Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние генов rol агробактерий на процессы роста и вторичного метаболизма в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние генов rol агробактерий на процессы роста и вторичного метаболизма в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia"

На правах рукописи

ШКРЫЛЬ ЮРИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ГЕНОВ ROL АГРОБАКТЕРИЙ НА ПРОЦЕССЫ РОСТА И ВТОРИЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА В КУЛЬТУРАХ ТРАНСГЕННЫХ КЛЕТОК RUBIA CORDIFOLIA

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2006

Работа выполнена в отделе биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук,

ст.н.с.

Булгаков

Виктор Павлович

доктор биологических наук,

профессор

Хотимченко

Юрий Степанович

кандидат биологических наук,

ст.н.с.

Аминин

Дмитрий Львович

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится « 28 » февраля 2006 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета К 005.003.01 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159. факс: (4232) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан «%0у> 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Музарок Т. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Культивируемые клетки растений являются основой для биотехнологического получения биологически активных веществ. Создание активных и стабильных штаммов-продуцентов является фундаментальной задачей для этой отрасли в целом.

Недавно установлена особенность трансформированных генами rol культур растительных клеток - способность к увеличенному синтезу вторичных метаболитов. Первичные мишени генов rol пока не найдены, а механизм активации синтеза вторичных метаболитов в трансформированных культурах не изучен. Понимание этого механизма дает возможность расширить знания об общих принципах регуляции синтеза вторичных метаболитов в растительных клетках.

В работе исследовали механизм активации генами rol синтеза антрахинонов, вторичных метаболитов шикиматного биосинтетического пути. В качестве модельного объекта использовали нетрансформированные (контрольные) и трансформированные генами rolB и rolC клеточные культуры лекарственного растения Rubia cordifolia L. (марена сердцелистная).

Эта работа является одной из немногих, выполняемых в настоящее время в мире, когда для увеличения биосинтеза вторичных метаболитов используют регуляторные гены, а не гены, кодирующие отдельные ферменты вторичного метаболизма. Впервые показано существование механизма воздействия на синтез вторичных метаболитов, осуществляемого путем регуляции экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение механизма активации синтеза антрахинонов в трансформированных генами rolC и rolB культурах марены сердцелистной.

рос национал* ■ \>

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Получить трансгенные каллусные культуры марены, стабильно экспрессируюшие гены rolB и rolC.

2. Провести сравнительное изучение ростовых и биосинтетических характеристик трансгенных культур в сравнении с контрольными.

3. Изучить экспрессию гена изохоризматотнтазы в трансгенных культурах марены.

4. Изучить участие важнейших известных сигнальных путей в rolB и го/С-опосредованных реакциях. Определить "точку приложения" трансгенов.

Научная новизна. Впервые установлено, что гены rol способны значительно увеличивать накопление антрахинонов в трансгенных культурах растений. Показано, что активаторная способность гена rolB bbil.ie, чем гена rolC. Оба гена увеличивают синтез антрахинонов путем активации экспрессии ключевого гена их биосинтеза -изохоризматсинтазы (ICS).

Установлено, что активаторный сигнал генов rol не связан с активацией октадеканоидного и NADPH-оксидазного сигнальных путей. Показано, что процессы фосфорилирозания играют важную роль в опосредованной генами rol активации биосинтеза вторичных метаболитов. Установлено, что ингибитор тирозинфосфатаз подавляет эффекты гена rolB.

Впервые показана связь между функцией генов rol и сигнальной системой кальция. Установлено, что в трансгенных культурах изменена экспрессия генов важных сигнальных молекул растительной клетки - кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK

Практическая значимость. Максимальная продуктивность культур составила 9,17 % суммы антрахинонов от сухой массы клеток, что в 10 раз превышает их содержание в нетрансгенных каллусах и в 45 раз в корнях марены сердцелистной.

Поскольку антрахиноны марены сердцелистной не обладают мутагенным действием, препараты на их основе могут стать

конкурентоспособными на рынке препаратов, обладающих способностью растворять и удалять камни из почек при почечнокаменной болезни.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Трансформация агробактериальными генами rolB и rolC представляет собой новый способ в биотехнологии, позволяющий увеличить биосинтетическую активность культивируемых клеток растений. На примере марены сердцелистной показано многократное увеличение содержания антрахинонов, составившее 9,17 % от сухого веса клеток, что в 45 раз выше, чем в корнях дикорастущих растений.

2. Реакции, вызванные экспрессией генов rol в клетках, не связаны с активацией NADPH-оксидазного, октадеканоидного, этилен-зависимого и салицилатного сигнальных путей, а модулируют сигнальную систему кальция.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2000, 2001, 2003), на международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001), на 7-ой Пущинской школе-коференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003), на 7-ой региональной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы химии и биологии" (Владивосток, 2003), на Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Саратов, 2004), на региональной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 92 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 150 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве эксплантов для получения клеточных культур использовали черешки листа стерильных микрорастений марены сердиелистной (Rubia cordifolia L.). Обычная (нетрансформированная) культура RK использовалась в качестве контроля. Трансгенные культуры были получены методом агробактериальной трансформации с использованием вектора Agrobacterium tumefaciens GV3101, несущего бинарную векторную систему, состоящую из двух плазмид: pMP90RK (v/V-хелперная плазмида) и pPCV002 - плазмида, содержащая в составе Т-ДНК один из генов rol и маркерный ген nptll, кодирующий неомицин-фосфотрансферазу (рис 1).

Культуры выращивали на питательной сред«; Wb/a (Bulgakov et al.,

1998), содержащей ростовые факторы 6-бензиламинопурин и а-нафтилуксусную кислоту. ДНК из культур марены выделяли методом СТАВ (Дрейпер, 1991).

Рис. 1. Физические карты плазмид компонентов бинарных векторов, используемых в работе

А -вектор, несущий ген го/С; Б - вектор, несущий ген rolB

Для выделения РНК использовали метод, разработанный для растений с высоким содержанием вторичных метаболитов (Bekesiova,

1999). Обратную транскрипцию (ОТ) проводили на основе набора фирмы Силекс М (Москва, Россия).

Праймеры к гену актина R. cordifolia были разработаны на основе секвенированного нами участка, включающего интрон. Праймеры фланкировали фрагменты 414 и 323 п.н. Праймеры к гену rolB фланкировали фрагмент 794 пар нуклеотидов, а к гену rolC - фрагмент

размером 393 н.п. Праймеры подобраны на основе известной последовательности генов rol.

Для сравнения уровня экспрессии генов CDPK и ICS использовали метод полуколичественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на нормализованных матрицах кДНК культур марены. Для нормализации кДНК использовали уровень экспрессии гена актина марены. Праймеры к гену CDPK фланкировали продукт 390 п.н., а к гену ICS -700 п.н.

Продукты ПЦР генов CDPK и ICS были клонированы в вектор pTZ57R/T согласно рекомендации фирмы-производителя (FERMENTAS, Vilnius, Lithuania). Далее продукты были секвенированы с праймерами М13 при помощи набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perking-Elmer Biosystems, Forster City, CA) согласно рекомендации фирмы-производителя. После осаждения этанолом последовательность была определена на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Perking-Elmer Biosystems).

Определение содержания антрахинонов проводили совместно с лабораторией химии природных хиноидных соединений ТИБОХ ДВО РАН спектрофотометрическим методом (Mischenko et al., 1999).

Измерение концентрации внутриклеточного кальция проводили методом лазерной флуоресцентной микроскопии с использованием зонда FURA-2AM в лаборатории биоиспытаний ТИБОХ ДВО РАН. Система состояла из инвертированного микроскопа "Axiovert 200М" (Zeiss, Германия) и монохроматора "Optoscan" (Cairn Research Ltd, Англия). Токи кальция в цитоплазме клеток индуцировали введением перекиси водорода в концентрации 1мМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика клеточных культур марены сердцелистной

Нетрансформированные (контрольные) культуры марены RK имеют рыхлую консистенцию и за счет присутствия антрахинонов

окрашены в желтый цвет. Трансформированные культуры RC и RB имеют более глубокую оранжевую или красно-оранжевую окраску.

Встройка генов rolC и rolB в культурах марены RC и RB была доказана ПЦР со специфическими прайме рами. Для детекции экспрессии генов rol в трансгенных культурах был использован метод обратной транскрипции. Для подтверждения нативности кДНК, вначале ее проверили на наличие сигналов к конститутивному гену актина арабидопсиса. Мы получили сигналы на матрицах ДНК и кДНК. Причем, фрагменты кДНК были примерно на 100 п.н. меньше фрагментов, полученных при амплификации с ДНК (рис. 2 А). Мы секвенировали полученные сигналы. Выпавший участок в 91 п.н. оказался интроном. Это позволило убедиться в отсутствии контаминации ДНК в РНК. Используя матрицы кДНК из контрольной и трансгенных культур, мы провели ОТ-ПЦР и показали наличие экспоессии генов rol в трансгенных культурах (рис. 2 Б).

Рис. 2. Экспрессия генов го1В (1) и го1С (2) в трансгенных культурах марены; А - ПЦР гена актина, Б - ПЦР генов го1В и го1С; М

- маркер молекулярных весов, 1ЧС - негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой ДНК), РС - позитивный контроль (плазмида РСУ002-го!АВС), ЛК - контрольная культура, ЯС

- го/С культура, КВ - го1В культура, ДНК - образец ДНК из культуры марены

Химический анализ показал, что все культуры продуцируют два основных антрахинона, муньистин и пурпурин, составляющие в сумме 90 % от всех антрахинонов. Содержание антрахинонов в каллусах RK составляет 0,6-1,2 % от сухого веса ткани, а в RC и RB культурах - 3,6 и 5,2 % от сухого веса, соответственно (рис. 3). Важно отметить, что антрахиноны, продуцируемые клеточными культурами R. cordifolia (муньистин и пурпурин) не обладают мутагенным действием (Kawasaki et al., 1992).

Рис. 3. Содержание антрахинонов (% от сухого веса) в клеточных культурах R. cordifolia Представлены средние значения из 10 определений, проведенных с интервалом 1 мес

Регуляция биосинтеза антрахинонов в трансгенных культурах

Изохоризматсинтаза (ICS) - это фермент, который превращает хоризмат в изохоризмат и, таким образом, направляет метаболиты шикимовой кислоты в биосинтез антрахинонов (Tegelen et al., 1999). Увеличение накопления антрахинонов в трансгенных культурах марены могло быть связано как с активацией экспрессии ICS, так и с увеличением активности фермента, а так же с ингибированием разрушения антрахинонов. Поэтому исследовали, связано ли увеличенное содержание антрахинонов в трансгенных культурах марены с активацией экспрессии ICS.

ОТ-ПЦР анализ показал, что в го/-культурах экспрессия гена ICS увеличена по сравнению с контролем (рис. 4). Уровень экспрессии ICS в культуре rolB выше, чем в rolC. Эти данные указывают на корреляцию уровня экспрессии ICS с содержанием антрахинонов в культурах марены (рис. 3). Таким образом, можно заключить, что

i.

6

Ч 2

Л I J •

¡пурпурин \иуньиспшн

Робине

Контроль

увеличение накопления антрахинонов связано с активацией экспрессии ICS под действием генов rol.

А - нормализация кДНК по уровню экспрессии гена актина марены, Б - сравнение экспрессии гена изохоризматсинтазы на кДНК в разведении 1/10

Известно, что жасмоновая кислота, салициловая кислота и этилен играют ключевую роль в активации защитных генов растений, в т.ч. генов, участвующих в биосинтезе фитоалексинов (Gaffney et al., 1993; Feys et al., 1994; Xu et al., 1994). Так как антрахиноны относятся к классу фитоалексинов (т.е. вторичных метаболитов, участвующих в защитных реакциях растений), возник вопрос, могут ли жасмоновая кислота, салициловая кислота и этилен участвовать в процессе rol -опосредованного активирования синтеза антрахинонов. Нами показано, что эти эффекторы стимулируют накопление антрахинонов в культурах R. cordifolia. Однако степень повышения была одинакова в контрольных и трансгенных культурах. Вероятно, эти эффекторы и продукты rol генов действуют по разным, независимым сигнальным путям, приводящим к активации синтеза антрахинонов.

Жасмоновая кислота является важным посредником в октадеканоидном сигнальном пути. Поскольку индукция синтеза антрахинонов под воздействием жасмоновой кислоты в контрольной и трансгенных культурах в наших экспериментах не отличалась, можно заключить, что октадеканоидный путь не участвует в активации вторичного метаболизма в га/-культурах.

Литературные данные указывают на участие1 киназно-фосфатазных каскадов в пути передачи сигнала от молекулярного распознавания элиситоров до активации защитных реакций у растений (Shirasu et al.,

А

Б

RK

М 1/1 1/10

Ш ¿f, .

щ

"f *

У '

Рис. 4. Экспрессия изохоризматсинтазы в культурах марены

и

1997; Romeis et al., 1999; Menke et al., 1999). Контрольную и трансгенные культуры выращивали на среде с кантаридином, ингибитором протеинфосфатазы 1 и 2А, и анализировали содержание антрахинонов (рис. 5). Нетрансформированная культура была нечувствительна к кантаридину в отношении содержания антрахинонов. Напротив, значительная и дозо-зависимая активация накопления антрахинонов была отмечена в обеих трансгенных культурах. Кантаридин при концентрации 5 мкМ ингибировал рост в контрольной и ro/C-культуре. Интересно, что рост гоШ-культуры не был изменён под действием ингибитора.

О I S Кантаридин,мкМ

- Сырая биомасса, г

- Содержание антрахинонов, % от сухого веса

Рис. 5. Влияние кантаридина на рост и накопление антрахинонов в культурах R. cordifolia

Полученный результат может означать, что в /-«/-опосредованные эффекты вовлечены процессы фосфорилирования. По-видимому, продукты генов rol стимулируют киназную активность, что приводит к повышенной экспрессии защитных генов. Однако в трансгенных клетках марены активирована какая-то неизвестная форма протеинфосфатазы, которая ингибирует киназную активность. Кантаридин блокирует фосфатазу и нейтрализует ее действие.

Для исследования синтеза защитных веществ растений, активируемого посредством окислительного взрыва, генерируемого NADPH-оксидазой, используют ингибитор DPI (Jabs et al., 1997; Guo et al., 1998). DPI в дозе 10 мкМ ингибировал рост культур, однако содержание антрахинонов не уменьшалось ни в контрольной, ни в

трансгенпых культурах. Этот результат свидетельствует о том, что NADPH-оксидаза не участвует в синтезе антрахинонов и не активируется сигналом генов rol. Полученный результат не является неожиданным. Сведения о реализации защитных реакций растений, которые минуют пути окислительного взрыва и генерации H2C>2, все чаще публикуются в последние годы. Так, известны примеры кальцийзависимых, но независимых от NADPH-оксидазы защитных реакций растений, регулируемых посредством киназно/фосфатазных каскадов (Romeis et al., 2000).

Поскольку ген rolB кодирует тирозинфосфатазу (Filipini et al., 1996), активность белка RolB пытались заблокировать, используя фениларсиноксид (РАО), эффективный и специфический ингибитор растительных тирозинфосфатаз (Olivan et al., 2000).

В наших экспериментах РАО в дозе 10 мкМ полностью подавлял рост контрольных клеток, несколько меньшие концентрации РАО (1 и 5 мкМ) значительно ингибировали рост контрольной культуры и незначительно повышали накопление антрахинонов. При этом в rolB-культуре отмечена устойчивость к высокой концентрации ингибитора. LD50 (доза, вызывающая 50 % ингибирования роста культуры) для контрольной культуры составила 2,5-3 мкМ, а для культуры rolB - 20 мкМ. При воздействии 1 мкМ РАО отмечалось стимулирование роста то/5-культуры и резкое снижение уровня антрахинонов.

Нами неоднократно отмечалось, что высокая экспрессия rolB детальна для клеток. Подавление функции белка RolB за счет внесения его ингибитора РАО приводит к улучшению роста культуры.

Эти данные подтверждают предположение, что белок RolB обладает тирозинфосфатазной активностью и что увеличение синтеза антрахинонов в культуре RB вызвано именно тирозинфосфатазной активностью RolB.

Сигнальная система кальция в регуляции биосинтеза антрахинонов в трансгенных культурах марены

Клеточные культуры RK, RC и RB выращивали на средах, не содержащих кальция хлорида, а так же на стандартной среде, содержащей 3 мМ Са2+. При выращивании на среде без кальция, культура RK накапливала лишь 14,5 ± 6,5 % сырой биомассы по сравнению с контролем (стандартная среда). В контрольной культуре отмечали появление некротических агрегатов, а линия RC в этих условиях подвергалась некрозу и не росла. По сравнению с этими культурами, культура RB, выращиваемая на среде без Са2+, морфологически не изменялась, и ее рост уменьшался менее чем наполовину.

Очевидным объяснением наблюдаемых различий роста rolC и rolB культур в условиях дефицита кальция могла быть разная проницаемость кальциевых каналов в трансгенных культурах. Планируя опыты с ингибиторами каналов, мы ожидали увидеть разницу в росте между трансгенными культурами.

Как известно, верапамил и La3+ блокируют Са2+-каналы, локализованные на плазматической мембране (Knight et al., 1992; Pineros, Tester, 1997). Верапамил был добавлен в среды, не содержащие хлорида кальция. После окончания цикла выращивания каллусов на этих средах их взвешивали и определяли содержание антрахинонов.

Действительно, верапамил в концентрации 0,5 мМ вызывал в контрольной культуре угнетение роста, а в го/С-культуре некротический ответ и полную остановку роста. При этом отмечено, что верапамил не оказывал влияния на рост ro/Я-культуры. На синтез антрахинонов верапамил влияния не оказал (рис. 6). Эффекты верапамила подтверждены в опытах с общим ингибитором Са2+ каналов хлористым лантаном.

rk ас j яа

frfl m.

, i i

А (ГГТ . п <м> А

О 0 1 0 5 О 01 05 0 01 05

Верапамил, мМ

Рис. 6. Влияние верапамила на рост и накопление антрахинонов в культурах Rubia cordifolia на агаризэванной среде без кальция

Полученные результаты были первым свидетельством того, что гены rol способны изменять нормальное функционирование одной из ключевых сигнальных систем эукариот - сигнальную систему кальция.

Можно было предположить, что гены rol модулируют активность кальциевых каналов, нарушая, таким образом, гомеостаз кальция в клетках Для проверки этого предположения клетки суспензионной культуры марены нагружали специфическим зондом FURA-2AM и исследовали при помощи флуоресцентной лазерной микроскопии. В процессе инкубации, FURA-2AM проникает внутрь клеток, где внутриклеточные эстеразы высвобождают основание FURA, которое высокоселективно связывается с кальцием. По увеличению флюоресценции удается точно измерить концентрацию кальция в цитоплазме. Эти эксперименты показали, что как обычные, так и трансгенные клетки поддерживают примерно равную концентрацию [Ca24]t>t на уровне 50-60 нМ.

1 аким образом, баланс кальция трансгены не меняли. Но возможно они изменяют чувствительность клеток к кальцию, т.е. действуют на какую-то кальций-сенсорную систему? Для проверки этого предположения необходимо было подействовать на клетки некоторым внешним индуктором, эффекты которого на токи кальция известны. Перекись водорода способна модулировать токи кальция внутри клеток; динамика этого процесса хорошо изучена (Knight et al., 1996; Coelho et al., 2002). Проведенные эксперименты показали, что перекись водорода индуцирует увеличения Са2+ в цитоплазме в

контрольных клетках классическим образом, т.е. быстро и стабильно повышает [Ca2+]cyt. Разница между максимальной концентрацией кальция при индукции и ее базовым уровнем в этих клетках составила 0,2800 ± 0,0342 отн. ед. В rolB и rolC культурах эта величина была существенно ниже и составила 0,0875 ± 0,0324 и 0,0058310,00398 отн. ед., соответственно (рис. 7 А, Б и В).

RK RC RB

Рис. 7. Динамика изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток марены при воздействии Н202

Полученный результат свидетельствовал, что гены rol каким-то образом модифицируют кальций-сенсорную систему клеток марены, предназначенную для восприятия сигналов от внешних воздействий.

Анализ литературных данных показал, что одним из возможных вариантов такого влияния может быть модификация основных сенсоров кальция в растениях - кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK). Необходимо было изучить экспрессию этих киназ в нормальных и трансгенных клетках.

Для этого разработали дегенеративные праймеры на основе известных последовательностей CDPK разных растений. В качестве основы брали изоформы CDPK, которые обуславливают те же эффекты, что и гены rol - т.е. активацию защитных функций растений. Полученные праймеры позволили выделить фрагменты (киназные домены) трех генов CDPK марены (RcCDPKl, RcCDPK2 и RcCDPK3), которые были клонированы и секвенированы. Далее из клеток

нормальных и трансгенных культур марены выделили препараты тотальной РНК и изучили экспрессию этих генов.

Используя метод ОТ-ПЦР, мы установили, что экспрессия генов СОРК в культурах марены различается (рис. 8). Во всех культурах наблюдается примерно равная экспрессия ЯсСВРК2, что позволяет отнести его к генам "домашнего хозяйства" поскольку он не индуцибельный и не участвует в защитных реакциях. ЯсСЭРК! и ЯсСПРКЗ имеют повышенную экспрессию в культурах го!В, при этом в культуре го!С и контрольной культуре их экспрессия незначительна. Гены ЯсСБРК1 и ЯсСОРКЗ близки к известным генам АгСВРК1 и ШСИРК2 (рис. 9), экспрессия которых приводит к активации защитных реакций растений арабидопсиса и табака. Это семейство генов СБРК хорошо изучено - они обычно слабо экспрессируются в растениях, активируются внешними стимулами, тем самым запуская каскады защитных реакций.

ЯсСОРКЗ ЯК НС яв

Яс-асН ЯК ЯС ЯВ

390 п.н.

Рис. 8. Экспрессия генов ЯсСОРКЗ и Яс-асН в культурах марены

300 п.н.

. о. од -моСАРг

ртрасоик

-гшСВРК1 -0»агярк7

-мюоткз —№СГЯ"К2

■с,;

КаСХЭТКЭ -рвссрка

• 1жх№1 мсогк!

-Рисгачс!

игорк2

Рис. 9. Филогенетическое дерево, полученное методом объединения ближайших соседей на основе аминокислотных последовательностей СБРК в программе СЫЫХ

В го/С-культуре ситуация иная. В ней, вероятно, происходит ингибирование экспрессии конститутивной формы CDPK. Такой конститутивно экспрессирующийся ген CDPK найден недавно в нашей лаборатории в нормальных каллусах женьшеня; в то/С-культуре женьшеня его экспрессия подавлена. Для марены он пока не идентифицирован. До сих пор был известен лишь один пример постоянно экспрессирующегося гена CDPK у растений, а именно, гена NtCDPKl табака, репрессия которого приводила к увеличению экспрессии защитных генов (Lee et al., 2003). Функция этого семейства генов CDPK в растениях пока неизвестна. Видимо, они являются своего рода «барьером», предохраняющим растения от несанкционированного запуска защитных реакций.

Таким образом, оба гена rol модифицируют экспрессию генов кальцийзависимых протеинкиназ. Механизмы действия генов на киназы несколько различны, но эффект один - активация защитных систем растений. Этот путь активации синтеза вторичных метаболитов выявлен для растений впервые.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установленное нами и другими авторами стимулирующее действие генов rolB и rolC на синтез вторичных метаболитов было эмпирическим наблюдением. Это не препятствовало применению генов в биотехнологии в качестве активаторов вторичного метаболизма. Более глубокое изучение генов rol показало, что они оказывают сложное влияние на процессы вторичного метаболизма, иногда вплоть до его ингибирования. Стало очевидным, что необходимо исследовать механизм их действия на биосинтетический аппарат растительной клетки.

В начальный период исследований мы установили, что гены не затрагивают такие генеральные сигнальные пути, как NADPH-оксидазный, октадеканоидный, пути салициловой кислоты и этилена.

Из этих данных следовало, что гены rol модулируют пока неизвестный путь регуляции синтеза вторичных метаболитов.

Поиску этого пути благоприятствовало открытие нами в 2003 г. эффекта изменения чувствительности к кальцию в трансгенных культурах. Мы предположили, что продукты генов rol влияют на кальциевые каналы, нарушая гомеостаз кальция. Позже выяснилось, что трансгенные клетки поддерживают баланс цитоплазматического кальция примерно на уровне контрольных клеток, но имеют радикально измененные токи кальция в цитоплазме при действии внешних факторов. Это предполагало, что гены модулируют активность какого-либо сенсора кальция, что и подтвердилось в постедующих экспериментах.

Путем сравнения экспрессии генов кальцийзависимой протеинкиназы в контрольных культурах и культурах, экспрессирующих гены rol, установлено, что мишенью продуктов генов могут быть кальцийзависимые протеинкиназы. Кальцийзависимые протеинкиназы растений представлены обширным семейством белков, распознающих сигналы кальция и преобразующих эти сигналы в функции защиты клетки от патогенов и стрессовых воздействий, функции роста, дифференциации и морфогенеза.

Дальнейшее прохождение сигнала, приводящего к увеличению синтеза вторичных метаболитов, пока неизвестно. Предстоит установить, как гены rol модулируют активность биосинтетических путей посредством CDPK - либо путем непосредственной активации факторов транскрипции, либо опосредованно через ионные каналы и мембранные протонные насосы.

В заключение необходимо отметить, что установление вовлечения генов rol в регуляцию важнейшего сигнального пути растительной клетки, такого как путь, регулируемый кальцийзависимыми протеинкиназами, является важным шагом не только в понимании функции генов rol, но также открывает новый способ воздействия на синтез вторичных метаболитов, не описанный ранее в литературе. Эти

исследования создают надежную базу для осознанного управления процессами синтеза вторичных метаболитов в культурах растительных клеток.

ВЫВОДЫ

1. Экспрессия агробачтериальных генов rolB и rolC в культурах клеток марены сердцелистной приводит к активации синтеза антрахинонов - вторичных метаболитов шикиматного биосинтетического пути. А ктивация происходит посредством увеличения экспрессии ключевого гена биосинтеза антрахинонов - ICS.

2. Увеличение содержания антрахинонов в трансформированных генами rol клетках не связано с активацией NADPH-оксидазного, окта-деканоидного, этилен-зависимого и салицилатного сигнальных путей.

3. Впервые показано, что в опосредованную генами rol активацию синтеза антрахинонов вовлечены кантаридин-чувствительные фосфатазы.

4. Установлено, что гены rol ингибируют повышение концентрации цитоплазматического кальция в ответ на внешние стимулы.

5. В трансформированных генами rol каллусных культурах марены изменен уровень экспрессии основных сенсоров кальция в клетках растений - кальцийзависимых протеинкиназ.

6. В трансгенных культурах R. cordifolia достигнуто максимальное содержание антрахинонов 9,17 % от сухого веса клеток, что в 45 раз выше, чем в корнях дикорастущих растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Шкрыль Ю.Н., Чернодед Г.К., Красовская Н.П., Булгаков В.П. Содержание аристолохиевых кислот в культурах клеток Aristolochia manshuriensis, трансформированных генами rolB и rolC Н Тез. докл. меж международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий". Саранск, 2001. С. 53.

Р - ^ 857

2. Ill крыль Ю.Н., Чернодед Г.К., Безруков Д.В., Булгаков В.П. Влияние Са2+ на рост трансгенных культур Rubia cordifolia, содержащих гены rolB и rolC И Тез. докл. 7-ой Пущинской школы-конференции молодых учённых "Биология - наука 21 века". Пущино, 2003. С. 392.

3. В.П. Булгаков, Г.К. Чернодед, Н.П. Мищенко, Ю.Н. Шкрыль, В.П. Глазунов, С.А. Федореев, Ю.Н. Журавлев Увеличение содержания антрахинонов в трансформированных генами rol клетках Rubia cordifolia не связано с активацией NADPH-оксидазного сигнального пути // Биохимия. 2003. Т. 68, № 7. С. 968-975.

4. V.P. Bulgakov, G.K. Tchernoded, N. P. Mischenko, Yu. N. Shkryl, V.P. Glazunov, S.A. Fedoreyev, Yu. N. Zhuravlev Effects of Ca2+ channel blockers and protein kinase/phosphatase inhibitors on growth and anthraquinone production in Rubia cordifolia cultures transformed by the rolB and rolC genes // Planta. 2003. V. 217. P. 349-355.

5. V.P. Bulgakov, G.K. Tchernoded, N. P. Mischenko, Yu. N. Shkryl, S.A. Fedoreyev, Yu. N. Zhuravlev The rolB and rolC genes activate synthesis of anthraquinones in Rubia cordifolia cells by mechanism independent of octadecaniod signaling pathway // Plant Science. 2004. V. 166. P. 1069-1075.

6. Шкрыль Ю.Н., Чернодед Г.К., Булгакоз В.П., Журавлев Ю.Н. Продукция антрахинонов трансгенными культурами Rubia cordifolia // Тез. докл. III Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ". Саратов, 2004. С. 256-257.

7. Журавлев Ю.Н., Булгаков В.П., Шкрыль Ю.Н. Биотехнология редких лекарственных растений Дальнего Востока // Тез. докл. региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии". Владивосток, 2004. С. 6-7.

Подписано в печать 11.01.2006 г. Формат 60x84/16.

Усл. печ. л. 1. Тир. 100 экз. Закат 5.

Отпечатано с оригинала заказчика, в типографии ЧП Ермаков, г. Владивосток, ул. Адм. Кузнецова, 82.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шкрыль, Юрий Николаевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика марены сердцелистной (Rubia cordifolia)

1.1.1. Ботаническая характеристика

1.1.2. Фитохимическая характеристика

1.1.3. Фармакологические и другие свойства вторичных метаболитов марены

1.2. Культуры растительных клеток, продуценты антрахинонов

1.3. Генетическая инженерия как метод биотехнологии

1.3.1. История и значение генетической инженерии

1.3.2. Генетическая инженерия растений

1.3.3. Агробактерии как векторы для трансформации высших растений

1.3.4. Ti-плазмиды агробактерий

1.3.5. Ri-плазмиды агробактерий

1.3.6. Механизм переноса Т-ДНК

1.3.7. Плазмиды агробактерий как векторы для трансформации

1.4. Метаболическая инженерия. Модификация шикимат-фенилаланинового биосинтетического пути .?.

1.5. Гены го/

1.5.1. Краткая история проблемы

1.5.2. Характеристика генов rol

1.5.3. Опухолеобразующая функция генов rol

1.5.4. Гены rol как активаторы вторичного метаболизма .'.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. МАТЕРИАЛЫ .:.

2.1. Растения

2.2. Бактерии и плазмиды

2.3. Среды для культивирования культур

2.4. Реактивы

3. МЕТОДЫ

3.1. Получение клеточных культур марены

3.1.1. ^трансформированная культура марены

3.1.2. Культура марены, трансформированная геном rolC

3.1.3. Культура марены, трансформированная геном rolB

3.2. Культивирование бактериальных культур

3.3. Культивирование каллусных культур марены сердцелистной

3.4. Эксперименты с ингибиторами

3.5. Выделение плазмидной ДНК

3.6. Доказательство трансгенности полученных культур

3.6.1. Выделение тотальной растительной ДНК

3.6.2. Полимеразная цепная реакция

3.7. Доказательство экспрессии генов rol в трансгенных культурах

3.7.J. Выделение тотальной растительной РНК

3.7.2. Обратная транскрипция

3.7.3. Полимеразная цепная реакция .ТГ.

3.7.4. Секвенирование rolB и rolC продуктов

3.8. Секвенирование участка гена актина марены на матрицах ДНК и кДНК

3.9. Анализ экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ

3.10. Анализ экспрессии изохоризматсинтазы

3.11. Химический анализ антрахинонов

3.12. Измерение концентрации внутриклеточного кальция методом лазерной флуоресцентной микроскопии с использованием зонда FURA-2AM

3.12.1. Приготовление клеток

3.12.2. Измерение концентрации кальция

3.13. Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Характеристика клеточных культур марены .5 *

4.1.1. Клеточные культуры марены

4.1.2. Доказательство трансгенности rolB и rolC культур марены

4.1.3. Доказательство экспрессии генов rolB и rolC в трансгенных культурах

4.1.4. Синтез антрахинонов в культурах марены

4.2. Регуляция биосинтеза антрахинонов в трансгенных культурах марены

4.2.1. Гены rol активируют экспрессию изохоризматсинтазы

4.2.2. Влияние элиситоров на синтез антрахинонов в культурах марены

4.2.3. Влияние ингибитора протеинфосфатаз, кантаридина, на синтез антрахинонов

4.2.4. Влияние окадаевой кислоты и стауроспорина

4.2.5. Ингибитор NADPH-оксидаз, DPI, не влияет на синтез антрахинонов в культурах марены

4.2.6. Влияние ингибитора тирозинфосфатаз, РАО, на рост и синтез антрахинонов

4.3. Кальциевая сигнальная система в регуляции биосинтеза антрахинонов в трансгенных культурах марены

4.3.1. Рост трансгенных культур в условиях дефицита кальция

4.3.2. Влияние ингибиторов кальциевых каналов на рост и содержание антрахинонов в культурах марены

4.3.3. Дефицит кальция блокирует кантаридин-стимулированный синтез антрахинонов

4.3.4. Устойчивость ro/ZJ-культуры к дефициту кальция снимается ингибитором тирозинфосфатаз

4.3.5. Влияние перекиси водорода на внутриклеточную концентрацию кальция в культурах марены

4.3.6. Изменение экспрессии кальцийзависимых протеинкиназ в культурах марены

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние генов rol агробактерий на процессы роста и вторичного метаболизма в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia"

Культивируемые клетки растений являются основой для биотехнологического получения биологически активных веществ. Создание активных и стабильных штаммов-продуцентов является фундаментальной задачей для этой отрасли в целом. Настоящая работа посвящена поиску путей, посредством которых можно создавать такие штаммы. На примере генов агробактерий мы показали в настоящей работе, что методы генетической трансформации, посредством которых осуществляется перенос генетической информации в ДНК клеток растений, могут являться мощным инструментом для получения штаммов-суперпродуцентов. Также разбираются возможные механизмы увеличения биосинтетической активности клеток под влиянием трансгенов. Эта работа является одной из немногих, выполняемых в настоящее время в мире, когда для увеличения биосинтеза вторичных метаболитов используют не гены, кодирующие отдельные ферменты вторичного метаболизма, а регуляторные гены.

В процессе взаимодействия Agrobacterium rhizogenes с растениями происходит перенос части плазмидной ДНК агробактерий (Т-ДНК) в геном растения. В составе Т-ДНК расположены гены rolB и rolC, которые переносятся в ДНК растений посредством природного механизма, осуществляемого v/r-генами бактерий и вызывают образование опухолей.

Недавно установлена интересная особенность трансформированных генами rol культур растительных клеток - способность к увеличенному синтезу вторичных метаболитов. Первичные мишени генов rol, пока не найдены, а механизм активации синтеза вторичных метаболитов в трансформированных культурах не изучен.

Понимание этого механизма важно по двум причинам. Во-первых, можно получить новые данные о протекании процесса онкогенеза у растений. Во-вторых, появляется возможность расширить знания об общих принципах регуляции синтеза вторичных метаболитов растений. Ингибиторы сигнальных путей применяются для первичной оценки вклада различных биосинтетических путей в ту или иную клеточную функцию. Мы воспользовались этим подходом для того, чтобы выяснить, меняются ли при воздействии ингибиторов ростовые и биосинтетические показатели трансгенных и контрольных каллусов. Разница в этих показателях могла бы указать "точку приложения" трансгена в клетке.

В работе исследовали механизм активации генами rol шикиматного биосинтетического пути. В качестве модельного объекта использовали клеточные культуры ценного лекарственного растения Rubia cordifolia L. (марена сердцелистная) не трансформированные контроль) и трансформированные генами rolB и rolC. Испытывая действие различных ингибиторов Са2+-каналов, протеин-киназ и фосфатаз, а также других ферментов, участвующих в сигнальных путях клетки, нам удалось получить новые сведения об их участии в rol-опосредованной активации синтеза антрахинонов. Эти результаты впервые показывают, что эффекты растительных онкогенов тесным образом связаны с Са2+ -опосредованными сигнальными путями.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение механизма активации синтеза антрахинонов в трансформированных генами rolC и rolB культурах марены сердцелистной.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: •

1. Получить трансгенные каллусные культуры марены, стабильно экспрессирующие гены rolB и rolC.

2. Провести сравнительное изучение ростовых и биосинтетических характеристик трансгенных культур в сравнении с контрольными.

3. Изучить экспрессию гена изохоризматсинтазы в трансгенных культурах марены.

4. Изучить участие важнейших известных сигнальных путей в rolB и rolC-опосредованных реакциях. Определить "точку приложения" трансгенов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Трансформация агробактериальными генами rolB и rolC представляет собой новый способ в биотехнологии, позволяющий увеличить биосинтетическую активность культивируемых клеток растений. На примере марены сердцелистной показано многократное увеличение содержания антрахинонов, составившее 9,17 % от сухого веса клеток, что в 45 раз выше, чем в корнях дикорастущих растений.

2. Реакции, вызванные экспрессией генов rol в клетках, не связаны с активацией NADPH-оксидазного, октадеканоидного, этилен-зависимого и салицилатного сигнальных путей, а модулируют сигнальную систему кальция.

Научная новизна. Впервые установлено, что гены rol способны значительно увеличивать накопление антрахинонов в трансгенных культурах растений. Показано, что активаторная способность гена rolB выше, чем гена rolC. Оба гена увеличивают синтез антрахинонов путем активации экспрессии ключевого гена их биосинтеза - изохоризматсинтазы (ICS).

Установлено, что активаторный сигнал генов rol не связан с индукцией октадеканоидного и NADPH-оксидазного сигнальных путей. Показано, что процессы фосфорилирования играют важную роль в опосредованной генами rol активации биосинтеза вторичных метаболитов. Установлено, что ингибитор тирозинфосфатаз подавляет эффекты гена rolB.

Впервые показана связь между функцией генов rol и сигнальной системой кальция. Установлено, что в трансгенных культурах изменена экспрессия генов важных сигнальных молекул растительной клетки - кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK).

Практическая значимость. Максимальная продуктивность культур составила 9,17 % суммы антрахинонов от сухой массы клеток, что в 10 раз превышает их содержание в нетрансгенных каллусах и в 45 раз в корнях марены сердцелистной.

Поскольку антрахиноны марены сердцелистной не обладают мутагенным действием, препараты на их основе могут стать конкурентоспособными на рынке препаратов, обладающих способностью растворять и удалять камни из почек при почечнокаменной болезни.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференциях молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2000, 2001, 2003), на международной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001), на 7-ой Пущинской школе-коференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2003), на 7-ой региональной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы химии и биологии" (Владивосток, 2003), на Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Саратов, 2004), на региональной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Работа выполнена в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Химический анализ антрахинонов выполнен совместно с сотрудниками лаборатории химии природных хиноидных соединений Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Анализ токов кальция при помощи флуоресцентных зондов выполнен совместно с к.б.н. Д. JT. Амининым, в лаборатории биоиспытаний Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Шкрыль, Юрий Николаевич

6. ВЫВОДЫ

1) Экспрессия агробактериальных генов rolB и rolC в культурах клеток марены сердцелистной приводит к активации синтеза антрахинонов - вторичных метаболитов шикиматного биосинтетического пути. Активация происходит посредством увеличения экспрессии ключевого гена биосинтеза антрахинонов - ICS.

2) Увеличение содержания антрахинонов в трансформированных генами rol клетках не связано с активацией NADPH-оксидазного, октадеканоидного, этилен-зависимого и салицилатного сигнальных путей.

3) Впервые показано, что в опосредованную генами rol активацию синтеза антрахинонов вовлечены кантаридии-чувствительные фосфатазы.

4) Установлено, что гены rol ингибируют повышение концентрации цитоплазматического кальция в ответ на внешние стимулы.

5) В трансформированных генами rol каллусных культурах марены изменен уровень экспрессии основных сенсоров кальция в клетках растений - кальцийзависимых протеинкиназ.

6) В трансгенных культурах R. cordifolia достигнуто максимальное содержание антрахинонов 9,17 % от сухого веса клеток, что в 45 раз выше, чем в корнях дикорастущих растений.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установленное нами и другими авторами стимуляторное действие на синтез вторичных метаболитов генов rolB и rolC, экспрессирующихся в трансформированных культурах растительных клеток, было эмпирическим наблюдением. Это не препятствовало применению генов в биотехнологии в качестве активаторов синтеза вторичных метаболитов до определенного времени, когда стало ясно, что гены могут иметь сложное влияние на процессы вторичного метаболизма, иногда вплоть до его ингибирования. Стало очевидным, что необходимо исследовать механизм их действия на биосинтетический аппарат растительной клетки.

Такую задачу ставили многие исследователи еще до открытия влияния генов на вторичный метаболизм. История исследования мишеней генов rol, разворачивающаяся на протяжении последних 15 лет, носила подчас драматический характер, когда данные одних ведущих в мире лабораторий опровергались данными других, не менее сильных коллективов. Мы описали эти исследования в обзоре данных литературы, здесь лишь заметим, что в основе трудностей лежит уникальность генов rolB и rolC в том плане, что они не имеют значительной гомологии ни с одним из известных про- или эукариотических генов, а также между собой.

В начальный период исследований мы проверили вовлечение сигналов генов rol в основные известные пути, регулирующие синтез вторичных метаболитов в культурах растительных клеток. Полученные данные свидетельствовали, что гены не затрагивают такие генеральные сигнальные пути, как NADPH-оксидазный, октадеканоидный, пути салициловой кислоты и этилена. Становилось очевидным, что гены rol модулируют пока неизвестный путь регуляции синтеза вторичных метаболитов.

Поиску этого пути благоприятствовало открытие нами в 2003 г. возможности модуляции баланса кальция в культурах клеток, экспрессирующих эти гены. Мы предположили, что продукты генов rol влияют на кальциевые каналы, нарушая гомеостаз кальция. Позже выяснилось, что трансгенные клетки поддерживают баланс цитоплазматического кальция примерно на уровне контрольных клеток, но имеют радикально измененные токи кальция в цитоплазме при действии внешних факторов. Предположение, что гены модулируют активность какого-либо сенсора кальция, подтвердилось в последующих экспериментах.

Путем сравнения экспрессии генов кальций-зависимой протеинкиназы в контрольных культурах и культурах, экспрессирующих гены rol, установлено, что мишенью продуктов генов могут быть кальций-зависимые протеинкиназы. Кальций-зависимые протеинкиназы (CDPK) растений представлены обширным семейством белков, распознающих сигналы кальция и преобразующих эти сигналы в функции защиты клетки от патогенов и стрессовых воздействий, функции роста, дифференциации и морфогенеза.

Дальнейшее прохождение сигнала, приводящего к увеличению синтеза вторичных метаболитов, пока неизвестно, но будет исследоваться в нашей последующей работе. Предстоит установить, как гены rol модулируют активность биосинтетических путей посредством CDPK - путем непосредственной активации факторов транскрипции, либо опосредованно через ионные каналы и мембранные протонные насосы.

В заключение необходимо отметить, что установление вовлечения генов rol в регуляцию важнейших сигнальных путей растительной клетки, такие как пути, регулируемые кальций-зависимыми протеинкиназами, является важным шагом не только в понимании функции генов rol, но также открывает новый путь регуляции синтеза вторичных метаболитов, не описанный ранее в литературе. Эти исследования создают надежную базу для осознанного управления процессами синтеза вторичных метаболитов в культурах растительных клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шкрыль, Юрий Николаевич, Владивосток

1. Булгаков В.П., Лауве Л.С., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев Ю.Н. Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированных растительным окогеном rolC II Генетика. 2000. Т. 2. С. 209-216.

2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии3. на их основе. М.: Наука, 1999.

3. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986.

4. Дрейпер Д., Скот С., Армитидж Ф., Дыори Г., Джэкоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Д. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991.

5. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. Т. 34, № 2. С. 165182.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

7. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды бактерий и генетическая инженерия растений. М.: Наука, 1985.

8. Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений. М.: Наука, 1988.

9. Федореев С.А. Химическое исследование хиноидных пигментов дальневосточных представителей семейства Boraginaceae (бурачниковые): Автореф. дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1980.

10. Хилтон М.-Д. Перенос новых генов в клетки растений // В мире науки. 1983. № 8. С. 17.

11. Чарльз С.Г., Роберт Т.Ф. Трансгенные культурные растения // В мире науки. 1992. № 8. С. 24-30.

12. Abdullah М.А., Ali A.M., Marziah M., Lajis N.H., Ariff A.B. Establishment of cell suspension cultures of Morinda elliptica for the production of anthraquinones 11 Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1998. Vol. 54. P. 173-182.

13. Adwankar M.K., Chitnis M.P. In vivo anti cancer activity of RC-18: a plant isolate from Rubia cordifolia, Linn, against a spectrum of experimental tumour models // Chemotherapy. 1982. Vol. 28, №4. P. 291-293.

14. Altamura M., Archilletti Т., Capone I., Costantino P. Histological analysis of the expression of Agrobacterium rhizogenes rolB-GUS gene fusions in transgenic tobacco // New Phytol. 1991. Vol. 118. P. 69-78.

15. Arnoult С., Lemos J.R., Florman H.M. Voltage-dependent modulation of T-type calcium channels by protein tyrosine phosphorylation // EMBO J. 1997. Vol. 16. P. 1593-1599.

16. Arrebola M.L., Ringbom Т., Verpoorte R. Anthraquinones form Isoplexis isabelliana cell suspension cultures // Phytochemistry. 1999. Vol. 52. P. 1283-1286.

17. Bailey J. Toward a science of metabolic engineering // Science. 1991. Vol. 252. P. 1668-1675.

18. Banthorpe D., White J.J. Novel anthraquinones from undifferentiated cell cultures of Galium verumIIPhytochemistry. 1995. Vol. 38, № l.P. 107-111.

19. Baquar S. Medicinal and poisonous plants of Pakistan. Karachi.: Printas, 1989.

20. Barros L.,. Curtis R., Vianna A., Campos L., Carneiro M. Fused RolA protein enhances beta-glucoronidase activity 50-fold: implication for RolA action // Protein Peptide Letters. 2003. Vol. 10. P. 303-311.

21. Bassetti L., Pijnenburg J., Tramper J. Silicone-stimulated anthraquinone production and release by Morinda citrifolia in a two-liquid-phase system // Biotechnol. Lett. 1996. Vol. 18. P. 377-382.ч

22. Bekesiova I., Nap J.-P., Mlynarova L. Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia II Plant Molecular Biology Reports. 1999. Vol. 17. P. 269-277.

23. Bestor Т.Н., Coxon A. The pros and cons of DNA methylation // Cell. 1993. Vol. 3. P. 384-386.

24. Biswas Т.К., Mukherjee B. Plant medicines of India origin for wound healing activities: a review // Lower Extremity Wounds. 2003. Vol. 2, № 3. p. 25-39.

25. Bhuyan R., Saikia C.N. Isolation of color components from native dye-bearing plants in northeastern India// Bioresour. Technol. 2005. Vol. 96, № 3. P. 363-372.

26. Blomeke В., Poginsky В., Schmutte C., Marquardt H., Westendorf J. Formation of genotoxic metabolites from anthraquinone glycosides, present in Rubia tinctorum L. // Mutat. Res. 1992. Vol. 265, №2. P. 263-272.

27. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Chernoded G. ., Zhuravlev Y.N. The impact of plant rolC oncogene on ginsenosid production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 1998. Vol. 49, № 12. P. 1929-1934.

28. Cai Y., Sun M., Xing J., Corke H. Antioxidant phenolic constituents in roots of Rheum officinale and Rubia cordifolia4. structure radical scavenging activity relationships // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, № 26. P. 7884-7890.

29. Capone I., Spano L., Cardarelli M., Bellincampi D., Petit A., Costantino P. Induction and growth properties of carrot roots with different complements of Agrobacterium rhizogenes T-DNA // Plant. Mol. Biol. 1989. Vol. 13. P. 43-52.

30. Cessna S.G., Low P.S. Activation of the oxidative burst in aequorin-transformed Nicotiana tabacum cells is mediated by protein kinase- and anion channel-dependent release of Ca2+ from internal stores // Planta. 2001. Vol. 214. P. 126-134.

31. Chasan R. Phytochemical forecasting// Plant Cell. 1994. Vol. 6, № 1. P. 3-9.

32. Chik C.L., Li В., Karpinski E., Ho A.K. Regulation of the L-type Ca2+ channel current in rat pinealocytes: role of basal phosphorylation Hi. Neurochem. 1999. Vol. 72. P. 73-80.

33. Chung M.I., Jou S.J., Cheng Т.Н., Lin C.N., Ко F.N., Teng C.M. Antiplatlet constituents of formosan Rubia akane // J. Nat. Prod. 1994. Vol. 57, № 2. P. 313-316.

34. Coelho S.M., Taylor A.R., Ryan K.P., Sousa-Pinto I., Brown M.T., Brownlee C. Spatiotemporal patterning of reactive oxygen production and Ca(2+) wave propagation in fucus rhizoid cells // Plant Cell. 2002. Vol. 14. P. 2369-2381.

35. Dehio C., Grossmann K., Schell J., Schmulling T. Phenotype and hormonal status of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes T-DNA // Plant Mol. Biol.1993. Vol. 23, Iss 6. P. 1199-1210.

36. Estruch J.J., Chriqui D., Grossman K., Schell J., Spena A. The plant oncogene rolC is responsible for the release of cytokinins from glucoside conjugates // EMBO J. 1991a. Vol. 10, № 10. P. 28892895.

37. Estruch J.J., Schell J., Spena A. The protein encoded by the rolB plant oncogene hydrolyses indole glucosides//EMBO J. 1991b. Vol. 10, № 11. P. 3125-3128.

38. Fillipini F., Rossi R., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P. M., Lo Schiavo F., Terzi M. A plant oncogene as a phosphatase // Nature. 1996. Vol. 379. P. 499-500.

39. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back! // Biotechnology. 1994. Vol. 12. P.883-888.

40. Fredenhagen A., Mett H., Meyer Т., Buchdunger E., Regenass U., Roggo B.E., Petersen F. Protein tyrosine kinase and protein kinase С inhibition by fungal anthraquinones related to emodin // J. of Antibiot. 1995. Vol. 48. P. 1355-1358.

41. Gaffney Т., Friedrich L., Vernooij В., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Kessmann H., Ryals J. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance // Science.1993. Vol. 261. P. 754-756.

42. Gelli A, Blumwald E. Hyperpolarization-activated Ca2+-permeable channels in the plasma membrane of tomato cells//J. Membr. Biol. 1997. Vol. 155. P. 35-45.

43. Gilani A.H., Janbaz K.H., Zaman M., Lateef A., Suria A., Ahmed H.R. Possible presence of calcium channel blockers in Rubia cordifolia: an indigenous medicinal plant // J. Рак. Med. Assoc.1994. Vol. 44. P. 82-85.

44. Gilani A.H., Janbaz K.H. Effect of Rubia cordifolia extract on acetaminophen and ССЦ-induced hepatotoxicity // Phytotherapy Res. 1995. Vol. 9. P. 372-375.

45. Giri A.M., Narasu L., Transgenic hairy roots: recent trends and applications // Biotechnology Advances. 2000. Vol. 18. P. 1-22.

46. Guivarc'h A., Carneiro M., Vilaine F., Pautot V., Chriqui D. Tissue-specific expression of the rolA gene mediates morphological changes in transgenic tobacco // Plant Molecular Biology. 1996. Vol. 30. P. 125-134.

47. Gundlach H., Muller M.J., Kutchan T.M., Zenk M.H. Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures // PNAS. 1992. Vol. 89. P. 2389-2393.

48. Guo Z.-J., Lamb C., Dixon R.A. Potentiation of the oxidative burst and isoflavonoid phytoalexin accumulation by serine protease inhibitors // Plant Physiol. 1998. Vol. 118. P. 1487-1494.

49. Haby C., Larsson O., Islam M.S., Aunis D., Berggren P.O., Zwiller J. Inhibition of serine/threonine protein phosphatases promotes opening of voltage-activated L-type Ca2+ channels in insulin-secreting cells // Biochem J. 1994. Vol. 298. P. 341-346.

50. Han Y.S., Heijden R., Verpoorte R. Biosynthesis of anthraquinones in cell cultures of the Rubiaceae II Plant Cell Tissue and Organ Culture. 2001. Vol. 67, P. 201-220.

51. Han Y.S., Heijden R., Lefeber A.W., Erkelens C., Verpoorte R. Biosynthesis of anthraquinones in cell cultures of Cinchona 'Robusta' proceeds via the methylerythritol 4-phosphate pathway // Phytochemistry. 2002. Vol. 59, № 1. P. 45-55.

52. Hassanean H.A., Ibraheim Z.Z., Takeya K., Itorawa H. Further quinoidal derivatives from Rubia cordifolia L. // Pharmazie. 2000. Vol. 55, № 4. P. 317-319.

53. Heike H., Heike D., Dietrich K. Biosynthesis and accumulation of anthraquinones in Galium verum II BioTec. 1996. Vol. 8. P. 47-49.

54. Hill C., Rimmer J., Grenn В., Finch J., Thomas J. Histone-DNA interaction and their modulation by phosphorylation of-Ser-Pro-X-Lys/Arg-motifes // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 1939-1948.

55. Hirschi K.D. Expression of Arabidopsis CAX1 in tobacco: Altered calcium homeostasis and increased stress sensitivity // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 2113-2122.

56. Hitotsuyanagi Y, Hasuda T, Aihara T, Ishikawa H, Yamaguchi K, Itokawa H, Takeya K. Synthesis of Gly-l.RA-VII, [Gly-2]RA-VII, and [Gly-4]RA-VII. Glycine-containing analogues of

57. RA-VII, an antitumor bicyclic hexapeptide from Rubia plants // J. Org. Chem. 2004. Vol. 69, № 5. P. 1481-1486.

58. Itokawa H., Takeya K., Mori N., Takanashi M., Yamamoto H., Sonobe Т., Kidokoro S. Cell growth inhibitory effects of derivatives of antitumor cyclic hexapeptide RA-V obtained from Rubia radix (V) // Gann. 1984. Vol. 75, № 10. P. 929-936.

59. Itokawa H., Ibraheim Z.Z., Qiao Y.F., Takeya K. Anthraquinones, naphtohydroquinones and naphtohydroquinone dimers from Rubia cordifolia and their cytotoxic activity // Chem. Pharm. Bull. 1993. Vol. 41, № 10. P. 1869-1872.

60. Jain A., Basal E. Inhibition of Propionibacterium induced mediators of inflammation by Indian herbs // Phytomedicine. 2003. Vol. 10, № 1. P. 34-38.

61. Jones D.L., Kochian L.V., Gilroy S. Aluminium induces a decrease in cytosolic calcium concentration in BY-2 tobacco cell cultures // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 81-89.

62. Kasture V.S., Deshmukh V.K., Chopde C.T. Anticonvulsant and behavioral actions of triterpene isolated from Rubia cordifolia L. // Indian J. Exp. Biol. 2000. Vol. 38, № 7. P. 675-680.

63. Kawasaki Y., Goda Y., Yoshihira K. The mutagenic constituents of Rubia tinctorum II Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 49, № 6. P. 1504-1509.

64. Kiegle E., Gilliham M., Haseloff J., Tester M. Hyperpolarisation-activated calcium currents found only in cells from the elongation zone of Arabidopsis thaliana roots // Plant J. 2000. Vol. 21. P. 225229.

65. Khouri H., Ibrahim R.K., Rideau M. Purification and some properties of five anthraquinone -specific glucosyltransferases from Cinchona succirubra cell suspension culture // Phytochemistry. 1987. Vol. 26. P. 2531-2535.

66. Knight M.R., Smith S.M., Trewavas A.J. Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium // PNAS. 1992. Vol. 89. P. 4967-4971.

67. Knight H., Trewavas A.J., Knight M.R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 489503.

68. Krol A.R., Mur L.A., Beld M., Mol J.N.M., Stultje A.R. Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression // Plant Cell. 1990. Vol. 2. P. 291-299.

69. Leach F., Aoyagi K. Promoter analysis of the highly expressed rolC and rolD root-inducing genes of Agrobacterium rhizogenes: enhancer and tissue-specific DNA determinants are dissociated // Plant Science. 1991. Vol. 79. P. 69-76.

70. Leistner E. Biosynthesis of morindone and alizarin in intact and cell suspension cultures of Morinda citrifolia!I Phytochemistry. 1973. Vol. 12. P. 1669-1674.

71. Leistner E. Biosynthesis of plant quinones // The Biochemistry of plants. 1981. Vol. 7. P. 403423.

72. Leistner E., Inouye H. Biochemistry of quinones // The Chemistry of Quinonoid Compounds. 1988. Vol. 2. P. 1293-1349.

73. Leistner E. XVI Morinda species: Biosynthesis of quinones in cell cultures // Biotechnology in Agriculture and Forestry. 1995. Vol. 33. P. 215-224.

74. Levesque H., Delepelaire P., Rous P., Slightom J., Tepfer D. Common evolutionary origin of the central portions of the Ri TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes and Ti T-DNAs of Agrobacterium tumefaciens // Plant Mol. Biol. 1988. Vol. 11. P. 731-744.

75. Liou M.J., Wu T.S. Triterpenoids from Rubia yunnanensis H J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65, № 9. P. 1283-1287.

76. Lodhi A.H., Charlwood B.V. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Rubia peregrina L: In vitro accumulation of anthraquinones // Plant Cell Tiss. Org. Cult. 1996. Vol. 46. P. 103-108.

77. Lodhi A.H., Bongaerts R.J.M., Verpoorte R., Coomber S.A., Charlwood B.V.

78. MacKintosh C., Cohen P. Identification of high levels of type 1 and type 2A protein phosphatases in higher plants//Biochem. J. 1989. Vol. 262. P. 335-339.

79. Mano Y., Nabeshima S., Matsui C., Ohkawa H. Production of tropane alkaloids by hairy roots cultures of Scopolia japonica II Agric. Biol. Chem. 1986. Vol. 50. № 11. P. 2715-2722.

80. Manojlovic N.T., Solujic S., Sukdolak S., Milosev M. Antifungal activity of Rubia tinctorum, Rhamnus frangula and Caloplaca cerina 11 Fitoterapia. 2005. Vol. 76, № 2. P. 244-246.

81. Marczylo Т., Arimoto-Kobayashi S., Hayatsu H. Protection against Trp-P-2 mutagenicity by purpurin: mechanism of in vitro antimutagenesis // Mutagenesis. 2000. Vol. 15, № 3. P. 223-228.

82. Marec F., Kollarova I., Jegorov A. Mutagenicity of natural anthraquinones from Rubia tinctorum in the Drosophila wing spot test // Planta Med. 2001. Vol. 67, № 2. P. 127-131.

83. Matzke A.J.M., Neuhuber F., Park Y.-D., Ambros P., Matzke M.A. Homology-dependent gene silencing in transgenic plants: epistatic silencing loci contain multiple copies of methylated transgenes // Mol. Gen. Genet. 1994. Vol. 244. P. 219-229.

84. Maurel C, Brevet J, Barbier-Brygoo H, Guern J, Tempe J. Auxin regulates the promoter of the root-inducing rolB gene of Agrobacterium rhizogenes in transgenic tobacco // Mol. Gen. Genet. 1990. Vol. l.P. 58-64.

85. Meyer P., Heidmann I., Niedenhof I. Difference in DNA-methylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia // Plant J. 1993. Vol. 4. P. 89-100.

86. Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Glazunov V.P., Chernoded G.K., Bulgakov V.P., Zhuravlev Y.N. Anthraquinone production by callus cultures of Rubia cordifolia II Fitoterapia. 1999. Vol. 70. N 6. P. 552-557.

87. Mol J.N.M., van Blokland R., de Lange P., Stam M., Kooter J.M. Post-transcriptional inhibition of gene expression: sense and antisense genes // Homologous recombination and gene silencing in plants. Kluever, Dordrecht: Netherlands. P. 309-334.

88. Morimoto M., Tanimoto K., Sakatani A., Komai K. Antifeedant activity of an anthraqunones aldehyde in Galium aparine L. against Spodoptera litura F. // Phytochemistry. 2002. Vol. 60, № 2. P. 163-166.

89. Morita H., Yamamiya Т., Takeya K., Itokawa H. New antitumor bicyclic hexapeptides, RA-XI, -XII, XIII and -XIV from Rubia cordifolia И Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 40, № 5. P. 1352-1354.

90. Morita H, Yamamiya T, Takeya K, Itokawa H, Sakuma C, Yamada J, Suga T. Conformational recognition of RA-XII by 80S ribosomes: a differential line broadening study in 1H NMR spectroscopy // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1993. Vol. 41, № 4. P. 781-783.

91. Nazif N., Rady M., el-Nasr M. Stimulation of anthraquinone production in suspension cultures of Cassia acutifolia by salt stress // Fitoterapia. 2000. Vol. 1. P. 43-40.

92. Pineros M., Tester M. Characterization of the high-affinity verapamil binding site in a plant plasma membrane Ca2+-selective channel // J. Membr. Biol. 1997. Vol. 157. P. 139-145.

93. Poginsky В., Westendorf J., Blomeke В., Marquardt H., Hewer A., Grover P.L., Philips D.H. Evaluation of DNA binding activity of hydroxyanthraquinones occurring in Rubia tinctorum L. // Carcinogenesis. 1991. Vol. 12, № 7. P. 1265-1271.

94. Rigden D.J., Carneiro M. A structural model for the rolA protein and its interaction with DNA // Proteins. 1999. Vol. 37, № 4. P. 697-708.

95. R6der F.T., Schmiilling Т., Gatz C. Efficiency of the tetracycline-dependent gene expression system: complete suppression and efficient induction of the rolB phenotype in transgenic plants // Mol. Gen. Genet. 1994. Vol. 243. P. 32-38.

96. Romeis Т., Piedras P., Jones J.D.G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response // Plant Cell. 2000. Vol. 12. P. 803-815.

97. Sato K., Yamazaki Т., Okuyama E., Yoshihira K., Shimomura K. Antraquinone production by transformed root culture of Rubia tinctorum: influence of phytohormones and sucrose concentration // Phytochemistry. 1991. Vol. 30, № 5. P. 1507-1509.

98. Schmulling T, Schell J, Spena A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development//EMBO J. 1988. Vol. 9. P. 2621-2629.

99. SchuIte U., El-Shagi H., Zenk M.H. Optimisation of 19 Rubiaceae species in cell suspension cultures of Cinchona ledgeriana// Plant Cell Rep. 1984. Vol. 3. P. 51-54.

100. Singh R., Geetanjali, Chauhan S.M.S. 9,10-anthraquinones and other active compounds from the genus Rubia // Chemistry and Biodiversity. 2004. Vol. 1. P. 1241-1264.

101. Sinkar V.P., Pythoud F., White F.F., Nester E.W., Gordon M.P. Rol A locus of the Ri plasmid directs developmental abnormalities in transgenic tobacco plants // Genes Development. 1988. Vol. 2. P. 688-697.

102. Shim J.J., Shin J.H., Pai Т., Chung I.S., Lee H.J. Permeabilization of elicited suspension cultures of madder (Rubia akane Nakai) cells for release of anthraquinones // Biotechnology Techniques. 1999. Vol. 13. P. 249-252.

103. Shimada Y., Nakano-Shimada R., Ohbayashi M., Okinaka Y., Kiyokawa S., Kikuchi Y. Expression of chimeric P450 genes encoding flavonoid-3',5'-hydroxylsae in transgenic tobacco and petunia plants // FEBS. 1999. Vol. 461. P. 241 -245.

104. Slightom J.L., Durand-Tardif M., Joanin L., Tepfer d. Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid // J. of Biol. Chem. 1986. Vol. 261, № 1. P. 108121.

105. Supartana P, Shimizu T, Shioiri H, Nogawa M, Nozue M, Kojima M. Development of simple and efficient in planta transformation method for rice (Oryza sativa L.) using Agrobacterium tumefaciens // J. Biosci. Bioeng. 2005. Vol. 4. 391-397.

106. Takahashi E., Marczylo Т.Н., Watanabe Т., Nagai S., Hayatsu H., Negishi T. Preventive effect of anthraquinone food pigments on the DNA damage induced by carcinogens in Drosophila II Mutat. Res. 2001. Vol. l.P. 139-145.

107. Talou J., Verberne M., Muljono В., van Tegelen L., Bernal В., Linthorst H., Wullems G., Bol J., Verpoorte R. Isochorismate synthase transgenic expression in Catharanthus roseus cell suspensions // Plant Physiol. Biochem. 2001. Vol. 39. P. 595-602.

108. Tegelen L., Moreno P., Croes A., Verpoorte R., Wullems G. Purification and cDNA cloning of isochorismate synthase from elicited cell cultures of Catharanthus roseus И Plant Physiology. 1999. Vol. 119. P. 705-712.

109. Tripathi Y.B., Pandey S., Shukla S.D. Anti-platelet activating factor of Rubia cordifolia Linn. // Indian J. Exp. Biol. 1993. Vol. 31, № 6. P. 533-555.

110. Tripathi Y.B., Sharma M., Manickam M. Rubiadin, a new antioxidant from Rubia cordifolia II Indian J. Biochem. Biophys. 1997. Vol. 34, № 3. P. 302-306.

111. Tripathi Y.B., Sharma M. Comparison of the antioxidant action of the alcoholic extract of Rubia cordifolia with rubiadin // Indian J. Biochem. Biophys. 1998. Vol. 35, № 5. P. 313-316.

112. Trovato M., Maras В., Linhares F., Costantino P. The plant oncogene rolD encodes a functional ornithine cyclodeaminase// PNAS. 2001. Vol. 98, № 23. P. 13449-13453.

113. Xing Т., Malik K., Martin Т., Miki B.L. Activation of tomato PR and wound-related genes by a mutagenized tomato MAP kinase kinase through divergent pathways // Plant Mol. Biol. 2001a. Vol. 46. P. 109-120.

114. Xing Т., Wang X.-J., Malik K., Miki B.L. Ectopic expression of an Arabidopsis calmodulin-like domain protein kinase-enhanced NADPH oxidase activity and oxidative burst in tomato protoplasts // MPMI. 2001b. Vol. 14. P. 1261-1264.

115. Xu Y., Chang P.F.L., Liu D., Narasimhan M.L., Raghothama K.G., Hasegawa P.M., Bressan R.A. Plant defense genes are synergistically induced by ethylene and methyl jasmonate // Plant Cell. 1994. Vol.6. P. 1077-1085.

116. Yoon G., Cho H., Ha H., Liu J., Lee J. Characterization of NtCDPKl, a calcium-dependent protein kinase gene in Nicotiana tabacum, and the activity of its encoded protein // Plant Mol. Biol. 1999. Vol. 5. P. 991-1001.

117. Yun D., Hashimoto Т., Yamada Y. Metabolic engineering of medicinal plants: transgenic Atropa belladonna with an improved alkaloid composition // PNAS. 1992. Vol. 89. P. 11799-11803.

118. Westendorf J., Pfau W., Schulte A. Carcinogenicity and DNA adduct formation observed in ACI rats after long-term treatment with madder root, Rubia tinctorum L. // Carcinogenesis. 1998. Vol. 19, № 12. P. 2163-2168.

119. Wijnsma R., Verpoorte R., Mulder-Krieger Th., Svendsen A. Antraquinones in callus cultures of Cinchona ledgeriana II Phytochemistry. 1984. Vol. 23, № 10. P. 1507-1509.

120. Wu T.S., Lin D.M., Shi L.S., Damu A.G., Kuo P.C., Kuo Y.H. Cytotoxic anthraquinones from the stems of Rubia wallichiana Decne // Chem. Pharm. Bull. 2003. Vol. 51, № 8. P. 948-950.

121. Zhao J., Davis L., Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites // Biotechnology advances. 2005. Vol. 23. P. 283-333.