Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L.

Веремейчик, Галина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L.
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L."

На празах рукописи

ВЕРЕМЕЙЧИК ГАЛИНА НИКОЛАЕВНА

ВЛИЯНИЕ АГРОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ ROLA, ROLB И ROLC НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АБИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ И БИОСИНТЕЗ АНТРАХИНОНОВ В ТРАНСГЕННЫХ КУЛЬТУРАХ RUBIA CORDIFOLIA L.

03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2008

дек да

003456004

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик РАН, Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

Хотимченко

Юрий Степанович

кандидат биологических наук, доцент

Кожемяко Валерий Борисович

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики

СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «24» декабря 2008 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159. факс: (42.-12) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотек; ДВО РАН.

Автореферат разослан «21» ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат £ иологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Биотехнологическое производство биологически активных веществ связано с получением стабильных растительных штаммов-суперпродуцентов. В этой области биотехнология тесно связана с достижениями клеточной и генетической инженерии растений. Одним из перспективных направлении является исследование эффектов генов rol, участвующих в агробактериалыюй колонизации растений за счет горизонтального переноса генетического материала (Combará, Baucher, 1988; Hasen et al., 1991; Levesque et al., 1988). Экспрессия генов rol из T- ДНК Agrobacterium rhizogenes в трансгенных растениях или клеточных культурах вызывает активацию вторичного метаболизма (Moyano et al., 1999). Расшифровка механизма этого процесса позволит использовать этот метод как поливалентный для получения штаммов-суперпродуцентов.

Поскольку вторичный метаболизм сопряжен со сложным механизмом защитных реакций растений, мы предполагаем, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC способна в ряде случаев повысить устойчивость трансгенных клеток к негативным абиотическим факторам. Механизм ^/-индуцируемой активации биосинтеза вторичных метаболитов в настоящее время активно изучается. Известно, что индивидуальная экспрессия генов rolB и rolC активирует биосинтез аЕгтрахинонов в культуре клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) (Bulgakov et al., 2002), ценного лекарственного растения, экстракт которого используют для лечения почечнокаменной болезни и в качестве антиоксидантного и противомикробного препарата (Gilani et al., 1994, Pandey et al., 1994, Singh et al., 2004, Manojlovic et al., 2005). При этом изучение влияния экспрессии этих генов на устойчивость трансгсниых клеток растений к абиотическим стрессам осталось в тени.

В данной работе мы впервые исследовали совместное влияние генов rol A, rolB и rolC на биосинтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы (гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов) в трансгенных культурах марены. Кроме того, в рамках исследования совместного и индивидуального влияния генов rol на устойчивость трансгенных клеток марены к стрессам мы изучали содержание активных форм кислорода в этих клетках, поскольку известно, что устойчивость растений к стрессам напрямую связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Yahraus etal., 1995).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление взаимосвязи между содержанием активных форм кислорода в клетках rol-трапегенных культур марены сердцелистной, их устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам и активацией вторичного метаболизма при совместном и индивидуальном действии агробактериальных онкогенов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Получить трапегенную культуру марены экспрессирующую совместно гены rol А, rolB и rolC — RABC,

2. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на ростовые и биосинтетические характеристики трансгенных клеточных культур марены сердцелистной.

3. Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на содержание активных форм кислорода в клеточных культурах марены сердцелистной.

4. Изучить реакцию трансгенных культур на воздействие негативными абиотическими факторами.

5. Исследовать влияние экспрессии гена rolC на механизм регуляции окислительного взрыва.

Научная новизна. Впервые получена клеточная культура марены сердцелистной, экспрессирующая совместно гены rolA, rolB и rolC и изучено влияние генов rol на рост и биосинтез антрахинонов при их совместной экспрессии.

Впервые установлена положительная корреляция между экспрессией генов rolC и rolB и экспрессией гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов — изохоризматсинтазой при индивидуальной и совместной экспрессии этих трансгенов.

Впервые показано, что в клетках, экспрессирующих ген rolC., снижено содержание активных форм кислорода, что, по-видимому, повышает устойчивость rolC-культур к солевому и температурному стрессам. Показано, что в го/С-клетках снижен уровень экспрессии патогениндуцируемой изоформы гена НАДФН-оксидазы марены и значительно ингибирован регуляторный механизм этого фермента.

Практическая значимость. Установлено, что в культурах марены сердцелистной с высоким уровнем экспрессии гена rolC повышена устойчивость к абиотическим стрессам по сравнению с контрольной культурой: в 4 раза при солевом стрессе и при повышении температуры и в 6,2 раза при понижении температуры. Изучен возможный механизм, обеспечивающий га/С-опосредопатптое повышение устойчивости клеток. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Повышение содержания антрахинонов и экспрессия гена изохоризматсингазы в rolC- и го/5-трансгенных линиях марены сердцелистной обнаруживают положительную корреляцию с уровнем экспрессии трапегенов.

2. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой.

3. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости к стрессам) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии з культурах R ABC и RA4, но друг друга не усиливают.

4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках снижается, а устойчивость к неблагоприятным абиотическим факторам повышается. Возможно это связано с тем, что экспрессия гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же оказывает ингибирующий эффект на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученных "Биология — наука 21 века" (Пущино, 2006), на Международном симпозиуме по биоразнообразию и биологически-активным веществам растений (Taiwan-Russia Bilateral Symposium on Plant Biodiversity and Bioactive Natural Products) (Тайвань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 29 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 168 наименований.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Анализ содержания АФК в культурах марены выполнен совместно с Т . Ю. Горпенченко и Д . JI. Амининым, а анализ содержания СК в культурах марены выполнен совместно с П. С. Дмитрснок в центре коллективного пользования ДВО РАН.

Благодарности. Автор выражает свою глубокую признательность научному руководителю академику Ю.Н. Журавлеву. Автор благодарит сотрудников группы биоинженерии В.П. Булгакова за ценные консультации по исследовательской работе, Ю.Н. Шкрыль за помощь в освоении методик молекулярной биологии. Автор искренне благодарит сотрудника группы биоинженерии Г.К. Чернодед за получение каллусных культур марены. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН Н.П. Мищенко, П. С. Дмитренок, Д. Л. Аминину и БНИ ДВО РАН Т. Ю. Горпенченко за помощь в проведении экспериментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали трансформированные генами rolA, rolB, rolC и диким штаммом Agrobacterium rhizogencs А4 каллусные культуры марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) — RA, RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M, RC-H, RA4, соответственно. Нетрансформированная культура R использовалась в качестве контроля. Культуры были получены Г.К . Чернодед и В.П . Булгаковым методом агробактериальной трансформации (Bulgakov et al., 2002). Трансгенная каллусная культура, экспрессирущая гены rolA, В и С одновременно (RABC) была получена нами из листьев марены таким же способом. Культуры выращивали на питательной среде wb/a (Bulgakov et al., 1998), содержащей ростовые факторы 6-бензиламинопурин и П-нафтилуксусную кислоту.

Для выделения РНК использовали метод, разработанный для растений с высоким содержанием вторичных метаболитов (Bekesiova et al., 1999). Обратную транскрипцию (ОТ) проводили с использованием набора фирмы Силекс (Москва, Россия), амплифицированную кДНК получали при помощи набора Mint фирмы Евроген (Москва, Россия). Определение концов кДНК проводили с помощью метода, основанного на явлении переключения матриц (template switching effect) и селективной супрессии полимеразной цепной реакции (Г1ЦР) (Matz et al., 1999; Лукьянов и др., 1999), используя препараты амплифицированной кДНК марены.

Полуколичественный анализ экспрессии генов rol, кальцийзависимой протеинкиназы (RcCDPK3) и изохоризматсинтазы (RcICSl) проводили с использованием специфических праймеров, количественно измеряя продукты амплификации в экспоненциальной стадии 1ЩР при помощи системы автоматизированного электрофореза "Expcrion" (Bio-Rad, США) с использованием технологии Lab-On-Chip (Gottwald et al., 2001). Уровень экспрессии изоформ гена НАДФН-оксидазы марены (RcRbohl, 2, 3) определяли методом подсчета клонов каждой изоформы гена, полученных при клонировании фрагментов Rboh, амплифицированных с вырожденными праймерами 5'-TTY TAY TGG GTN ACN MGN GAR-3' и 5'-RAA RTK YTC YTT RTG RAA-3', в вектор pTZ57RЯ (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Экспрессию всех генов нормализовали по уровню экспрессии гена актина марены (RcAct, код доступа в GeneBank DQ531565). Все продукты ПЦР бьши секвенироваЕШ с праймерами М13 (Fermentas, Vilnius, Lithuania) при помощи набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perking-Elmer Biosystems, Forster City, CA) согласно рекомендации фирмы-производителя. После осаждения этанолом последовательность была определена на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Поиск гомологов секвенированных фрагментов кДНК осуществляли в базе данных последовательностей GenBank в программе BLAST (Altschul et al., 1990). Аминокислотные последовательности, соответствующие секвенированным фрагментам кДНК, определяли в программе Gene Runner 3.0. Сравнение секвенированных участков генов марены с соответствующими генами из других видов растений проводили в программе ClustalX 1.81, филогенетические деревья строили на основе произведенных сравнений в программе Tree View 1.6.6 (Feng, Doolittle, 1987).

Определение содержания антрахинонов проводили спектрофотометрическим методом (Mischenko et al., 1999).

Измерение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК) проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 510 meta (Carl Zeiss, Germany), оснащенном аргоновым лазером, мощностью 30 мВт с использованием флуоресцентных красителей: 50 мкМ 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA, Molecular Probes, Eugene, OR), 10 мкМ дигидрородамин 123 (H2R123, Molecular Probes).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индивидуальное и совместное действие генов rol в трансгенных культурах марены сердцелистной

Характеристика клеточных культур, трансформированных генами rolA, rolABC и диким штаммом A4. Нетрансгенная культура R, имеет вид рыхлой желтой ткани, в то время как трансформированные культуры RA, RABC и RA4 имеют более насыщенную окраску. Все культуры обладают стабильным ростом и минимальной изменчивостью по накоплению биомассы в течение длительного выращивания.

Доказательство трансгенности RA, RABC и RA4 культур марены сердцелистной. Для доказательства встройки генов rol в культурах RA, RABC и RA4 проводили ПЦР

со специфическими праймсрами к генам rolA, rolCu rolB на препаратах ДНК, выделенных из всех трех культур одного срока культивирования (рис. 1). В ДНК, выделенной из контрольной культуры, нет последовательностей гомологичных праймерам. Культура RA содержит только ген rolA, а культуры RABC и RA4 содержат все три гена rol.

_го/А_ _rolB_ _rolC_

М Nc Pe RA RABC RA4 R Nc Pe RABC RA4 R Nc l*c RABCRA4 tt

1500 _______________.

HHMfl.tl. S; -

Wtn.H. ■ - •

Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации генов rolA, rolB и rolC из трансгенных культур Rubia cordifolia. М — маркер молекулярных весов 100-1500 п.н.; РС — позитивный контроль (плазмнда PCVÜOl-rolABC)', NC — негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой ДНК); R — ^трансформированная культура; RA —гоМ-культура; RABC — rolABC-культура; RA4 — А4-культура.

Доказательство экспрессии генов rol в rolA-, rolABC- и А4- культурах марены. Для детекции экспрессии генов rol в трансгенных культурах использовали кДНК культур марены R, RA, RABC и RA4. В результате ПЦР со специфическими праймерами к генам rolA, В и С ( рис. 2) на кДНК культур R, RA, RABC и RA4 были получены сигналы, которые показали наличие экспрессии генов rol в трансгенных культурах.

а) \с рс u ra плис KA4 Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов г эг —у "jí'.Tlt ""1 амплификации гена актина марены (а) и генов rolA, rolB и wrrtb' rolC (б) из трансгенных культур Rubia cordifolia'. NC —

б) IV u ra к лис КЛ4 негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой

''""ir—*r р (*■ | ДНК), PC — позитивный контроль: амплифицированная

U.J JL.jL i кДНК марены (а) и плазмида РСУ002-гоШС (б), R —

пт _ ^трансформированная культура, RA — го/Л-культура,

Г 1ПГ 'V У" 1 RABC —гоШС-культура, RA4 —А4-культура. L—i— ________-¡ ..««— ,

rolC

> JT "i' ! >t T^ uJi___Jkj. i< . JL-J

Характеристика трансгенных линий марены сердцелистной с разным уровнем экспрессии генов rolB и rolC. Для выявления индивидуального воздействия генов rolB и rolC мы исследовали три клеточные линии, экспрессирующие ген rolB — RB-L, RB-M и RB-H и три линии, экспрессирующие ген га/С— RC-L, RC-M и RC-H (от англ. low — низкий, moderate — средний, high — высокий). Трансгенность этих культур была доказана ранее (Шкрыль, 2006). Анализ экспрессии траисгенов показал, что экспрессия генов rolB и rolC максимальна в культуре RB-H и RC-H и минимальна в культурах RB-L и RC-L, соответственно. Экспрессия этих генов в культурах RABC и RA4 соответствует таковой в линиях RB-M и RC-M, соответственно. Уровень экспрессии гена rolA в культуре RA ниже, чем в культурах RABC и RA4 в 2 и 1.9 раза соответственно. Уровень экспрессии гена rolB в культуре RABC выше, чем в культуре RA4 в 1.53, а генов rolA и rolC значительно не различались.

Индивидуальное и совместное действие генов rol на рост культур, синтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы. Накопление биомассы в культуре RA в 1.5 раза выше, чем в контрольной культуре. Экспрессия гена rolB приводила к ингибированию роста культур — 85% от контроля в культуре RB-L и 59% и 35% от контроля в культурах RB-M и RB-H, соответственно. Индивидуальная экспрессия гена rolC и совместная экспрессия генов rolA, rolB и rolC не оказали значительного влияния на рост культур RC-L, RC-M, RC-H, RABC и RA4 по сравнению с контролем (рис. 3, а). Содержание антрахинонов в RA культуре в 2.7 раза выше, чем в R культуре. Содержание антрахинонов в культурах RB-L, RB-M и RB-H в 2.8, 11.7 и в 14.8 раз, соответственно, превышает содержание антрахинонов в R культуре. Содержание антрахинонов в культурах RC-L, RC-M и RC-H в 2, в 3 и в 4.3 раза, соответственно, выше по сравнению с контрольной культурой. Совместная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в RABC и RA4 привела к увеличению содержания антрахинонов в 6.5 и в 4.5 раза, соответственно, по сравнению с R культурой (рис. 3, б).

)

б)

3 Г',

.OI.

К RA RK-I. RB-M RB-H RC-L RC-M RC-H RABC RA4 Клеточные линии марены

Рис. 3. Индивидуальное и совместное действие генов rol на рост культур (а) и синтез антрахинонов (б). R — контрольная культура, RB-L, RJ3-M, RB-H — ro/Л-культуры, RC-L, RC-M, RC-H ro/C-культуры, RABC — то/ЛВС-культура, RA4 — А4-культура. Данные представлены как среднее значение ± С.О.

Изохоризматсинтаза (ICS) — это фермент, который направляет метаболиты шикимовой кислоты в биосинтез антрахинонов (Tegelen et aL, 1999). Уровень экспрессии гена RcICS в культурах RB-M и RJ3-H выше, чем в R культуре в 13 и 9 раз, соответственно. В культурах RC-M и RC-H — в 2.5 и 4.5 раза, соответственно. В культурах RA, RB-L и RC-L экспрессия гена RcICS превышает экспрессию в R культуре в 2.3, в 2.1 ив 1.8 раза, соответственно. В культурах RABC и RA4 экспрессия гена Rc/CS выше, чем в R культуре в 7.2 и в 5.1 раза, соответственно (рис. 4, б). В культурах с разной интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC — RB-L, RB-M, RB-H, RC-L, RC-M и RC-H выявлена положительная корреляция между уровнем экспрессии трансгенов и Re ICS (r=Q.839; Р<0.001 и r=0.953; РО.ОО1, где г — коэффициент корреляции). Экспрессия генов rolC и rolA в культурах RABC и RA4 примерно одинаковая, при этом экспрессия гена rolB в культуре RABC выше, чем в культуре RA4 в 1.5 раза, что, по-видимому, привело к более высокому уровню экспрессии гена RcICS (в 1.6 раза) и более высокому содержанию антрахинонов в этой культуре (рис. 4).

Ik.

о/а

Uro! It

ПгЫС

ОгЫА

r ra rb-i. rb-m rb-h rc-l rc-m rc-h rabc ra4

Клеточные линии марены

Рис. 4. Полуколичественный анализ экспрессии гена RcICS и генов rol в трансгенных культурах марены. R контрольная культура, RB-L, RB-M, RB-H — го/5-культуры, RC-L, RC-M, RC-H — rolC-культуры, RABC — rolABC-культура, RA4 — А4-культура. Данные представлены как среднее значение ± С.О.

Влияние генов rol на содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках марены сердцелистной

Содержание активных форм кислорода в трансгенных культурах марены. Постоянная экспрессия генов rol в культуре клеток растений приводит к повышению экспрессии PR-белков (Kiselev et al., 2006) и активации биосинтеза фитоалексинов (Yoshikawa et al., 1987; Rhodes et al., 1990; Trypsteen et al., 1991; Palazyn et al., 1998; Kiselev et al., 2007), к которым относятся и антрахиноны. Таким образом , rol-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов в культурах марены является частью патоген-индуцируемого защитного механизма растений. Защитные реакции растений напрямую связаны с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Тарчевский, 2002) и с окислительным взрывом, в результате которого происходит быстрое образование активных форм кислорода (АФК) — супероксида аниона, перекиси водорода, синглетного кислорода и радикала гидроксила (Полесская, 2007).

Мы предположили, что экспрессия генов rol оказывает влияние на НАДФН-оксидазную сигнальную систему и на внутриклеточное содержание АФК. Измерения содержания АФК проводили посредством конфокальной микроскопии с помощью флуоресцентного зонда дихлорфлуоресцеина (DCF). Клетки культур марены нагружали DCF и наблюдали флуоресценцию зонда при его взаимодействии с АФК (рис. 5, а, б — зеленая флуоресценция). Интенсивность свечения исследуемых клеток соответствует содержанию АФК в цитоплазме этих клеток. Для подтверждения данных, полученных с помощью DCF зонда, был использован другой зонд — дигидрородамин 123 — R123. Этот зонд специфичен для АФК, генерируемых митохондриями клетки (рис. 5, а, б — розовая флуоресценция).

Содержание АФК в культурах RA, R-ABC, R-A4 и R существенно не различается. Флуоресценция зондов в культурах, экспрессирующих ген rolB, незначительно ниже, чем в контрольных клетках. Флуоресценция DCF и R123 в клетках RC-L и RC-H значительно ниже, чем в нетрансгенной культуре. Содержание АФК в культуре с высоким уровнем экспрессии трансгена гораздо ниже, чем в культуре с низкой его экспрессией. Таким образом, мы показали зависимость между степенью понижения содержания АФК и уровнем экспрессии гена rolC (рис. 5, а, б).

б)

R RA R-ЛВС R-A4

Клеточные лишш марены

"vj / "*v~ "»i-, и - -__ti » * . í

4 * ** r * .у rc-l rc-H

r rc-L rc-H

Рис. 5. Содержание активных форм кислорода в трансгенных и контрольной культурах марены сердцелистной: Я

нетрансформированная культура; ЯА

— то/Л-культура; ЯВ-Ь, ЯВ-М, ЯВ-Н

— гоМ-культуры; ЯС-Ь, ЯС-М, ЯС-Н

— го/С-культуры; ЯАВС — го1АВС-культура; ЯА4 — А4-культура. а) — количественная оценка флуоресценции ОСР (зеленая флуоресценция) и Я123 (розовая флуоресценция) в культурах марены. Данные представлены как среднее значение ± С.О. б) — визуализированное с помощью БСБ и Я123 зондов содержание АФК в контрольных и го1С-экспрессирующих клетках марены.

R RC-L RC-H

Клеточные линии марены

Воздействие абиотических факторов на rol-экспрессирующие культуры марены сердцелистной

Влияние температурного стресса на содержание активных форм кислорода в rolC-трансгенных культурах. При понижении или повышении температуры, засолении, воздействии тяжелых металлов, УВ-облучении и др., окислительный взрыв приводит к гибели клеток (Полесская, 2007). Более устойчивые к негативным абиотическим воздействиям формы растений обладают более высоким содержанием ферментов, участвующих в элиминировании кислородных радикалов (Browse, Xin, 2001; Jiang, Deyholos, 2006). Таким образом, чем меньше АФК продуцируют клетки растения в ответ на стрессовое воздействие, тем выше их устойчивость к этому воздействию (Kiraly et al., 2005).

Мы предположили, что пониженное содержание АФК оказывает положительное влияние на устойчивость rolC-клеток к световому и тепловому стрессу. Культуры RC-L и R были подвергнуты облучению аргоновым лазером (488 нм) с интенсивностью 5.9 % в течение 15.8 мин. При этом клетки нагружали зондом DCF и фиксировали накопление АФК. Облучение контрольной культуры привело к массивному окислительному взрыву на протяжении всего времени воздействия. Кривая накопления АФК в R культуре вышла на плато после 600 сек облучения. При

этом облучение лазером культуры ЯС-Ъ не привело к окислительному взрыву. При трехкратном увеличении интенсивности лазера было отмечено незначительное повышение содержания АФК в го1С-клетках. Кривая накопления АФК вышла на плато уже после 300 сек облучения (рис. 6). Такая особенность накопления АФК в го/С-клетках указывает на ингибирование процессов генерации АФК за счет действия продукта гена го1С. Другими словами, го/С-клетки не способны к генерации высокого уровня АФК даже при воздействии неблагоприятных факторов.

Рис. 6. Влияние светового и теплового стрессов на накопление АФК в контрольных и го/С-экспрессирующих клетках марены сердцелистной. Я —нетрансгенная культура марены, ЯС-Ь — культура марены с низкой экспрессией гена го1С\ а) — облучение лазером с интенсивностью 5.9%, б) — облучение лазером с интенсивностью 17.7%.

Влияние солевого стресса на содержание активных форм кислорода в rolC-трансгенных культурах марены. NaCl, ингибируя некоторые антиоксидантные ферменты, вызывает массированный окислительный взрыв, который в свою очередь приводит к гибели подвергшегося воздействию растения (Avsian-Kretchmer et al., 2004). Культуры R, RC-L и RC-H были подвергнуты воздействию 150 мМ NaCl в течение 30 мин. Затем клетки нагружали зондом DCF и наблюдали изменение флуоресценции по сравнению с контрольными клетками. В клетках R культуры было зафиксировано значительное повышение содержания АФК. В клетках культур RC-L и RC-H так же содержание АФК под воздействием NaCl повысилось. Но при этом содержание АФК в rolC клетках марены инкубированных с NaCl было меньше, чем в R клетках, не подвергнутых воздействию NaCl (рис. 7). Результаты этого эксперимента указывают на схожую способность культур R, RC-L и RC-H к нейтрализации продуктов окислительного взрыва и на пониженную способность го/С-культур к генерации АФК

Рис. 7. Влияние солевого стресса на накопление АФК в нетрансгенной (R) и rolC-экспрессирующих (RC-L, RC-H) культурах марены. Данные представлены как среднее значение ± С.О.

Изучение устойчивости го1-экспрессирующих культур марены к солевому стрессу. Нетрансгенную культуру R и трансгенные культуры ЯА, РБ-Ь, 11В-Н, КС-Ь, RC-H, R-ABC и R-A4 выращивали на питательных средах с добавлением №С1 в различных

концентрациях: 0, 20, 60 и 200 мМ. Концентрация №С1, при которой гибнет 50% клеток для культуры Я оказалась самой низкой — 16.5 мМ. Для ЯВ-Ь

культуры 1^50 составила 20мМ №С1. Для ЯА и 11В-Н культур ЬБ5о составила 23.5 и 26.8 мМ ЫаС1, соответственно. Культура ШЗ-Ь более чем в 2 раза устойчивее культуры Я — ЬО50 составила 36.7 мМ ЫаС1. Наибольшую устойчивость к солевому стрессу показала культура ЯС-Н, для нее ЬО50 составил 69.8 мМ №С1. Устойчивость к ЫаС1 культур ЯАВС и ЯА4, оказалась выше, чем у культуры ЯС-Ь, но ниже, чем у ЯС-Н, и 1^50 для них составила 45.6 и 41.7 мМ ЫаС1, соответственно. Возможно, это связано с тем фактом, что ген го/С в культурах ЯАВС и ЯА4 экспрессируется на уровне культуры ЯС-М (рис. 8). Таким образом, мы показали, что максимальная устойчивость к солевому стрессу выявлена у культур, экспрессирующих ген го1С — ЯС-Ь, ЯС-Н, И-АВС и ЯА4. При этом, чем выше уровень экспрессии трансгена, тем выше устойчивость культуры к ЫаС1.

70 £ »

'Л

Рис. 8. Устойчивость клеточных культур марены, экспрессирующих гены rol, к солевому стрессу. R

^трансформированная культура; RA — rolA-культура; RB-L, RB-M, RB-H — rolB-культуры; RC-L, RC-M, RC-H — rolC-культуры; RABC — ro/ЛЙС-культура; RA4 — А4-культура. Данные представлены как среднее значение ± С.О.

RC-L ВС-Н марены

Устойчивость rol-экспрессирующих культур марены к температурному стрессу. Другим абиотическим фактором, оказывающим стрессовое воздействие, является понижение или повышение температуры (Kratsch, Wise, 2000). Гибель растений при нефизиологических температурах, называют фотоокислительной смертью (Kiraly et al., 2005). Клеточные линии марены R, RA, RB-L, RB-H, RC-L, RC-H, R-ABC и R-A4 выращивали в условиях повышенной температуры (28°С) и при нормальной температуре (25°С). Результаты эксперимента показали наличие устойчивости к повышенной температуре у всех трансгенных культур. Менее устойчивой оказалась культура RB-L; прирост биомассы культур RA, RB-H и RC-L вдвое превышал прирост биомассы культуры R. Максимальная устойчивость была выявлена у культуры RC-H — прирост биомассы был в 4 раза выше, чем у нетрансгенной культуры R. Устойчивость культур RABC и RA4 занимает промежуточное положение между RC-L и RC-H культурами (рис. 9, а).

Культуры R, RB-L, RB-H, RC-L и RC-H выращивали в условиях пониженной (8°С) и при нормальной температурах (25°С). Культуры RB-L и RB-H оказались более устойчивы, чем R культура в 2.2 и 2.6 раза, соответственно. Устойчивость культур RC-L и RC-H в 4.6 и 6.2 раза, соответственно превышает устойчивость R культуры (рис. 9, б).

Повышение устойчивости к температурным стрессам по сравнению с R культурой присуще всем го/-экспрессирующим линиям марены; максимальная устойчивость

отмечена для го1С- культур. Степень повышения устойчивости го/С-культур относительно И-культуры коррелирует с уровнем экспрессии трансгена.

а)

3 IZO

1 И»

28 С

ЕЁ

К \ UBI, RB-I1 КС-I UC-I! К ЛВС К л с ro'miJc. jifiiini мироны

б)

Iм

8 С

ЕЙ

Рис. 9. Устойчивость клеточных культур марены,

экспрессирующих гены rol, к температурному стрессу, а) — устойчивость культур к повышению температуры до 28°С:

R —(^трансформированная культура; RA — го 1А-культура; RB-L, RB-M, RB-H — rolB-культурьг; RC-L, RC-M, RC-H — го/С-культуры; RABC — rolABC-культура; RA4 — А4-культура. б) — устойчивость культур марены с низкой и высокой экспрессией генов rolB (RB-L и RB-И) и rolC (RC-L и RC-H) к понижению температуры до 8 С' Данные представлены как среднее значение ± С.О.

Кле I очт.|с линии марены

Воздействие генов rol ни НАДФН-оксидазную сигнальную систему

Влияние генов rol на кальциевую сигнальную систему в rol-экспрессирующих культурах марены. При неблагоприятных воздействиях содержание активных форм кислорода в растительной клетке значительно увеличивается, что приводит к окислительному взрыву (Hippeli et al., 1999). При этом запускается механизм генерации АФК ферментом НАДФН-оксидазой (Moshe, Robert, 2006; Sagi et al., 2006). Регуляция работы этого фермента осуществляется за счет кальциевой сигнальной системы, основными составляющими которой являются кальциевые каналы и кальцийзависимые протеинкиназы (CDPK). Активность кальциевых каналов обеспечивает присутствие в клетке кальция, необходимого для активирования НАДФН-оксидаз и CDPK. CDPK. фосфорилируют определенные формы НАДФН-оксидаз, тем самым активируя их (Kobayasi et al., 2007). Мы предполагаем, что постоянная экспрессия гена rolC оказывает ингибирующие действие на работу НАДФН-оксидазы или кальциевой сигнальной системы. Ранее были изучены токи кальция в клетках культур R и RC-L под действием Н202 (Шкрыль, 2006). Результаты этих экспериментов позволили предположить, что активность НгСЬ-индуцируемых кальциевых каналов в ro/C-культуре марены значительно ингибирована относительно нетрансгенной культуры.

Изоформа StCDPK5 картофеля (Solarium tuberosum L.) активирует иатогениидуцируемую НАДФН-оксидазу картофеля, что приводит к увеличению содержания АФК (Kobayasi et al., 2007). С помощью ПЦР с вырожденными праймерами мы идентифицировали форму CDPK марены, высокогомологичную (идентичность а. о. — 94%) форме StCDPK5 — RcCDPK3 (рис. 10). Анализ экспрессии гена RcCDPK3 в культурах R, RC-L и RC-H показал, что в га/С-к летках RC-L и RC-H экспрессия гена RcCDPK3 снижена относительно R культуры и составляет 74% и 36%, соответственно (рис. 11). Полученные данные указывают на ингибирующие влияние экспрессии гена rolC на кальциевую сигнальную систему, за счет которой осуществляется регуляция работы НАДФН-оксидаз.

Влияние гена rolC на экспрессию НАДФН-оксидазы в rolC-трансгенных культурах марены. НАДФН-оксидазы растений, гомологи НАДФН-оксидазы фагоцитов человека

gp91 phox (Groom et al, 1996), иначе называемые Rboh (respiratory burst oxidase homolog), генерируют АФК, вызывая тем самым окислительный взрыв (Doke, 1983; Keller et al., 1998; Torres et al., 1998; Amicucci et al., 1999; Yoshioka et al., 2001, 2003; Yoshie et al., 2005).

С помощью ПЦР с вырожденными праймерами были идентифицированы 3 формы Rboh марены: RcRbohl, RcRboh2 и RcRboh3. Основываясь на расположении этих форм Rboh марены в филогенетическом дереве, построенном на основе выравнивания а. о. Rboh арабидопсиса, табака и картофеля (рис. 12), мы предположили, что экспрессия гена RcRbohl является патоген-индуруемой, a N-конец белка RcRbohl содержит мотив для активирования посредством RcCDPK3. Экспрессия генов RcRboh2 и RcRboh3 является постоянной и активирование этих форм НАДФН-оксидаз посредством RcCDPK3 фосфорилирования маловероятно (Kobayasi et al., 2007).

■СЕ

-СЕ

-СЕ СЕ

AtCDPK3(Al4g236S0)

NtCDPK3(AJ344155)

mcdpkhmjo«*»

AtCDPK2(At3glOWO)

ReCDPI<3(i;F090620)

AICDPK2aA!48382301

StCDPK4(AB279737)

StCDPKS(A0279738)

AtCDPK25(At2g35l90)

RCCDPK2(EF090621)

AlCDPK4(At4g09S70)

SICDPK3(AB05I809)

AtCDPK24(At2g3IS00)

AICDPI<10(AllglS190)

AtCDPK13<AO«Sl«SO)

RcCDPKI (DQ531564)

AtCDPK14(At2e41860)

AtCDPK32(At3g57530)

AtCDPK19(Atlg61950)

AtCDPK16(Al2gl7W0)

AtCDPK16(Al4g36070)

AtCDPK2a(At5gS6210)

NtCDPK4(AF43S4SI)

NtCDPkS(AV971376)

NtCDPK1(AF072908)

AtCDPK2KAt4g04720)

A1CDPK27(A14604700)

AtCDPK3(At3g204!0)

StCDPK2CAf4l8561)

N1CDPKI!(AJ549!IO)

StCDPK1(DQ5irJS62)

Рис. 10. Филогенетическое дерево, построенное в программе Тгее\,1е\у на основе выравнивания ами-нокислотных последова-тельностей СОРК араби-донсиса — А. ЛаИапа (А1СОРК), табака — N. шЬасит (№СБРК), картофеля — ¡¡.шЬегояит (51СОРК) и марены

R.cordifolia полученного в ClustalX.

(RcCDPK), программе

«6 §

С) о

ш.

Рис. 11. Полуколичественный анализ экспрессии гена ЯсСОРКЗ в иетрансгсмной (Я) н га/С-экснрессирующих (ЯС-Ь и ИС-Н) культурах марены. Данные представлены как среднее значение ± С.О.

RC.1. RC-II

Клеточные линии марены

Полуколичественный ОТ-ПЦР анализ показал, что в культурах ЯС-Ь и КС-Н экспрессия гена ЛсЛ^оЛУ значительно снижена относительно Я культуры и составляет 72% и 17%, соответственно. Экспрессия генов /?сЙ6о/г2 и ЯсЯЬо/гЗ в культурах Я и ЛС-Ь значительно не различалась, в то время как в культуре ИС-Н эти конститутивные формы экспрессировались на крайне низком уровне (рис. 13).

а®ЬоЬа(А15807390> рис 12. Филогенетическое дерево, построенное в программе ТгееУ1еш на основе

выравнивания аминокис-лотных последовательностей ШюЬ

арабидопеиса — АлИаНапа (АПИзоИ), табака — N. шЬасит (Ы1ЯЬоЬ) и N. ЬешИштапа (МЬЛЬоЬ), картофеля — ¡¡ЛиЬеговит ^ЯЬоЬ) и марены -

■CZ

-CZ

-а d

RrRbohl

StRboIJ)(BAE79345)

StRboliC(BAE79344)

NbRbohB(BAC56865)

NtRbohD(ABN58915)

.4iRbobD{At5g47910)

AtRboliB(Atlg09090)

SlRboKB (BAB7075I)

AtRb olj (At4g 1123 0)

AtRboliE(AUg64060)

StRboliF(BAB84124)

RcRboU

StRbohA(BAB7075ö) NbRbohA(BAC56864) NtRhüliF (ABS85195) AtRboliE(AtlE19230) RcRboli2

AiRWuT(At3g45810) AtRboUKAt5g60010) AiRbohG(At4g25090) AtRbohC(AtSg51060)

R.cordifulia

полученного

ClustalX.

(КсЯЬоЬ), программе

Рис. 13. Полу количественный анализ экспрессии генов КсКЬоЬ/, 2 и 3 в [^трансформированной культуре 11 и го/С-культурах ЯС-Ь и ЛС-Н.

К кс-ь кс-н

Клеточные линии марены

Общая схема предполагаемого механизма го1С-индуцируемого ингибирования генерации активных форм кислорода. В данном исследовании было выявлено значительное снижение содержания АФК в ro/C-клетках марены по сравнению с нетрансгенными, коррелирующее с уровнем экспрессии трансгена. При этом rolC-клетки генерируют гораздо меньше АФК в ответ на различные абиотические стрессы, что, повидимому, придает этим клеткам повышенную устойчивость. Чтобы объяснить этот феномен, было изучено влияние экспрессии гена rolC на систему регуляции окислительного взрыва.

Было выявлено ингибирующее влияние экспрессии гена rolC на активность Н2О2-индуцируемых каналов, что не позволяет повышать содержание кальция в клетке при стрессовом воздействии. Это приводит к тому, что активность белков RcCDPK3 и RcRbohl, зависящая от наличия ионов кальция, не повышается. Малоактивный белок RcCDPK3 не активирует RcRbohl посредством фосфорилирования. Изучив влияние гена rolC на экспрессию генов RcCDPK3 и RcRbohl, мы обнаружили, что происходит ее значительное понижение. При этом в RC-H культуре понижена экспрессия даже конститутивных форм генов RcRboh2 и RcRbohS.

Мы предполагаем, что все эти явления приводят к постоянному пониженному содержанию АФК в ro/C-клетках марены. И, кроме того, препятствуют окислительному взрыву при воздействии температурного и солевого стрессов, что придает /-о/С-культурам марены повышенную устойчивость к этим воздействия по сравнению с нетрансгенной культурой или культурами, экспрессирующими другие гены rol.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспрессия агробактериальных генов rol оказывает различные эффекты на трансгенные культуры. В основном исследователи уделяли внимание такому эффекту как активация вторичного метаболизма. В этом аспекте изучалось действие генов rolB и rolC и дикого штамма Л. rhizogenes А4 (Moyano et al., 1999).

Известно, что вторичный метаболизм растений напрямую связан с системой патоген-индуцируемого защитного механизма (Тарчевский, 2002). Поэтому мы предположили, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC в культуре растительных клеток способна повлиять не только на вторичный метаболизм, но и на устойчивость культур к неблагоприятным абиотическим воздействиям.

Нами было исследовано индивидуальное действие генов rolA, rolB и го 1С с разным уровнем экспрессии трансгена в культуре клеток марены сердцелистной. Для выявления эффектов генов rol при их совместной экспрессии мы исследовали клеточные культуры марены, трансформированные диким штаммом A. rhizogenes А4 и конструкцией rolABC.

Нами было показано, что во всех го/-экспрессирующих культурах марены активирован биосинтез антрахинонов и повышен уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы — ключевого фермента биосинтеза антрахинонов. В rolB- и го/С-культурах с разным уровнем экспрессии трансгена мы показали наличие положительной корреляции между интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC и биосинтетическими показателями культур. Из полученных данных мы сделали вывод, что максимальная активация биосинтеза антрахинонов наблюдается при экспрессии гена rolB. Этот эффект был описан как для культур, экспрессирующих только ген rolB, так и для культур, экспрессирующих все три гена rol..

Исследовав влияние неблагоприятных абиотических воздействий на клеточные культуры марены, мы показали, что все го/-экспрессирующие культуры обладают повышенной устойчивостью к этим воздействиям. При этом наибольшую устойчивость 1С солевому и температурным стрессам показали культуры, экспрессирующие ген rolC, как индивидуально, так и совместно с генами rolA и rolB.

Таким образом, мы показали, что вышеописанные эффекты генов rolB (активация биосинтеза антрахинонов) и rolC (повышение устойчивости к негативным абиотическим воздействиям) сохраняются и при совместной их экспрессии в клетках RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

Поскольку экспрессия генов rol в клеточных культурах марены приводит к активации биосинтеза антрахинонов, можно было ожидать, что при этом происходит значительное повышение содержания активных форм кислорода в трансгенных клетках. Однако, мы показали, что только индивидуальная экспрессия гена rolC оказывает влияние на содержание АФК. При этом экспрессия гена rolC не повышала, а напротив значительно понижала содержание АФК в клетках, в то время как индивидуальная экспрессия генов rolA и rolB на содержание АФК не влияла. Кроме того, была значительно снижена способность го/С-клеток генерировать окислительный взрыв в ответ на стрессовые воздействия. Такой эффект гена rolC был нейтрализован в культурах, экспрессирующих все три гена rol.

биосинтеза антрахинонов не связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой, как этого можно было ожидать.

Экспериментальные данные показали, что в га/С-культурах значительно снижена экспрессия генов НАДФН-оксидаз — основных источников АФК в клетке. Кроме того, мы показали, что экспрессия гена го/С оказывает влияние и на систему регуляции этого фермента: кальциевые каналы и ЯсСОРКЗ. Принимая во внимание данные о действии Н2СЬ на токи кальция в клетках культур Я и ЛС-Ь (Шкрыль, 2006), мы предположили, что активность Н202-индуцируемых кальциевых каналов в го/С-культуре марены значительно ингибирована. Экспрессия гена ЯсСОРКЗ в культурах ЯС-Ь и НС-Н так же значительно снижена, что, возможно, приводит к понижению активности патоген-индуцируемой изоформы НАДФН-оксидазы марены, как это было описано для 81СОРК5 и НАДФН-оксидазы картофеля ^ЯВОНВ) (КоЬауавЫ еГ а/., 2007).

В нашем исследовании мы обнаружили новый способ повышения устойчивости клеток растений к абиотическим стрессам за счет влияния трансгена га/С на метаболизм АФК. Был частично изучен предполагаемый механизм этого явления. Дальнейшее более детальное изучение га/-опосредованных эффектов на сигнальные системы клеток растений может иметь значение для управления защитным аппаратом растительного организма.

ВЫВОДЫ

1. Была получена трансгенная культура марены ЯАВС, экспрессирующая совместно агробактериальные гены ю1А, го1В и го!С.

2. Для культур с разной интенсивностью экспрессии генов га/б и га/С — 1Ш-Ь, ЛВ-М, ЯВ-Н, ЫС-Ь, 11С-М и КС-П было показано наличие положительной корреляции между уровнем экспрессии трансгенов и гена изохоризматсинтазы марены: г=0.839; Р<0.001 и 1=0.953; Р<0.001, соответственно, где г — коэффициент корреляции.

3. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген го!С, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой. Повышение устойчивости го/С-клеток к стрессовым воздействиям возможно связано с понижением их способности генерировать АФК в ответ на абиотический стресс

4. С повышением уровня экспрессии гена га/С содержание активных форм кислорода в трансгснных клетках снижается по сравнению с контрольными клетками.

5. Экспрессия гена га/С вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же ингибирующе влияет на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

6. Эффекты экспрессии генов го1С (повышение устойчивости) и го1В (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах ИАВС и ЯА4, но друг друга не усиливают.

¡9

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Shkryl Y.N., VeremeichikG.N., Bulgakov V.P.,TchernodedG.K.,Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Individual and Combined Effects of the /о/А, В, and С Genes on Anthraquinone Production in Rubia cordifolia Transformed Calli // Biotechnology and Bioengineering. 2008. V. 100. P. 118-125.

2. Bulgakov V.P., Aminin D.L., Shkryl Y.N., Gorpenchenko T.Y., Veremeichik G.N., Dmitrenok P.S., Zhuravlev Y.N. Suppression of reactive oxygen species and enhanced stress tolerance in Rubia cordifolia cells expressing the rolC oncogene // Molecular Plant-Microbe Interaction. 2008. V. 21. № 12. P. 1561-1570.

Работы, опубликованные в материалах всероссийской и международной конференций

3. Шкрыль Ю.Н., Веремейчик Г.Н., Булгаков В.П. 2006. Гены rol стимулируют экспрессию изохоризматсинтазы в трансгенных культурах Rubia cordifolia 11 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. — Пущино.С.406.

4. Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Gorpenchenko T.Y., Bulgakov V.P., Aminin D.L., Zhuravlev Y.N. 2008. ROS (reactive oxygen species) suppression induced by the Agrobacterium rhizogenes oncogene in Rubia cordifolia transformed cells // Taiwan-Russia bilateral symposium on plant biodiversity and bioactive natural products. — Taiwan. P. 107-115.

ВЕРЕМЕЙЧИК ГАЛИНА НИКОЛАЕВНА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СПЕЦЗАКАЗ. УСЛ.П.Л. 1.0. УЧ.-ИЗД.Л. 0.8

ФОРМАТ 60X84/16 ТИРАЖ 100 ЭКЗ. ЗАКАЗ 1118/1 ИЗДАНО ООО «МК-СЕРВИС». 690041, Г. ВЛАДИВОСТОК, УЛ. РАДИО, 5. ОТПЕЧАТАНО ООО «МК-СЕРВИС», ТЕЛ. 310-687

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Веремейчик, Галина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика марены сердцелистной (Rubia cordifolia)

1.2. Агробактериальная индукция онкогенеза у растений

1.3. Агробактериальные гены rol — растительные онкогены

1.4. Активные формы кислорода, их роль в защитных реакциях растений

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования

2.2. Получение и культивирование клеточных культур марены

2.3. Выделение плазмидной ДНК

2.4. Выделение тотальной растительной ДНК

2.5. Выделение тотальной растительной РНК

2.6. Реакция обратной транскрипции и получение амплифицированиой кДНК

2.7. Доказательство трансгенности полученных культур

2.8. Доказательство экспрессии генов rol в трансгенных культурах

2.9. Анализ экспрессии гена изохоризматсинтазы (ICS)

2.10. Анализ экспрессии генов кальцийзависимых протеинкиназ (CDPK)

2.11. Анализ экспрессии генов НАДФН-оксидаз (Rboh)

2.12. Методы оценки уровня экспрессии генов

2.13. Секвенирование и анализ последовательностей

2.14. Химический анализ антрахинонов

2.15. Измерение концентрации внутриклеточного кальция

2.16. Измерение внутриклеточной концентрации активных форм кислорода

2.17. Флуориметрическое измерение активных форм кислорода

2.18. Масс-спектрометрический анализ содержания салициловой кислоты

2.19. Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1 Индивидуальное и совместное действие генов rol в трансгенных культурах марены сердцелистной

4.2. Влияние генов rol на содержание активных форм кислорода в трансгенных клетках марены сердцелистной

4.3. Воздействие абиотических факторов на rol-экспрессирующие культуры марены сердцелистной

4.4. Воздействие гена ro/С на НАДФН-оксидазную сигнальную систему в ro/C-культурах марены сердцелистной

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L."

Биотехнологическое производство биологически активных веществ связано с получением стабильных растительных штаммов-суперпродуцентов. В этой области биотехнология тесно связана с достижениями клеточной и генетической инженерии растений. Возможности генетической инженерии позволяют не только получать практически значимый результат, но и выявлять механизмы активации вторичного метаболизма в культуре клеток лекарственных растений для осознанного управления этими сложными процессами.

В последнее время усилия генетической инженерии растений направлены на изучение влияния регуляторных генов, активирующих вторичный метаболизм в клеточных культурах ценных лекарственных растений. Одним из перспективных направлений в этой области является исследование эффектов генов rol, участвующих в агробактериальной колонизации растений за счет горизонтального переноса генетического материала (Combard, Baucher, 1988; Hasen et al1991; Levesque et al., 1988). Экспрессия генов rol из Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes в трансгенных растениях или клеточных культурах вызывает активацию вторичного метаболизма (Moyano et al., 1999). Расшифровка механизма этого процесса позволит использовать этот метод как поливалентный для получения штаммов-суперпродуцентов.

Поскольку вторичный метаболизм сопряжен со сложным механизмом защитных реакций растений, мы предполагаем, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC способна в ряде случаев повысить устойчивость трансгенных клеток к негативным абиотическим факторам. Механизм го/-индуцируемой активации биосинтеза вторичных метаболитов в настоящее время активно изучается. Известно, что индивидуальная экспрессия генов rolB и rolC активирует биосинтез антрахинонов в культуре клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) (Bulgakov et al., 2002), ценного лекарственного растения, экстракт которого используют для лечения почечнокаменной болезни и в качестве антиоксидантного и противомикробного препарата (Gilani et al., 1994, Pandey et al., 1994, Singh et al., 2004, Manojlovic et al.,

2005). При этом изучение влияния экспрессии этих генов на устойчивость трансгенных клеток растений к абиотическим стрессам осталось в тени.

В данной работе мы впервые исследовали совместное влияние генов rolA, rolB и rolC на биосинтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы (гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов) в трансгенных культурах марены. Кроме того, в рамках исследования совместного и индивидуального влияния генов rol на устойчивость трансгенных клеток марены к стрессам мы изучали содержание активных форм кислорода в этих клетках, поскольку известно, что устойчивость растений к стрессам напрямую связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Yahraus etal., 1995).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление взаимосвязи между содержанием активных форм кислорода в клетках го/-трансгенных культур марены сердцелистной, их устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам и активацией вторичного метаболизма при совместном и индивидуальном действии агробактериальных онкогенов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Получить трансгенную культуру марены экспрессирующую совместно гены rolA, rolB и rolC — RABC,

4. Изучить реакцию трансгенных культур на воздействие негативными абиотическими факторами.

5. Исследовать влияние экспрессии гена rolC на механизм регуляции окислительного взрыва.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Повышение содержания антрахинонов и экспрессия гена изохоризматсинтазы в rolC- и ro/5-трансгенных линиях марены сердцелистной обнаруживают положительную корреляцию с уровнем экспрессии трансгенов.

3. Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости к стрессам) и rolB (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах RABC и RA4, но друг друга не усиливают.

Впервые показано, что в клетках, экспрессирующих ген rolC, снижено содержание активных форм кислорода, что, по-видимому, повышает устойчивость ro/C-культур к солевому и температурному стрессам. Показано, что в ro/C-клетках снижен уровень экспрессии патогениндуцируемой изоформы гена НАДФН-оксидазы марены и значительно ингибирован регуляторный механизм этого фермента.

Практическая значимость. Установлено, что в культурах марены сердцелистной с высоким уровнем экспрессии гена rolC повышена устойчивость к абиотическим стрессам по сравнению с контрольной культурой: в 4 раза при солевом стрессе и при повышении температуры и в 6,2 раза при понижении температуры. Изучен возможный механизм, обеспечивающий го/С-опосредованное повышение устойчивости клеток.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученных "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2006), на Международном симпозиуме по разнообразию и биологически-активным веществам растений (Taiwan-Russia Bilateral Symposium оп Plant Biodiversity and Bioactive Natural Products) (Тайвань, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии и группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН. Анализ содержания АФК в культурах марены выполнен совместно с Т. Ю. Горпенченко и Д. JI. Ампниным, а анализ содержания СК в культурах марены выполнен совместно с П. С. Дмитренок в центре коллективного пользования ДВО РАН.

Благодарности. Автор выражает свою глубокую признательность научному руководителю академику Ю.Н. Журавлеву. Автор благодарит сотрудников группы биоинженерии В.П. Булгакова за ценные консультации по исследовательской работе, Ю.Н. Шкрыль за помощь в освоении методик молекулярной биологии. Автор искренне благодарит сотрудника группы биоинженерии Г.К. Чернодед за получение каллусных культур марены. Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН Н.П. Мищенко, П. С. Дмитренок, Д. JI. Аминину и БПИ ДВО РАН Т. Ю. Горпенченко за помощь в проведении экспериментов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Веремейчик, Галина Николаевна

6. ВЫВОДЫ

1. Была получена трансгенная культура марены ЯАВС, экспрессирующая совместно агробактериальные гены го1А, го1В и го1С.

2. Для культур с разной интенсивностью экспрессии генов го1В и го1С — ЯВЬ, ЯВ-М, ЯВ-Н, ЯС-Ь, ЯС-М и ЯС-Н было показано наличие положительной корреляции между уровнем экспрессии трансгенов и гена изохоризматсинтазы марены: г=0.839; Р<0.001 и 1-0.953; Р<0.001, соответственно, где г — коэффициент корреляции.

3. Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген го1С, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой. Повышение устойчивости го/С-клеток к стрессовым воздействиям возможно связано с понижением их способности генерировать АФК в ответ на абиотический стресс

4. С повышением уровня экспрессии гена го1С содержание активных- форм кислорода в трансгенных клетках снижается по сравнению с контрольными клетками.

5. Экспрессия гена го1С вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же ингибирующе влияет на систему регуляции патогениндуцируемой формы НАДФН-оксидазы.

6. Эффекты экспрессии генов гоЮ (повышение устойчивости) и го1В (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии в культурах ЯАВС и ЯА4, но друг друга не усиливают.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами было исследовано индивидуальное действие генов rol A, rolB и rolC с разным уровнем экспрессии трансгена в культуре клеток марены сердцелистной. Для выявления эффектов генов rol при их совместной экспрессии мы исследовали клеточные культуры марены, трансформированные диким штаммом A. rhizogenes А4 и конструкцией rolABC.

Нами было показано, что во всех /*о/-экспрессирующих культурах марены активирован биосинтез антрахинонов и повышен уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы — ключевого фермента биосинтеза антрахинонов. В rolB- и ro/С-культур ах с разным уровнем экспрессии трансгена мы показали наличие положительной корреляции между интенсивностью экспрессии генов rolB и rolC и биосинтетическими показателями культур.

Из полученных данных мы сделали вывод, что максимальная активация биосинтеза антрахинонов наблюдается при экспрессии гена rolB. Этот эффект был описан как для культур, экспрессирующих только ген rolB, так и для культур, экспрессирующих все три гена rol. Блокирование тирозинфосфотазной активности белка RolB снимает этот эффект.

Исследовав влияние неблагоприятных абиотических воздействий на клеточные культуры марены, экспрессирующие гены rol A, rolB и rolC, мы показали, что все го/-экспрессирующие культуры обладают повышенной устойчивостью к этим воздействиям. При этом наибольшую устойчивость к солевому и температурным стрессам показали культуры, экспрессирующие ген rolC, как индивидуально, так и совместно с генами rol А и rolB.

Поскольку экспрессия генов rol в клеточных культурах марены приводит к активации биосинтеза антрахинонов, можно было ожидать, что при этом происходит значительное повышение содержания активных форм кислорода в трансгенных клетках. Однако, мы показали, что только индивидуальная экспрессия гена rolC оказывает влияние на содержание АФК. При этом экспрессия гена rolC не повышала, а напротив значительно понижала содержание АФК в клетках, в то время как индивидуальная экспрессия генов rolA и rolB на содержание АФК не влияла. Кроме того, была значительно снижена способность ro/C-клеток генерировать окислительный взрыв в ответ на стрессовые воздействия. Такой эффект гена rolC был нейтрализован в культурах, экспрессирующих все три гена rol.

Мы предполагаем, что ингибирующее действие гена rolC на систему генерации АФК обеспечивает го/С-клеткам повышенную устойчивость к абиотическим стрессам. При этом можно предположить, что го/-опосредованная активация биосинтеза антрахинонов не связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой, как этого можно было ожидать.

Экспериментальные данные показали, что в го/С-культурах значительно снижена экспрессия генов НАДФН-оксидаз — основных источников АФК в клетке. Кроме того, мы показали, что экспрессия гена rolC оказывает влияние и на систему регуляции этого фермента: кальциевые каналы и RcCDPK3. Принимая во внимание данные о действии Н202 на токи кальция в клетках культур R и RC-L (Шкрыль, 2006), мы предположили, что активность Н202-индуцируемых кальциевых каналов в ro/C-культуре марены значительно ингибирована относительно нетрансгенной культуры. Экспрессия гена RcCDPK3 в культурах RC-L и RC-H так же значительно снижена относительно контрольной культуры, что, возможно, приводит к понижению активности патоген-индуцируемой изоформы НАДФН-оксидазы марены, как это было описано для 81£ЮРК5 и НАДФН-оксидазы картофеля фКВОНВ) (КоЬауаэЫ е/ а1, 2007).

В нашем исследовании мы обнаружили новый способ повышения устойчивости клеток растений к абиотическим стрессам за счет влияния трансгена го1С на метаболизм АФК. Было частично изучен предполагаемый механизм этого явления. Дальнейшее более детальное изучение /^/-опосредованных эффектов на сигнальные системы клеток растений может иметь значение для управления защитным аппаратом растительного организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Веремейчик, Галина Николаевна, Владивосток

1. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов Ю.Б. Перекисное окисление и стресс. СПб.: Наука, 1992.

2. Булгаков В.П., Лауве Л.С., Чернодед Г.К., Ходаковская М.В., Журавлев Ю.Н. Хромосомная вариабельность клеток женьшеня, трансформированных растительным окогеном rolCII Генетика. 2000. Т. 2. С. 209-216.

3. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: Наука, 1999.

4. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М.: Мир, 1986.

5. Дрейпер Д., Скот С., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джэкоб Л., Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Д. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991.

6. Лукьянов К., Гурская Н., Богданова Е., Лукьянов С. Селективная супрессия полимеразной цепной реакции // Биоорганическая химия. 1999. Т. 25. С. 163-170.

7. Лутова Л.А., Павлова З.Б., Иванова М.М. Агробактериальная трансформация как способ изменения гормонального метаболизма у высших растений // Генетика. 1998. Т. 34, №2. С. 165-182.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

9. Пирузян Э.С., Андрианов В.М. Плазмиды бактерий и генетическая инженерия растений. М.: Наука, 1985. ,

10. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислородаю М.: КДУ, 2007.

11. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.

12. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002.

13. Тинланл Б.А. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 3. С. 354-359.

14. Федореев С.А. Химическое исследование хиноидных пигментов дальневосточных представителей семейства Boraginaceae (бурачниковые): Автореф. дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1980.

15. Шкрыль Ю.Н. Влияние генов rol агробактерий на процессы роста и вторичного метаболизма в культурах трансгенных клеток Rubia cordifolia: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 2006.

16. Хилтон М.Д. Перенос новых генов в клетки растений // В мире науки. 1983. № 8. С.17.

17. Allan A., Fluhr R. Two distinct sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells // Plant Cell. 1997. Vol. 9. P. 1559-1572.

18. Altamura M., Archilletti Т., Capone I., Costantino P. Histological analysis of the expression of Agrobacterium rhizogenes rolB-GUS gene fusions in transgenic tobacco // New Phytol. 1991. Vol. 118. P. 69-78.

19. Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. Vol. 215. P. 403-410.

20. Amicucci E., Gaschler K., Ward J.M. NADPH oxidase genes from tomato (.Lycopersicon esculentum) and curly-leaf pondweed (Potamogeton crispus) // Plant Biol. 1999. Vol. 1. P. 524-528.

21. Apel K, Hirt H Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal ' transduction //Annu. Rev. Plant Biol. 2004. Vol. 55. P. 373-399.

22. Baquar S. Medicinal and poisonous plants of Pakistan. Karachi.: Printas, 1989.

23. Barlow J., Mathias A., Williamson R., Gammack D. A simple method for the quantitative isolation of undegraded high molecular weight ribonucleic acid // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1963. Vol. 13. P. 61-66.

24. Barros L.,. Curtis R., Vianna A., Campos L., Cameiro M. Fused RolA protein enhances beta-glucoronidase activity 50-fold: implication for RolA action // Protein Peptide Letters. 2003. Vol. 10. P. 303-311.

25. Bekesiova I., Nap J.-P., Mlynarova L. Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia II Plant Mol. Biol. Rep. 1999. Vol. 17. P. 269277.

26. Biswas T.K., Mukherjee B. Plant medicines of India origin for wound healing activities: a review // Lower Extremity Wounds. 2003. Vol. 2, № 3. P. 25-39.

27. Bolwell G.P., Butt V.S., Davies D.R., Zimmerlin A. The origin of the oxidative burst in plants // Free Radical Res. 1995. Vol. 23. P. 517-532.

28. Blomeke B., Poginsky B., Schmutte C., Marquardt H., Westendorf J. Formation of genotoxic metabolites from anthraquinone glycosides, present in Rubia tinctorum L. // Mutat. Res. 1992. Vol. 265, № 2. P. 263-272.

29. Broothaerts W., Mitchell H., Weir B., Kaines S., Smith L., Yang W., Mayer J., Roa-Rodriguez C., Jefferson R. Gene transfer to plants by diverse species of bacteria // Nature. 2005. Vol. 433. P. 629-633.

30. Browse J., Xin Z. Temperature sensing and cold acclimation // Curr. Opin. Plant Biol. 2001. Vol. 4. P. 241-246.

31. Bulgakov V.P., Kiselev K.V., Yakovlev K.V., Zhuravlev Y.N., Gontcharov A.A., Odintsova N.A. Agrobacterium-mediated transformation of sea urchin embryos // Biotechnol. J. 2006. Vol. 4. P. 454-461.

32. Bulgakov V.P. Functions of rol genes in plant secondary metabolism // Biotechnol. Adv. 2008. Vol. 26. P. 318-24.

33. Busto V., Rodriguez-Talou J., Giulietti A., Merchuk J. Effect of shear stress on anthraquinones production by Rubia tinctorum suspension cultures // Biotechnol. Prog. 2008. Vol. 24. P. 175-181.

34. Cai Y., Sun M., Xing J., Corke H. Antioxidant phenolic constituents in roots of Rheum officinale and Rubia cordifolia: structure radical scavenging activity relationships // J. Agric. Food Chem. 2004. Vol. 52, № 26. P. 7884-7890.

35. Capone I., Spano L., Cardarelli M., Bellincampi D., Petit A., Costantino P. Induction and growth properties of carrot roots with different complements of Agrobacterium rhizogenes T-DNA // Plant. Mol. Biol. 1989. Vol. 13. P. 43-52.

36. Chang C.J., Kao C.H. 1997. Paraquat toxicity is reduced by poliamines in rice leaves // Plant Growth Regul. 1997. Vol. 22. P. 163-168.

37. Cheng S., Willmann M., Chen H., Sheen J. Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family // Plant Physiol. 2002. Vol. 129. P. 469-485.

38. Chung M.I., Jou S.J., Cheng T.H., Lin C.N., Ko F.N., Teng C.M. Antiplatlet constituents of formosan Rubia akane // J. Nat. Prod. 1994. Vol. 57, № 2. P. 313-316.

39. Citovsky V., Kozlovsky S., Lacroix B., Zaltsman A., Dafny-Yelin M., Vyas S., Tovkach A., Tzfira T. Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium infection // Cell Microbiol. 2007. Vol. 9. P. 9-20.

40. Coelho S.M., Taylor A.R., Ryan K.P., Sousa-Pinto I., Brown M.T., Brownlee C.0 4

41. Spatiotemporal patterning of reactive oxygen production and Ca wave propagation in fiicus rhizoid cells // Plant Cell. 2002. Vol. 14. P. 2369-2381.

42. Combard A., Baucher M.-F. A common organization of the T-DNA genes expressed in plant hairy roots induced by different plasmids of Agrobacterium rhizogenes II Plant Mol. Biol. 1988. Vol. 10. P. 499-509.

43. Dehio C., Grossmann K., Schell J., Schmulling T. Phenotype and hormonal status of transgenic tobacco plants overexpressing the rolA gene of Agrobacterium rhizogenes T-DNA //Plant Mol. Biol. 1993. Vol. 23, Iss 6. P. 1199-1210.

44. Estruch J.J., Chriqui D., Grossman K., Schell J., Spena A. The plant oncogene rolC is responsible for the release of cytokinins from glucoside conjugates // EMBO J. 1991a. Vol. 10, № 10. P. 2889-2895.

45. Estruch J.J., Schell J., Spena A. The protein encoded by the rolB plant oncogene hydrolyses indole glucosides//EMBO J. 1991b. Vol. 10, № 11. P. 3125-3128.

46. Feng D., Doolittle R. Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees // J. Mol. Evol. 1987. Vol. 60. P. 351-360.

47. Fillipini F., Rossi R., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P. M., Lo Schiavo F., Terzi M. A plant oncogene as a phosphatase // Nature. 1996. Vol. 379. P. 499-500.

48. Finnegan J., McElroy D. Transgene inactivation: plants fight back! // Biotechnology. 1994. Vol. 12. P. 883-888.

49. Fredenhagen A., Mett H., Meyer T., Buchdunger E., Regenass U., Roggo B.E., Petersen F. Protein tyrosine kinase and protein kinase C inhibition by fungal anthraquinones related to emodin// J. of Antibiot. 1995. Vol. 48. P. 1355-1358.

50. Furusawa I., Tanaka K., Thanutong P., Mizuguchi A., Yazaki M., Asada K. 1984. Paraquat resistant tobacco calluses with enhanced superoxide dismutase activity // Plant Cell Physiol. 1984. Vol. 25. P. 1247-1254.

51. Gelvin S.B. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 51. P. 223-256.

52. Gilani A.H., Janbaz K.H., Zaman M.5 Lateef A., Suria A., Ahmed H.R. Possible presence of calcium channel blockers in Rubia cordifolia: an indigenous medicinal plant // J. Pak. Med. Assoc. 1994. Vol. 44. P. 82-85.

53. Gilani A.H., Janbaz K.H. Effect of Rubia cordifolia extract on acetaminophen and CCI4-induced hepatotoxicity // Phytotherapy Res. 1995. Vol. 9. P. 372-375.

54. Gottwald E., Muller O., Polten A. 2001. Semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction with the Agilent 2100 Bioanalyzer // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 40164022.

55. Groom Q.J., Torres M.A., Fordham-Skelton A.P., Hammond-Kosack K.E., Robinson N.J., Jones J.D.G. RbohA, a rice homologue of the mammalian gp91phox respiratory burst oxidase gene // Plant J. 1996. Vol. 10. P. 515-522.

56. Guivarc'h A., Carneiro M., Vilaine F., Pautot V., Chriqui D. Tissue-specific expression of the rolA gene mediates morphological changes in transgenic tobacco // Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 30. P. 125-134.

57. Halliwell B. Free radicals in biology and medicine. NY.: Oxford University Press, 1999.

58. Han Y.S., Heijden R., Lefeber A.W., Erkelens C., Verpoorte R. Biosynthesis of anthraquinones in cell cultures of Cinchona 'Robusta' proceeds via the methylerythritol 4-phosphate pathway // Phytochemistry. 2002. Vol. 59, № 1. P. 45-55.

59. Hanks S.K., Hunter T. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification // FASEB J. 1995. Vol. 9. P. 546-596.

60. Harmon A.C., Gribskov M., Gubrium E., Harper J.F. The CDPK superfamily of protein kinases//New Phytol. 2001. Vol. 151. P. 175-183.

61. Hassanean H.A., Ibraheim Z.Z., Takeya K., Itorawa H. Further quinoidal derivatives from Rubia cordifolia L. // Pharmazie. 2000. Vol. 55, № 4. P. 317-319.

62. Hellens R., Millineaux P., Klee H. Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors // Trends Plant Sci. 2000. Vol. 5. P. 446-451.

63. Hernandez J.A., Campillo A., Jimenez A., Alarcon J.J., Sevilla F. Response of antioxidant systems and leaf water relations to NaCl stress in pea // New Phytol. 1999. Vol. 141. P. 241251.

64. Hill C., Rimmer J., Grenn B., Finch J., Thomas J. Histone-DNA interaction and their modulation by phosphorylation of -Ser-Pro-X-Lys/Arg-motifes // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 1939-1948.

65. Hippeli S., Heiser I., Elstner E. F. Activated oxygen and free oxygen radicals in pathology: New insights and analogies between animals and plants // Plant Physiol. 1999. Vol. 37. P. 167-178.

66. Hong Y., Takano M., Liu C.M., Gasch A., Chye M.L., Chua N.H. Expression of three members of the calcium dependent protein kinase gene family in Arabidopsis thaliana II Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 30. P 1259-1275.

67. Itokawa H., Ibraheim Z.Z., Qiao Y.F., Takeya K. Anthraquinones, naphtohydroquinones and naphtohydroquinone dimers from Rubia cordifolia and their cytotoxic activity // Chem. Pharm. Bull. 1993. Vol. 41, № 10. P. 1869-1872.

68. Jain A., Basal E. Inhibition of Propionibacterium induced mediators of inflammation by Indian herbs // Phytomedicine. 2003. Vol. 10, № 1. P. 34-38.

69. Jiang Y., Deyholos M. Comprehensive transcriptional profiling of NaCl-stressed Arabidopsis roots reveals novel classes of responsive genes // BMC Plant Biol. 2006. Vol. 12. P. 6-25.

70. Kawasaki Y., Goda Y., Yoshihira K. The mutagenic constituents of Rubia tinctorum II Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 49, № 6. P. 1504-1509.

71. Keller T., Damude H.G., Werner D., Doerner P., Dixon R.A., Lamb C. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs // Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 255-266.

72. Kiraly L., Hafez Y., Fodor J., Kiraly Z. Induction of hypersensitive necrosis at high temperatures by generation of reactive oxygen forms in virus resistant tobacco // Acta Biol. Szegediensis. 2005. Vol. 49. P. 85-87.

73. Kiselev K.V., Kusaykin M.I., Dubrovina A.S., Bezverbny D.A., Zvyagintseva T.N., Bulgakov V.P. The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related (3-1,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 2225-2231.

74. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. 2007. Vol. 128. P. 681-692.

75. Knight H., Trewavas A.J., Knight M.R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 489-503.

76. Kobayashi M., Ohura I., Kawakita K., Yokota N., Fujiwara M., Shimamoto K., Doke N., Yoshioka H. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase // Plant Cell. 2007. Vol. 19. P. 1065-1080.

77. Koncz C., Schell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector // Mol. Gen. Genet. 1986. Vol. 204. P. 383-396.

78. Kovtun Y., Chiu W.-L., Tena G., Sheen J. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 2940-2945.

79. Kratsch H.A., Wise R.R. The infrastructure of chilling stress // Plant Cell Environ. 2000. Vol. 23. P. 337-350.

80. Kulinsky V., Kolesnichenko L.S. Extrinsic regulation of metabolic and energetic mitochondrial functions. Focus on Signal Transduction Research. NY.: Nova Science Publishers Inc. 2007.

81. Kunik T., Tzfira T., Kapalnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 1871-1876.

82. Lambeth J.D. Nox enzymes and the biology of reactive oxygen // Nature Rev. Immunol. 2004. Vol. 4. P. 181-189.

83. Lander H.M. An essential role for free radicals and derived species in signal transduction // FASEB J. 1997. Vol. 11. P. 118-124.

84. Leach F., Aoyagi K. Promoter analysis of the highly expressed rolC and rolD root-inducing genes of Agrobacterium rhizogenes: enhancer and tissue-specific DNA determinants are dissociated // Plant Science. 1991. Vol. 79. P. 69-76.

85. Leipner J., Fracheboud Y., Stamp P. Acclimation by suboptimal growth temperature diminishes photooxidative damage in maize leaves // Plant Cell Environ. 1997. Vol. 20. P. 366-372.

86. Levesque H., Delepelaire P., Rous P., Slightom J., Tepfer D. Common evolutionary origin of the central portions of the Ri TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes and Ti T-DNAs of Agrobacterium tumefaciens II Plant Mol. Biol. 1988. Vol. 11. P. 731-744.

87. Levine A., Tenhaken R., Dixon R., Lamb C. H202 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response // Cell. 1994. Vol. 79. P. 583-593.

88. Liou M.J., Wu T.S. Triterpenoids from Rubia yunnanensis II J. Nat. Prod. 2002. Vol. 65, №9. P. 1283-1287.

89. Low P.S., Merida J.R. The oxidative burst in plant defense:function and signal transduction. Physiol. Plant. 1996. Vol. 96. P. 533-542.

90. Manojlovic N.T., Solujic S., Sukdolak S., Milosev M. Antifungal activity of Rubia tinctorum, Rhamnus frangnla and Caloplaca cerina II Fitoterapia. 2005. Vol. 76, № 2. P. 244246.

91. Marczylo T., Arimoto-Kobayashi S., Hayatsu H. Protection against Trp-P-2 mutagenicity by purpurin: mechanism of in vitro antimutagenesis // Mutagenesis. 2000. Vol. 15, №3. P. 223-228.

92. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR//Nucleic Acids Res. 1999. Vol. 27. P. 1558-1560.

93. Maurel C., Brevet J., Barbier-Brygoo H., Guern J., Tempe J. Auxin regulates the promoter of the root-inducing rolB gene of Agrobacterium rhizogenes in transgenic tobacco // Mol. Gen. Genet. 1990. Vol. 1. P. 58-64.

94. Mehler A.H. Studies on the reactions of illuminated chloroplasts. I Mechanism of the reduction of oxygen and other Hill reagents // Arch. Biochem. Biophys. 1951. Vol. 33. P. 6577.

95. Merzlyak M.N., Hendry G.A.F. Free Radical Metabolism, pigment degradation and lipid peroxidation in leaves during senescence // Proc. Royal Soc. Edinbrough. 1994. Vol. 102B. P. 459-471.

96. Mikosch T., Lavrijssen B., Sonnenberg A., van Griensven L. Transformation of the cultivated mushroom Agaricus bisporm (Lange) using T-DNA from Agrobacterium tumefaciens II Curr. Genet. 2001. Vol. 39. P. 35-39.

97. Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Glazunov V.P., Chemoded G.K., Bulgakov V.P., Zhuravlev Y.N. Anthraquinone production by callus cultures of Rubia cordifolia // Fitoterapia. 1999. Vol. 70. N 6. P. 552-557.

98. Mittler R., Vanderauwera S., Gollery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen gene network of plants // Trends Plant Sci. 2004. Vol. 9. P. 490-498.

99. Morimoto M., Tanimoto K., Sakatani A., Komai K. Antifeedant activity of an anthraqunones aldehyde in Galium aparine L. against Spodoptera litura F. // Phytochemistry. 2002. Vol. 60, № 2. P. 163-166.

100. Morita H., Yamamiya T., Takeya K., Itokawa H. New antitumor bicyclic hexapeptides, RA-XI, XII, - XIII and - XIV from Rubia cordifolia II Chem. Pharm. Bull. 1992. Vol. 40, № 5. P. 1352-1354.

101. Moshe S., Robert F. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases // Plant Physiol. 2006. Vol. 141. P. 336-340.

102. Moyano E., Fornale S., Palazon J., Cusido R., Bonfill M., Morales C., Pinol M. Effect of Agrobacterium rhizogenes T-DNA on alkaloid production in Solanaceae plants // Phytochemistry. 1999. Vol. 52. P. 1287-1292.

103. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures II Physiol. Plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

104. Nilsson O, Moritz T, Sundberg B, Sandberg G, Olsson O. Expression of the Agrobacterium rhizogenes rolC gene in a deciduous forest tree alters growth and development and leads to stem fasciation // Plant Physiol. 1996. Vol. 2. P. 493-502.

105. Noctor G., Foyer C. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control // Annu. Rev. Plant Physiol. 1998. Vol. 49. P. 249-279.

106. Olivari C., Albumi C., Pugliarello C.M., Michelis M.I.D. Olivari C., Albumi C., Pugliarello C.M., Michelis M.I.D. Phenylarsine oxide inhibits the fusicoccin-induced activation of plasma membrane H^-ATPase // Plant Physiol. 2000. Vol. 122. P. 463-470.

107. Ozgen U., Houghton P.J., Ogundipe Y., Coskun M. Antioxidant and antimicrobial activities of Onosoma argentatum and Rubia peregrine II Fitoterapia. 2003. Vol. 74. P. 682685.

108. Pan X., Welti R., Wang X. Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry // Phytochemistry. 2008. Vol. 69. P. 1773-1781.

109. Pandey S., Sharma M., Chaturvedi P., Tripathi Y.B. Protective effect of Rubia cordifolia on lipid peroxide formation in isolated rat liver homogenate // Indian J. Exp. Biol. 1994. Vol. 32, №3. P. 180-183.

110. Piedras P., Hammond-Kosack K., Harrison K., Jones J. Rapid, Cf-9- and Avr9-dependent production of active oxygen species in tobacco suspension cultures // Mol. Plant Microbe Interact. 1998. Vol. 11. P. 1155-1166.

111. Piers K., Heath J., Liang X., Stephens K., Nester E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of yeast//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 1613-1618.

112. Poginsky B., Westendorf J., Blomeke B., Marquardt H., Hewer A., Grover P.L., Philips D.H. Evaluation of DNA binding activity of hydroxyanthraquinones occurring in Rubia tinctorum L. // Carcinogenesis. 1991. Vol. 12, № 7. P. 1265-1271.

113. Prasad T.K. Mechanism of chilling-induced oxidative stress injury and tolerance in developing maize seedlings: changes in antioxidant system, oxidation of proteins and lipids, and protease activities//Plant J. 1996. Vol. 10. P. 1017-1026.

114. Rhodes M.J.C., Robins R.J., Hamill J.D., Parr A.J., Hilton M.G., Walton N.J. Properties of transformed root cultures. NY.: Clarendon Press, 1990.

115. Roberts D.M., Harmon A.C. Calcium-modulated proteins: targets of intracellular calcium signals in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. 1992. Vol. 43. P. 375-414.

116. Rudd J.J., Franklin-Tong V.E. Unravelling responsespecificity in Ca2+ signalling pathways in plant cells // New Phytol. 2001. Vol. 151. P. 7-33.

117. Sagi M., Davydov O., Orazova S., Yesbergenova Z., Ophir R., Stratmann J.W., Fluhr R. Plant respiratory burst oxidase homologs impinge on wound responsiveness and development m Ly coper si con esculentum II Plant Cell. 2004. Vol. 16. P. 616-28.

118. Sagi M., Fluhr R. Production of reactive oxygen species by plant NADPH oxidases // Plant Physiol. 2006. Vol. 141. P. 336-340.

119. Sanders D., Brownlee C., Harper J.F. Communicating with calcium // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 691-706.

120. Schmulling T, Schell J, Spena A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes influence plant development // EMBO J. 1988. Vol. 9. P. 2621-2629.

121. Schulman H., Lou L.L. Multifunctional Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase: domain structureand regulation // Trends Biochem. Sci. 1989. Vol. 14. P. 62-66.

122. Segarra G., Jauregui O., Casanova E., Trillas I. Simultaneous quantitative LC-ESI-MS/MS analyses of salicylic acid and jasmonic acid in crude extracts of Cucumis sativus under biotic stress 11 Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 395-401.

123. Singh R., Geetanjali, Chauhan S.M.S. 9,10-anthraquinones and other active compounds from the genus Rubia II Chemistry and Biodiversity. 2004. Vol. 1. P. 1241-1264.

124. Sinkar V.P., Pythoud F., White F.F., Nester E.W., Gordon M.P. Rol A locus of the Ri plasmid directs developmental abnormalities in transgenic tobacco plants // Genes Development. 1988. Vol. 2. P. 688-697.

125. Sheng J., Citovsky V. Agrobacterium-pXant cell DNA transport: have virulence proteins, will travel // Plant Cell. 1996. Vol. 8. P. 1699-1710.

126. Slightom J.L., Durand-Tardif M., Joanin L., Tepfer d. Nucleotide sequence analysis of TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropine type plasmid // J. Biol. Chem. 1986. Vol. 261, №> l.P. 108-121.

127. Spena A., Schmulling T., Koncz C., Schell J. Independent and synergetic activity of rol A, B and C loci in stimulating abnormal growth in plants // EMBO J. 1987. Vol. 6, № 13. P. 3891-3899.

128. Suzuki Y.J., Forman IT.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction // Free Radical Biol. Med. 1996. Vol. 22. P. 269-285.

129. Takahashi E., Marczylo T.H., Watanabe T., Nagai S., Hayatsu H., Negishi T. Preventive effect of anthraquinone food pigments on the DNA damage induced by carcinogens in Drosophila I I Mutat. Res. 2001. Vol. 1. P. 139-145.

130. Tinland B., Hohn B. Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: integration of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome // Genet. Eng. (NY). 1995. Vol. 17. P. 209-229.

131. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends Plant Sci. 1996. Vol. l.P. 178-184.

132. Tjus S.E., Moller B.L., Schelle H.V. Photosystem I is an early target of photoinhibition in barley illuminated at chilling temperatures // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 755-764.

133. Torres M.A., Onouchi H., Hamada S., Machida C., Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Six Arabidopsis thaliana homologues of the human respiratory burst oxidase (gp91phox) // Plant J. 1998. Vol. 14. P. 365-370.

134. Tripathi Y.B., Pandey S., Shukla S.D. Anti-platelet activating factor of Rubia cordifolia Linn. // Indian J. Exp. Biol. 1993. Vol. 31, №> 6. P. 533-555.

135. Tripathi Y.B., Sharma M., Manickam M. Rubiadin, a new antioxidant from Rubia cordifolia II Indian J. Biochem. Biophys. 1997. Vol. 34, № 3. P. 302-306.

136. Tripathi Y.B., Sharma M. Comparison of the antioxidant action of the alcoholic extract of Rubia cordifolia with rubiadin // Indian J. Biochem. Biophys. 1998. Vol. 35, № 5. P. 313316.

137. Trovato M., Maras B., Linhares F., Costantino P. The plant oncogene rolD encodes a functional ornithine cyclodeaminase // PNAS. 2001. Vol. 98, № 23. P. 13449-13453.

138. Trypsteen M., van Lijsebettens M., van Severan R., van Montagu M. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Echinacea purpurea II Plant Cell Rep. 1991. Vol. 10. P. 85-89.

139. Valentine L. Agrobacterium tumefaciens and the plant: the David and Goliath of modern genetics // Plant Physiol. 2003. Vol. 133. P. 948-955.

140. Westendorf J., Pfau W., Schulte A. Carcinogenicity and DNA adduct formation observed in ACI rats after long term treatment with madder root, Rubia tinctorum L. // Carcinogenesis. 1998. Vol. 19, № 12. P. 2163-2168.

141. White P. The cultivation of animal and plant cells. NY.: Ronald Press. 1963.

142. Wildermuth M.C., Dewdney J., Wu G., Ausubel F.M. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence // Nature. 2001. Vol. 29. P. 562-565.

143. Wiseman H., Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer // Biochem. J. 1996. Vol. 313. P. 17-29.

144. Wu T.S., Lin D.M., Shi L.S., Damu A.G., Kuo P.C., Kuo Y.H. Cytotoxic anthraquinones from the stems of Rubia wallichiana Decne // Chem. Pharm. Bull. 2003. Vol. 51, №8. P. 948-950.

145. Yahraus T., Chandra S., Legendre L., Low P. Evidence for a mechanically induced oxidative burst // Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 1259-1266.

146. Yamamoto Y., Kobayashi Y., Devi S., Rikiishi S., Matsumoto H. Aluminum toxicity is associated with mitochondrial dysfunction and the production of reactive oxygen species in plant cells //Plant Physiol. 2002. Vol. 128. P. 63-72.

147. Yoshie Y., Goto K., Takai R., Iwano M., Takayama S., Isogai A., Che F.-S. Function of the rice gp91phox homologs OsrbohA and OsrbohE genes in ROS-dependent plant immune responses // Plant Biotechnol. 2005. Vol. 22. P. 127-135.

148. Yoshikawa T., Furuy a T. Saponin production by cultures of Panax ginseng transformed with Agrobacterium rhizogenes // Plant Cell Rep. 1987. Vol. 6. P. 449-453.

149. Yoshioka H., Sugie K., Park H.-J., Maeda H., Tsuda N., Kawakita K., Doke N. Induction of plant gp91 phox homolog by fungal cell wall, arachidonic acid, and salicylic acid in potato // Mol. Plant Microbe Interact. 2001. Vol. 14. P. 725-736.

Информация о работе

Веремейчик, Галина Николаевна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Влияние агробактериальных генов rolA, rolB и rolC на устойчивость к абиотическим факторам и биосинтез антрахинонов в трансгенных культурах Rubia cordifolia L. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы