

Рис. 1. А. Ште/аЫет в культуре с эмбрионами морских ежей (3 су ток совместного культивирования). А — контакт между агробактерией и клеткой морского ежа, Б -единичная бактерия. Линейка 200 им.

Рис. 2. Экспрессия гена актина СуПЬ эмбрионов морских ежей 5. пидш на стадии гаструлы. Р - позитивный контроль (ПЦР с кДНК), N - негативный контроль (ПЦР с РНК), М - молекулярный маркер с шагом 100 п.н.

N Р 1 2 3 4 М N Р 5 М N Р 6 7 М

Рис. 3. Выявление транскрипции генов го/ и прШ в эмбрионах морских ежей после совместного культивирования с А. (ыте/аЫепя методом ОТ ПЦР.

N - негативный контроль (кДНК нетрансформированных эмбрионов); Р -позитивный контроль, амплификация с плазмидой рРСУ002-го/АВС; эмбрионы, трансформированные штаммами с плазмидами: 1 — рРСУ002-го/С, 2 - рРСУ002-го1С + мутантный \1гА (р"П237), 3 - рРСУ002-го1С + мутантный локус \>и-В (рТ1243), 4 - рРСУ002-го/С + мутантный уп-в (рТП9), 5 - рРСУ002-го1В, 6 -транскрипция прП1 в трансформированных рРСУ002-го/б эмбрионах, 7 -транскрипция npt.ll в трансформированных рРСУ002-го/С эмбрионах, М -молекулярный маркер с шагом 100 п.н.

При использовании агробактериальных штаммов, несущих мутантные гены vir (vir А, virB, virG), экспрессию генов rol и nptll не наблюдали (Рис 3, линии 2, 3, 4) Эти данные подтверждают результаты ПЦР-анализа При использовании штаммов, мутантных по генам vir, не обнаружено присутствия генов rol и nptll в эмбрионах морских ежей Из этого следует, что при передаче Т-ДНК задействован v/r-опосредованный механизм переноса

Для доказательства встройки Т-ДНК мы использовали метод TAIL-ПЦР Этот метод позволяет амплифицировать участок ДНК, где произошла сшивка чужеродной и геномной ДНК, с использованием специфического и вырожденного (рэндом) праймеров Для доказательства встройки мы выбрали участок Т-ДНК, прилегающий к правому бордеру После трех амплификаций (Рис 4, А) ПЦР-продукт был клонирован и секвенирован Точная масса ампликона составила 161 п н , из которых 34 п н приходились на фрагмент, прилегающий к правому бордеру участка Т-ДНК, 2 п н - на остаток бордера и 125 п н - предположительно, на последовательность ДНК морского ежа (Рис 4, А, Б) Анализ фрагмента величиной 125 п н не показал гомологии с последовательностью плазмиды pPCV002-/o/, поэтому мы предполагаем, что данная последовательность является последовательностью ДНК морского ежа К сожалению, гомологии на данный участок среди известных последовательностей ДНК морского ежа S purpuratus (GenBank) не было обнаружено Это дает основание предположить, что встройка Т-ДНК произошла в видоспецифическую неконсервативную последовательность Наличие границы, где прошла сшивка при встраивании между Т-ДНК и геномной ДНК морских ежей, опровергает вероятный ненаправленный путь трансформации путем захвата эмбриональными клетками плазмидной ДНК из разрушенных бактериальных клеток и свидетельствует о нормальном протекании процесса агробактериальной трансформации, который является единым для животных и растительных клеток

Появление и возможные причины формирования

опухолеподобных структур (ОПС) у эмбрионов морских ежей

В ходе совместного культивирования агробактерий A tumefaciens, несущих растительные онкогены rolB и rolC, у части эмбрионов наблюдается формирование опухолеподобных структур - такие структуры представлены неоформленными скоплениями клеток на поверхности эмбрионов и получили название вследствие их внешнего вида

107bp

97Ьр

TAIL1 -AD3^ IIЦР- • продукт I

TAIL2-AD 3*

^ 11Ц1'. \

ирЩГК! „цр.

ГДЙ-З-АОЗ-Л^дук, Я

клшпфишипк' и секисинровнинг

pPt'VlllU м с

pf'CVlIOZ

м <

pl4'VO02

чг р|Ч VQD2 М С

I: I, ; I

и (.4 1 i

. ( i ( 11 (. t; I l l \ \ v < i v i с ч.т'.м и;и\мл i \i.u h.iii ¡; .i < rii i.i.i i i \ v \< i \ и и;««.1 ■ i(.TCK'TNi ( ,u i <n;i(.\c

i - = ■ l i w. < ' l \ \ t, i <, \ v \ м, \ м <. i i i \ i I v i .1 \ ( \ \ i < <, i; и i t i i w \ \ (л, I I А Л (Ч Л< f' I I C M (TCCACI (;< |'1Ч'ЛС IСЛССЛС ("1 ('( At 'CTCI Л< ('С1;Т( (.t 11, \ v \ w.u i i i н i 11.1 i < i, и t ч i i к, i \ |ч. I i.( \ i (.( ( i и i \i,i. глстс( (< лг(кч лес (;i;t<слллпч;(;лт1 ( i (;<;<;см с; i <ч;л<т<;<;л<;л

(. I I ( ( 1®|'П

Рис. 4. Клонирование последовательности, содержащей сшивку Т-ДНК А. tumefaciens и геномной ДНК S. intermedins. А - схема проведения TAIL-ГЩР. На схеме представлены три последовательные амплификации. Часть Т-ДНК, прилегающая к правому бордеру (черный сегмент), отображена белым цветом, геномная ДНК S. intermedins представлена серым сегментом. Б - выравнивание нуклеотидной последовательности участка плазмиды pPCV002-ro/C, несущего прилегающие к правому бордеру области, и клонированной нуклеотидной последовательности в месте соединения Т-ДНК с геномной ДНК S. intermedins.

о с О

о.

ID 5 п О С

5.5 5.0 4.54.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

а<Г

-5-

<г

<г <г

<Г

Рис. 5. Число эмбрионов п^ш с опухолеподобными структурами при трансформации плазмидами, несущими гены gal4 (58-59 часов после оплодотворения), го!В и го1С (24-29 часов после оплодотворения).

Ранее ОПС были описаны у трансформированных геном gal4 эмбрионов морских ежей В связи с этим, мы, наряду с агробактериальной трансформацией, проводили ПЭГ-опосредованную трансформацию плазмидами, несущими ген gal4 или растительные онкогены го!В и rolC, для сравнения количества эмбрионов с ОПС, а также для сравнительного анализа морфологии опухолеподобных структур

Эксперименты по ПЭГ-опосредованной трансформации плазмидной ДНК (Рис 5), несущей либо ген gal4, либо растительные онкогены rolB или rolC, показали, что процент эмбрионов с ОПС находится на одном уровне (35,5 %) Такого рода сходство говорит о высокой эффективности ПЭГ-опосредованной трансформации Количество эмбрионов с ОПС при трансфекции геном gal4 в процентном соотношении составляет 3,6±0,5% В этом случае опухолеподобные структуры наблюдали на 3 сутки после оплодотворения Эффект растительных онкогенов rolB и rolC проявляется уже к концу первых суток, содержание эмбрионов с ОПС при этом составляет 4,5±0,75% для гена rolC и 3,8±0,6% для rolB В контрольной культуре эмбрионов наблюдали небольшой процент (в среднем 0,82±0,15%) эмбрионов с ОПС, по-видимому, это связано с нарушением хода эмбриогенеза у части эмбрионов При обработке ПЭГ 4000 Да и плазмидой pPCV002 процент ОПС несколько возрастает (1,65±0,15%) Незначительное увеличение процента ОПС можно объяснить токсическим эффектом ПЭГ Увеличение количества ОПС при трансформации pPCV002 (2±0,38%), вероятнее всего, связано со встройкой чужеродной ДНК в геномную ДНК морских ежей, что может приводить к сбою программы развития вследствие инактивации генов или их неконтролируемой активности

Результаты агробактериальной трансформации, которую проводили путем совместного культивирования A tumefaciens с эмбрионами морских ежей трех видов, представлены на рисунке 6 Максимальное количество эмбрионов с ОПС наблюдали через 20-24 часа у Scaphechinus mirabilis и через 24-28 часов у S midus и S mtermedius После этого количество эмбрионов с такими аномалиями развития сокращалось, но в культуре появлялось большое количество одиночных клеток По-видимому, спустя какое-то время происходил распад эмбрионов с ОПС на клетки Подводя итог, можно сказать, что при совместном культивировании со штаммом агробактерий GV3101(pMP90RK), несущих плазмиду pPCV002, количество эмбрионов с ОПС варьировало в пределах 1-3% Процентное содержание в культуре эмбрионов с ОПС составило 4-8% для pPCV002-ro/C и 4,5-14% для

pPCV002-ro/S При сравнении количества эмбрионов с ОПС при агробактериальной и ПЭГ-опосредованной трансформациях оказалось, что при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с A tumefaciens процент ОПС выше Кроме того, увеличение числа таких эмбрионов практически не зависит от присутствия бактерий в культуре, так как относительное количество эмбрионов с ОПС при культивировании со штаммом GV3101(pMP90RK), который не несет гены rol, находится на уровне обработанной ПЭГ эмбриональной культуры Процент эмбрионов морских ежей с ОПС при агробактериальной трансформации генами rolB и rolC, различается у трех видов морских ежей Scaphechimis mirabilis, S intermedins и S nudus, но достоверное увеличение числа ОПС при использовании конструкций с генами rolB и rolC говорит о влиянии растительных онкогенов на ход эмбриогенеза у всех трех видов

Для того, чтобы проверить, связано ли появление опухолеподобных структур с трансформацией эмбрионов агробактериальной Т-ДНК, а также, идет ли перенос ДНК по угг-опосредованному механизму, мы провели ряд экспериментов по совместному культивированию эмбрионов с штаммами А tumefaciens, несущими бинарные векторы с мутантными генами virA, virG и мутацией в локусе virB Использованные мутантные гены приводят к потере функций кодируемых белков (Stachel, Nester, 1986)

В таблице 1 приведены данные, показывающие снижение количества эмбрионов с ОПС при совместном культивировании со штаммами, несущими бинарные векторы с мутантными генами vir Процент эмбрионов с ОПС при этом такой же, как и при использовании штаммов с бинарным вектором без генов rol Этот факт указывает на то, что формирование опухолеподобных структур у эмбрионов связано с интеграцией гена rolC в геномную ДНК морских ежей и что трансформация клеток эмбрионов морских ежей идет по v/r-опосредованному механизму, по которому происходит агробактериальный перенос Т-ДНК в растительные клетки Более того, это говорит о влиянии растительных онкогенов rolB и rolC на ход эмбриогенеза морских ежей Таким образом, активность растительных онкогенов rolB и rolC способна влиять на судьбу эмбриональных клеток морских ежей К сожалению, на сегодняшний день функции генов rolB и rolC до конца не ясны Известно лишь то, что белок RolB обладает тирозинфосфатазной активностью (Filippini et al, 1996)

и с о

СJ

со о я о

V® §

з-

5 4

3 2 1 О

12 10 8

4 2 0

16 12 8 4 0

рБт

век гор

вектор

го/С

■'■л'йА'

го/В

•.:.:

d 1

вектор

га/С

го/В

Рис. 6. Число эмбрионов с опухолеподобными структурами (%) у разных видов морских ежей. А - ЗсарИесЫтт ти-аЫН$\ Н .V, /МегтесИш", В - 5. пис1ия. Эмбрионов культивировали совместно с А. Ште/ааепя вУЗ 101(рМР90КК) с плазмидой рРСУ002 (вектор), СУ3101(рМР9011К) с плазмидой рРСУ002-го/С (го/С), ОУЗ101 (рМРУОЯК) с плазмидой рРСУ002-го/Я (го/В) в течение 24-28 часов.

Одна из других наиболее вероятных причин нарушения хода эмбриогенеза морских ежей - это изменение рН морской воды При неизменности других параметров окружающей среды, определенное значение рН является фактором, обуславливающим нормальное протекание физиологических процессов в организме, в том числе и в зародыше Значение рН может варьировать в некоторых пределах, при этом жизнеспособность и физиологические процессы клеток будут протекать нормально Также известно, что изменение рН морской воды значительно влияет на ход эмбриогенеза морских ежей снижение значения рН ниже оптимума на 0,20,5 может приводить к дефектам развития (Pagano eí al, 1985), хотя обычно рН морской воды варьирует в диапазоне 8,0-8,2 При совместном культивировании эмбрионов морских ежей и A tumefaciens рН морской воды меняется, но эти изменения незначительные (в течение трех суток от 8,15 до 7,8-8) и больше связаны с жизнедеятельностью эмбрионов Несомненно, добавление агробактерий в морскую воду с эмбрионами вызывает небольшое уменьшение значения рН на 0,1-0,35 Однако, такое незначительное изменение рН не может отразиться на процессах эмбриогенеза и тем более не может приводить к гибели эмбрионов на третьи сутки

Внешний вид и строение опухолеподобных структур

Как уже ранее упоминалось, опухолеподобные структуры у эмбрионов морских ежей располагаются на поверхности и представляют собой неоформленные группы клеток При сравнении эмбрионов с ОПС, трансформированных генами gal4, либо rolC или tolB были выявлены морфологические различия Во-первых, трансформированные gal4 эмбрионы с опухолеподобными структурами имеют округлую форму, ОПС также округлые (Рис 7, Б, В), иногда красного цвета Это говорит о наличии в клетках эхинохрома - пигмента, который на ранних эмбриональных стадиях синтезируется пигментными клетками, берущими начало от вторичной мезенхимы Второй немаловажный момент - время появления опухолеподобных структур При трансформации геном gal4 ОПС наблюдаются на 2-3 сутки с момента оплодотворения Контрольные эмбрионы в это время находятся на стадии 4-рукого плутеуса (Рис 7, А) Эмбрионы с опухолеподобными структурами не имеют пищеварительной системы (Рис 8, Б) Практически все внутреннее пространство заполнено мезенхимными клетками Однако в центре эмбриона сохраняется небольшое свободное пространство - остаток бластоцеля

Таблица 1. Частота встречаемости ОПС у эмбрионов \ntermedius и 5'. п^ш,

культивируемых с разными штаммами А. Ште/аает (через 28 часов после оплодотворения).

Агробактериальные векторы % эмбрионов с ОПС

S. intermedins S. nudus

Контроль (без обработки) 0 0

pPCV002 + полная функция vir (pMP90RK) 1.2 ±0.1 1.6 + 0.2

pPCV002-rolC + полная функция vir (pMP90RK) 4.5 + 0.4 5.5 + 0.7

pPCV002-ro/C+ мутация virA (pTi237) 0.8 + 0.1 1.2 ± 0.2

pPCV002-rolC + мутация virB (pTi243) 0.6 + 0.1 1.2 ±0.3

pPCV002-rolC + мутация virG (pTi 19) 0.3 ±0.2 0.8 ±0.1

pMP90RK (только функция vir) 0.4 ±0.2 1.0 ± 0.4

Штаммы содержат различные плазмиды, несущие ген rolC.

Рис. 7. Внешний вид эмбрионов Scaphechinus mirabilis, обработанных плазм идой рМА563, несущей ген ga\4 (60 часов после оплодотворения). А - контрольный эмбрион (плутеус), Б, В - эмбрионы с ОПС. Линейка 20 мкм.

На полутонких срезах хорошо видно, что опухолеподобные структуры представлены рыхлым скоплением клеток и, очевидно, возникают из-за разрыва эктодермы эмбриона и выселения части чрезмерно развитой мезенхимы наружу По-видимому, экспрессия gal4 приводит к увеличению пролиферативной активности эмбриональных клеток морских ежей, как это было показано на первичных культурах эмбриональных клеток морских ежей (Bulgakov et al, 2002) К какому зачатку (эктодерма или энтодерма) следует относить поверхностный эпителий зародыша с опухолеподобной структурой, морфологически определить невозможно, поэтому мы характеризуем его как внешний слой клеток Из этого следует, что, несмотря на неорганизованный рост клеток внутренней массы, после трансфекции геном gal4, клетки претерпевают детерминацию, т к в таких эмбрионах можно различить эпителиальные структуры и производные мезодермы Кроме того, наблюдаемые в этом случае процессы изменения хода эмбриогенеза при формировании ОПС сильно отличаются от таковых, имеющих место при экзогаструляции, где при вегетализации эмбриона сдвиг детерминации клеточных полей эмбрионов происходит в энто-мезодермальном направлении Механизмы, по которым запускается ненормированный рост мезенхимы эмбрионов, неизвестен Скорей всего, это происходит благодаря активации гена эпидермального фактора роста (ЭФР) морских ежей, в промоторной последовательности которого обнаружен участок UAS (Delgadillo-Reynoso et al, 1989) Известно, что ЭФР участвует в формировании как эктодермальных, так и мезодермальных тканей (Schuldiner, Benvenisty, 2003) Хотя не исключено, что мишенями могут оказаться другие гены

Эмбрионы с ОПС, сформировавшиеся в результате агробактериальной трансформации генами rolB (Рис 9, В) и rolC (Рис 9, Г) имеют значительные отличия как в строении эмбрионов в целом, так и в структуре опухолеподобных образований Эмбрионы имеют вытянутую форму, в бластоцеле видны мезенхимные клетки, плотность которых увеличивается в направлении к ОПС Опухолеподобные структуры, в отличие от трансформированных gal4 эмбрионов, представляют собой группу клеток, локализованную на поверхности эмбрионов без видимых повреждений стенки эмбрионов (Рис 10, А, Б) Ультраструктурный анализ клеток эктодермы контрольных и трансформированных эмбрионов не выявил различий

-■'л iV л --

S J* Li .ч

Рис. 8. Полутонкие срезы эмбрионов Scaphechinus mirabilis, обработанных плазмидой рМА563, несущей ген gal4 (60 часов после оплодотворения). А -контрольный эмбрион на стадии раннего плутеуса. Б - эмбрион с ОПС. Окраска метиленовым синим. Линейка 50 мкм.

m - V 1 ! <? , J | y \г , Б

ïiL * «H Я n 4 В liter " * Су. 1 ' | .г

Рис. 9. Внешний вид эмбрионов с ОГ1С морского ежа S. intermedins, культивированных совместно с A. tumefaciens спустя 32 часа после оплодотворения. А - внешний вид контрольного эмбриона на стадии поздней гаструлы. Эмбрион из культуры с добавлением штамма A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) с плазмидой pPCV002 (вектор) (Б), с плазмидой pPCV002-rolC (В), с плазмидой pPCV002-ro/5 (Г). Линейка 45 мкм.

Рис. 10. Полутонкие срезы эмбрионов с ОПС Scaphechinus mirabilis (А) и S. intermedins (Б), культивированных совместно со штаммами A. tumefaciens GV3101 (pMP90RK) с плазмидой pPCV002-rolB (А) и GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-ro/C (Б). 20 часов совместного культивирования. Окраска метиленовым синим. Линейка 50 мкм.

Также обнаружено значительное морфологическое сходство между клетками вторичной мезенхимы контрольных эмбрионов на стадии поздней гаструлы и клетками ОПС.

Морфологические нарушения эмбриогенеза морских ежей, наблюдаемые в наших экспериментах по агробактериальной трансформации, сходны с нарушениями, которые наблюдали Коффман с коллегами у эмбрионов после блокировки активности гена транскрипционного фактора spRunt, регулирующего экспрессию актинового гена СуШа в аборальной эктодерме (Coffman et al., 2004).

Хотя авторы сравнивают эти нарушения с экзогаструлой, тем не менее, они указывают на формирование рудиментарной первичной кишки или на полное отсутствие экзоархентерона. При ингибировании spRunt эмбриональные клетки морских ежей приобретают черты, свойственные раковым клеткам, при этом в эмбрионах наблюдается апоптоз и вторичная эктопическая пролиферация клеток. Это неудивительно, так как гены группы Runx часто функционируют как супрессоры онкогенеза (Coffman, 2003). При анализе клеток в эмбрионах морских ежей на включение БДУ после агробактериальной трансформации мы также обнаружили эктопическое включение метки. Из этого следует, что растительные онкогены, вызывающие процессы неопластической трансформации растительных клеток, не ингибируют пролиферацию эмбриональных клеток морских ежей, но влияют на дифференцировку эмбриональных полей, что приводит к нарушению хода эмбриогенеза.

ВЫВОДЫ

1 Впервые доказан факт агробактериальной трансформации эмбриональных клеток морских ежей в условиях морской среды Процесс трансформации проходит в ходе совместного культивирования эмбрионов морских ежей с агробактериями и сопровождается формированием контактов между бактериями и эмбриональными клетками при помощи Т-пилей Визуальный эффект агробактериальной трансформации выражается в появлении у части эмбрионов на поверхности опухолеподобных структур

2 Использование агробактериальных штаммов, несущих мутантные гены по локусу vir, приводит к снижению числа ОПС у эмбрионов Это, наравне с формированием контактов при помощи Т-пилей, является доказательством угг-опосредованного механизма переноса Т-ДНК Помимо этого, наличие границы между последовательностями Т-ДНК и геномной ДНК морских ежей свидетельствует о том, что трансформация идет именно за счет Т-ДНК, а не за счет других участков плазмидной или хромосомной ДНК агробактерий

3 Впервые показано, что экспрессия генов rolB и rolC приводит к появлению ОПС у эмбрионов морских ежей Время появления и морфология таких эмбрионов достаточно сильно отличается от эмбрионов с ОПС, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген универсального активатора транскрипции gal4 Нарушение хода эмбриогенеза в обоих случаях связано с ненормальным и чрезмерным развитием клеток мезенхимы Хотя, вероятно, в случае трансформации геном gal4 и генами rolB и rolC задействованы разные механизмы

4 Растительные онкогены rolB и rolC влияют на дифференцировку эмбриональных полей Результатом этого является нарушение хода эмбриогенеза морских ежей

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Киселев К В , Одинцова H А , Кольцова Е А , Булгаков В П , Яковлев К В Влияние активатора транскрипции GAL4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток в первичных культурах плоского морского ежа (Scaphechmits mirabilis) II Тезисы научной конференции НОЦ ДВГУ «Морская биота» (Владивосток,

2 октября 2002) Владивосток изд-во ДВГУ, 2002 С 82

2 Киселев К В , Одинцова H А, Булгаков В П , Кольцова Е А , Яковлев К В Клетки плоских морских ежей как возможные продуценты биологически активных веществ // Вестник ДВО РАН 2002 №5 С 101-104

3 Киселев К В , Дячук В А , Яковлев К В , Одинцова H А , Булгаков В П Перенос Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens в эмбрионы и клеточные культуры морских ежей // Сборник тезисов 7-ой Международной школы-конференции молодых ученых

«Биология - наука XXI века» (Пущино, 14-18 апреля 2003) Пущино ПНЦ РАН, 2003 С 341

4 Одинцова H А , Киселев К В , Булгаков В П , Кольцова Е А , Яковлев К В Влияние активатора транскрипции эукариот GAL4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток в первичных культурах морского ежа Scaphechinus mirabilis II Онтогенез 2003 Т 34, № 4 С 267-272

5 Одинцова H А , Киселев К В , Дячук В А , Яковлев К В , Булгаков В П Инициация опухолеподобных структур в эмбрионах морских ежей // Материалы 1-го Всероссийского симпозиума по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 14-17 октября 2003) Цитология 2003 Т 45, № 9 С 908-909

6 Киселев К В , Дячук В А, Яковлев К В , Одинцова H А, Булгаков В П Экспрессия агробактериальных генов в эмбриональных клетках морских ежей // Сборник тезисов 8-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 17-21 мая 2004) Пущино ПНЦ РАН, 2004 С 14

7 Одинцова H А, Яковлев К В , Киселев К В , Булгаков В П Генно-инженерная регуляция дифференциации и пролиферации эмбриональных клеток морских ежей // Тезисы Международного научного семинара «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2-4 ноября 2004) Мурманск ММБИ КНЦ РАН, 2004 С 93-95

8 Яковлев К В , Одинцова H А, Киселев К В , Булгаков В П Взаимодействие Agrobacterium tumefaciens с клетками морских ежей, сопровождающееся переносом Т-ДНК и нарушением эмбрионального развития морских ежей // Тезисы Международного научного семинара «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2-4 ноября 2004) Мурманск ММБИ КНЦ РАН, 2004 С 149-150

9 Bulgakov V Р , Kiselev К V , Yakovlev К V , Zhuravlev Y N , Gontcharov А А , Odintsova NA Agrobactei /г/m-mediated transformation of sea urchin embryos II Biotechnology Journal 2006 Vol 1 P 447-453

10 Яковлев К В Одинцова НА, Киселев КВ, Булгаков ВП Трансформация эмбрионов морских ежей агробактериями // Сборник X Международной молодежной Школы-конференции (МЭС, ТИБОХ, 12-19 сентября, 2006) Владивосток ДВО РАН, 2006 С 54

11 Одинцова H А, Яковлев К В, Дячук В А Регуляция процессов роста и дифференцировки клеток морских беспозвоночных в культуре // Материалы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 17-19 октября, 2006) Цитология Т 48, № 9 С 785-786

12 Одинцова НА, Яковлев КВ, Дячук В А Культуры клеток морских беспозвоночных проблемы, успехи, перспективы // Сборник тезисов Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании - 2006» (Калининград, 18-20 октября, 2006) Калининград изд-во КГТУ, 2002 С 50-52

Константин Владимирович ЯКОВЛЕВ

АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНОВ МОРСКИХ ЕЖЕЙ И НАРУШЕНИЕ ХОДА ЭМБРИОГЕНЕЗА ПРИ ЭКСПРЕССИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОНКОГЕНОВ го/В И го!С

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Зак № 1п Формат 60x84 Уел п л 1,0 Тираж 100 экз Подписано в печать 10 01 2008 г Печать офсетная с оригинала заказчика

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор» 690105, г Владивосток, ул Бородинская, 46/50, тел 32-70-49 E-mail press-dpr@rambler ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлев, Константин Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Перенос генетического материала у прокариот.

1.2 Агробактериальный перенос ДНК.

1.2.1 Распознавание растительной клетки-реципиента.

I 1.2.2 Трансформация и ядерный транспорт Т-ДНК.

1.2.3. Биологическое значение агробактериальной трансформации.

1.3. Горизонтальный перенос генов от прокариот в эукариотические клетки, возможно, имеет эволюционное значение.

1.4. Эмбриональное развитие морских ежей.

1.4.1. Бластуляция морских ежей.

1.4.2. Процесс гаструляции.

1.4.3. Появление и развитие мезенхимного паттерна.

1.4.4. Клеточные взаимодействия, определяющие дифференцировку и развитие.

1.4.5. Молекулярная регуляция событий, происходящих на ранних эмбриональных стадиях.

1.4.6. Использование универсального активатора транскрипции дрожжей гена

§а14.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.

2.1. Животные.

2.2. Трансформация оплодотворенных яйцеклеток.

2.2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2.2. Выделение плазмиды.

2.2.3. Трансформация плазмидой, содержащей ген универсального активатора транскрипции gal4.

2.2.4. Агробакгериальная трансформация эмбрионов.

2.3. Измерение числа агробактерий в ходе совместного культивирования с эмбрионами морских ежей.

2.4. Измерение рН морской воды в ходе совместного культивирования агробакгерий и эмбрионов морских ежей.

2.5. Световая и трансмиссионная электронная микроскопия.

2.6. ДНК- и РНК-анализ.

2.6.1. ПЦР и ОТ ПЦР.

2.6.2. «TAIL» ПЦР.

2.6.3. Клонирование и секвенирование.

2.7. Выявление включения 5-бромо-2'-дезоксиуридина в эмбрионах морских ежей.

2.7. Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Жизнеспособность агробакгерий в морской воде.

3.2. Прикрепление агробакгерий к клеткам эмбрионов морских ежей.

3.3.1. Наличие и экспрессия генов rol в трансформированных эмбрионах.

3.3.2. Доказательство встройки Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей.

3.4. Появление и возможные причины формирования опухолеподобных структур (ОПС) у эмбрионов морских ежей.

3.4.1. Процент ОПС при трансформации геном gal4 и растительными онкогенами rolB и rolC.

3.4.2. Уменьшение числа ОПС при использовании конструкций, несущих мутантные гены vir.

3.4.3. Изменение рН морской воды в ходе совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей.

3.5. Строение эмбрионов с опухолеподобными структурами.

3.5.1. Внешний вид эмбрионов с опухолеподобными структурами.

3.5.2. Строение и ультраструктура эмбрионов с ОПС.

3.5.2.1 Строение и структура эмбрионов, трансформированных плазмидой рМА

3.5.2.2 Строение и структура эмбрионов с ОПС после агробактериальной трансформации.

3.5.2.3 Включение 5-бромо-2'-дезоксиуридина в эмбрионах с ОПС после агробактериальной трансформации.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Жизнеспособность и способность к трансформации А^оЬаМегшт Ште/аЫет в морской воде.

4.2. Встройка Т-ДНК агробактерий и экспрессия генов го1В и го1С при совместном культивировании с эмбрионами морских ежей.

4.3. Появление опухолеподобных структур у эмбрионов обусловлено переносом Т-ДНК агробактерий.

4.4. Возможное влияние изменения рН морской воды при совместном культивировании А. tumefaciens и эмбрионов морских ежей.

4.5. Опухолеподобные структуры эмбрионов морских ежей: строение и возможные причины возникновения в результате изменения нормального хода эмбриогенеза.

4.5.1. Внешний вид и строение опухолеподобных структур.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Агробактериальная трансформация эмбрионов морских ежей и нарушение хода эмбриогенеза при экспрессии растительных онкогенов rolB и rolC"

Актуальность

На сегодняшний день агробактериальная трансформация растений является самым изученным примером горизонтального переноса генов от бактерий к эукариотам in vivo. В ходе эволюции бактерии рода Agrobacterium (в соответствии с новой классификацией большинство видов реклассифицировано в род Rhizobium, однако большинство ученых, изучающих агробактериальную трансформацию растительных клеток, используют старое название) приспособились к переходу от сапротрофного типа питания к своеобразному паразитическому типу путем переноса в растительные клетки генов синтеза, опинов (продуктов реакции кетосахаров и аминокислот) и генов, вызывающих неопластическую трансформацию клеток растений. В результате такой трансформации у растений появляются быстро делящиеся клетки, синтезирующие опины, которые служат для агробактерий источником углерода и азота. Агробактериальная трансформация нашла широкое применение в генной инженерии растений и на сегодняшний день относится к наиболее распространенным методам генетической трансформации растений. ,

Наличие у ряда представителей некоторых групп морских беспозвоночных (кольчатые черви, моллюски, ракообразные, иглокожие) ферментов опинового синтеза позволило сделать предположение о возможном переносе генов опинсинтетаз от агробактерий к морским беспозвоночным. Долгое время вопрос о возможной агробактериальной трансформации животных клеток оставался открытым, пока в 2001 году не было показано, на культуре клеток человека HeLa, что агробактерии могут трансформировать клетки млекопитающих (Kunik et al., 2001). Несколькими годами ранее было показано, что агробактерии могут трансформировать клетки грибов (Bundock, Hooykaas, 1996; Piers et al., 1996). Необходимым условием для формирования первичных контактов при взаимодействии между агробактериями и клетками-хозяевами является наличие белка внеклеточного матрикса животных — витронектина (Wagner, Matthisse, 1992) или витронектин-подобного белка растений (Zhu et al, 1994).

На сегодняшний день известно, активация генов под контролем растительных промоторов (nos и 35S) в животных клетках возможна благодаря распознаванию их регуляторными элементами клетки-реципиента (Bailas et al., 1989; Zahm et al., 1989). Эти промоторы имеют либо вирусную природу (35S, вирус мозаики цветной капусты), либо агробактериальную (nos, бактерии рода Agrobacteriiim). Однако информации о функционировании регуляторных генов растений в клетках животных нет. Это особенно касается функционирования растительных онкогенов rol в связи с возможностью агробактериальной трансформации клеток животных.

В наших экспериментах мы показали, что в условиях морской среды in vitro может происходить агробактериальная трансформация при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с агробактериями Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter), которые несут растительные онкогены rolB' и rolC. У части эмбрионов нарушается ход эмбриогенеза с образованием опухолеподобных структур (ОПС). Такие структуры формируются на поверхности эмбрионов и получили свое название из-за внешнего вида. Подобное нарушение эмбриогенеза было описано ранее после трансформации генетическими конструкциями, несущими ген универсального активатора транскрипции gal4 (Bulgakov et al., 2002). В наших исследованиях мы изучали строение эмбрионов с опухолеподобными структурами после трансформации плазмидной ДНК, несущей ген gal4, и после агробактериальной трансформации генами rolB и rolC. Это позволило выявить различия в строении эмбрионов с опухолеподобными структурами и в строении самих ОПС, а на основании этого установить, что возникновение опухолеподобных структур является следствием действия разных механизмов.

Цели и задачи исследования

При выполнении работы мы преследовали две цели. Во-первых, изучить явление агробактериального переноса Т-ДНК (transferred DNA, переносимая одноцепочечная ДНК) в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, доказать встройку чужеродной ДНК и активность перенесенных генов rolB и rolC. Во-вторых, изучить влияние растительных онкогенов rolB и rolC на ход эмбриогенеза морских ежей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Подобрать и оптимизировать условия агробактериальной трансформации эмбрионов морских ежей в процессе их совместного культивирования со штаммами A tumefaciens GV3101, которые несут бинарный вектор: pMP90RK (vzr-хелперная плазмида) и pPCV002, содержащую в составе Т-ДНК один из генов rol (rolB или rolC). Определить возможные механизмы трансформации.

2. Оценить эффективность агробактериальной трансформации в сравнении с ПЭГ-опосредованной трансформацией плазмидными конструкциями, несущими чужеродные гены.

3. Доказать встройку Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, используя методы ПЦР и TAIL-ПЦР. Определить активность генов rolB и rolC методом обратно-транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР) после совместного культивирования эмбрионов с агробактериями.

4. Провести сравнительный морфологический анализ эмбрионов с опухолеподобными структурами, возникающими вследствие трансформации генетическими конструкциями, несущими ген gal4 и гены rolB и rolC. Определить сходство и различие в строении эмбрионов и опухолеподобных структур после трансформации.

Научная новизна и теоретическая значимость

В нашей работе впервые продемонстрирована возможность агробактериальной трансформации в условиях морской среды на примере эмбрионов морских ежей. Это является подтверждением гипотезы о переносе генов опинового синтеза от агробактерий к представителям различных групп морских беспозвоночных. Более того, нами зафиксирована встройка агробактериальной Т-ДНК в геномную ДНК морских ежей. Наряду с известным фактом трансформации клеток млекопитающих наши данные указывают на целенаправленный транспорт Т-ДНК в ядра клеток животных.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на I и IV Всероссийских симпозиумах по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2006), на международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2004), на Международной научной конференции "Инновации в науке и образовании -2006" (Калининград, 2006), на X Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС, ТИБОХ, 2006) и на годичной научной конференции Института биологии моря'имени А. В. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2006).

Материалы диссертации изложены в 3 статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и содержит 2 таблицы. Список литературы содержит 193 наименования.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Яковлев, Константин Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Впервые доказан факт агробактериальной трансформации эмбриональных клеток морских ежей в условиях морской среды. Процесс трансформации проходит в ходе совместного культивирования эмбрионов морских ежей с агробактериями и сопровождается формированием контактов между бактериями и эмбриональными клетками при помощи Т-пилей. Визуальный эффект агробактериальной трансформации выражается в появлении у части эмбрионов на поверхности опухолеподобных структур.

2. Использование агробактериальных штаммов, несущих мутантные гены по локусу vir, приводит к снижению числа ОПС у эмбрионов. Это, наравне с формированием контактов при помощи Т-пилей, является доказательством vir-опосредованного механизма переноса Т-ДНК. Помимо этого, наличие границы* между последовательностями Т-ДНК и геномной ДНК морских ежей свидетельствует о том, что трансформация идет именно за счет Т-ДНК, а не за счет других участков плазмидной или хромосомной ДНК агробактерий.

3. Впервые показано, что экспрессия генов rolB и rolC приводит к появлению ОПС у эмбрионов морских ежей. Время появления и морфология о таких эмбрионов достаточно сильно отличается от эмбрионов с ОПС, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген универсального активатора транскрипции gal4. Нарушение хода эмбриогенеза в обоих случаях связано с ненормальным и чрезмерным развитием клеток мезенхимы. Хотя, вероятно, в случае трансформации геном gal4 и генами rolB и rolC задействованы разные механизмы.

4. Растительные онкогены rolB и rolC влияют на дифференцировку эмбриональных полей. Результатом этого является нарушение хода эмбриогенеза морских ежей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлев, Константин Владимирович, Владивосток

1. Дыбан А. П. Опыты на зародышах млекопитающих // Методы биологии развития. Отв. ред. Детлаф Т. А. М. Наука. 1974. Стр. 217-246.,

2. Иванова-Казас О. М. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных: иглокожие и полухордовые. М.: Наука, 1978. 168 с.

3. Киселев К. В., Одинцова Н. А, Булгаков В. П., Кольцова Е. А., Яковлев К. В.» Клетки плоских морских ежей как возможные продуценты биологически активных веществ // Вестник ДВО РАН, 2002. Т. 5. Стр. 101-104.

4. Никольский Н. Н., Соркин А. Д. Сорокин А. Б. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука, 1987. 200 с.

5. Одинцова Н. А. Основы культивирования клеток морских беспозвоночных. Владивосток: Дальнаука, 2001. 162 с.

6. Тарчевский И. А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. 2000. Т. 47. Стр. 321-331.

7. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Мир, 1974. 325 с.

8. Akiyoshi D. E., Klee H. J., Amasino R., Nester E. W., Gordon M. P. T-DNA of Agrobacterium tumefaciens codes an enzyme of cytokinin biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984. Vol. 81. P. 5994-5998.

9. Alfano J. R., Collmer A. Bacterial pathogens in plants: life up against the wall // Plant Cell, 1996. Vol. 8. P. 1683-1698.

10. Ambros P. F., Matzke A. J. M., Matzke M. A. Localization of Agrobacterium rhizogenes T-DNA in plant chromosomes by in situ hybridization // EMBO J. 1986. Vol.5. P. 2073-2077.

11. Andersson J. O. Lateral gene transfer in eukaryotes // Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 1182-1197.

12. Andersson J. O., Doolittle W. F., Nesbo C. L. Are there bugs in our genome? Science, 2001. Vol. 292. P. 1848-1850.

13. Aoki S., Syono K. Horizontal gene transfer and mutation: Ngrol genes in the genome of Nicotiana glauca II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. Vol. 96. P. 1322913234.

14. Apella E., Weber I. T., Blast F. Structure and function of epidermal growth factorlike regions in proteins // FEBS Lett. 1988. Vol. 231. P. 1-4.

15. Averhoff B. DNA transport and natural transformation in mesophilic and thermophilic bacteria // J. Bioenerg. Biomembr. 2004. Vol. 36. P. 25-33.

16. Avilion A. A., Nicolis S. K., Pevny L. H., Perez L., Vivian N., Lovell-Badge R. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on Sox2 function // Genes Dev. 2003. Vol. 17. P. 126-140.

17. Avissar S., Schreiber G., Danon A., Belmaker R. H. Lithium inhibits adrenergic and cholinergic increases in GTP binding in rat cortex // Nature, 1988. Vol. 331. P. 440-442.

18. Ballas N., Brodo S., Soreg H., Loyer A. Efficient functioning of plant promoters and poly(A) sites vaXenopus oocytes // Nucleic Acid. Res. 1989. Vol. 17. P. 78917903.

19. Ballas N., Citovsky V. Nuclear localization signal binding protein from Arabidopsis mediates nuclear import of Agrobacterium VirD2 protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997. Vol. 94. P. 10723-10728.

20. Bauer B., Moese S., Bartfeld S., Meyer T. F., Selbach M. Analysis of cell type-specific responses mediated by the type IV secretion system of Helicobacter pylori II Infect. Immun. 2005. Vol. 73. P. 4643-4652.

21. Benink H., Wray G., Hardin J. Archenteron precursor cells can organize secondary axial structures in the sea urchin embryo // Development, 1997. Vol. 124. P. 3461-3470.

22. Benson S., Rawson R., Killian C., Wilt F. The role of the extracellular matrix and tissue specific gene expression in the sea urchin // Mol. Reprod. Dev. 1991. Vol. 29. P. 220-226.

23. Bent A. F. Plant disease resistance genes: function meets structure // Plant Cell,1996. Vol. 8. P. 1757-1771.

24. Bidlack J. E., and Silverman P. M. An active type IV secretion system encoded by the F plasmid sensitizes Escherichia coli to bile salts // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 5202-5209.

25. Bisgrove B. W., Andrews M. E, Raff R. A. Fibropellins, products of an EGF repeat-containing gene, form a unique extracellular matrix structure that surrounds the sea urchin embryo // Dev. Biol. 1991. Vol. 146. P. 89-99.

26. Bitter W., Koser M., Latijnhouwers M., de Cock., Tommassen J. Formation of oligomeric rings by XcpQ and PilQ, which are involved in protein transport across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. 1998. Vol. 27. P. 209-219.

27. Bulgakov V. P., Kiselev K. V., Yakovlev K. V., Zhuravlev Y. N., Gontcharov A. A., Odintsova N. A. Agrobacterium-mQdiated transformation of sea urchin embryos // Biotechnology J1 2006. Vol. 1. P. 454-461.

28. Bulgakov V., Odintsova N., Plotnikov S., Kiselev K., Zacharov E., Zhuravlev Yu. GAL4 gene-dependent alterations of embryo development and cell growth in a primary culture of the sea urchins // Marine Biotech. 2002. Vol. 4. P. 480-486.

29. Bundock P., Hooykaas P. Integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA in the Saccharomyces cerevisiae genome by illegitimate recombination I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. Vol. 93. P. 15272-15275.

30. Butler E., Hardin J., Benson S. The role of lysyl oxidase and collagen cross-linking during sea urchin development // Exp. Cell Res. 1987. Vol. 173. P. 174-182.

31. Calestani C., Rast J. P., Davidson E. H. Isolation of pigment cell specific genes in the sea urchin embryo by differential macroarray screening // Development, 2003. Vol: 130. P. 4587-4596.

32. Cameron E. R., Neil J. C. The Runx genes: lineage-specific oncogenes and tumor suppressors // Oncogene, 2004. Vol. 23. P. 4308-4314.

33. Caplan A., Herrera-Estrella L., Inza D., Van Hauter E., Van Montagu M., Schell J:, Zambryski P. Introduction of genetic material into plant cells // Science, 1984. Vol. 222. P. 815-821.

34. Cecchetti V., Altamura M. M, Serino G., Pomponi M., Falasca G., Costantino P., Cardarelli M. ROX1, a gene induced by rolB, is involved in procambial cell proliferation and xylem differentiation in tobacco stamen // Plant J. 2007. V. 49. P. 27-37.

35. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell, 2003. Vol. 113. P. 643-655.

36. Christie P. J. Bacterial type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems // Biochem. Biophys. Acta, 2004. Vol. 1694. P. 219-234.

37. Christie P. J., and Vogel J. P. Bacterial type IV secretion: conjugation systems adapted to deliver effector molecules to host cells // Trends Microbiol. 2000. Vol. 8. P. 354-360.

38. Christie P. J., Atmakuri K., Krishnamoorthy V., Jakubowski S., Cascales E. Biogenesis, architecture, and function of bacterial type IV secretion systems // An. Rev. Microbiol. 2005. Vol. 59. P. 451-485.

39. Christie P. J., Ward J. E., Winans S. C., Nester E. W. The Agrobacterium tumefaciens virE2 gene product is a single-stranded-DNA-binding protein that associates with T-DNA//J. Bacterid. 1988. Vol. 170. P. 2659-2667.

40. Citovsky V., Kozlovsky S. V., Lacroix B., Zaltsman A., Daftiy-Yelin M., Vyas S., Tovkach A., Tzfira T. Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium infection // Cell. Microbiol. 2007. Vol. 9. P. 9-20.

41. Citovsky V., Zupan J., Warnick D., Zambryski P. Nuclear localization of Agrobacterium VirE2 protein in plant cells // Science, 1992. Vol. 256. P. 18031805.

42. Coffman J. A. Runx transcription factors and the developmental balance between cell proliferation and differentiation // Cell Biol. Int. 2003. Vol. 27. P. 315-324.

43. Coffman J. A., Dickey-Sims C., Haug J. S., McCarthy J. J., Robertson A. J. Evaluation of developmental phenotypes produced by morpholino antisense targeting of a sea urchin Runx gene // BMC Biology, 2004. 2: 6.

44. Conway G., Margoliath A., Wong-Madden Sh., Roberts R., Gilbert W. Jakl kinase is required for cell migrations and anterior specification in zebrafish embryos // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997. Vol. 94. P. 3082-3087.

45. Dasgupta J., Garbers D. Tyrosine protein kinase activity during embryogenesis // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. P. 6174-6178.

46. Davidson E. A view from the genome: spatial control of transcription in sea urchin development//Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. Vol. 9. P. 530-541.

47. Davidson E., Cameron R., Ransick A. Specification of cell fate in the sea urchin embryo: summary and some proposed mechanisms // Development, 1998. Vol. 125. P. 3269-3290.

48. Delepalaire P., Wandersman S. Protein export and secretion in gram-negative bacteria // Microbial transport systems / Ed: Winkelmann G. Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2001. P. 165-208.

49. Dickey-Sims C., Robertson A. J., Rupp D. E., McCarthy J. J., Coffman J. A. Runx-dependent expression of PKC is critical for cell survival in the sea urchin embryo // BMC Biology, 2005. 3:18.

50. Dixon D. R. Methods for assessing the effects of chemicals on reproductive function in marine mollusks // Methods for assessing the effects of chemicals on reproductive functions / Ed.: Vouk V. B., Sheehan P. J. N. Y., 1983. P. 439-457.

51. Doolittle W. F. You are what you eat: a gene transfer ratchet could account for bacterial genes in eukaryotic nuclear genomes // Trends Genet. 1998. Vol. 14. P. 307-311.

52. Doolittle W. F., Boucher Y., Nesbo C. L., Douady C. J., Andersson J. O. Roger A. Ji How big is the iceberg of which organellar genes in nuclear genomes are but the tip? Philos Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2003. Vol. 358. P. 39-58.

53. Drummond A. H. Lithium affects G-protein receptor coupling // Nature, 1988. Vol. 331. P. 338.

54. Engel J. FGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized signals for growth and differentiation? FEBS Lett. 1989. Vol. 251. P. 1-7.

55. Estruch J., Schell J., Spena A. The protein encoded by the rolB plant oncogene hydrolyses indole glucosides // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 3125-3128.

56. Ettensohn C. A., Ingersoll E. P. Morphogenesis of the sea urchin embryo // Morphogenesis: an analysis of the development of biological form / Marcel Dekker, Inc. New York, 1992. P. 189-262.

57. Ettensohn C. A., McClay D. R. Cell lineage conversion in the sea urchin embryo // Dev. Biol. 1988. Vol. 125. P. 396^109.

58. Ettensohn C., Malinda K. Size regulation and morphogenesis: a cellular analysis of skeletogenesis in the sea urchin embryo // Development, 1993. Vol. 119. Pi 155167.

59. Ettensohn C., Ruffms S. Mesodermal cell interactions in the sea urchin embryo: properties of skeletogenic secondary mesenchyme cells // Development, 1993. Vol. 117. P. 1275-1285.

60. Figge R. M., Schubert M., Brinkmann H., Cerff R. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene diversity in eubacteria and eukaryotes: evidence for intra-and inter-kingdom gene transfer // Mol. Biol. Evol. 1999. Vol. 16. P. 429^140.

61. Filippini F., Rossi V., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P. M., Lo Schiavo F., Terzi M. A plant oncogene as a phosphatase // Nature, 1996. Vol. 379. P. 499-500.

62. Fink R. D., McClay D. R. Three cell recognition changes accompany the ingression of sea urchin primary mesenchyme cells // Dev. Biol. 1985. Vol. 107. P. 66-74.

63. Fischer J. A., Giniger E., Maniatis T., Ptashne M. GAL4 activates transcription in Drosophila //Nature, 1988. Vol. 332. P. 853-856.

64. Genereux D. P., Logsdon J. M. Jr. Much ado about bacteria-to-vertebrate lateral gene transfer// Trends Genet. 2003. Vol. 19. P. 191-195.

65. Gentschev I., Dietrich G., Goebel W. The E. coli a-hemolysin secretion system and its use in vaccine development // Trends Microbiol. 2002. Vol. 10. P. 39-45.

66. Giniger E., Varnum S. M., Ptashne M. Specific DNA binding of GAL4, a positive regulatory protein of yeast // Cell, 1985. Vol. 40. P. 767-774.

67. Godin R. E., Urry L. A., Ernst S. G. Alternative splicing of the Endol6 transcript produces differentially expressed mRNAs during sea urchin gastrulation // Dev. Biol. 1996. Vol. 179. P. 148-159.

68. Gogarten J. P. Gene transfer: gene swapping craze reaches eukaryotes // Curr. Biol. 2003. Vol. 13. P. R53-R54.

69. Grohmann E., Muth G., Espinosa M. Conjugative plasmid transfer in Gram-positive bacteria//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 277-301.

70. Guralnick B., Thomsen G., Citovsky V. Transport of DNA into the nuclei of Xenopus oocytes by a modified VirE2 protein of Agrobacterium II Plant Cell, 1996. Vol. 8. P. 363-373.

71. Gustafson T., Wolpert L. The cellular basis of morphogenesis and sea urchin development//Intern. Rev. Cytol. 1963. Vol. 15. P. 139-214.

72. Hardin J. The cellular basis of sea urchin gastrulation // Curr. Topics Dev. Biol. 1996. Vol. 33. P. 159-262.

73. Harris R. L., Hombs V., Silverman P. M. Evidence that F-plasmid proteins TraV, TraK and TraB assemble into an envelope-spanning structure in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 42. P. 757-766.

74. Heifitz A., Lennarz W. J. Biosyntheis of N-glycosidically linked glycoproteins during gastrulation of sea urchin embryos // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 61106127.

75. Heldin C-H., Westermark B. Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor//Physiol. Rev. 1999. Vol. 79. P. 1283-1316.

76. Heifer A., Pien S., Otten L. Functional diversity and mutational analysis of Agrobacterium 6B oncoproteins // Mol. Genet. Genomics, 2002. Vol. 267. P. 577-586.

77. Henderson I. R., Navarro-Garcia F., Desvaux M., Fernandez R. C., Ala'Aldeen D. Type V protein secretion pathway: the autotransporter story // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. Vol. 68. P. 692-744.

78. Henry T., Gorvel J. P., Meresse S. Molecular motors hijacking by intracellular pathogens // Cell. Microbiol. 2006. Vol. 8. P. 23-32.

79. Hoch R. V., Soriano P. Roles of PDGF in animal development // Development, 2003. Vol. 130. P. 4769-4784.

80. Hochachka P. The nature of evolution and adaptation: resolving the unity diversity paradox//Can. J. Zool. 1988. Vol. 66. P. 1146-1152.

81. Hodor P., Ettensohn C. The dynamics and regulation of mesenchymal'cell fusion in the sea urchin embryo // Dev. Biol. 1998: Vol. 199. P. 111-124.

82. Holefors A., Xue Z.-T., Welander M. Transformation of the apple rootstock M26 with the rolA gene and its influence on growth // Plant Sci. 1998. Vol. 136.,P. 69-78.

83. Howard E., Zupan J., Citovsky V., Zambryski P.C. The VirD2 protein of A. tumefaciens contains a C-terminal bipartite nuclear localization signal: implications for nuclear uptake of DNA in plant cells // Cell, 1992. Vol'. 68P. 109-118.

84. Hursh D. A., Andrews M. E., Raff R. A. A- sea urchin gene encoded a polypeptide homologous to epidermal growth factor // Science, 1987. Vol. 237. P. 14871490.

85. Jain R., Rivera M.C, Lake J.A. Horizontal gene transfer among genomes: the complexity hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. Vol. 96. P. 38013806.

86. Jain R., Rivera M.C, Moore J.E., Lake J.A. Horizontal gene transfer accelerates genome innovation and evolution // Mol. Biol. Evol. 2003. Vol. 20. P. 15981602.

87. Johnson L. R, Johnson T. K., Desler M., Luster T. A., Nowling T., Lewis R. E., Rizzino A. Effects of B-Myb on gene transcription: phosphorylation-dependent activity and acetylation by p300 // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 4088-4097.

88. Johnson L. R., Lamb K. A., Gao Q., Nowling T. K., Rizzino A. Role of thetranscription factor Sox-2 in the expression of the FGF-4 gene in embryonal carcinoma cells // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 50. P. 377-386.

89. Jones A. L., Shirasu K., Kado C. I, The product of the virB4 gene of Agrobacterium tumefaciens promotes accumulation of VirB3 protein I I J. Bacteriol. 1994. Vol. 176. P. 5255-5261.

90. Kado C. I. Promiscuous Agrobacterium DNA transfer system: potential role of the virB operon in sex pilus assembly and synthesis. I I Mol. Microbiol. 1994. Vol. 12. P. 17-22.

91. Kathir P., Ippen-Ihler K. Construction and characterization of derivatives carrying insertion mutations in F plasmid transfer region genes, trbA, traA, traQ, and trbB II Plasmid, 1991. Vol. 26. P. 40-54.

92. Katow H., Aizu G. Essential role of growth factor receptor-mediated signal transduction through the mitogen-activated protein kinase pathway in early embryogenesis of the echinoderm // Develop. Growth Differ. 2002. Vol. 44. P. 437-455.

93. Keeling P. A brief history of plastids and their hosts // Protist, 2004. Vol: 155. P. 3-7.

94. Kidwell M. G. Lateral transfer in natural populations of eukaryotes // Annu. Rev. Genet. 1993. Vol. 27. P. 235-256.

95. Kiselev K. V., Dubrovina A. S., Veselova M. V., Bulgakov V. P., Fedoreyev S. A., Zhuravlev Y. N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J1. Biotechnol. 2007. Vol. 128 P. 681-692.

96. Kiselev K. V., Kusaykin M. I., Dubrovina A. S., Bezverbny D. A., Zvyagintseva T. N., Bulgakov V. P. The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related b-l,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry, 2006. Vol. 67. P. 2225-2231.

97. Koltsova E., Boguslavskaya L., Maximov O. On the functions of quinonoid pigments in sea urchin embryos // Int. J. Invertebr. Reprod. 1981. Vol. 4. P. 17-23.

98. Kominami T. Establishment of pigment cell lineage in embryos of sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus II Develop. Growth. Differ. 2000. Vol. 42. P. 4151.

99. Kominami T., Takata H. Process of pigment cell specification in the sand dollar, Scaphechinus mirabilis I I Develop. Growth. Differ. 2002. Vol. 44. P. 113-125.

100. Koncz C., Kreuzaler F., Kalmen Z. S., Schell J. A simple method to transfer, integrate and study expression of foreign genes, such as chicken ovalbumin and alpha-actin in plant tumors // EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 1023-1037.

101. Ma J., Przibilla E., Hu J., Bogorad L., Ptashne M. Yeast activators stimulate plant gene expression // Nature, 1988. Vol. 334. P. 631-633.

102. Maneewannakul K., Maneewannakul S., Ippen-Ihler K. Synthesis of F pilin // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175. P. 1384-1391.

103. Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular Cloning, A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1982.

104. Masui M, Kominami T. Change in the adhesive properties of blastomeres during early cleavage stages in sea urchin-embryo // Develop. Growth. Differ. 2001. Vol. 43. P. 43-53.

105. McCoon P. E., Angerer R. C., Angerer L. M. SpFGFR, a new member of the fibroblast growth factor receptor family, is developmentally regulated during early sea urchin development // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 20119-20125.

106. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell, 2003. Vol. 113. P. 631-642.

107. Nester E. W., Kosuge T. Plasmids specifying plant hyperplasias // Annu. Rev. Microbiol. 1981. Vol. 35 P. 531-565.

108. Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4 // Cell, 1998. Vol. 95. P. 379-391.

109. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells // Nat. Genet. 2000. Vol. 24. P. 372-376.

110. Ochman H, Lawrence J.G., Groisman E.A: Lateral gene transfer and the nature of-bacterial innovation //Nature, 2000. Vol. 405. P. 299-304.

111. Pagano G., Cipollaro M., Corsale G., Esposito A., Ragucci E., Giordano G.G. pH-induced changes in mitotic and developmental patterns in sea urchin embryogenesis. I. Exposure of embryos // Teratog. Carcinog. Mutagen. 1985. Vol. 5. P. 101-112.

112. Peix A., Rivas R., Trujillo M. E., Vancanneyt M., Velazquez E., Willems A. Reclassification of Agrobacterium ferrugineum LMG 128 as Hoeflea marina gen. nov., sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. Vol. 55. P: 1163-1166.

113. Peters N. K., Verma D. P. S. Phenolic compounds as regulators of gene expression in plant-microbe interactions // Mol. Plant-Microbe Interact. 1990. Vol. 3. P. 4-8.

114. Piers K., Heath J., Liang X., Stephens K., Nester E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996. Vol. 93. P. 1613-1618.

115. Ptashne M., Gann A. Activators and targets // Nature, 1990. Vol. 346. P. 329-331.

116. Qian Q., Keeling P. J. Diplonemid glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and prokaryote-to-eukaryote lateral gene transfer // Protist, 2001. Vol. 152. P. 193-201.

117. Ransick A., Davidson E. A complete second gut induced by transplantedmicromeresin the sea urchin embryo // Science, 1993. Vol. 259. P. 1134-1138.

118. Salman H., Abu-Arish A., Oliel S., Loyter A., Klafter J., Granek R., Elbaum M. Nuclear localization signal peptides induce molecular delivery along microtubules // Biophys. J.' 2005. Vol. 89. P. 2134-2145.

119. Schildiner M., Benvenisty N. Factors controlling human embryonic stem cell differentiation // Differentiation of embryonic stem cells / Methods in Enzymology. Vol. 365. Ed: Wassarman P. M., Keller G. M. Elsevier Inc. 2003. P. 446-461.

120. Schmulling T., Schell J., Spena A. Single genes from1 Agrobacterium rhizogenes influence plant development // EMBO J. 1988. Vol. 7. P. 2621-2629.

121. Schrammeijer B., Beijersbergen A., Idler K. B., Melchers L. S., Thompson D. V., Hooykas P. J. J. Sequence analysis of the vzV-region from Agrobacerium tumefaciens II J. Exp. Botany, 2000. Vol.51. P. 1167-1169.

122. Segal G, Feldman M, Zusman T. The Icm/Dot type-IV secretion systems of Legionella pneumophila and Coxiella burnetii II FEMS Microbiol. Rev. 2005. Vol. 29. P.65-81.

123. Shaw C. H., Leemans J., Shaw C. H., Van Montagu M., Schell J. A general method for the transfer of cloned genes to plant cells // Gene, 1983. Vol. 23. P. 815-830.

124. Sheng J., Citovsky V. Agrobacterium-$3X& cell DNA transport: have virulence proteins, will travel // Plant Cell, 1996. Vol. 8. P. 1699-1710.

125. Shook D., Keller R. Mechanisms, mechanics and function of epithelial-mesenchymal transitions in early development // Mech. Dev. 2003. Vol. 120: P. 1351-1383.

126. Soltysik-Espanola M., Klinzing D. C., Pfarr K., Burke R. D., Ersnt S. G. Endol6, a large multidomain protein found on the surface and ECM of endodermal cells during sea urchin gastrulation, bind calcium // Dev. Biol; 1994'. Vol. 165. P. 7385.

127. Spena A., Langenkemper K. Mutational analysis of the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes in tobacco: function of the rolA pre-mRNA intron and RolA proteins defective in their biological activity // Genet. Res. 1997. Vol. 69. P. 11-15.

128. Stachel S. E., Messens E., Van Montagu M., Zambryski P. Identification of the signals molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens II Nature, 1985. Vol. 318. P. 624-629.

129. Stachel S; E., NesterE. W. The genetic and transcriptional, organization of the viri'region of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens II EMBO J. 1986. Voh 5. P. 1445-1454.

130. Stanhope M. J:, Lupas A., Italia M. J., Koretke K. K., Volker C., Brown J. R. Phylogenetic analyses do not support horizontal gene transfers from bacteria to vertebrates //Nature, 2001. Vol. 411. P. 940-944.

131. Steele R. E., Hampson S. E., Stover N. A., Kibler D. F., Bode H. R. Probable horizontal transfer of a gene between a protist and a cnidarian // Curr. Biol. 2004. Vol. 14. P. R298-R299.

132. Sun X., Meyers E. N., Lewandoski M., Martin G. R. Targeted disruption of FGF8 causes failure of cell migration in the gastrulating mouse embryo // Genes Dev. 1999. Vol. 13. P. 1834-1846.

133. Suyemitsu T, Asami-Yoshizumi T, Noguchi S, Tonegawa Y, Ishihara K. The exogastrula-inducing peptides in embryos of the sea urchin, Anthocidariscrassispina isolation and determination of the primary structure // CellDiffer. Dev. 1989. Vol. 26. P. 53-66.

134. Tam R., Saier M. H. Structural, functional, and evolutionary relationships amongtextracellular solute-binding receptors of bacteria // Microbiol. Rev. 1*993. Vol. 57. P, 30-346.i i

135. Tamura, M., Nogimori K., Murai S., Yajima M., Ito K., Katada T., Ui M., Ishii S. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis.toxin, in conformity with the A-B model // Biochemistry, 1982. Vol. 21. P. 5516-5522.

136. Taylor L., Marshak D., Landreth G. Identification of a nerve growth factor- and epidermal growth factor-regulated protein kinase that phosphorylates the protooncogene product c-Fos // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. Vol. 90. P. 368-372.

137. Tepfer D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype // Cell, 1984. Vol. 34. P. 959-967.

138. The International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome //Nature, 2001. Vol. 409. P. 860-921.

139. Tzfira T., Vaidya M.*, Citovsky V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity //EMBO J. 2001. Vol. 20. P. 3596-3607.

140. Veluthambi K., Krishnan M., Gould J. H., Smith R. H., Gelvin S. B. Opines stimulate induction of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid I I J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. P. 3696-3703.

141. Voronina E., Wessel G. Apoptosis in sea urchin oocytes, eggs, and early embryos // Mol. Reprod. Dev. 2001. Vol. 60. P. 553-561.

142. Wagner V. T., Matthysse A. G. Involvement of vitronectin-like protein in attachment of Agrobacterium tumefaciens to carrot suspension culture cells I I J.'Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 5999-6003.

143. Ward E., Barnes W. Marine molluscan genomes contain sequences homologous to the octopine synthase gene of Agrobacterium tumefaciens II Biol. Bull. 1984. Vol. 165. P. 498.

144. Wessel G. M., McClay D. R. Gastrulation in the sea urchin embryo requires the deposition of collagen in the extracellular matrix // Dev. Biol. 1987. Vol. 121. P. 149-165.

145. Wessel G. M., Wikramanayake A. How to grow a gut: ontogeny of the endoderm in the sea urchin embryo // BioEssays, 1999. Vol. 21. P. 459-471.

146. White F. F., Nester E. W. Hairy root: plasmid encodes virulence traits in Agrobacterium rhizogenes 11 J. Bacteriol. 1980. Vol. 141. P. 1134-1141.

147. White F., Taylor B. H., Huffman G. A., Gordon M. P., Nester E. W. Molecular and genetic analysis of the transferred DNA regions of the root-inducting plasmid of Agrobacterium rhizogenes II J. Bacteriol. 1985. Vol.164. P. 33-44.

148. Winans S. C., Mantis N. J., Chen C. Y., Chang C. H., Han D. C. Host recognition by the VirA, VirG two-component regulatory proteins of Agrobacterium tumefaciens //Res. Microbiol. 1994. Vol.145. P. 461-473.

149. Xiao L, Yuan X, Sharkis S. J. Activin A maintains self-renewal and. regulates fibroblast growth factor, Wnt, and bone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells // Stem Cells, 2006. Vol. 24. P. 1476-1486.

150. Yamasu K., Suzuki G., Horii K., Suyemitsu T. Transcriptional regulation of the gene for epidermal growth factor-like peptides in sea urchin embryos // Int. J. Dev. Biol. 2000. Vol. 44. P. 777-784.

151. Yang Q., Angerer L. M. Angerer R. C. Unusual pattern of accumulation of mRNA encoding EGF-related protein in sea urchin embryos // Science, 1989. Vol. 246. P. 806-808.

152. Yuh C.-H., Davidson E. H. Modular cis-regulatory organization of Endolô, a gut-specific gene of the sea urchin embryo // Development, 1996. Vol. 122. P. 10691082.

153. Zahm P., Rhim S. L., Geider K. Promoter activity and expression of sequences from Ti-plasmid stably maintained in mammalian cells // Mol. Cell. Biochem. 1989. Vol. 90. P. 9-18.

154. Zhao, Z. M., Sagulenko E., Ding Z. Y., Christie P. J. Activities of virEl and the VirEl secretion chaperone in export of the multifunctional VirE2 effector via an Agrobacterium type IV secretion pathway. // J. Bacteriol. 2001. Vol. 183. P. 3855-3865.

155. Zhu J.-K., Damsz B., Kononowicz A. K., Bressan R. A., Hasegawa P. M. A higher plant extracellular vitronectin-like adhesion protein is related to the translational Elongation Factor-I a // Plant Cell, 1994. Vol. 6. P. 393-404.

156. Zhu Y., Nam J., Carpita N. C., Matthysse A. G., Gelvin S. B. Agrobacterium-mediated root transformation is inhibited by mutation of an Arabidopsis cellulose synthase-like gene // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 1000-1010.

157. Ziemienowicz A., Gorlich D., Lanka E., Hohn B., Rossi L. Import of DNA into mammalian nuclei by proteins originating from a plant pathogenic bacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. Vol. 96. P. 3729-3733.

Информация о работе

Яковлев, Константин Владимирович
кандидата биологических наук
Владивосток, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Агробактериальная трансформация эмбрионов морских ежей и нарушение хода эмбриогенеза при экспрессии растительных онкогенов rolB и rolC - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы