Влияние трансформации клеточной культуры винограда Vitis amurensis Rupr.геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола

Дубровина, Александра Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние трансформации клеточной культуры винограда Vitis amurensis Rupr.геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Влияние трансформации клеточной культуры винограда Vitis amurensis Rupr.геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола"

На правах рукописи

ДУБРОВИНА АЛЕКСАНДРА СЕРГЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ВИНОГРАДА Кйи атитетЫ Шфг. ГЕНОМ го1В ИЗ АцгоЬааегшт гЫю^епеБ НА БИОСИНТЕЗ РЕЗВЕРАТРОЛА

03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВЛАДИВОСТОК 2010

003491010

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик РАН

Журавлев Юрий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Одинцова Нэлия Адольфовна

кандидат биологических наук, доцент

Кожемяко Валерий Борисович

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики

СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «26» февраля 2010 г. в «10.00» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г.Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, факс: 8 (4232)310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО

РАН.

Автореферат разослан « » января 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Музарок Т. И,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Решение проблемы промышленного получения биологически активных веществ (БАВ) часто осложняется недостатком быстро воспроизводимых сырьевых источников. Такими источниками могут стать культуры клеток растений. Однако опыт получения клеточных культур показывает, что содержание в них целевых веществ чаще всего ниже, чем необходимо для эффективного промышленного производства этих соединений, поэтому разработка методов увеличения содержания БАВ в клетках растений in vitro является актуальной задачей.

Известно, что резвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) обладает превентивными свойствами против нескольких видов рака, положительно влияет на сердечнососудистую систему, а также обладает высоким фармакологическим потенциалом в лечении нейродегенеративных заболеваний (Shankar et al., 2007; Vingtdeux et al., 2008). Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как арахис, клюква и голубика, однако виноград, в том числе и дикий виноград Vitis amurensis Rupr., относят к основным источникам резвератрола. В растениях содержание этого вещества невелико, поэтому получать резвератрол из растений невыгодно. Синтетические аналоги БАВ часто содержат токсичные примеси. Клеточные культуры винограда, при условии их высокой целевой продуктивности, могли бы стать альтернативным источником резвератрола.

Клеточные культуры растений, трансформированные генами rol из Agrobacterium rhizogenes, уже давно привлекали внимание биотехнологов вследствие повышенной способности продуцировать самые разнообразные вторичные метаболиты (Bulgakov, 2008). Так, недавно был показан стимулирующий эффект трансформации Rubia cordifolia геном rolB на синтез антрахинонов в культурах клеток этого растения (Bulgakov et al., 2002). Однако механизм активации биосинтеза вторичных метаболитов в культурах клеток, трансформированных геном rolB агробактерий, не изучен. Понимание этого механизма имеет фундаментальное и прикладное значение. Новые данные о протекании процессов онкогенеза у растений и влиянии белка RolB на метаболизм растительных клеток позволят расширить знания об общих принципах регуляции биосинтеза вторичных метаболитов, что важно для промышленного получения ценных БАВ.

Цель и задачи исследования. Цель работы - получение культуры клеток V. amurensis с высоким содержанием резвератрола, а также исследование биохимических механизмов активации биосинтеза резвератрола в полученных клетках.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить эффективность классических биотехнологических приемов, направленных на увеличение продукции резвератрола клеточной культурой V. amurensis.

2. Трансформировать клетки культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes и оценить биосинтез резвератрола в трансгенных клеточных линиях.

3. Изучить механизм влияния трансформации культуры клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Воздействие различных элиситоров, добавление фенилаланина в питательные среды, а также селекция на фторфенилаланине приводят к увеличению продукции транс-резвератрола культурой клеток V. amurensis, однако уровень биосинтеза этого

вещества остается недостаточным для промышленного использования полученных клеточных линий.

2. Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rol В из A. rhizogenes приводит к активации биосинтеза транс-резвератрола и накоплению больших количеств этого стильбена в полученных трансгенных клеточных линиях.

3. В /-о/В-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре V. amurensis, обработанной салициловой кислотой (SA), дифференциально увеличена экспрессия генов ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, таких как фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и стильбен синтаза (STS). При этом влияние SA и трансформации геном rolB на экспрессию генов PAL и STS в культурах клеток V. amurensis значительно различается.

4. Ингибиторы кальциевых каналов снимают стимулирующий эффект трансформации клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.

5. Трансформация геном rolB значительно изменяет экспрессию некоторых генов Са2+-зависимых протеинкиназ (CDPK), а также приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательности Ser/Thr-киназного домена.

Научная новизна. Впервые изучено влияние трансформации растительных клеток геном rolB из A. rhizogenes на биосинтез стильбенов. В клеточной культуре V. amurensis, активно экспрессирующей ген rolB, продукция транс-резвератрола клетками составила 111.5 мг/л среды или 1431.3 мкг/г сырого веса клеток (2.32% от сухого веса клеток), что значительно превышает ранее сообщаемые данные для резвератрол-продуцирующих клеточных культур растений. Впервые показано, что трансформация растительных клеток геном rolB и обработка SA по-разному влияют на экспрессию генов PAL и STS. Впервые показано, что трансформация культур клеток растений геном rolB из A. rhizogenes значительно изменяет экспрессию некоторых генов CDPK и приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательностей Ser/Thr-киназного домена.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные результаты важны для понимания протекания процессов опкогенеза у растений, механизма действия гена rolB A. rhizogenes на метаболизм трансгенных растительных клеток, а также принципов регуляции биосинтеза стильбенов. Понимание этих процессов необходимо для решения практических задач биотехнологии растений. Запатентован новый способ получения резвератрола, основанный на получении гай-трансгенных клеточных культур V. amurensis (Патент РФ №2326165).

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на Всероссийском конкурсе инновационных проектов "Живые системы" (г. Киров, 2005); на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); на XI Международной молодежной Школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2007); на IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008); на Международном Симпозиуме по достижениям в биохимической инженерии (Китай, 2009); на 4-й Международной конференции польского сообщества экспериментальной растительной биологии (Польша, 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и один патент.

Структура и объем работы.

Благодарности. Автор искренне благодарит научного руководителя академика Журавлева Ю.Н. за всестороннюю помощь и поддержку, к.б.н. Киселева К.В. за помощь в освоении экспериментальных методов и ценные консультации на всех этапах работы, чл.-корр. Булгакова В.П. за ценные консультации в работе. Автор признателен Исаевой Г.А., Чернодед Г.К. и Черкавской Г.Д за помощь в работе с культурами клеток растений. Также автор выражает глубокую признательность Веселовой М.В. и Федорееву С.А. (ТИБОХ ДВО РАН) за проведение ВЭЖХ анализов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дикорастущие растения винограда амурского Vilis amurensis Rupr. (Vitaceae) были собраны на юге Приморского края Дальнего Востока России и определены в лаборатории геоботаники БПИ ДВО РАН. Каллусные культуры VI, V2 и V3 получены из молодых стеблей взрослых растений. Каллусы культивировали в пробирках размером 200x20 мм с 15 мл агаризованной среды WB/A (Bulgakov et al., 1998) с добавлением 0.5 мг/л 6-бензиламинопурина и 2.0 мг/л а-нафтилуксусной кислоты, в темноте при 24-25°С. Для экспериментов использовали каллусные агрегаты клеточных культур, начальный вес которых составлял около 0.2 г. Интервал субкультивирования составлял 35 дней.

Растворы метилжасмоната (MeJA) и салициловой кислоты (SA) добавляли в культуральные среды, как было описано ранее (Bulgakov et al., 2002) в необходимых концентрациях. Фенилаланин (Phe) и нитропруссид натрия (SNP) растворяли в стерильной дистиллированной воде и добавляли в культуральные среды после автоклавирования в асептических условиях. Фениларсин оксид (РАО), а также нифлюмовую кислоту (NA) растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) и добавляли в питательные среды после автоклавирования в асептических условиях. Эквивалентные количества DMSO были добавлены в питательную среду для контрольной культуры клеток. Ортованадат натрия (SOV), хлористый лантан (LaCl3) и верапамил (VER) растворяли в стерильной дистиллированной воде и добавляли в культуральные среды до автоклавирования и до измерения рН среды. р-фтор-Ш,-фенилаланин (PFP) растворяли в горячей воде (50°С) и добавляли в питательные среды после автоклавирования в стерильных условиях. Клеточные агрегаты культуры V2 поддерживали на среде, содержащей 30 и 100 мг/л PFP, как описано ранее (Bulgakov et al., 2001). Фирма-производитель SNP, РАО, NA, DMSO, SOV и LaCl3 - ICN Pharmaceuticals (Коста-Меса, США). Фирма-производитель MeJA, Phe и PFP - Sigma (Сант Луис, США). Фирма-производитель SA - Serva (Хаапподж, США).

га/В-трансгенные каллусные культуры VB1 и VB2 были получены в результате трансформации суспензионной культуры V2 штаммом GV3101 A. lumefaciens, несущим бинарную векторную конструкцию pPCV002-CaMVB/pMP90RK (Spena et al., 1987), согласно ранее описанной методике (Bulgakov et al., 1998). В конструкции pPCV002-CaMVB ген rolB находится под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Контрольная культура VV получена в результате кокультивации суспензионной культуры V2 со штаммом GV3101 A. tumefaciens, несущим конструкцию pPCV002/pMP90RK, содержащую только селективный маркер (ген неомицинфосфотрансферазы nptlí), согласно описанной методике (Bulgakov et al., 1998). pMP90RK - vir-хелперная плазмида, кодирующая полный состав vir-белков.

Образцы растительной ДНК выделяли из культур клеток по опубликованной методике (Киселев и Булгаков, 2009). Тотальную РНК экстрагировали из клеточных культур на 35 день культивирования при помощи набора YellowSolve (donogen, Санкт-Петербург, Россия) по методике, описанной производителем, либо при помощи метода с использованием LiCl, оптимизированного для работы с тканями растений, богатыми вторичными метаболитами (Bekesiova et al., 1999). Комплементарную ДНК (кДНК) получали, используя 1-3 мкг тотальной РНК, с помощью набора для обратной транскрипции (Силекс М, Москва, Россия) по опубликованной методике (Gorpenchenko et al., 2006). Две пары праймеров были использованы для амплификации фрагментов гена rolB длиной 623 пн и 200 пн (помер доступа в GenBank К03313). ПЦР проводили по опубликованной методике (Bulgakov et al., 2005). Участок транскриптов гена VaActinl длиной 303 пн был амплифицирован с использованием праймеров, дизайн которых был сделан на основе последовательности гена актина V. vinifera (номер доступа в GenBank AY680701). На основе анализа аминокислотных последовательностей генов PAL из разных видов растений были разработаны вырожденные праймеры для амплификации фрагментов PAL из V. amurensis длиной 266 пн. Для амплификации фрагментов генов STS длиной 461 пн были разработаны вырожденные праймеры на основе анализа аминокислотных последовательностей STS разных видов растений сем. Vitaceae. Амплификацию участков генов CDPK V. amurensis проводили, используя вырожденные праймеры, разработанные на основе сравнения аминокислотных последовательностей CDPK из разных видов растений. Последовательности праймеров и особенности проведения ПЦР представлены в диссертации. Полученные ампликоны генов rolB, PAL, STS и CDPK были выделены из геля при помощи набора Glass Milk (Силекс M, Москва, Россия). Последовательности генов PAL, STS и CDPK переносили в вектор pTZ57R/T согласно протоколу фирмы-производителя (Fermentas, Вильнус, Литва). ПЦР продукты VaActinl, rolB PAL, STS и CDPK были секвенированы с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perking-Elmer Biosystems, Форстер, Канада), следуя протоколу и рекомендациям изготовителя. После очистки этанолом последовательности были секвенированы на ABI 310 Genetic Analyser (Perking-Elmer Biosystems). Для оценки суммарной экспрессии генов PAL, STS и CDPK, а также экспрессии гена rolB, в разных культурах клеток, использовали полуколичественную обратно-транскрипционную ПЦР (ОТ-ПЦР) и технологию микрочипов с DNA 1000 LabChip® kit на Agilent 2100 Bioanalyzer (Германия). Данные представлены как относительные флуоресцентные единицы, нормализованные к экспрессии гена VaActinl. Экспрессию отдельных генов семейств PAL, STS и CDPK оценивали количественно, основываясь на данных о количестве клонов каждого транскрипта, полученных с помощью секвенирования, и данных о суммарной экспрессии этих генов, полученных с помощью микрочиповой технологии на Bioanalyzer. Относительные единицы рассчитывали следующим образом: нормализованная к экспрессии гена VaActinl суммарная экспрессия генов PAL, STS и CDPK умноженная на процент клонов каждого транскрипта и деленная на 100 (Киселев и др., 2008). Кроме того, экспрессию отдельных генов семейств PAL, STS и CDPK оценивали количественно с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР PB). ПЦР PB генов PAL, STS и CDPK была выполнена согласно методике, описанной Giulietti с соавторами (2001). Геноспецифичные пары праймеров, TaqMan пробы и особенности проведения ПЦР PB представлены в диссертации.

Определение качественного и количественного содержания стильбенов производилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в

лаборатории химии природных хиноидных соединений (ЛХПХС) ТИБОХ ДВО РАН в соответствии с опубликованной методикой (Рес1огеуеу й а1., 2005; КлзЫсу й а1., 2007).

Результаты были обработаны при помощи программы 81а11811са, версия 8.0. Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка измерений (С.О.). Значимость полученных данных оценивали по спаренному критерию Стыодента. Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика нетрансгенных клеточных культур V. атигет'к

Каллусные культуры VI, У2 и УЗ представляют собой рыхлую активно растущую гомогенную ткань, не проявляющую тенденции к дифференциации. С помощью ВЭЖХ было показано, что в каллусах присутствуют такие стильбены как транс-резвератрол, пицеатаннол и ампелопсин А. Содержание резвератрола достигало 0.026% от сухого веса клеток в культуре У2 (табл. 1). Пицеатаннол и ампелопсин присутствовали в исследуемых образцах в следовых количествах. Таким образом, данные ВЭЖХ показали, что транс-резвсратрол является доминирующим стильбеном в культурах VI, У2 и УЗ, однако содержание его невелико. Наибольшую продукцию резвератрола наблюдали в культуре У2 (табл. 1), поэтому именно эта клеточная культура использовалась для дальнейших экспериментов.

Таблица 1

Прирост биомассы, содержание и продукция резвератрола в каллусных культурах V. атигепъ:.?.

Культура Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л транс-резвератрол, % от сухого веса клеток Продукция транс-резвератрола, мг/л

VI 218.6±19.1 10.3±0.7 0.004±0.002 0.41

V2 231.7±26.1 9.8±0.7 0.026±0.010 2.55

V3 192.3±12.4 8.8±0.5 0.022±0.009 1.94

Данные представлены как среднее значение ± С.О.

Увеличение продукционных характеристик клеточной культуры V2

Салициловую кислоту (SA) причисляют к стрессовым фитогормонам. Это хорошо известный, хотя и не универсальный, индуктор синтеза защитных вторичных метаболитов в растениях (Zhao et al., 2005). При добавлении SA в питательные среды общая продукция резвератрола культурой V2 возросла в 2.5 раза (табл. 2).

Таблица 2

Влияние различных эффекторов нарост и биосинтез стильбенов в клеточной культуре У2.

Эффектор Phe (мМ) SA (мкМ) MeJA (мкМ) SOV (мМ) SNP (мМ)

Концентрации 0 0.1 0 50 0 50 0 0.1 0 0.1

Сырая биомасса, г/л 129 ±8 107 ±4* 274 ±9 239 ±15 184 ±11 84 ±12** 156 ±6 91 ±14** 231 ±8 78 ±5**

Сухая биомасса, г/л 6.7 6.0 10.8 10.5 8.1 5.5 6.8 5.2 8.4 4.1

/иргте-резвератрол, % от сухого веса клеток 0.043 0.050 0.017 0.045 0.039 0.058 0.035 0.036 0.036 0.150

Продукция т/ганс-резперагрола, мг/л 2.88 3.00 1.85 4.73 3.16 3.19 2.38 1.87 3.02 6.15

Данные представлены как среднее значение ± С.О., * -р< 0.05, ** -р <0.01.

Жасмоновую кислоту (JA) и ее более активное производное, метилжасмонат (MeJA), также причисляют к стрессовым фитогормонам. MeJA повысил содержание резвератрола в клетках V2 в 1.5 раза, но суммарная продукция резвератрола при этом не увеличилась из-за значительного ингибирования роста клеток (табл. 2). Тассони с соавторами (Tassoni, et al., 2005) сообщают, что ортованадат натрия (SOV) стимулировал продукцию г/ыс-резвератрола суспензионной культурой клеток V. vinifera cv. Barbera. По нашим данным SOV ингибирует прирост биомассы клеточной культуры V2 и не влияет на содержание резвератрола (табл. 2). Известно, что нитропруссид натрия (SNP), донор N0, способен индуцировать работу N0-синтазной сигнальной системы растений и накопление некоторых вторичных метаболитов (Zhao et al., 2005). Несмотря на значительное ингибирование роста культуры V2, суммарная продукция резвератрола клетками при концентрации SNP 0.1 мМ возросла в 2 раза (табл. 2). Присутствие Phe - важный фактор для биосинтеза стильбенов, однако экзогенный Phe незначительно влиял на продукцию стильбенов в культуре V2 в наших опытах (табл. 2). Известно, что отбор клеток устойчивых к фторфенилаланину (PFP), аналогу Phe, может приводить к аккумуляции больших количеств ароматических соединений в культуре растительных клеток (Quesnel and Ellis, 1989). В результате трехмесячной селекции культуры V2 на средах с добавлением PFP в концентрации 100 мг/л была получена линия V2F. Продукция резвератрола клетками полученной линии возросла в 11 раз по сравнению с контролем и составила 16.53 мг/л (0.257% от сухого веса клеток).

Результаты вышеописанных экспериментов подтверждают результаты других авторов о том, что высокая продукция резвератрола и его производных культурами клеток растений не может быть обеспечена обработкой элиситорами (Ku et al., 2005; Tassoni et al., 2005). Мы исключаем возможность того, что низкая продукция резвератрола клеточными культурами V. amurensis вызвана низким пулом предшественников резвератрола в исследуемых клетках, поскольку добавление Phe в культуральные среды и селекция клеток культуры V2 на средах, содержащих PFP, были малоэффективны.

Характеристика трансгепных клеточных культур V. amurensis

Трансгенные культуры клеток VV, VB1 и VB2 были получены с помощью агробактериальной трансформации клеточной культуры V2. Культура клеток VV (контрольная), которая была трансформирована штаммом A. rhizogenes, не содержащим гена rolB, обладает схожими морфологическими, ростовыми и биосиптетическими характеристиками с культурой клеток V2 (табл. 1, табл. 3). Это свидетельствует о том, что процесс трансформации не является причиной морфологических и биохимических изменений в го/В-культурах.

Таблица 3

Накопление биомассы, содержание и продукция резвератрола трансгенными клеточными

культурами V. amurensis.

Культура Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л транс-резвератрол, % от сухого веса клеток Продукция траис-резвератрола, мг/л Продукция транс-резвератрола, мкг/г сырого веса клеток

VV 184.1 ±11.5 7.8±0.3 0.018±0.007 1.4 7.6

VB1 170.6±15.3 8.6±0.4 0.232±0.120* 20.0 116.9

VB2 77.9±6.9** 4.8±0.3** 2.323±0.356** 111.5 1431.3

Данные представлены как среднее значение± С.О. *р-< 0.05, **-р <0.01.

Первоначально для каллусов, трансформированных геном rolB, было характерно высокое морфологическое разнообразие и различный рост. Кроме нормального рыхлого каллусного фенотипа, характерного для V2 и VV культур, в /-o/5-трансгенных культурах наблюдали формирование плотного глобулярного каллуса. Только после отбора в течение полугода более рыхлых и активно растущих клеточных агрегатов, произошло формирование стабильных каллусных фенотипов. Две характерные клеточные линии, быстрорастущая VB1 и умереннорастущая линия VB2, были выбраны для дальнейших исследований (табл. 3).

Экспрессию гена rolB в культурах винограда оценивали при помощи ОТ-ПЦР путем сравнения с экспрессией гена актина V. amurensis (рис. 1 а). Визуальная оценка результатов электрофореза (рис. 1 а) соответствует результатам количественного анализа ПЦР проб, полученных с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer (рис. 1 б). Оказалось, что ген rolB в культуре VB1 экспрессируется на низком уровне, в то время как в культуре VB2 экспрессия гена rolB выше более чем в 40 раз.

1000 пн 500 пн^

Рис. 1. Оценка уровня экспрессии гена rolB в трансгенпых культурах V. amurensis: а -электрофоретическое разделение ПЦР-продуктов rolB и VaActinl; б - количественный анализ продуктов ПЦР гена rolB в культурах, проведенный с помощью технологии микрочипов. VV -векторная культура, VB1 и VB2 - то/Д-экспрессирующие культуры, М - маркер молекулярных весов, Рс - позитивный контроль (плазмида pPCV002-CaMVB), Nc - негативный контроль (11ЦР смесь без кДНК).

Данные ВЭЖХ показывают, что содержание транс-резвератрола в rolB-трансгенных культурах клеток VB1 и VB2 значительно превышает содержание этого вещества в контрольной культуре клеток VV (табл. 3). Других стильбепов, кроме тракс-резвератрола, в клетках культур VB1 и VB2 обнаружено не было. Показано, что рост VB2 клеточной культуры значительно снижен по сравнению с ростом контрольной клеточной культуры, в то время как рост культуры клеток VB1 находится на уровне контроля (табл. 3). Содержание резвератрола в клеточной культуре VB2 на два порядка превышает ранее сообщаемые данные для резвератрол-продуцирующих клеточных культур растений (Sgarbi et al., 2003; K.u et al., 2005; Tassoni et al., 2005). Необходимо отметить, что представленные в данной работе эксперименты были проведены в течение двух лет после формирования стабильных каллусных фенотипов ro/B-трапсгенных культур клеток. Все это время содержание резвератрола в VB2 культуре клеток было стабильно высоким, варьируя от 1.34% до 3.15% от сухого веса клеток (табл. 3, рис. 2, рис. 7). Однако после двух лет культивирования продуктивность культуры VB2 начала постепенно снижаться (данные не представлены). В культуре клеток VB1, в течение двух лет после получения, содержание резвератрола варьировало от 0.006% до 0.561% от сухого веса клеток

(табл. 3, рис. 2, рис. 7), повышаясь с течением времени. Нам не известна точная причина флуктуаций в содержании резвератрола в клетках го/В-трансгенных культур. Возможно, что одна из причин этого явления - наличие клеточных популяций с разным уровнем экспрессии трансгена в исследуемых культурах, и, вероятно, размер таких популяций может варьировать по причине случайной селекции. Для выяснения точных причин этого явления необходимо отдельное исследование. Высокое содержание резвератрола, наблюдаемое в УВ2 культуре, показывает, что запас предшественников резвератрола в клетках достаточен для синтеза стильбенов. Исходя из этого, возможно предположить существование регуляторного механизма, который способен сдерживать синтез резвератрола нетрапсформированными клетками V. атигепз1з в условиях среды без какого-либо стрессового воздействия.

Влияние ингибитора Туг-фосфатаз феннларсиноксида на рост и содержание резвератрола в клеточных культурах V. атигеп$1$

Известно, что белок Ко ¡В обладает Туг-фосфагазной активностью (РШррш ег а1., 1996). Чтобы показать, действительно ли значительное увеличение продукции резвератрола го/В-трансгенными клетками обусловлено действием 11о1В как Туг-фосфатазы, мы решили исследовать влияние ингибитора 'Гуг-фосфатаз фениларсин оксида или РАО (ОНуап е! а!., 2000) на рост и аккумуляцию резвератрола в контрольной и го/В-трансгенных культурах V. атигеп$1$. В присутствии РАО частично снималось подавляющее действие трансформации геном го1В на прирост сырой биомассы культур УВ1 и УВ2 (рис. 2 а), а также снижался стимулирующий эффект трансформации геном го1В на продукцию резвератрола (рис. 2 б).

а б

VV VBI VB2 vv VB1 VB2

Рис. 2. Влияние ингибитора фосфатаз РАО на рост (а) и аккумуляцию резвератрола (б) в клеточных культурах V. amurensis. VV - векторная культура, VB1 и VB2 - го/В-экспрессирующие культуры. Данные представлены как среднее значение ± С.О., ** - р < 0.01.

Это говорит о том, что дефосфорилирование Туг остатков вовлечено в стимулирующее действие гена rolB на аккумуляцию резвератрола клетками V. amurensis. Таким образом, можно предположить, что компонент сигнальной сети, контролирующий биосинтез стильбенов в клетках V. amurensis, регулируется фосфорилироваиием/дефосфорилированием по Туг прямо или опосредованно. Вероятно, белок RolB способствует ослаблению действия этого компонента, стимулируя таким образом биосинтез резвератрола.

Экспрессия генов PAL и STS в контрольной и ro/В-траисгенных клеточных культурах V. amurensis

Фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и стильбен синтаза (STS) - ключевые ферменты в биосинтезе резвератрола. Суммарная экспрессия генов PAL и STS в культурах клеток VV, VB1 и VB2 была определена с помощью полу количественной ОТ-ПЦР с использованием вырожденных праймеров. Визуальная оценка результатов электрофореза (рис. 3 а) соответствует результатам количественного анализа ПЦР проб, проведенного с помощью прибора Agilent 2100 Bioanalyzer (рис. 3 б). Оказалось,

что суммарная экспрессия генов семейства PAL в культуре клеток VB1 выше в 2.3 раза, а в VB2 выше в 3.8 раза, чем в культуре VV (рис. 3 а, б). Суммарная экспрессия генов семейства 5Г5 в культуре клеток VB1 выше в 1.3 раза, а в VB2 выше в 1.9 раз, чем в контроле (рис. 3 а, б). Интересно, что в то время как продуктивность VB2 культуры клеток на два порядка превышает продуктивность контрольной культуры, суммарная экспрессия генов PAL и STS в rolB-трансгенных клетках изменяется не столь значительно.

Рис. 3. Оценка суммарной экспрессии генов PAL и STS в трансгенных культурах V. amurensis: а - электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР-продуктов генов VaPAL, VaSTS и VaActinP, б - количественный анализ продуктов ПЦР генов VaPAL и VaSTS, проведенный с помощью технологии микрочипов. VV - векторная культура, VB1 и VB2 - rolB-экспрессирующие культуры. 1,3 и 5 - ПЦР продукты, полученные с использованием 0.5 мкл препаратов кДНК из культур VV, VB1 и VB2, разведенных водой (1:4); 2, 4 и 6 - 0.5 мкл неразведенных препаратов кДНК из культур VV, VB1 и VB2. М - маркер молекулярных весов, Рс - позитивный контроль (плазмидные ДНК, содержащие кДНК генов VaPAL, VaSTS и VaActinl), Nc - негативный контроль (ПЦР смесь без кДНК). Данные получены из трех независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О., **-р < 0.01.

ОТ-ПЦР продукты были клонированы, и для каждой из трех культур секвенировапо от 36 до 97 клонов генов PAL и STS. Экспрессию отдельных генов семейств PAL и STS (рис. 4) оценивали, основываясь на данных о количестве клонов каждого транскрипта в исследуемых пробах и данных о суммарной экспрессии генов PAL и STS (рис. 3). Показано, что суммарная экспрессия генов PAL увеличена в rolB-трансгенных культурах V. amurensis за счет значительного повышения уровня экспрессии генов VaPALI и VaPAL2 (рис. 4 а). Экспрессия VaPAL3 увеличивалась в VB 1 культуре и не изменялась в VB2 культуре клеток (рис. 4 а).

|олш| рлш ~ ели

ПУаSTSI ®VaSTS3 0 VaSTSl,4,S, 7

uygsm

Рис. 4. Экспрессия отдельных генов семейств PAL (а) и STS (б) в культурах клеток VV, VB1 и VB2 V. amurensis.

Уровень суммарной экспрессии генов семейства STS увеличен не только за счет повышения экспрессии гена VaSTSl, но и за счет увеличения экспрессии пяти генов STS: VaSTS2, VaSTS3, VaSTS4, VaSTS5 и VaSTS7 (рис. 4 б). Значения экспрессии генов VaSTS2, VaSTS4, VaSTS5 и VaSTS7 объединены на графике, поскольку только экспрессия VaSTSl и VaSTS3 выше фоновой. Важно отметить, что уровень экспрессии VaSTSó значительно не изменялся во всех исследуемых культурах. Экспрессию генов PAL и STS определяли также с помощью ПЦР РВ (данные представлены в диссертации). Полученные данные ПЦР РВ подтвердили вышеописанные результаты. Необходимо отметить, что, согласно данным ПЦР РВ, экспрессия VaPAL3 значительно не изменялась в исследуемых клеточных культурах.

Таким образом, RolB прямо или опосредованно активирует экспрессию большинства известных нам для V. amurensis генов PAL и STS, но в разной степени. Интересно, что в контрольной культуре VV наблюдается довольно высокий уровень суммарной экспрессии генов PAL и STS (рис. 3), в то время, как содержание резвератрола низкое.

Влияние салициловой кислоты на экспрессию генов PAL и STS в контрольной культуре клеток V. amurensis

В настоящей работе установлено, что салициловая кислота (SA) оказала наибольшее влияние на биосинтез резвератрола клетками V. amurensis по сравнению с Phe, MeJA и SOV (табл. 2). Мы провели анализ экспрессии генов VaPAL и VaSTS при культивировании культуры VV на питательных средах с добавлением SA с целью сравнения действия этого фитогормона и трансформации геном rolB на экспрессию ключевых генов биосинтеза резвератрола в клетках V. amurensis. Культура клеток VV являлась контрольной при изучении экспрессии VaPAL и VaSTS в го/В-трансгенных клеточных культурах, поэтому мы ее используем для изучения влияния SA на экспрессию этих генов в клетках V. amurensis. При добавлении 50 и 300 мкМ SA в питательные среды суммарная экспрессия генов VaPAL значительно не изменялась (рис. 5 а, б).

¡Mí7 ТУ Т.Д— М к 50 300 -Nc Рс

VaSTS

1 М К 5« ЗОЙ Nc Рс

VaActini

-ттш

I °J

VaPAL

VaSTS

Рис. 5. Оценка суммарной экспрессии генов PAL и STS в культуре клеток VV при добавлении в питательные среды 50 и 300 мкМ SA: а - электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР-продуктов генов VaPAL, VaSTS и VaActini', б - количественный анализ продуктов ПЦР генов VaPAL и VaSTS, проведенный с помощью технологии микрочипов. К, 50 и 300 - 0.5 мкл препаратов кДНК культуры VV, разведенных водой (1:4), без добавления SA (К), а также при добавлении 50 и 300 мкМ SA. М - маркер молекулярных весов, Рс - позитивный контроль (плазмидные ДНК, содержащие кДНК генов VaPAL, VaSTS и VaActini), Nc - негативный контроль (ПЦР смесь без кДНК). Данные получены из двух независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О.

Экспрессию отдельных генов VaPAL исследовали с помощью анализа частоты встречаемости различных транскриптов PAL в ОТ-ПЦР-продуктах (рис. 6 а). Как в контрольной культуре VV, так и при обработке клеток этой культуры SA, наблюдали экспрессию пяти генов PAL. Доля транскриптов VaPALl была наибольшей во всех исследуемых образцах. Экспрессия VaPAL3 достоверно возрастала под воздействием SA (300 мкМ), в то время как экспрессия VaPALl, VaPAL2, VaPAL4 и VaPAL5 значительно не изменялась. ПЦР РВ подтвердила полученные данные (результаты ПЦР РВ представлены в диссертации). При добавлении 50 и 300 мкМ SA в питательные среды суммарная экспрессия генов VaSTS увеличивалась, однако наблюдаемое увеличение не было достоверным (рис. 5 а, б). Экспрессию отдельных генов VaSTS исследовали с помощью анализа частоты встречаемости различных транскриптов STS в ОТ-ПЦР-продуктах (рис. 6 б). В SA-обработанных клетках значительно увеличивалась экспрессия VaSTS2, VaSTS3 и VaSTSó. При добавлении 300 мкМ SA в питательные среды доля транскриптов VaSTS2 и VaSTSó была высокой и сравнима с долей транскриптов VaSTSI (рис. 6 б), в то время как в rolB-трансформированных клетках экспрессия VaSTSó не изменялась, а экспрессия VaSTS2 увеличивалась только в VB2 культуре (рис. 4 б).

Рис. 6. Экспрессия отдельных генов семейств PAL (а) и STS (б) в культуре клеток VV без добавления SA (К), а также при добавлении 50 и 300 мкМ SA в питательные среды. Данные получены из двух независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О., * - р <0.05, **-р< 0.01.

Также при воздействии SA наблюдали экспрессию генов VaSTS4, VaSTS5 и VaSTS8, транскрипты которых не были обнаружены в контроле. ПЦР РВ подтвердила полученные данные (результаты ПЦР РВ представлены в диссертации).

Таким образом, обработка клеток SA и трансформация их геном rolB действуют по-разному на экспрессию генов PAL, и некоторых генов STS (VaSTS 1, VaSTS3 и VaSTSó) в клетках V. amurensis (рис. 5, рис. 6). Возможно, что SA и белковый продукт гена rolB индуцируют биосинтез и накопление резвератрола, действуя через различные регуляторные пути. Известно, что PAL могут участвовать в процессах одревеснения (Raes et al., 2003), или в биосинтезе стресс-гормонов (Chaman et al., 2003), поэтому не удивительно, что гены биосинтеза стильбенов могут активно экспрессироваться в клетках, где содержание резвератрола низкое (рис. 5, рис. 6). Основываясь на анализе полученных результатов и литературных данных, мы предполагаем, что белковые продукты генов VaSTSI, VaSTSó и VaPAL3 выполняют функции, не связанные с синтезом резвератрола, или обладают низкой молекулярной активностью его биосинтезе.

Влияние ингибиторов Са2+-каналов на прирост биомассы и синтез резвератрола в каллусных культурах V. amurensis

Для изучения взаимосвязи стимулирующего действия трансформации клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола с уровнем концентрации Са2+ в цитоплазме мы исследовали влияние ингибиторов Са2+-каналов на рост и биосинтез резвератрола в трансгенных и контрольной культурах клеток (рис. 7).

Ш1 Сухая биомасса Резпсратрол

LS_

0,5 1

П 0,5 1 VER, мМ

0 0,5 I VER, >|M

' Сухяя Оиимясся ~ Fianepaipoji

160

ЬаС!з, мМ VBI

' ¡Суйя Пкомасс* — Рсдвсратрол |

Рис. 7. Влияние VER, LaCb и NA на прирост сырой (а, б, в) и сухой (г, д, е) биомассы культур клеток V. amurensis, а таюке на содержание стильбенов в исследуемых клетках (г, д, е). VV - контрольная культура клеток, VB1 и VB2 - го/В-экспрессирующие клеточные культуры. Данные представлены как среднее значение ± С.О., **—/>< 0.01, * —р < 0.05.

Мы использовали LaCl3, общий ингибитор Са+-каналов (Knight et al. 1992), верапамил (VER), ингибитор Са2+-каналов плазматической мембраны L-типа (Pineros and Tester, 1997), а также нифлюмовую кислоту (NA), ингибитор внутренних Са2+-каналов (Cessna and Low, 2001). Показано, что рост го/В-трансгенпых культур клеток V. amurensis менее чувствителен к VER и LaCI3 по сравнению с ростом контрольной культуры клеток (рис. 7 а, б, г, д). Интересно, что добавление NA в питательные среды не повлияло на прирост сухой биомассы культуры VV, в то время как прирост сырой биомассы был значительно ингибирован (рис. 7 в, е). Прирост сухой биомассы культур VB1 и VB2 значительно не изменялся под влиянием NA. Таким образом, четкой корреляции между ростовой чувствительностью культур к NA и уровнем экспрессии гена rolB не наблюдается. Добавление VER, LaCl3 и NA в питательные среды

приводило к значительному снижению аккумуляции резвератрола в го/В-трансгенных культурах клеток (рис. 7 г, д, е). Необходимо отметить, что в экспериментах с VER, LaCl3 и NA содержание резвератрола в культуре клеток VV было значительно ниже, чем в культурах VB1 и VB2, либо стильбенов не было обнаружено вовсе (рис. 7 г, д, е).

Результаты экспериментов с ингибиторами Са2+-каналов показывают, что ингибирование притока Са2+ в цитоплазму блокирует активную продукцию резвератрола ro/B-трансгенными культурами клеток V. amurensis, а значит активация аккумуляции резвератрола, вызванная трансформацией клеток V. amurensis геном rolB, зависит от поступления Са2+ в клетку. Мы предполагаем, что активный биосинтез резвератрола в ro/B-трансгенных культурах клеток является Са2+-зависимым процессом. Оказалось, что рост то/В-трапсгенных культур более устойчив к LaCl3 и VER, чем рост контрольной культуры (рис. 7), что коррелирует с данными Булгакова с соавторами (Bulgakov, et al., 2003): рост га/В-трансгенной клеточной культуры R. cordifolia был более устойчив к LaCl3 и VER по сравнению с контролем. Предположительно, в ro/B-трансгенных клеточных культурах нарушен гомеостаз Са2+. Экспрессия генов CDPK в клеточных культурах V. amurensis Методом ОТ-ПЦР на кДНК культур VV, VB1 и VB2, используя вырожденные праймеры, мы получили ампликоны CDPK ожидаемого размера (рис. 8 а).

PTTTTTPcNcM

,gJ000 ГШ

, 4U0 III!

VV VV VBI VB! VB2 VB2 „

I 2 I 2 I Pc Nc

VV VV VBI VBI VB2 VB2 ... 1 2 1 2 1 2 Pc Nc

j^JOOO till _40l) mi

I^JOOO пн _400 nil

VaActinl

Рис. 8. Оценка суммарной экспрессии генов СОРК в трансгенных культурах V. атигет'м. а

- электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР-продуктов УаСОРК, го1В и УаАсИпР, б -количественный анализ продуктов ПЦР генов СОРК и го1В, проведенная с помощью технологии микрочипов. УУ- векторная культура, УВ1 и УВ2 - го/В-экспрессирующие культуры. 1 -0.5 мкл препаратов кДНК из культур УУ, УВ1 и УВ2, разведенных водой (1:4); 2 - 0.5 мкл перазведенных препаратов кДНК из культур УУ, УВ1 и УВ2, М - маркер молекулярных весов, Рс

- позитивный контроль (плазмида рРСУ002-СаМУВ и плазмидные ДНК, содержащие кДНК генов УаСОРК и УаАсНп1), Ыс - негативный контроль (ПЦР смесь без кДНК). Данные получены из трех независимых экспериментов и представлены как среднее значение ± С.О.

В го/В-трансгенных культурах винограда УВ1 и УВ2 общий уровень экспрессии генов СОРК был выше, чем в контрольной культуре, однако находился в пределах доверительного интервала (рис. 8). Ампликоны СОРК клонировали и секвенировали. Проанализировано 74, 107 и 137 клонов для УВ1, УУ и УВ2 культур клеток, соответственно (табл. 4). Кроме того, была проведена повторная оценка экспрессии гена го1В в исследуемых культурах клеток для того, чтобы показать, изменилась ли экспрессия трансгена (рис. 8 б). ОТ-ПЦР анализ показал, что в клетках культуры УВ2

ген го1В по-прежнему экспреесируетея на более высоком уровне по сравнению с его экспрессией в клетках УВ1 (рис. 8).

При анализе выведенных аминокислотных последовательностей генов СОРК V. атигет1з транскрипты СОРК разделились на три подсемейства, которые получили название УаСОРК!, УаСОРК2 и УаСОРКЗ. Каждое подсемейство представлено несколькими группами транскриптов, всего выделено 15 групп (табл. 4). Основанием для выделения новой группы транскриптов было отличие аминокислотной последовательности секвенированного участка СОРК от других последовательностей больше, чем на один аминокислотный остаток. Далее, для удобства, мы не употребляем слово "группы" при упоминании групп транскриптов СОРК.

Таблица 4

Количество и процентное содержание клонов различных транскриптов СОРК, полученных из кДНК контрольной и го/В-экспрессирующих культур клеток V. атигеп.ч!* с использованием вырожденных праймеров, и экспрессия генов СРРК._

Транскрипты СОРК Число клонов С01'К (процентное содержание) Экспрессия СОРК, относительные флуоресцентные единицы

УУ УВ1 УВ2 УУ УВ1 УВ2

УаСОРК1а 22 (20.6) 13(17.6) 38 (27.7) 0.299 0.296 0.510

УаСОРКП, 0 1 (1.4) 0 0 0.024 0

УаСГ)РК!с 0 2 (2,7) 0 0 0.045 0

УаСОРКЫ 2(1.9) 5 (6.8) 18(13.1) 0.028 0.114 0.241

УаСОРК1е 0 1 (1.4) 2(1.5) 0 0.024 0.028

УаСОРК 1а-32 0 0 2(1.5) 0 0 0.028

УаСОРК1-11-а 0 1 (1.4) 3 (2.2) 0 0.024 0.040

УаСОРЮ-И-Ь 0 2 (2.7) 0 0 0.045 0

УаСОРК1-Ь2-Ь 0 1 (1.4) 1 (0.7) 0 0.024 0.013

УаСОРК 1-1.3 0 1 (1.4) 0 0 0.024 0

УаСОРК2а 5 (4.7) 1 (1.4) 9 (6.6) 0.068 0.024 0.121

УаСОРКЗа 78 (72.9) 45 (60.8) 61 (44.5) 1.057 1.021 0.819

УаСОРКЗЬ 0 0 1 (0.7) 0 0 0.013

УаСОРКЗа^/ 0 1 (1.4) 1 (0.7) 0 0.012 0.013

УаСОРКЗа^ 0 0 1 (0.7) 0 0 0.013

Суммарная экспрессия генов СРРК, относительные флуоресцентные единицы 1.452 1.677 1.839

Экспрессия отдельных генов СОРК (табл. 4) просчитана на основе данных о количестве клонов каждого транскрипта СОРК в кДНК-пробах различных клеточных культур (табл. 4) и данных о суммарной экспрессии генов СОРК (рис. 8, табл. 4). В контрольной культуре клеток УУ экспрессируются гены УаСОРК1а, УаСОРКЫ, УаСОРК2а и УаСОРКЗа (табл. 4). Трансформация геном го1В привела к увеличению числа экспрессирующихся генов СОРК до 12 и 11 в УВ1 и УВ2 культурах, соответственно, а также к изменению уровня экспрессии некоторых генов, транскрипты которых присутствуют и в контроле (табл. 4). В кДНК-пробах культуры клеток УВ1, помимо вышеназванных четырех СОРК для культуры клеток УУ, показано наличие еще восьми транскриптов: УаСОРК1Ь, УаСОРК1с, УаСОРК1е, УаСОРК1-И-а, УаСОРП-Ы-Ъ, УаСОРК1-12-Ь, УаСОРК1-ЬЗ и УаСОРКЗа-Б1 (табл.

4). В кДНК-пробах культуры клеток VB2, также помимо вышеназванных четырех CDPK для культуры клеток VV, обнаружено семь транскригггов: VaCDPKle, VaCDPK3b, VaCDPKl-Ll-a, VaCDPKl-L2-b, VaCDPKla-S2, VaCDPK3a-Sl и VaCDPK3a-S2 (табл. 4). В VB2 культуре клеток экспрессия VaCDPKla увеличивается в 1.7 раза по сравнению с культурой VV. Экспрессия VaCDPKld в клеточных культурах VB1 и VB2 увеличивается в 4.2 и 8.9 раз, соответственно; экспрессия VaCDPK3a в культуре VB2 снижается в 1.3 раза (табл. 4). Данные об экспрессии VaCDPK2a противоречивы; в культуре клеток VB1 экспрессия этого гена снижается в 2.8 раза, тогда как в VB2 увеличивается в 1.8 раза по сравнению с контролем (табл. 4). Транскрипты VaCDPK3a и VaCPKla преобладают в кДНК пробах всех исследуемых культур клеток: процентное содержание клонов УаСРКЗа составило 44.5-72.9%, а клонов VaCPKla - 17.6-27.7% (табл. 4). Для подтверждения и уточнения полученных результатов экспрессию CDPK оценивали с помощью ПЦР РВ. Результаты ПЦР РВ (данные представлены в диссертации) подтвердили данные, представленные в таблице 4. Необходимо отметить, что согласно ПЦР РВ экспрессия VaCDPKla и VaCDPK2a значительно не изменяется.

В кДНК го/В-трансформированных клеточных культур V. amurensis были найдены короткие транскрипты CDPK, в последовательности Ser/Thr-киназного домена которых отсутствует участок длиной 48, 63 или 114 нуклеотидов: VIII каталитический субдомен и половина IX в VaCPKla-S2, VI каталитический субдомен в VaCPK3a-Sl и часть VIII каталитического субдомена в VaCPK3a-S2 (рис. 9, табл. 4). Рамка считывания при этом не сбивается (рис. 9). Кроме коротких транскриптов CDPK, в кДНК га/В-трансгенных клеточных культурах V. amurensis нами были найдены длинные транскрипты CDPK (рис. 10, табл. 4). Все последовательности длинных транскриптов (VaCDPKl-Ll-a, VaCDPKl-Ll-b, VaCDPKl-L2-b и VaCDPKl-L3) содержат 35 дополнительных нуклеотидов в последовательности VII каталитического субдомена (рис. 10). По нуклеотидным последовательностям длинные транскрипты наиболее близки к транскрипту VaCDPKla. Наиболее яркой отличительной особенностью VaCDPKl-Ll-a и VaCDPKl-Ll-b от других транскриптов с вставками является отсутствие пяти нуклеотидов в промежуточной области между V и VI субдоменами (рис. 10).

VkCVFKla

ViiCDPXti,

VéCBPKXc

VfiCMVXld

VaCDPKla

VaCJ>FK2á

VaCDPKM

VáCPXSe -SI

VaCJPK.Ii, S¿

VaCJJPXJb

RITAKGSXSEREAAD1CHQ IVTWHVCÍÍFMGV^ RITftKGSXSEREAADICRQIVTWKVCKmi RITAKGSYSERFAADTCRQIVTVVHVCfflíXll RXTAKGS Y.SEHEAAÜ 1OKQ XV TWHVCHFMÍA RIIAQGHXSBRIUlAAICRAIVHWHianrMUI RI XAKGHYSERAAASICRAXVNWHI CHFMGVÍ^ RXVARGJfYTERAftAAVTRT IVEWQ1. CKKHGV: RXVQRUHYSEREAAKLXKTXVGWKOCHSl.t

RIVQRGMYS'ERE------------------

RXVQRGHXSEREAAKl.XKTXVOWEGCHSl. R1VKRGHYTERKAAI)LARTX 1 GWEACJISLGVM

llRDLKPtHf íLKPEB iOI.KPEHf l. IRDLKPEHt ICRDLKPEHí iLKPEi DI,КРЕН! I, IIRD1.1

!<t 111

bfMVSREEHSPU tWSREEMSPLl ¡ÜVSRBEHSPI.t tlUWSREEHSU. LLSSKDEAAMJ-Í LSSKGEHALU LFAHKKENSRU l.EDTTAEDAAU

--------AAL»

LFDTTAEDAAJJ UVHEGEESPLf

ATDEGL ATDfc'GL rATDFGI. г Й.ТСРШ ATDt'UI. ftTDFGl ■ AIDFG1 AfDFGI. rjAIDfGL iTDFOt TXPFGl

svfiedhevxkpvvgsa: SVflEOHEVXKDW SWIDEAEVYROWU.SA! SVFIEEGKVXRD ivosaí SVE1EEGKVXRDXVGSA5 SVF IEEGKVjRDXVGSAI SXFFKPGERFSETVfiSR' Í.VÍ'TKPGKTFSDWG-SI': SVFXKPGE TE S1)VV USP: SVFXKP---------

svfekpgeiltdwgsí:

¡YG^£X1>VWSA£

----WSA(

T.PWSA« JPIVÍSA^ IXUKÍEIPIWSAI lYG^EIPIWS SXDIWSAÍ iPVWSAl 'GtjEADVHSAl HYGI'jEAI'VWSAÍ iYGl'jEAPVWSVt

ILXIU.SC.V 109 ILYII.LSGV S9 XFYVI.l.SGT 100 XJ.YXU.SGV Ю9 1LXILJ.SBV 109 Il.YILl.SGV 109 II.YXU.OGV 109 I1.XX1.LSGV 109 •XLXIU.SGV 71 XI.YTU.SGV 93 X1XXU.SBV 109

Рис. 9. Выравнивание аминокислотных последовательностей частей Ser/Thr-киназных доменов коротких транскриптов CDPK V. amurensis. VI, VII, VIII и IX - каталитические субдомены Ser/Thr-киназного домена CDPK.

В связи с отсутствием пяти нуклеотидов для транскриптов VaCDPKl-Ll-a и VaCDPKl~Ll-b характерно изменение рамки считывания и появление четырех стоп-кодонов в области VI, VII субдоменов и последовательности промежуточной между VI и VII субдоменами (рис. 10). В последовательностях VaCDPKl-Ll-a и VaCDPKl-Ll-b рамка считывания восстанавливается после 35-нуклеотидной инсерции. Для VaCDPKl~L2-b характерно изменение рамки считывания после инсерции 35 нуклеотидов и наличие трех стоп-кодонов (рис. 10). В последовательности VaCDPKl-

ЬЗ присутствует два стоп-кодона, и происходит изменение рамки считывания после инсерции 35 нуклеотидов (рис. 10). Рамка считывания восстанавливается после появления дополнительного гуанина (однонуклеотидная инсерция) между VIII и IX субдоменами, однако в промежуточной области между IX и X субдоменомами появляется второй дополнительный гуанин, в результате чего рамка считывания снова сбивается (рис. 10).

Мы не можем с уверенностью говорить о точном количестве генов каждого подсемейства СйРК в геноме У. атигеп$15, так как геном этого растения полностью не секвенирован. Недавно были секвенированы высоко гомозиготный и гетерозиготный геномы двух сортов V. уШ/ега, близкого вида для V. атигетгя (,1аШоп е1 а!., 2007; УЫаБсо й а!., 2007).

ТСДАА 7 TACA GCCAAA ВО - -

Т СААА Т TACAS С CAAAQC - --

•• •• ATCCAGA О Т GA BAA G СА С СААА ТИТ С Т 6СА G GCAGAT Т GT GAAT В С СО ТССА Т PIС Т 6Í САТ Т Т ТА ТА6 GA ВТ 0АТ1

Т САДА Т ТА СА«С СААА О WiACÍ1 T¡

Т BGCASAT Т G t IÍAATIIС (Л! T'

I СААА Т ТА СА ОС CAA ВС GA GC Т Т А Т ССА ПАСИ

HCAAOCACCAAATATCCOCACOCAGATtCIWATSCO(>TTCATOieTOTCAIttTATAOeACT№TI^ATAG(^ACTTeAAOCCTI>AC^tITCfrTA i ISAAH s о Р. О I I Я >. V Н V С Н Г ТРУ TCCGAITACC QCSAAAG CTAGT YAT Т С С GAGC GftGAAGCCGCA GA ГА Т СТС Т ACACAGAT Т С Т &АСС£Т G <? í Т САТОТ ТТ GT СА Т Т Т Т АТС С ВАС Т GA Т GRATAS С САС t Т ВАА5С С Т GAGAA Т Т Т ф X В 1ÍC

vaCDPKl -li -г

VaCDtWi -II-VM:nvKi í.I

5 ATOOTCAOTCAACC^AAATTCACTSTTGAAA KCACCCATTt!

МС-Е2Т>ШКГТУ£!Н0Г| i AICOTnAGTCAACR^gAAATTCACTSTIGAAA JCCACGr-ATTlj

H G E * " Ü1 K ' TVE i

1 АТ1!Г,Г(«1>ГСДА«1!ТаАЙДАТ1<'АГТет1еААА >

* V s

1 ATOGTCARCCCRGAACASAATTCCCffiTTCAAAlB

'< tCTOrCTTCATACATGAACCTOAAOTCIACAD<?CMOttOItOO

.CICTCTRTrtTCATCGAKTTTCACATCTTTTBGACI'

CWATTTTUAACT CT CHITO TTCAT CAAIf T T X CACATti TT f T l!6A<: T <

i ATGCI0ACTCAA08T0AAAATTCACT0TIGAAApCCATCeAlTITAGACTCTCT6TCtTCATC0AICTtTCACCT0mTCCACT<

rüt SVriPLSRVb&i llBCCACABAITri.................................-......-.....-.......-

CTeíCTTCATAGATGAA6CTCAAGTGTACAR0SATim0Ttfi0 25S

? V Г I I- f. A T. V S ft D V V

.Т(»Д«СТв»АГЛН1АСА1!1?(»ТвТТСТХ1!1> '.'■ <•.'>

.ТОААЯСГОААСТОТАСАССВАТОТТСТТСС 250

CTGTCTtCATAGAGGACAATGAAGIGTACAARGATfiTTGTTGG 225

2 5« AACICCAMdTATeTOOCTCCACAGCTCTtOCACCCC

3 A M ÍS6 AACTfiCAAAl

т ex i; o<' т с cakaswt вт r i¡ с с с с ct

1 AACTGCAAA1

' T С CADA SKTfiT T ОС «(1С C<.

' AT01ВССTCCAOAС07CIтесOOCCG

СА0АТТ0ДГСТС; GCACIGCTGSÍ GICAITTTTTATGTTCTTCTAAGT6GC-ACA Э

:T<ATTTIATAIATICTTCTAAI¡Ti

•AACAATCCAAAAp

aacaati;i;i и t< ;;

Ш: АД T [i(!AAAAÍ¡A КАСТ ВДТВ Г С T HGAIÍT GCT GGAjlST' iACAATOeAAAftlBAeATTGAieTCTGGAOTGCTC(^tCATTITAtATCITCTTCTAAOIOOGjiíCA • ГА T 9T В G ГIССАПАО Г.Т G СIG С GAC С 0(-A0 С T AT O GGA

' Г ffv Ci

!OJ> [¡ТСЛТТТШТЛГДТТСТТСТАЛвТООе-ОТС ?

Рис. 10. Выравнивание аминокислотных и пуклеотидных последовательностей частей Scr/Thr-ки/шмого домена транскриптов CDPK V. amurensis, принадлежащих к ipynue VaCDPKl-L. VI, Vil, VIII и IX - каталитические субдомены SeiTThr-киназного домена CDPK. Серым цветом выделены стоп-кодопы, стрелками обозначены одпонуклеотидные инсерции.

Проведя поиск среди депонированных в ОепВапк геномных последовательностей У. ут/ега, мы нашли близкие последовательности для всех описанных нами транскриптов СйРК V. атигепя1$ (идентичность пуклеотидных последовательностей 98-100%), за исключением коротких транскриптов, а также двух длинных - УаСйРК!-ЬЗ и УаСОРК1-Ь2-Ь. Также в геноме У. ут/ега мы не обнаружили транскриптов высоко гомологичных "химерным" трапскриптам V. атигет1я УаСРРК1Ь и УаСОРК1с, которые были получены нами из препаратов кДНК культуры клеток УВ1 (табл. 4). Последовательность транскрипта УаСОРШс с 1 по 178 нуклеотид идентична последовательности транскрипта УаСйРК1а-2, однако между 170 по 328 нуклеотидами УаСОРК1с идентична транскрипту УаСОРКЫ. Последовательность УаСОРК1Ь с 1 по 230 нуклеотид идентична УаСОРК!а, а с 214 по 328 нуклеотид идентична транскрипту УаСОРК1-Ы-а, за исключением позиции 270. УаСОРК1а-1 и УаСОРК1а-2 различаются на один нуклеотид и принадлежат к группе транскриптов УаСОРК1а.

Таким образом, главное различие в экспрессии генов СОРК между контрольной культурой и го/Я-трансгенными заключается в том, что в то/Д-культурах значительно

изменяется сила экспрессии некоторых генов CDPK и увеличивается разнообразие транскриптов CDPK (табл. 4). Мы предполагаем, что VaCDPKId и VaCDPKle -кандидаты для изучения аномалий развития, механизмов ризогенеза и других биохимических и морфологических изменений, вызываемых трансформацией растительных клеток геном rolB. Ген VaCDPK3a, экспрессия которого уменьшалась в го/В-трансгенных клетках, может быть также вовлечен в регуляцию различных клеточных процессов, таких как вторичный метаболизм, восприимчивость к ауксинам и баланс Са2+.

Присутствие в кДНК пробах /-о/В-трансформированных культур коротких, длинных и "химерных" транскриптов CDPK вызывает особый интерес (рис. 9, рис. 10, табл. 4). Мы исключаем возможность аномалий прохождения легирования, клонирования или амплификации коротких и длинных транскриптов CDPK V. amurensis. Мы отметили, что количество отсутствующих нуклеотидов во всех коротких транскриптах кратно трем, и один и тот же вид модификаций был получен для разных клеточных культур V. amurensis (VaCDPK3a-Sl, VaCDPKl-Ll-a и VaCDPKl-L2-b) (табл. 4). Кроме того, в геноме V. vinifera обнаружена последовательность близкая к VaCDPKl-Ll-a и VaCDPKl-Ll-b (номер в GenBank АМ427019). Известно несколько случаев подобных изменений последовательностей киназных доменов для некоторых Ser/Thr-протеинкиназ растений и животных (Xiong, Yang, 2003; Park et al., 2006; Kurihara et al., 2007; We¡ et al., 2007; Laudadio et al., 2008). Однако для CDPK подобные модификации последовательностей киназного домена не были прежде описаны, и их физиологическое значение не известно. Информация об альтернативном сплайсинге транскриптов CDPK очень скудна. Нишияма с соавторами (Nishiyama, et al., 1999) сообщают о случае альтернативного сплайсинга гена CDPK, в последовательности мРНК которого были модифицированы участки, соответствующие областям связывания Са2+. В геноме V. vinifera мы обнаружили последовательности близкие только к VaCDPKl-Ll-a и VaCDPKl-Ll-b из найденных нами необычных транскриптов CDPK V. amurensis, поэтому можно предположить, что эти транскрипты не подвергались посттранскрипционным изменениям мРНК, и в геноме V. amurensis присутствуют соответствующие гены. Так как в геноме V. vinifera не обнаружено последовательностей близких VaCDPKla-S2, VaCDPK3a-S¡ и VaCDPK3a-S2, можно предположить, что эти транскрипты CDPK подвергались альтернативному сплайсингу, однако это предположение требует дальнейшей проверки. Возможно, белковые продукты, соответствующие трапскриптам VaCDPKla-S2, VaCDPK3a-Sl и VaCDPK3a-S2, в последовательностях киназного домена которых отсутствуют некоторые важные каталитические субдомены, не обладают киназной активностью, но, несмотря на отсутствие данной каталитической активности, могут иметь другие важные функции, в том числе и каталитические. Возможно, что присутствие стоп-кодонов в последовательностях длинных транскриптов CDPK V. amurensis, приводит к образованию коротких белков CDPK, однако, с другой стороны, не исключено, что транскрипты VaCDPKl-Ll-a, VaCDPKl-Ll-b, VaCDPKl-L2-b и VaCDPKl-L3 являются мишенями "nonsense-mediated mRNA decay", как это было показано для других аберрантных мРНК (Baker and Parker, 2004). Функция каждого гена CDPK, экспрессия которого изменена в го/В-экспрессирующих клетках V. amurensis, требует дальнейшего исследования.

ВЫВОДЫ

1. С помощью воздействия различных элиситоров, добавления Phe в питательные среды и селекции на PFP можно повысить содержание стильбенов (транс-резвератрол) в культуре клеток V. amurensis в 1.2-11 раз. Максимальное содержание отранс-резвератрола достигало 0.26% от сухого веса клеток в результате трехмесячной селекции культуры на PFP, что является недостаточным для использования культуры в биотехнологическом производстве стильбенов.

2. Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes приводит к активации биосинтеза mpa/íc-резвератрола и накоплению больших количеств этого стильбена го/В-трансформированными клетками в течение двух лет после формирования стабильных каллусных фенотипов. го/В-трансгенная культура, активно экспрессирующеая трансген, накапливала более 2% резвератрола от сухого веса клеток.

3. В го/В-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре V. amurensis, обработанной SA, дифференциально увеличена экспрессия генов ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, PAL и STS.

4. Паттерны влияния трансформации клеток V. amurensis геном rolB и обработки SA на экспрессию генов VaPAL и VaSTS значительно различаются. Это свидетельствует о том, что эти способы воздействия на клетки винограда индуцируют биосинтез и накопление резвератрола, действуя через различные регуляторные пути.

5. Дефосфорилирование тирозиновых остатков неизвестного белка вовлечено в стимулирующее действие трансформации клеток V. amurensis геном rolB на аккумуляцию транс-резвератрола.

6. Ингибиторы кальциевых каналов снимают стимулирующий эффект трансформации клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола. Трансформация геном rolB значительно изменяет экспрессию некоторых генов CDPK, а также приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательности Ser/Thr-киназного домена. Эти данные свидетельствуют о том, что активный синтез резвератрола является Са2+-зависимым процессом.

Список работ по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах:

1. Kiselev К.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vit is amurensis transformed cells // Journal of Biotechnology. 2007. V. 128. № 3. P. 681-692.

2. Киселев K.B., Горпенченко Т.Ю., Чернодед Г.К., Дубровина A.C., Грищенко О.В., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Кальций-зависимый механизм соматического эмбриогенеза в культурах клеток женьшеня Panax ginseng, экспрессирующих онкоген rolC // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 2. С. 275-285.

3. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Bulgakov V.P. Phenylalanine ammonia-lyase an stilbene synthase gene expression in rolB transgenic cell cultures of Vitis amurensis Applied Microbiology and Biotechnology 2009. V. 82. № 4. P. 647-655.

4. Dubrovina A.S., Kiselev K.V., Veselova M.V., Isaeva G.A., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. Enhanced resveratrol accumulation in rolB transgenic cultures of Vitis amurensis correlates with unusual changes in CDPK gene expression // Journal of Plai Physiology. 2009. V. 166. № 11. P. 1194-1206.

Патент:

5. Федореев С.А., Киселев К.В., Дубровина A.C., Веселова М.В., Кулеш Н.И., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Патент РФ №2326165. Способ получения резвератрола. C12N 5/04, C12N 15/05, А01Н 1/04. Заявка 2006135294. Решение о выдаче патента от 19.10.2007 г.

Работы, опубликованные в материалах всероссийских и международных научных конференций и симпозиума:

6. Дубровина A.C., Булгаков В.П. Активация синтеза резвератрола, ценного противоопухолевого полифенола, в трансгенных клеточных культурах винограда амурского // Живые системы: Всероссийский конкурс инновационных проектов. Тезисы докладов. Киров, 2005. С. 85-87.

7. Дубровина A.C., Киселев К.В., Веселова М.В., Федореев С.А., Булгаков В.П. Активация синтеза резвератрола - ценного противоопухолевого полифенола в трансгенных клеточных культурах Vitis amurensis // Биология - наука XXI века: X Пущинская школа-конференция молодых ученых. Пущино, 2006. С. 16.

8. Дубровина A.C., Киселев К.В., Булгаков В.П. Влияние гена roIB агробактерий на биосинтез резвератрола в культуре клеток винограда (Vitis amurensis Rupr.) 11 XI Международная молодежная Школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток, 2007. С. 12-13.

9. Киселев К.В., Дубровина A.C., Булгаков В.П. Экспрессия генов кальций-зависимых протеинкиназ в ro/ß-трансгенных культурах клеток винограда и женьшеня // XI Международная молодежная Школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток, 2007. С. 22-23.

10. Дубровина A.C., Киселев К.В. Экспрессия генов биосинтеза резвератрола PAL и STS в ro/ß-трансгенных клетках винограда амурского // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: IX Международная конференция. Звенигород, 2008. С. 114-115.

11. Киселев К.В., Дубровина A.C., Исаева Г.А., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Экспрессия генов CDPK и появление транскриптов CDPK с модифицированной

оследовательностыо серин/треонин-киназного домена в пэ/5-трансгенных клетках винограда // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: IX Международная онференция. Звенигород, 2008. С. 172-173.

12. K.V. Kiselev, A.S. Dubrovina, Y.N. Zhuravlev Regulation of resveratrol iosynthesis in grape cell cultures // International Mini-Symposium on Advances in iochemical Engineering Sciences (ABioChES). Shanghai, 2009. P. 8.

13. Kiselev K.V., Dubrovina A.S. Stilbene synthase gene expression in callus cultures f Vitis amurensis with different levels of resveratrol production // 4th Conference of Polish ociety of Experimental Plant Biology, Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica. racow, 2009. V. 51. Suppl. 2. P. 78.

ДУБРОВИНА Александра Сергеевна

ВЛИЯНИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ВИНОГРАДА Vitis amurensis Rupr. ГЕНОМ roIB ИЗ Agrobacterium rhizogenes НА БИОСИНТЕЗ РЕЗВЕРАТРОЛА

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уч.-изд. л. 1,0 Формат 60х84/16

Тираж 100 экз. Заказ № 013

Отпечатано в типографии РПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дубровина, Александра Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Стильбены растений семейства Укасеае.

1.2. Биологически активные свойства резвератрола.

1.3. Биосинтез резвератрола и его производных.

1.4. Регуляция биосинтеза стильбенов.

1.4.1. Регуляция экспрессии генов биосинтеза стильбенов.

1.4.2. Сигнальные пути, регулирующие биосинтез стильбенов.

1.5. Биосинтез резвератрола и его производных клетками растений, бактерий и грибов.

1.6. Влияние трансформации клеток растений геном го1В из Agrobacteriыm rhizogenes на их морфологию и метаболизм.

1.7. Кальциевая сигнальная система.

1.7.1. Кальциевая сигнальная система и ее роль во внутриклеточной сигнальной сети.

1.7.2. Участие кальциевой сигнальной системы в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов растений.

1.7.3. Са -зависимые протеинкиназы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал и клеточные культуры.

2.2. Обработка элиситорами и другими эффекторами.

2.3. Селекция клеток на фторфенилаланине.

2.4. Генетическая трансформация.

2.5. Выделение нуклеиновых кислот и синтез кДНК.

2.6. Условия проведения ПЦР.

2.7. Секвенирование ДНК.

2.8. Количественный и полуколичественный анализ экспрессии генов rolB, фенилаланин-аммиак-лиаз (PAL), стильбен синтаз (STS) и Са -зависимых протеинкиназ (CDPK).

2.9. Определение содержания стильбенов в культурах V. amurensis.

2.10. Статистический анализ полученных результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Накопление биомассы и биосинтез стильбенов каллусными культурами V. amurensis.

3.2. Увеличение продукционных характеристик культуры V2.

3.2.1. Обработка элиситорами.

3.2.2. Эффект фенилаланина и селекция клеток на фторфенилаланине

3.3. Трансформация клеток V. amurensis геном rolB и отбор фенотипических линий.

3.4. Доказательство и оценка экспрессии гена rolB в культурах клеток- V. amurensis.

3.5. Накопление биомассы и биосинтез стильбенов ro/5-трансгенными клеточными культурами V. amurensis.

3.6. Влияние ингибитора Tyr-фосфатаз фениларсиноксида и общего ингибитора фосфатаз ортованадата натрия на рост и содержание резвератрола в клеточных культурах V. amurensis.

3.7. Экспрессия генов PAL и STS в контрольной и го/Б-трансгенных клеточных культурах V. amurensis.

3.8. Влияние салициловой кислоты на экспрессию генов PAL и STS в контрольной культуре клеток V. amurensis.

3.9. Влияние ингибиторов Са -каналов на прирост биомассы и синтез резвератрола в каллусных культурах V. amurensis.

3.10. Экспрессия генов CDPK в клеточных культурах V. amurensis.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние трансформации клеточной культуры винограда Vitis amurensis Rupr.геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола"

Использование клеточных культур растений для промышленного получения биологически активных веществ (БАВ) является перспективным направлением в биотехнологии. Большинство вторичных метаболитов растений обладают ценными фармакологическими свойствами и поэтому являются важнейшими компонентами различных лекарственных препаратов. Решение проблемы промышленного получения БАВ часто осложняется недостатком быстро воспроизводимых сырьевых источников. Такими источниками могут стать культуры клеток растений. Однако опыт получения клеточных культур показывает, что содержание в них целевых веществ чаще всего ниже, чем необходимо для эффективного промышленного производства этих соединений, поэтому разработка методов увеличения содержания БАВ в клетках растений in vitro является актуальной задачей.

Известно, что резвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) обладает превентивными свойствами против некоторых видов рака, положительно влияет на сердечно-сосудистую систему, а также обладает высоким фармакологическим потенциалом в лечении нейродегенеративных заболеваний (Pervaiz, 2003; Aggarwal et al., 2004; Shankar et al., 2007). Резвератрол выделяется среди полифенолов растений своей мощной антиоксидантной активностью, которая превосходит активность витамина Е (de la Lastra and Villegas, 2007). Кроме того, существуют данные о положительном эффекте резвертрола на продолжительность жизни живых организмов (Wood et al., 2004). В настоящее время на основе этого вещества уже создаются биологически активные добавки к пище. Резвератрол обладает высоким потенциалом для применения в фитотерапии и фармакологии (Shankar et al., 2007). Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как тутовое дерево, арахис, клюква и голубика. Виноград, в том числе и дикий виноград Vitis amurensis Rupr., относят к основным источникам резвератрола.

На сегодняшний день нет дешевого и эффективного способа получения резвератрола. В растениях содержание этого вещества невелико, и необходимо довольно долгое время для их выращивания, поэтому получать резвератрол таким способом невыгодно. Синтетические аналоги БАВ часто содержат токсичные примеси. Отделение примесей и получение чистого вещества — это дополнительная затрата времени и средств. Клеточные культуры винограда, при условии их высокой целевой продуктивности, могли бы стать альтернативным источником резвератрола. Однако известно, что содержание резвератрола в клеточных культурах растений обычно ниже необходимого для использования этих культур в промышленном производстве стильбенов (Donnez et al., 2009), поэтому следует индуцировать биосинтез резвератрола с помощью методов биотехнологии.

Классическими методами индукции синтеза вторичных метаболитов в культурах клеток растений являются методы селекции и отбора наиболее продуктивных клеточных линий, варьирование состава питательных сред, а также обработка клеток разнообразными элиситорами. В связи с бурным развитием технологий рекомбинантных ДНК и биохимии растений появилась возможность принципиально нового подхода в управлении метаболическим аппаратом клетки. Так, клеточные культуры растений, трансформированные генами rol из почвенных бактерий Agrobacterium rhizogenes, уже давно привлекали внимание биотехнологов вследствие повышенной способности продуцировать самые разнообразные вторичные метаболиты (Bulgakov, 2008). К повышению синтеза некоторых групп вторичных метаболитов ведет как трансформация диким штаммом A. rhizogenes, так и интеграция индивидуальных генов rol в геном растения. Недавно был показан стимулирующий эффект трансформации Rubia cordifolia геном rolB на синтез антрахинонов в культурах клеток этого растения (Bulgakov et al., 2002). Для получения клеточной культуры V. amurensis, активно продуцирующей резвератрол, были использованы не только классические методы индукции синтеза вторичных метаболитов, но и агробактериальная трансформация культуры клеток V. amurensis геном rolB.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. Трансформировать клетки культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes и оценить биосинтез резвератрола в трансформированных клеточных линиях.

3. Изучить механизм влияния трансформации культуры клеток V. amurensis геном rolB на биосинтез резвератрола.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes приводит к активации биосинтеза трянс-резвератрола и накоплению больших количеств этого стильбена в полученных трансгенных клеточных линиях.

3. В ro/5-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре V. amurensis, обработанной салициловой кислотой (SA), дифференциально увеличена экспрессия генов ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, таких как фенилаланин-аммиак-лиаза (PAL) и стильбен синтаза (STS). При этом влияние SA и трансформации геном rolB на экспрессию генов PAL и STS в культурах клеток V. amurensis значительно различается.

5. Трансформация клеток V. amurensis геном rolB значительно изменяет экспрессию некоторых генов С а" -зависимых протеинкиназ (CDPK), а также приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательности Ser/Thr-киназного домена.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые изучено влияние трансформации растительных клеток геном rolB из A. rhizogenes на биосинтез стильбенов. В клеточной культуре V. amurensis, активно экспрессирующей ген rolB, продукция гаранс-резвератрола клетками составила 111.5 мг/л среды или 1431.3 мкг/г сырого веса клеток (2.32% от сухого веса клеток), что значительно превышает ранее сообщаемые данные для резвератрол-продуцирующих клеточных культур растений. Впервые показано, что трансформация растительных клеток геном rolB и обработка SA по-разному влияют на экспрессию генов PAL и STS. Впервые показано, что трансформация культуры клеток растений геном rolB из A. rhizogenes значительно изменяет экспрессию некоторых генов CDPK и приводит к появлению транскриптов CDPK с необычными модификациями последовательностей Ser/Thr-киназного домена.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на Всероссийском конкурсе инновационных проектов "Живые системы" (г. Киров, 2005); на 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2006); на XI Международной молодежной Школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2007); на IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008); на Международном Симпозиуме по достижениям в биохимической инженерии (Китай, 2009); на 4-й Международной конференции польского сообщества экспериментальной растительной биологии (Польша, 2009). Материалы диссертации изложены в четырех статьях, опубликованных в одном отечественном и трех международных журналах.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 13 таблиц. Список литературы насчитывает 186 наименований. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, ДВО РАН и Президента РФ (01-04-48887-а, 03-04-48102-а, 06-04-48149-а, 06-04-96008-рвостока, 07-04-12020-офи, МК-714.2008.4, 09-Ш-А-06-169, 09-Ш-В-06-234).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Дубровина, Александра Сергеевна

ВЫВОДЫ

1. С помощью воздействия различных элиситоров, добавления Phe в питательные среды и селекции на PFP можно повысить содержание стильбенов (транс-резвератрол) в культуре клеток V. amurensis в 1.2-11 раз. Максимальное содержание гарянс-резвератрола достигало 0.26% от сухого веса клеток в результате трехмесячной селекции культуры на PFP, что является недостаточным для использования культуры в биотехнологическом производстве стильбенов.

2. Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из А. rhizogenes приводит к активации биосинтеза гарянс-резвератрола и накоплению больших количеств этого стильбена в течение двух лет после формирования стабильных каллусных фенотипов трансформированных культур, ro/5-трансгенная культура, активно экспрессирующеая трансген, накапливала более 2% резвератрола от сухого веса клеток.

3. В ro/5-экспрессирующих клеточных культурах и в контрольной культуре V. amurensis, обработанной SA, дифференциально увеличена экспрессия генов ключевых ферментов в биосинтезе резвератрола, PAL и STS.

5. Дефосфорилирование тирозиновых остатков неизвестного белка вовлечено в стимулирующее действие трансформации клеток V. amurensis геном rolB на аккумуляцию /;//?анс-резвератрола.

6. Ингибиторы кальциевых каналов снимают стимулирующий эффект трансформации клеток V. атигет18 геном го1В на биосинтез резвератрола. Трансформация геном го1В значительно изменяет экспрессию некоторых генов СОРК, а также приводит к появлению транскриптов СИРК с необычными модификациями последовательности Зег/ТЬг-киназного домена. Эти данные свидетельствуют о том, что активный синтез резверотрола является Са2+-зависимым процессом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дубровина, Александра Сергеевна, Владивосток

1. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф., Жигалова Т.В., Мейчик Н.Р., Носов A.M., Полесская О.Г., Харитоношвили Е.В., Чуб В.В. Физиология растений. М.: Издательский центр "Академия", 2005. 640 с.

2. Киселев К.В. и Булгаков В.П. (2009) Стабильность наследования и экспрессия гена rolC в 15-летних клеточных культурах женьшеня Panax ginseng II Прикладная Биохимия и Микробиология. 45: 618-624.

3. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: "Наука", 2002. 294 с.

4. Aggarwal В., Bhardwaj A., Aggarwal R., Seeram N., Shishodia S., Takada Y. (2004) Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies // Anticancer research. 24: 2783-2840.

5. Adrian M., Jeandet P., Bessis R., Joubert J.M. (1996) Induction of phytoalexin (resveratrol) synthesis in grapevine leaves treated with aluminium chloride (A1C13) // J. Agric. Food Chem. 44: 1979-1981.

6. Adrian M., Jeandet P., Douillet-Breuil A.C., Tesson L., Bessis R. (2000) Stilbene content of mature Vitis vinifera berries in response to UV-C elicitation // J. Agric. Food Chem. 48: 6103-6105.

7. Altamura M., Archilletti Т., Capone I., Costantino P. (1991) Histological analysis of the expression of Agrobacterium rhizogenes rolB-GUS gene fusions in transgenic tobacco // New Phytol. 118: 69-78.

8. Altamura M.M. (2004) Agrobacterium rhizogenes rolB and rolD genes: regulation and involvement in plant development // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 77: 89-101.

9. Anderson R.M., Bitterman K.J., Wood J.G., Medvedik O., Sinclair D.A. (2003) Nicotinamide and PNC1 govern lifespan extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae II Nature. 423: 181-185.

10. Athar M., Back J.H., Tang X., Kim K.H., Kopelovich L., Bickers D.R., Kim A.L. (2007) Resveratrol: A Review of Pre-clinical Studies for Human Cancer Prevention // Toxicol Appl. Pharmacol. 224: 274-283.

11. Aziz M.H., Kumar R., Ahmad N. (2003a) Cancer chemoprevention by resveratrol: in vitro and in vivo studies and the underlying mechanisms // Int. J. Oncol. 23: 17-28.

12. Austin M.B., Bowman M.E., Ferrer J.L., Schroder J., Noel J.P. (2004) An aldol switch discovered in stilbene synthases mediates cyclization specificity of type III polyketide synthases // Chem. Biol. 11: 1179-1194.

13. Baker K.E. and Parker R. (2004) Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression // Curr. Opin. Cell Biol. 16: 293-299.

14. Bavaresco L., Fregoni C., Cantu E., Trevisan M. (1999) Stilbene compounds: from the grapevine to wine // Drugs Exptl. Clin. Res. 25: 57-63.

15. Beekwilder J., Wolswinkel R., Jonker H., Hall R., de Vos C.H., Bovy A. (2006) Production of resveratrol in recombinant microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 72: 5670-5672.

16. Becker J.W., Armstrong G.O., Van der Merwe M.J., Lambrechts M., Vivier M.A., Pretorius I.S. (2003) Metabolie engineering of Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of the wine-related antioxidant resveratrol // Ferns Yeast Res. 4: 7985.

17. Bekesiova I., Nap J.P., Mlynarova L. (1999) Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia // Plant Mol. Biol. Rep. 17: 269-277.

18. Belhadj A., Saigne C., Telef N., Cluzet S., Bouscaut J., Corio-Costet M.F., Merillon J.M. (2006) Methyl jasmonate induces defense responses in grapevine and triggers protection against Erysiphe necator I I J. Agric. Food Chem. 54: 91199125.

19. Belhadj A., Telef N., Cluzet, S., Bouscaut J., Corio-Costet M.F., Merillon J.M. (2008b) Ethephon elicits protection against Erysiphe necator in grapevine // J. Agric. Food Chem. 56: 5781-5787.

20. Bezier A., Lambert B., Baillieul F. (2002) Study of Defense-related Gene Expression in Grapevine Leaves and Berries Infected with Botrytis cinerea II Eur. J. Plant Pathol. 108: 111-120.

21. Blume B., Nürnberger T., Nass N., Scheel D. (2000) Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley//Plant Cell. 12: 1425-1440.

22. Boudet A.M. (2007) Evolution and current status of research in phenolic compounds // Phytochemistry. 68: 2722-2735.

23. Boudeau J., Miranda-Saavedra D., Barton G.J., Alessi D.R. (2006) Emerging roles of pseudokinases // Trends Cell Biol. 16: 443-452.

24. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.V., Tchernoded G.K., Zhuravlev Y.N. (1998) The impact of plant rolC oncogene on ginsenoside production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 49: 1929-1934.

25. Bulgakov V.P., Kozyrenko M.M., Fedoreyev S.A., Mischenko N.P., Denisenko V.A., Zvereva L.V., Pokushalova T.V., Zhuravlev Y.N. (2001) Shikonin production by p-fluorophenylalanine resistant cells of Lithospermum erythrorhizon II Fitoterapia.72: 394-401.

26. Bulgakov V.P. (2008) Functions of rol genes in plant secondary metabolism //Biotechnology Advances. 26: 318-324.

27. Blume B., Nürnberger T., Nass N., Scheel D. (2000) Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defence in parsley//Plant Cell. 12: 1425-1440.

28. Cacho M., Moran M., Tarrago J.F., Corchete P. (1995) Calcium restriction induces cardenolide accumulation in cell-suspension cultures of Digitalis-thapsi L. // Plant Cell Reports. 14: 786-789.

29. Cacho M., Moran M., Corchete P., Fernandez-Tarrago J. (1999) Effect of calcium restriction on cardenolide accumulation in two cell lines of Digitalis thapsi grown under different right regimes // Acta Physiol. Plant. 24: 335-340.

30. Calderon A.A., Garcia-Florenciano E., Pedreno M. A., Munoz R., Ros Barcelo A. (1990) Zymographic screening of plant peroxidase isoenzymes oxidizing 4-hydroxystilbenes // Electrophoresis. 11: 507-508.

31. Calderon A.A.; Zapata J.M. Pedreno M.A.; Munoz R., Ros Barcelo A. (1992) Levels of 4-hydroxystilbene oxidizing isoperoxidases related to constitutive disease resistance in v/Yro-cultured grapevines // Plant Cell Tissue Organ Cult. 29: 63-70.

32. Capone I., Cardarelli M., Mariotti D., Pomponi M., Paolis A., Costantino P. (1991) Different promoter regions control level and tissue specificity of expression of Agrobacterium rhizogenes rolB gene in plants // Plant Molecular Biology. 16: 427-436.

33. Cessna S.G. and Low P.S. (2001) Activation of the oxidative burst in aequorin-transformed Nicotiana tabacum cells is mediated by protein kinase- and anion channel-dependent release of Ca~ from internal stores // Planta. 214: 126134.

34. Chaman M.E., Copaja S.V., Argandona V.H. (2003) Relationships between salicylic acid content, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity, and resistance of barley to aphid infestation // J. Agric. Food Chem. 51: 2227-2231.

35. Chemler J.A. and Koffas M.A.G. (2008) Metabolic engineering for plant natural product biosynthesis in microbes // Curr. Opin. Biotech. 19: 597-605.

36. Cheng S.H., Willmann M.R., Chen H.C., Sheen J. (2002) Calcium signaling through protein kinases. The Arabidopsis calcium-dependent protein kinase gene family // Plant Physiol. 129: 469-485.

37. Chiron H., Drouet A., Lieutier F., Payer H.D., Ernst D., Sandermann H. (2000) Gene induction of stilbene biosynthesis in Scots pine in response to ozone treatment, wounding, and fungal infection // Plant Physiol. 124: 865-872.

38. Chong J.L., Poutaraud A., Hugueney P. (2009) Metabolism and roles of stilbenes in plants//Plant Science. 177: 143-155.

39. Cochrane F.C., Davin L.B., Lewis N.G. (2004) The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family: kinetic characterization of the four PAL isoforms//Phytochemistry. 65: 1557-1564.

40. Delaunois B., Cordelier S., Conreux A., Clement C., Jeandet P. (2009) Molecular engineering of resveratrol in plants // Plant Biotechnol. J. 7: 2-12.

41. Des Marais D.L. and Rausher M.D. (2008) Escape from adaptive conflict after duplication in an anthocyanin pathway gene // Nature. 454: 762-U85.

42. Docherty J.J., Fu M.M., Stiffler B.S., Limperos R.J., Pokabla C.M., DeLucia A.L. (1999) Resveratrol inhibition of herpes simplex virus replication // Antiviral. Res. 43: 145-155.

43. Donnez D, Jeandet P, Clément C, Courot E. (2009) Bioproduction of resveratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms // Trends Biotechnol. 27:706-13.

44. Douillet-Breuil A.C., Jeandet P., Adrian M., Bessis R. (1999) Changes in the phytoalexin content of various Vitis spp. in response to ultraviolet C elicitation // J. Agric. Food Chem. 47: 4456-4461.

45. Draczynska-Lusiak B., Doung A., Sun A.Y. (1998) Oxidized lipoproteins may play a role in neuronal cell death in Alzheimer disease // Mol. Chem. Neuropathol. 33: 139-148.

46. Estruch J., Schell J., Spena A. (1991) The protein encoded by the rolB plant oncogene hydrolyses indole glucosides // EMBO J. 10: 3125-3128.

47. Ferrer J.L., Austin M.B., Stewart C., Noe J.P. (2008) Structure and function of enzymes involved in the biosynthesis of phenylpropanoids // Plant Physiol. Biochem. 46: 356-370.

48. Filippini F., Rossi V., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P.M., Lo Schiavo F., Terzi M. (1996) A plant oncogene as a phosphatase // Nature. 379: 499-500.

49. Fornara V., Onelli E., Sparvoli F., Rossoni M., Aina R., Marino G., Citterio S. (2008) Localization of stilbene synthase in Vitis vinifera L. during berry development//Protoplasma. 233: 83-93.

50. Frankel E.N., Waterhouse A.L. (1993) Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol // Lancet. 341: 1103-1104.

51. Fremont L., Belguendouz L., Delpal S. (1999) Antioxidant activity of resveratrol and alcohol-free wine polyphenols related to LDL oxidation and polyunsaturated fatty acids // Life Sci. 64: 2511—2521.

52. Fremont L. (2000) Biological effects of resveratrol // Life Sci. 66: 663-673.

53. Gargantini P.R., Gonzales-Rizzo S., Chinchilla D., Raices M., Giammaria V., Ulloa R.M., Frugier F., Crespi M.D. (2006) A CDPK isoform participates in the regulation of nodule number in Medicago truncatida I I Plant J. 48: 843-856.

54. Gatto P., Vrhovsek U., Muth J., Segala C., Romualdi C., Fontana P., Pruefer D., Stefanini M., Moser C., Mattivi F., Velasco R. (2008) Ripening and genotype control stilbene accumulation in healthy grapes // J. Agricult. Food Chem. 56: 11773-11785.

55. Giacometti S., Camoni L., Albumi C., Visconti S., De Michelis M.I., Aducci P. (2004) Tyrosine phosphorylation inhibits the interaction of 13-3-3 proteins with the plasma membrane H^-ATPase // Plant Biol. 6: 422-431.

56. Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu C. (2001) An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression // Methods. 25: 386-401.

57. Goldberg D.M., Hahn S.E., Parkes J.G. (1995) Beyond alcohol: beverage consumption and cardiovascular mortality // Clin. Chim. Acta 237: 155-187.

58. Hain R., Bieseler B., Kindl H., Schröder G., Stöcker R. (1990) Expression of a stilbene synthase gene in Nicotiana tabacum results in synthesis of the phytoalexin resveratrol // Plant Mol. Biol. 15: 325-335.

59. Hall D. and De Luca V. (2007) Mesocarp localization of a bi-functional resveratrol/hydroxycirmamic acid glucosyltransferase of Concord grape (Vitis labruscd) II Plant J. 49: 579-591.

60. Harper J.F. and Harmon A. (2005) Plants, symbiosis and parasites: a calcium signaling connection // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6: 555-566.

61. Hart J.N. and Shrimpton D.M. (1979) Role of stilbenes in resistance of wood to dacay II Phytopathol. 69: 1138.

62. Harmon A.C. and Gribskov M., Gubrium E., Harper J.F. (2001) The CDPK superfamily of protein kinases //New Phytol. 151: 175-183.

63. Hattori R., Otani H., Maulik N., Das D.K. (2002) Pharmacological preconditioning with resveratrol: role of nitric oxide // Am. J. Physiol. 282: 1988— 1995.

64. Hung L.M., Chen J.K., Huang S.S., Lee R.S., Su M.J. (2000) Cardioprotective effect of resveratrol, a natural antioxidant derived from grapes // Cardiovasc. Res. 47: 549-555.

65. Jaillon O., Auiy J.M., Noel B., Policriti A., Clepet C., Casagrande A., Choisne N., Aubourg S., Vitulo N., Jubin C., et al. (2007) The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla // Nature. 449: 463-467.

66. Jeandet P., Bessis R., Gautheron B. (1991) The production of resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene) by grape berries in different developmental stages //Am. J.Enol. Vitic. 42:41-46.

67. Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M. Weston L.A.,Debord S., Meunier P., Maume G., Bessis R. (1997) HPLC analysis of grapevine phytoalexins coupling photodiode array detection and fluorometry// Anal. Chem. 69: 5172-5177.

68. Jeandet P., Douillt-Breuil A.C., Bessis R., Debord S., Sbaghi M., Adrian M. (2002) Phytoalexins from the vitaceae: biosynthesis, phytoalexin gene expression in transgenic plants, antifungal activity, and metabolism // J. Agric. Food Chem. 50:2731-2741.

69. Jez J.M., Austin M.B., Ferrer J., Bowman M.E., Schroder J., Noel J.P. (2000) Structural control of polyketide formation in plant-specific polyketide synthases // Chem. Biol. 12: 919-930.

70. Kang B.S., Shin N.H., Lee S.H., Min K.R., Kim Y. (1998) Inhibitory effects of alpha-viniferin and resveratrol on the L-dopa oxidase activity of tyrosinase // Med. Sci. Res. 26: 235-237.

71. Kao Y.Y., Harding S.A., Tsai C.J. (2002) Differential expression of two distinct phenylalanine ammonia-lyase genes in condensed tannin-accumulating and lignifying cells of quaking aspen // Plant Physiol. 130: 796-807.

72. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. (2007) The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. 128:681-692.

73. Knight M.R., Smith S.M., Trewavas A.J. (1992) Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 49674971.

74. Kobayashi M., Ohura I., Kawakita K., Yokota N., Fujiwara M., Shimamoto K., Doke N., Yoshioka H. (2007) Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase // Plant Cell. 19: 1065-1080.

75. Kodan A., Kuroda H., Sakai F. (2002) A stilbene synthase from Japanese red pine {Pinus densiflora): implications for phytoalexin accumulation and down-regulation of flavonoid biosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 3335-3339.

76. Krisa S., Larronde F., Budzinski H., Decendit A., Deffieux G., Merillon J.M. (1999) Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures: Methyl jasmonate induction and C-13 biolabeling // J. Nat. Prod. 62: 1688-1690.

77. Ku K.L., Chang P.S., Cheng Y.C., Lien C.Y. (2005) Production of stilbenoids from the callus of Arachis hypogaea: a novel source of the anticancer compound piceatannol // J. Agric. Food Chem. 53: 3877-3881.

78. Kurihara D., Kawabe A., Matsunaga S., Nakagawa K., Fujimoto S., Uchiyama S., Fukui K. (2007) Characterization of a splicing variant of plant Aurora kinase // Plant Cell Physiol. 48: 369-374.

79. Melchior F., Kindl H. (1991) Coordinate- and elicitor-dependent expression of stilbene synthase and phenylalanine ammonia-lyase genes in Vitis cv. Optima // Arch. Biochem. Biophys. 288: 552-557.

80. Milne J.C., Lambert P.D., Schenk S., Carney D.P., Smith J J., Gagne D.J., Jin L., Boss O., Perni R.B., Vu C.B., et al. (2007) Small molecule activators of SIRT1 as therapeutics for the treatment of type 2 diabetes // Nature. 450: 712-716.

81. Mithofer A., Ebel J., Bhagwat A.A., Boiler T., Neuhaus-Url G. (1999) Transgenic aequorin monitors cytosolic transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors // Planta. 207: 566-574.

82. Morales M., Alcantara,J., Ros Barcelo A. (1997) Oxidation of trans-resveratrol by a hypodermal peroxidase isoenzyme from Gamay Rouge grape (Vitis vinifera) berries // Am. J. Enol. Vitic. 48: 33-38.

83. Morales M., Ros Barcelo A., Pedreno M.A. (2000) Plant stilbenes: recent advances in their chemistry and biology // Adv. Plant Physiol. 3: 39-70.

84. Moriuchi H., Okamoto C., Nishihama R., Yamashita I., Machida Y., Tanaka N. (2004). Nuclear localization and interaction of RolB with plant 14-3-3 proteins correlates with induction of adventitious roots by the oncogene rolB // Plant J. 38: 260-275.

85. Murakami S., Arai I., Muramatsu M., Otomo S., Baba K., Kido T., Kozawa M. (1992) Effect of stilbene derivatives on gastric H1", K(+)-ATPase // Biochem. Pharmacol. 44: 1947-1951.

86. Nilsson O., Crozier A., Schmulling T., Sandberg G., Olsson O. (1993) Indole-3-acetic acid homeostasis in transgenic tobacco plants expressing the Agrobacterium rhizogenes rolB gene // Plant J. 3: 681-689.

87. Ning W., Wang J.X., Liu Y.M., Li N., Cao R.Q. (1998) The effects of Ca2+ during the elicitation of shikonin derivatives in Onosma paniculatum cells // In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 34: 261-265.

88. Olas B., Wachowicz B., Szewczuk J., Saluk-Juszczak J., Kaca W. (2001) The effect of resveratrol on the platelet secretory process induced by endotoxin and thrombin // Microbios. 105: 7-13.

89. Olivari C., Albumi C., Pugliarello C.M., Michelis M.I.D. (2000) Phenylarsine oxide inhibits the fiisicoccin-induced activation of plasma membrane H^-ATPase // Plant Physiol. 122: 463-470.

90. Orallo F. (2006) Comparative studies of the antioxidant effects of cis- and /raws-resveratrol // Curr. Med. Chem. 13: 87-98

91. Paul B., Masih I., Deopujari J., Charpentier C (1999) Occurrence of resveratrol and pterostilbene in age-old darakchasava, an ayurvedic medicine from India// J. Ethnopharmacol. 68: 71-76.

92. Pervaiz S. (2003) Resveratrol: from grapevines to mammalian biology // Faseb J. 17: 1975-1985.

93. Pezet R. and Pont V. (1990) Ultrastructural observations of pterostilbene fungitoxicity in dormant conidia of Botrytis cinerea Pers // J. Phytopathol. 129: 2930.

94. Pineros M. and Tester M. (1997) Characterization of the high-affinity• ^ jverapamil binding site in a plant plasma membrane Ca~ -selective channel // J. Membr. Biol. 157: 139-145.

95. Preisig C.L. and Moreau R.A. (1994) Effects of potential signal-transduction antagonists on phytoalexin accumulation in tobacco // Phytochemistry. 36: 857863

96. Pryce R.J. and Langcake P. (1977) e-Viniferin: an antifungal resveratrol trimer from grapevines//Phytochemistry. 16: 1452-1454.

97. Quesnel A.A. and Ellis B.E. (1989) Comparison of UV irradiation and p-fluorophenylalanine as selective agents for production of aromatic compounds in plant cell cultures // J. Biotechnol. 10: 27-37.

98. Raes J., Rohde A., Christensen J.H., Van de Peer Y., Boerjan W. (2003) Genome-wide characterization of the lignification toolbox in Arabidopsis II Plant Physiol. 133: 1051-1071.

99. Ramani S. and Chelliah J. (2007) UV-B-induced signaling events leading to enhanced-production of catharanthine in Catharanthus roseus cell suspension cultures // BMC Plant Biol. 7: 61.

100. Regev-Shoshani G., Shoseyov O., Bilkis I., Kerem Z. (2003) Glycosylation of resveratrol protects it from enzymic oxidation // Biochem. J. 374: 157-163.

101. Reyes D., Rodriguez D., Nicolas G., Nicolas C. (2006) Evidence of a role for tyrosine dephosphorylation in the control of postgermination arrest of development by abscisic acid in Arabidopsis thaliana L. // Planta. 223: 381-385.

102. Richter H., Pezet R., Viret O., Gindro K. (2006) Characterization of 3 new partial stilbene synthase genes out of over 20 expressed in Vitis vinifera during the interaction with Plasmopara viticola I I Physiol. Mol. Plant. 67: 248-260.

103. Rimm E.B., Klatsky A., Grobbee D., Stampfer M.J. (1996) Review of moderate alcohol consumption and reduced risk of coronary heart disease: is the effect due to beer, wine, or spirits // Br. Med. 312: 731-736.

104. Ritter H. and Schulz G.E. (2004) Structural basis for the entrance into the phenylpropanoid metabolism catalyzed by phenylalanine ammonia-lyase // Plant Cell. 12: 3426-3436.

105. Roberts D.M. and Harmon A.C. (1992) Calcium-modulated proteins: targets of intracellular calcium signals in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 375-414.

106. Roemer K. and Mahyar-Roemer M. (2002) The basis for the chemopreventive action of resveratrol // Drugs Today. 38: 571-580.

107. Rosemann D., Heller W., Sandermann H. (1991) Plant responses to ozone: II. Induction of stilbene biosynthesis in scots Pine {Pinus sylvestris L.) seedlings // Plant Physiol. 97: 1280-1286.

108. Sanchez-Sampedro M.A., Fernandez-Tarrago J., Corchete P. (2005) Enhanced silymarin accumulation is related to calcium deprivation in cell suspension cultures of Silybum marianum (L.) Gaertn // J. Plant Physiol. 162: 1177-1182.

109. Sanders D., Brownlee C., Harper J.F. (1999) Communication with calcium // The Plant Cell. 11: 691-706.

110. Schnee S., Viret O., Gindro K. (2008) Role of stilbenes in the resistance of grapevine to powdery mildew // Physiol. Mol. Plant Pathol. 72: 128-133.

111. Schroder G., Brown J.W.S., Schroder J. (1988) Molecular analysis of resveratrol synthase cDNA: Genomic clones and relationship with chalcone synthase//Eur. J. Biochem. 197: 161-169.

112. Schroder J. (1999) The chalcone/stilbene synthase-type family of condensing enzymes // Compr. Nat. Prod. Chem. 1: 749-771.

113. Sgarbi J., Villaca F., Garbeline B., Villar H., Romaldini J. (2003) The effects of early antithyroid therapy for endogenous subclinical hyperthyroidism in clinical and heart abnormalities // J. Clin. Endocrinol. Metab. 88: 1672-1677.

114. Shankar S., Singh G., Srivastava R.K. (2007) Chemoprevention by resveratrol: molecular mechanisms and therapeutic potential // Front Biosci. 12: 4839-4854.

115. Siemann E.H. and Ceasy L.L (1992) Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine // Am. J. Enol. Vitic. 43: 49-52.

116. Signorelli P. and Ghidoni R. (2005) Resveratrol as an anticancer nutrient: molecular basis, open questions and promises // J. Nutrit. Biochem. 16: 449-466.

117. Soleas G., Diamandis E., Goldberg D. (1997) Wine as a biological fluid: History, production, and role in disease prevention // Clin J. Lab. Anal. 11: 287313.

118. Spaink H.P., Hooykaas P.J.J., Kondorosi A. The Rhizobiaceae // Kluwer Academic Pub., 1998. 592 p.

119. Sparvoli F., Martin C., Scienza A., Gavazzi G., Tonelli C. (1994) Cloning and molecular analysis of structural genes involved in flavonoid and stilbene biosynthesis in grape {Vitis vinifera L.) // Plant Mol. Biol. 24: 743-755.

120. Spena A., Schmulling T., Koncz C., Schell J.S. (1987) Independent and synergistic activity of rolA, B and C loci in stimulating abnormal growth in plants //EMBO J. 6:3891-3899.

121. Takaoka M. J. (1940) Of the phenolic substances of white hellebore (Veratrum grandiflorum Loes. Fil.) // J. Faculty Sci. Hokkaido Imperial University. 3: 1-16.

122. Tassoni A., Fornale S., Franceschetti M., Musiani F., Michael A.J., Репу В., Bagni N. (2005) Jasmonates and Na-orthovanadate promote resveratrol production in Vitis vinifera cv. Barbera cell cultures // New Phytol. 166: 895-905.

123. Tavernier E., Wendehenne D., Blein J.P., Pugin A. (1995) Involvement of free calcium in action of cryptogein, a proteinaceous elicitor of hypersensitive reaction in tobacco cells//Plant Physiol. 109: 1025-1031.

124. Tropf S., Lanz Т., Rensing S.A., Schroder J., Schroder G. (1994) Evidence that stilbene synthases have developed from chalcone synthases several times in the course of evolution // J. Mol. Evol. 38: 610-618.

125. Velasco R., Zharkikh A., Troggio M., Cartwright D.A., Cestaro A., Pruss D., Pindo M., Fitzgerald L.M., Vezzulli S., Reid J., et al. (2007) A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety // PLoS ONE. 2: el326.

126. Versari A., Parpinello G.P., Tornielli G.B., Ferrarini R., Giulivo C. (2001) Stilbene compounds and stilbene synthase expression during ripening, wilting, and UV treatment in grape cv. Corvina // J. Agric. Food Chem. 49: 5531-5536.

127. Vingtdeux V., Dreses-Werringloer U., Zhao H., Davies P., Marambaud P. (2008) Therapeutic potential of resveratrol in Alzheimer's disease // BMC Neurosci. 9 (Suppl 2): S6

128. Vogeli U., Vogelilange R., Chappell J. (1992) Inhibition of phytoalexin biosynthesis in elicitor-treated tobacco cell-suspension cultures by calcium calmodulin antagonists // Plant Physiol. 100: 1369-1376.

129. Waffo-Teguo P., Descendit A., Deffieux G., Vercauteren J., Me.rillon J.M. (1996) Trans-resveratrol-3-O-a-glucoside (piceid) in cell suspension cultures of Vitis Vinifera II Phytochemistry. 42: 1591-1593.

130. Waterhouse, A.L. and Lamuela-Raventos, R.M. (1994) The occurrence of piceid, a stilbene glucoside in grape berries // Phytochemistiy. 37: 571-573.

131. Watts K.T., Lee P.C., Schmidt-Dannert C. (2006) Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli II BMC Biotechnol. 6: 22.

132. Wei Y.H., Fu G.L., Hu H.R., Lin G., Yang J.C., Guo J.H., Zhu Q.Q., Yu L. (2007) Isolation and characterization of mouse testis specific ser/thr kinase 5 possessing four alternatively spliced variants // J. Biochem. Mol. Biol. 40: 749756.

133. Wiese W., Vornam B., Krause E., Kindl H. (1994) Structural organization and differential expression of three stilbene synthase genes located on a 13 kb grapevine DNA fragment // Plant Mol. Biol. 26: 667-677.

134. White P.J. and Broadley M.R. (2003) Calcium in plants // Ann. Bot-London. 92:487-511.

135. Wood J.G., Rogina B., Lavu S., Howit, K., et al. (2004) Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans // Nature 430: 686-689.

136. Xing T., Wang X., Malik K., Miki B. (2001) Ectopic expression of an Arabidopsis calmodulin-like domain protein kinase-enhanced NADPH oxidase activity and oxidative burst in tomato protoplasts // Mol. Plant Microbe In. 14: 1261-1264.

137. Xiong L.Z. and Yang Y.N. (2003) Disease resistance and abiotic stress tolerance in rice are inversely modulated by an abscisic acid-inducible mitogen-activated protein kinase // Plant Cell. 15: 745-759.

138. Yu X.C., Li M.J., Gao G.F., Feng H.Z., Geng X.Q., Peng C.C., Zhu S.Y., Wang X.J., Shen Y.Y., Zhang D.P. (2006) Abscisic acid stimulates a calcium-dependent protein kinase in grape berry // Plant Physiol. 140: 558-579.

139. Zamboni A., Vrhovsek U., Kassemeyer H. (2006) Elicitor-induced resveratrol production in cell cultures of different grape genotypes // Vitis 45: 63-68.

140. Zhao J., Davis L.C., Verpoorte R. (2005) Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites // Biotechnol. Adv. 23: 283-333.

141. Zhang Y., Li S.Z., Li J., Pan X., Cahoon R.E., Jaworski J.G., Wang X., Jez J.M., Chen F., Yu O. (2006) Using unnatural protein fusions to engineer resveratrol biosynthesis in yeast and mammalian cells // J. Am. Chem. Soc. 128: 13030-13031.

Информация о работе

Дубровина, Александра Сергеевна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Влияние трансформации клеточной культуры винограда Vitis amurensis Rupr.геном rolB из Agrobacterium rhizogenes на биосинтез резвератрола - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы