Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)"

На правах рукописи

OQ3454243

ИНЮШКИНА Юлия Витальевна

ПРОДУКЦИЯ МЕТАБОЛИТОВ КОФЕЙНОЙ КИСЛОТЫ В ОБЫЧНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНОМ ROLC КУЛЬТУРА КЛЕТОК ERITRICHIUM SERICEUM (Lehm. CD.)

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степен/1 кандидата биологических наук

5 fttÄ»»

Владивосток - 2008

003454243

Работа выполнена в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВОРАН

Научный ру» оводитель

Официальн эю оппоненты

Ведущая организация'

доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Булгаков Виктор Павлович

доктор биологических наук, профессор Кушнерова Наталья Федоровна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Аминин Дмитрий Львович

Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, г Владивосток

Защита состоится « 24 » декабря 2008 года в « 10 » часов на заседании диссертационно "О совета ДМ 005.003 04 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159 факс: (4232) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферг.т разослан « ноября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ^^ Музарок Т. И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности. Этот подход основан на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать вторичные метаболиты Клетки растений можно выращивать в искусственных условиях неопределенно долго (каллусы женьшеня растут в культуре in vitro уже более 50 лет), а путем различных манипуляций часто удается повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки in vitro - это удобная модель для изучения вторичного метаболизма, поскольку исследователь может управлять функционированием клетки через изменение условий культивирования или экспрессии генов

В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения. Экстракты лекарственных растений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности (Ullah and Khan, 2008). Активно изучаются антиоксидантные и противовоспалительные свойства растительных полифенолов (Ivanauskas et al., 2008; Ueda et al, 2002). Известно, что эти вещества перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты - розмариновая кислота (содержит два остатка кофейной кислоты) и литоспермовая кислота Б (содержит четыре остатка кофейной кислоты и является аналогом рабдозина) (Makino et al, 2002) Перечисленные вещества продуцируются клетками растений семейства бурачниковые (Boraginaceae).

На Дальнем Востоке произрастают несколько представителей этого семейства, в том числе редкий вид незабудочник шелковистый (Eritrichium sericeum Lehm DC). Это растение содержит наибольшее среди других представителей бурачниковых количество интересующих нас полифенолов, однако его промышленное использование невозможно без использования методов биотехнологии Разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур Е sericeum является перспективной задачей для биотехнологии растений.

В настоящее время в биотехнологии широко используются методы генетической инженерии. Так, например, в последние годы выявлены гены, оказывающие существенное влияние на продукцию вторичных метаболитов в культурах клеток растений, в том числе гены rol Agrobacterium rhizogenes. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур (Bulgakov, 2008). К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов rol на биосинтез полифенолов, продуктов фенилпропаноидного биосинтетического пути, ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и rolC-трансгенной культурах клеток Е. sericeum.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии. В рамках поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

получить контрольную и экспрессирующую ген га/С культуры клеток Е. sericeum;

увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum посредством селекции и воздействия элиситоров;

исследовать связь между экспрессией гена rolC и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты,

исследовать фармакологическое действие полифенолов из культуры клеток Е. sericeum.

Научная новизна работы

Показано, что клеточные культуры незабудочника шелковистого синтезируют метаболиты кофейной кислоты в больших количествах, многократно превышающих содержание этих веществ в природных растениях. Установлена зависимость действия гена го/С на продукцию метаболитов кофейной кислоты от времени культивирования каллусов - с возрастанием числа пассажей ген проявляет активирующее влияние на вторичный метаболизм. В культурах клеток Е. sericeum обнаружен ген CYP98A3, кодирующий специфическую форму цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, вовлеченную в биосинтез розмариновой кислоты Установлена взаимосвязь экспрессии CYP98A3 с экспрессией гена го/С и повышением содержания метаболитов кофейной кислоты в го/С-трансгенной культуре клеток.

Практическое значение работы

Получена клеточная культура незабудочника шелковистого, которая является воспроизводимым источником метаболитов кофейной кислоты Максимальное содержание рабдозина в ней составляет 4.11% от сухого веса ткани, что является самым высоким содержанием этого вещества в природных и биотехнологических источниках. Показано, что полифенолы из культуры клеток Е. sericeum обладают выраженным антиоксидантным действием, снижают симптомы при остром воспалении, что делает их перспективными для углубленного фармакологического изучения с целью создания в дальнейшем медицинских препаратов.

Апробация работы и публикации

Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2006), II Международном конгрессе по молекулярному размножению растений (2nd International Conference on Plant Molecular Breeding) (КНР, Санья, 2007), 21-м Тихоокеанском научном конгрессе (21st Pacific Science Congress) (Япония, Окинава, 2007), Международной конференции по биоинформатике

(International Multi-conference of Engineers and Computer Scientists) (Гонконг, 2008), 13-м Международном симпозиуме по биотехнологии "13th International Biotechnology Symposium and Exhibition (IBS-2008)" (КНР, Далянь, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 12 таблиц Список литературы содержит 90 наименований, из них 77 на английском языке

Финансовая поддержка

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" "Научные школы" НШ-6923.2006.4., Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и РФФИ/ДВО 06-04-96008.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю В.П. Булгакову за внимательное и конструктивное руководство, благодарность сотрудникам группы биоинженерии К В Киселеву за помощь в освоении методик молекулярной биологии и руководство при выполнении генетической части настоящей работы, Г.К. Чернодед за помощь в работе с культурами клеток, Ю Н. Шкрыль за методическую помощь Автор выражает благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН С А. Федорееву и М.В. Веселовой за сотрудничес/^о и помощь в определении качественного и количественного состава пог.чфенолов культур клеток и корней Е. seriœum, а так же коллегам из -'лтайско'о государственного медицинского университета под руководством пооф. Зверева Я.Ф . за выполнение фармакологических исследований

MAI ЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Контрольные и го/С-трансгенныэ клеточные культуры незабудочника шелковистого были получены из стерильных проростков. При згробактериальной трансформации использовали Agrobactermm tumefaciens GV3101, несущую бинарную векторную систему, состоящую из двух плазмид Первая, pMP90RK - viV-хелперная плазмида, содержит vir-белки (А, В, G, С, D, Е), осуществляющие перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосому растительной клетки (рис 16). Втор,-я составляющая бинарного вектора, PCV002-35S-ro/C-плазмида, содержания в составе Т-ДНК целевой ген го/С под контролем сильного вирусного промотора 35S и маркерный ген устойчивости к канамицину nptll, кодирующий неомицин-фосфотрансферазу (рис.1 в) В качестве контроля использовали культуру, трансформированную "пустым" вектором pPCV002, не содержащим целевого гена (рис 1а).

а б в

Рис. 1. Физическая карта бинарной векторной системы

а - "Пустой" вектор, использовался для получения контрольной культуры; б -vir-хелперная плазмида, осуществляющая перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосому растительной клетки; в - плазмида, несущая ген rolC

Первичные каллусы Е. seríceum, трансформированные как "пустой" плазмидой pPCV002 (культура Es-vector), так и pPCV002-35S-ro/C (культура Es-го/С) спонтанно формировали адвентивные корни, из которых были получены культуры корней. Высокопродуктивная клеточная линия Е-4, использовавшаяся в фармакологических исследованиях, была получена из первичного каллуса Es-vector,

Препараты ДНК из культур клеток Е. seríceum выделяли методом 2-кратного СТАВ буфера (Дрейпер, 1991). Для выделения РНК использовали метод, разработанный для растений с высоким содержанием вторичных метаболитов (Bekesiova, 1999). Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили при помощи набора для синтеза первой цепи кДНК (Силекс, Россия).

Праймеры к гену актина Е. seríceum были разработаны на основе секвенированного участка, включающего интрон. Продукты амплификации с матриц ДНК и кДНК составляли 290 и 206 п.н., соответственно. Праймеры к гену rolC были подобраны на основе известной последовательности гена го/С и фланкировали фрагмент размером 394 п.н. Для оценки относительного уровня экспрессии генов СУР и PAL в контрольной и го/С-трансгенной культурах Е. seríceum использовали метод полимеразой цепной реакции (ПЦР) с вырожденными праймерами, разработанными на основе известных аминокислотных последовательностей CYP и PAL разных видов растений. Эти праймеры фланкировали фрагменты 256 и 266 п.н. для CYP и PAL, соответственно.

Уровень экспрессии генов определяли при помощи биоанализатора Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, USA) и нормировали относительно экспрессии гена актина Е. seríceum (используя те же препараты кДНК, что применялись для анализа CYP и PAL). Продукты ОТ-ПЦР генов СУР и PAL были клонированы в вектор pTZ57R/T (Fermentas, Литва). Клоны амплифицировали с праймерами М13 и секвенировали при помощи набора

Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) согласно протоколу фирмы-производителя. После осаждения этанолом первичная последовательность нуклеотидов была определена на секвенаторе ABI 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems). На основе секвенированных участков генов были получены аминокислотные последовательности транскриптов при помощи программы Gene runner 3 05. Далее их сравнивали с известными аминокислотными последовательностями CYP и PAL других видов растений в программе NCBI BLAST. Филогенетическое дерево строили в программе ClustalX. Значения экспрессии генов, выраженные в относительных единицах, получали на основе данных по суммарной экспрессии генов СУР (полученных в результате ОТ-ПЦР с дегенеративными праймерами) и данных по количественному распределению секвенированных клонов. Эти данные подтвердили при помощи ПЦР в реальном времени, проведенной согласно методу Giulietti et al. (2001). Последовательности праймеров и TaqMan-зондов для генов CYP98A3 и го/С разрабатывали при помощи программы Primer Premier 5.0.

Качественный и количественный анализ полифенолов проводили совместно с лабораторией химии природных хиноидных соединений ТИБОХ ДВО РАН физико-химическими методами - 13СЯМР, масс-спектрометрии (FAB-MS), ИК и УФ-спектроскопии, спектроскопии кругового дихроизма и ВЭЖХ согласно опубликованным методикам (Fedoreyev et al., 2005).

Эксперименты по выявлению фармакологического действия препаратов из культуры клеток Е. sericeum проводили на беспородных крысах. Измеряли суточный диурез, суточную экскрецию креатинина, ионов калия и натрия Препарат из сухой измельченной биомассы Е. sericeum (линия Е-4) в виде 2%-ной крахмальной взвеси вводили крысам при помощи желудочной помпы в дозе 100 мг/кг в день, что соответствовало 4.5 мг розмариновой кислоты и 1.5 мг рабдозина Противовоспалительную активность препарата изучали на модели острого воспалительного отека лапы крысы, вызванного каррагенином Для исследования возможной прооксидантной и антиоксидантной активности m vitro использовали спиртовые 50% и 70% экстракты полифенолов Е. sericeum. Содержание продуктов окисления ТВИН-80 определяли спектрофотометрическим методом. В экспериментах in vivo исследовали влияние препаратов из сухой биомассы Е. sericeum на состояние свободно-радикального окисления в почке крыс в обычных условиях и на фоне непродолжительной ишемии. Общую прооксидантную активность, суммарный показатель концентрации всех прооксидантов и свободно-радикальных метаболитов оценивали по накоплению в почечной ткани продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Антиоксидантную активность оценивали по изменению интегративного показателя общей антиоксидантной активности и активности антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы).

Данные были обработаны при помощи программы Statistics, версия 5.5. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка и

проверены по критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0.05 выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клеточные культуры

Характеристика клеточных культур Е. sericeum

Первичные каллусы Es-vector (из которых нами в дальнейшем получена линия Е -4) и Es-га/С были получены в 2003 году из проростков семян Е. sericeum методом агробактериальной трансформации (Bulgakov et al., 2005). В итоге селекции с использованием канамицина были получены культуры корней и каллусов Es-vector и Es-го/С (рис. 2а,б).

а б

Es -rolC

Рис. 2. Культуры каллусов (а) и корней (б) Е. sericeum

Ко времени начала настоящей работы, контрольная каллусная культура Es-vector характеризовалась активным ростом и представляла собой рыхлую каллусную ткань коричнево-серого цвета. Продуктивность сырой биомассы составляла в среднем 491 ± 43 г/л. RolC-трансгенная культура Es-rolC

Es-vector

характеризовалась замедленным ростом по сравнению с культурой Es-vector и представляла собой более рыхлую, обводненную каллусную ткань коричнево-желтого цвета, со средней продуктивностью биомассы 283 ± 53 г/л. В течение нескольких лет го/С-трансгенная ткань была гетерогенной, проявляла нестабильность фенотипических и ростовых характеристик. Полученные культуры корней имели необычную темно-коричневую (Es-vector) и коричневую (Es-ro/C) окраску. Ro/C-трансгенные корни характеризовались более активным ростом по сравнению с контрольной культурой. Так, продуктивность сырой биомассы корней Es-vector и Es-ro/C составлял 169 ± 19 г/л и 211 ± 17 г/л, соответственно.

Трансгенность этих культур была доказана при помощи метода ПЦР-анализа со специфическими праймерами к гену nptll. Для подтверждения нативности кДНКи ДНК мы проверяли их на наличие сигнала к гену актина. Ампликоны, полученные с использованием препаратов ДНК, имели размер 290 п.н., кДНК - 206 п.н., а выпавший фрагмент представлял интрон (рис. За). Подобранные таким образом праймеры позволяют убедиться в отсутствии примеси ДНК в препаратах кДНК. Экспрессия гена rolC в культуре корней Es-ro/C была показана методом ОТ-ПЦР, где наличие соответствующего сигнала размером 394 п.н. указывает на то, что ген rolC успешно экспрессируется. Этот сигнал в контрольной культуре Es-vector отсутствовал (рис. 36). Для определения экспрессии гена rolC в каллусной культуре Е. seríceum был использован метод ПЦР в реальном времени.

1 2

М 1 2 ДНК НК 3 ¡VI 1 2 НК ДНК

500 п.к-

I п.н.—>

вам

70П п ц

300 п.н^ т пм 300 п.н^ 206 П.н.

206 п.н.

М 1 2 ПК НК

500 п.н-

Рис. 3. Проверка нативности препаратов кДНК и доказательство

экспрессии гена rolC в трансгенных 394 п.н:

культурах каллусов (1) и корней (2) Е. sericeum

а - ПЦР гена актина Е. seríceum, б - ПЦР гена ro/C; М - маркер молекулярных весов, 1 - препараты кДНК из культур Es-ro/C, 2 - препараты кДНК из культур Es-vector, НК - негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой кДНК), ПК - позитивный контроль (плазмида PCV002-ro//lSC)

Химический анализ полифенольных фракций из клеточных культур Е sericeum показал, что доминирующими веществами, накапливаемыми в культурах корней и каллусов, являлись метаболиты кофейной кислоты, а

именно розмариновая кислота и (-)-рабдозин (табл. 1) Кроме того, в культурах было обнаружено небольшое количество тримера кофейной кислоты, эритрихина (Рес1огеуеу е! а1., 2005). В дальнейшем мы его не учитывали, поскольку эритрихин не вносит заметного вклада в суммарную продуктивность культур.

Таблица 1. Рост и биосинтетическая активность культур корней и каллусов Е. эепсеит

Содержание метаболитов кофейной кислоты, % от сухой биомассы Продукция метаболитов кофейной кислоты (мг/л)

Образец ткани Рабдозин Розмариновая кислота Общее содержание полифенолов

Каллусы Es-vector 0.90 ±0.35 2.32 ± 1.30 3.22 + 1.22 409

Каллусы Es-ro/C 0 59 ± 0.32 0.81 ±0 48* 1.40 ±0 40* 181

Культура корней Es-vector 1.66 ± 0.10 4.56 ± 0 50 6.22 ± 0.43 746

Культура корней Es-ro/C 0.84 ± 0 07* 2.00 ± 0 30* 2.84 ± 0.25* 415

Надземные части растения 0.01 ± 0.007 следовое количество 0.01 ± 0.007 —

Корни природного растения 0 32 ±0.12 0 07 ± 0.02 0.39 ±0 12 —

Данные получены на основе десяти определений содержания метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток за период 2-х летнего культивирования (20042005 гг), * р < 0 05

ВЭЖХ-анализ показал, что клеточные и корневые культуры по содержанию метаболитов кофейной кислоты существенно превосходят природное растение. На период 2004-2005 годов наблюдалось снижение содержания полифенолов в го/С-трансформированных культурах каллусов и корней (Es-rolC) незабудочника шелковистого - более чем в 2 раза по сравнению с контрольными культурами Es-vector.

Культура корней незабудочника шелковистого накапливала больше полифенолов, чем каллусная, однако, исходя из технологических особенностей культивирования (каллусы имеют ряд преимуществ при

промышленном культивировании), главной задачей являлось увеличение продуктивности именно каллусной культуры.

Получение высокопродуктивной клеточной культуры Е. sericeum

Известно, что трансформация "пустым" вектором является нейтральной в плане влияния на синтез вторичных метаболитов и рост клеток. Принимая во внимание то, что изначально каллусная культура Es-vector обладала более высокими ростовыми и биосинтетическими показателями по сравнению с го/С-трансгенной культурой Es-го/С, было решено использовать именно ее для получения высокопродуктивной клеточной линии и для исследования фармакологических свойств. Первичный каллус Es-vector состоял из светло-желтых, светло-коричневых и темно-коричневых агрегатов, отличавшихся по интенсивности роста и содержанию полифенолов. Методом селекции более чем через 20 циклов субкультивирований были получены активно-растущие гомогенные каллусы, обозначенные линией Е-4. Общее содержание метаболитов кофейной кислоты в селектируемой ткани Е-4 было повышено с 2.7% до 6.3% от сухого веса биомассы и оставалось стабильным на протяжении более двух лет культивирования (табл. 2) Такой выход вторичных метаболитов значительно превышал содержание полифенолов в надземных частях и корнях природного растения: в 635 и 16 раз, соответственно.

Таблица 2. Получение высокопродуктивной каллусной линии Е-4 из исходной культуры Es-vector

Образец ткани Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л Содержание метаболитов кофейной кислоты, % от сухой биомассы Продукция метаболитов кофейной кислоты, мг/л

(-)-Рабдозин Розмариновая кислота Сумма полифенолов

Первичный каллус 90 11 7.2 0.6 0.62 0.05 0.84 0.22 1.45 104

Es-vector, 10й пассаж 165 23 89 07 0.33 0.05 1 02 0.12 1 35 120

Es-vector, 20й пассаж 180 30 9.2 1 0 0.66 0.22 2 04 0.40 2.70 249

Es-vector, ЗОЙ пассаж 310 28 14.1 1.2 1.83 0 32 4.32 0.33 6.15 867

Es-vector, 40й пассаж 311 21 14.5 1 1 1.80 0 26 4.55 0.45 6.35 920

Начальная масса ткани при пассировании: 16-20 г/л

Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. seríceum

С целью дальнейшего увеличения продуктивности линии Е-4 мы использовали другие стандартные биотехнологические методы - варьировали концентрацией сахарозы в культуральной среде, изменяли соотношение ионов аммоний и нитратов в среде, добавляли фенилаланин -предшественник биосинтеза метаболитов кофейной кислоты, использовали пироксикам (индуктор шикимат-производного пути вторичного метаболизма). Все эти приемы оказались не эффективными либо подавляли рост каллусов. Поэтому дальнейшее повышение содержания полифенолов в каллусной культуре незабудочника шелковистого оказалось сложной задачей. Тем не менее, были обнаружены два индуктора, повлиявшие на биосинтез полифенолов в каллусах: метилжасмонат и ионы Си2+. Метилжасмонат является известным активатором вторичного метаболизма растений. При исследовании влияния метилжасмоната на каллусную культуру Е -4 было обнаружено, что метилжасмонат в концентрациях 1 и 5 мкМ стимулировал продукцию как розмариновой кислоты, так и рабдозина при некотором угнетении роста. В этом случае содержание розмариновой кислоты увеличилось в 1 2 раза, продукция (-)-рабдозина - в 2 4 раза, общее содержание полифеноловв клетках повысилось на 20-38% по сравнению с контролем (табл. 3).

Таблица 3. Влияние метилжасмоната и Си2+ на рост каллусов Е-4 и содержание в них метаболитов кофейной кислоты

Элиситор/ концентрация Сырая биомасса, г Содержание метаболитов кофейной кислоты, % от сухого веса ткани Продукция метаболитов кофейной кислоты, мг/л

(-)-Рабдозин Розмариновая кислота Сумма полифенолов (% от контроля)3

Метилжасмонат, мкМ

0 7.38 ±0 32 1.07 4.63 5.70 813

0.5 7.33 ± 0.28 1.37 4 53 5.90 (104) 838

1 7.24 ±0.19 1.47 5.39 6 86 (120) 960

5 5 39 ± 0.48 2 56 5.30 7 86 (138) 825

CuS04, мг/л

0.025ь 7.67 ± 0.48 2.50 3.50 6.00 894

0.25° 7.02 ± 0.28 4.11 2.30 6.41 (107) 871

"В скобках приведено содержание полифенолов в процентах от контроля (без добавления элиситора), бСиЭ04 х 5 Н20, стандартная концентрация для среды \А/б/а, в СиЭСЦ х 5 НгО использовался в виде глицерата меди. Для определения содержания полифенолов использовали среднюю пробу из 10 колб

Добавление ионов меди в составе Си2+-глицератного комплекса в культуральную среду в сравнительно высокой концентрации - 0.25 мг/л не повлияло на общее содержание полифенолов, но изменило соотношение рабдозин/розмариновая кислота в сторону увеличения содержания более активного вещества - рабдозина. Таким образом, содержание (-)-рабдозина в каллусах незабудочника повысилось до 4.1% от сухого веса ткани (табл. 3). По нашим данным, это самое высокое содержание рабдозина, известное для природных и биотехнологических источников.

В работе Ямамото и соавторов приведено максимальное содержание (+)-рабдозина, которое было зафиксировано в суспензионной культуре клеток L erythrorhizon (1.4% от сухой массы клеток, Yamamoto et al., 2000а). Ранее было сделано предположение, что продукция розмариновой кислоты и рабдозина в клетках растений семейства бурачниковые регулируется различными механизмами (Fedoreyev et al, 2005) По-видимому, метилжасмонат активирует пути биосинтеза как рабдозина, так и розмариновой кислоты, в то время как ионы Си+2 активируют превращение розмариновой кислоты в рабдозин.

Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов

При длительном культивировании проводился постоянный контроль за содержанием полифенолов в пассируемой ткани. Так, методом ВЭЖХ было зафиксировано изменение содержания метаболитов кофейной кислоты в каллусных культурах Е. sericeum: на период 2006-2008 гг. отмечено повышение содержания полифенолов в го/С-трансгенной культуре каллусов по сравнению с контрольной культурой Es-vector (табл. 4).

Таблица 4. Содержание метаболитов кофейной кислоты в контрольной и гоЮ-трансгенной культурах клеток Е. зепсеит на период 2006-2008 гг.

Культура клеток Сырая биомасса, г/л Сухая биомасса, г/л % сухой биомассы Содержание метаболитов кофейной кислоты, % от сухой биомассы Продукция полифенолов, мг/л

Рабдозин Розмариновая кислота Сумма полифенолов

Es-vector 492 + 3 3 14+ 0 8 29 1.6 ± 0 2 1 1 ±02 2.7 385

Es-rotC 283 ±53 6 12 9+1 1 46 2 0 ± 0.7 30 ±0.7 50 649

Данные получены по результатам шести экспериментов, с интервалом в три

месяца

Увеличение содержания полифенолов в го/С-трансгенной культуре каллусов сопровождалось, однако, уменьшением сырой массы клеток. Продуктивность сухой биомассы в Еэ-го/С культуре практически не уменьшилась, но снижение сырой массы делает го/С-трансгенную культуру менее удобной для промышленного использования. Это вызвано тем, что снижение показателей продуктивности сырой биомассы требует значительную часть материала направлять на поддержание культуры, а не на съем биомассы. Таким образом, можно заключить, что каллусы Еэ-го/С в плане промышленного производства в настоящее время не имеет преимуществ над каллусами линии Е-4.

Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена го/С

Для изучения возможного механизма активации биосинтеза метаболитов кофейной кислоты, опосредуемого продуктом экспрессии гена го/С, мы исследовали экспрессию ключевых генов биосинтеза фенилпропаноидного пути вторичного метаболизма: фенилаланин аммиак-лиазы (PAL) и цитохром-Р450-монооксигеназы (СУР) в культурах каллусов незабудочника шелковистого Es-vector и Es-rolC.

Экспрессия генов PAL

Фенилаланин аммиак-лиаза (PAL) является первым и ключевым ферментом фенилпропаноидного пути вторичного метаболизма растений. Активность генов PAL определяет интенсивность потока метаболитов в фенилпропаноидный путь. Используя метод ОТ-ПЦР с вырожденными праймерами, мы получили ампликоны ожидаемого размера (266 п.н.) для культур Es-vector и Es-го/С (рис. 4а). Оценка суммарной экспрессии генов PAL показала, что экспрессия не отличается в контрольной и го/С-трансгенной культурах (рис. 46).

1 2 3 4 М IIK

266 п.н

500 400 300

СС S 0,75

о

0)

с ^ 0,6

О ф

о 5 ° 0,45

i ч: 0,3

СО О ш ^

о as й о s X 0,15

5 £

s

о. 0

б

¡0,374 _

Es-vector

0,377

Es-rolC

п.н.

Рис. 4. Экспрессия гена PAL в контрольной (Es-vector) и го/С-трансгенной (Es-rolC) культурах каллусов Е. sericeum

а- Гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР генов PAL Е. sericeum. 1,2 — препарат кДНК из каллусной культуры Es-vector, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; 3, 4 - препарат кДНК из каллусной культуры Es-го/С, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; М - маркер молекулярной массы; НК -негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой кДНК); 6 -количественная оценка суммарной экспрессии гена PAL, данные представлены в относительных единицах и нормированы относительно экспрессии гена актина £. sericeum

Клонирование и секвенирование ампликонов, полученных с использованием препаратов кДНК из каллусных культур Es-vector и Es-ra/C, показало гомологию секвенированных транскриптов с известными генами PAL растений. Анализ клонов выявил, что в обеих культурах экспрессируется только одна форма гена - PAL1 (код доступа EU494974). В результате клонирования и секвенирования ампликонов, полученных с использованием препаратов ДНК обеих культур, было выявлено ещё две формы гена, PAL2 и PAL3.

Таким образом, результаты изучения экспрессии генов PAL в контрольной и га/С-трансгенной культурах Е. sericeum соответствуют полученным ранее данным об отсутствии в каллусах незабудочника ограничения потока метаболитов со стороны реакции, катализируемой PAL. поскольку добавление фенилаланина не вызвало активацию биосинтеза метаболитов кофейной кислоты (iriyushkina et ai., 2007).

Экспрессия генов СУР

Аналогично анализировали экспрессию генов СУР и установили, что значения суммарной экспрессии генов СУР находились в пределах ошибки и были одинаковы для культур Es-vector и Es-га/С (рис. 5 а, б).

М НК

256 п.н.

500 400 300 200

П.Н.

0,2

i* 8"

о m § g

S 0)

Рис. 5. Экспрессия контрольной (Es-vector) и

0,22

Es-vector

0.18

Es-rolC

генов СУР в о. го/С-трансгенной 1 (Es-fo/C) культурах каллусов £. sericeum

а Гель-электрофорез продуктов ОТ-ПЦР генов CYP .1,2- препарат кДНК из каллусной культуры Es-vector, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; 3, 4 - препарат кДНК из каллусной культуры Es-ro/C, разведения матрицы кДНК 1:3 и 1:1, соответственно; М- маркер молекулярной массы; НК- негативный контроль (реакционная смесь без анализируемой кДНК); б - количественная оценка суммарной экспрессии генов СУР, данные представлены в относительных единицах и нормированы относительно экспрессии гена актина Е. sericeum

Анализ полученных фрагментов СУР из Е. вепсеит показал, что все они по аминокислотным последовательностям наиболее близки к известным цитохром Р-450-содержащим монооксигеназам растений семейства СУР98 (рис. 6), которые кодируют З'-гидроксилазы эфиров кумаровой кислоты и вовлечены в биосинтез вторичных метаболитов.

Аминокислотные последовательности, построенные на основе секвенированных транскриптов СУР98 незабудочника шелковистого,

представляли собой междоменную область размером 74 аминокислотных остатка.

- CYP98A1-Eritrichium

CYP98A2-Eritnchlum

— - - CYP98A2p-Glicme

i CYP9SA1З-Ocimum (л Кумэроилшикимат "i -гмдроксилаза) I CYP98A37-Medicago

_i EsCYP98A3-Eritrichium

'- CYP93A6-Llthospeimum (Гидрокеилаэа 4-кумароил 4 -ГФМК)

_i- CYP98A8-Arabidopsis

I- CYPS8A9-Arabldopsis

- CYP75B2-Petunia (фгиеюноид 3' гидроксилаза)

- -■ CYP73A30-Lithospermum (4 Гидроксипаза коричной кислоты)

CYP86A1-Atabidopsis (Гидроксилаза жирных кислот)

- CYP710-Arabidopsis (Ciepon С 22 десатуроза)

- CYP85A1-Solanum (Сб-оксвдаза) CYP707A2-Afabidopsis (3 -гидроксилаза абсцизовон

О 1 КИСЛОТЫ)

Рис. 6. Филогенетическое дерево белков семейства CYP, построенное с помощью программы ClustalX по аминокислотным последовательностям CYP из Е senceum и последовательностям известных представителей Р450 других видов растений. В скобках указаны функции соответствующих белков. В рамку выделены CYP из Е. sericeum

В результате секвенирования и последующего выравнивания в программе ClustalX из незабудочника шелковистого нами было идентифицировано 3 гена: CYP98A1, CYP98A2v\ CYP98A3 (коды доступа в GenBank' EU494971, EÜ494972, EU494973). Идентичность между ними по аминокислотной последовательности составляла не менее 71% Выравнивание и сравнение аминокислотных последовательностей фрагментов CYP98 Е. sericeum с известными последовательностями цитохром Р450-зависимых монооксигеназ растений показало, что CYP98A1 £. sericeum на 80% гомологичен CYP98A2 (код доступа 048922) из сои Glycine тах (L.), ферменту с неизвестной субстратной специфичностью (Siminszky et al., 1999) CYP98A2 £. sericeum наиболее близок к CYP98A13 (код доступа AAL99200) из базилика Ocimum basilicum (L) (94% гомологии), который кодирует З'-гидроксилазу шикимового эфира л-кумаровой кислоты (Gang et al., 2002) CYP98A3 Е. sericeum на 94% гомологичен CYP98A6 (код доступа ВАС44836) из культуры клеток воробейника L. erythrorhizon (Matsuno et al., 2002) (рис. 7). CYP98A6 является гидроксилазой 4-кумароил-4'-гидроксифенилмолочной кислоты, т.е. ферментом, который катализирует последние стадии биосинтеза розмариновой кислоты.

Анализ экспрессии CYP98A3 показал, что количество транскриптов CYP98A3 в Es-rolC каллусах было примерно в 5 раз выше, чем в контрольной культуре Es-vector (рис. 8). При этом уровень экспрессии CYP98A2 не изменился, a CYP98A1 уменьшился примерно в два раза Данные ПЦР в

реальном времени с праймерами, подобранными к CYP98A3, показали увеличение экспрессии CYP98A3 в Es-ra/C каллусной культуре в 3.6 раза по сравнению с контрольной культурой Es-vector. Эти данные свидетельствуют о том, что ген го/С осуществляет дифференциальную регуляцию специфического гена СУР, а активация экспрессии CYP98A3 в го/С-трансгенной культуре незабудочника шелковистого по сравнению с контролем коррелирует с активацией продукции полифенолов. Наши данные соответствуют результатам, полученным японскими учеными, которые при стимуляции культуры клеток L. erythrorhizon элиситорами наблюдали значительное увеличение как продукции розмариновой кислоты, так и экспрессии гена CYP98A6 (Matsuno et al., 2002).

Es CYP98A3 --------LVRWR%^(«^lJ»WGSDR:DnEADVSKLPYLQCrvK£SLRLH^^ ------

Le CYP98A6 STEWÍMÍB-W№RVC¡Rrj>QEHJ»Vua>DRI>^^

Es CYP9SA2 --------LXK№RVQQK^EELDPVl<ryERS#n^ADFSSLPVlJ3CVAKEj^RLHPP^ÜÍLPHKANANVl<IGGyDIPKGSN------

Ob CYP9BA13 SV«4M/ELIKNPRVQQKAQEELDKVIGFERWTFmi3SLPYLQCV^

Gm CYP98A2p SVEWÍM№LIRNPRVQQKW3EEUJRVIGLERWTE№l3NLPYlj^

Es CYP9SA1 --------LLRHPRVIKKA3EELDRVIGTERm7EADFPNLPYW«rrKEALRU^ ------

At CYP9SAS V^EWM£04IKCP7M]EKAKELD5WGSERLJflTESDIPILPYUXWKEALRLHPSTPU*ILPHKASETV

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей CYP98A1, CYP98A2 и CYP98A3 из каллусных культур Е. sericeum с аминокислотными последовательностями представителей семейства CYP98: CYP98A13 (AAL99200) -Ocimum basilicum, CYP98A2p (048922) - Glycine max, CYP98A6 (BAC44836) -Lithospermum erythrorhizon, CYP98A8 (NP__177594) - Arabodopsis thaliana Es - E. sericeum, Le - L. erythrorhizon, At - A. thaliana, Ob - O. basilicum, Gm - G. max

О -CZ О

St 5 о

is

5 U

0.2 0.15 0.1 0.05 0

Es-vector

0.16

У

0.06

0.01

0s 0s G4

Es-rolC

0.07

0.05

0.05

O4 C? 0s

Рис. 8. Нормализованная экспрессия подсемейств генов CYP в контрольной (Es-vector) и го/С-трансгенной (Es-rolC) каллусных культурах Е. sericeum

Значения уровня экспрессии каждого гена, выраженные в относительных единицах, получали на основе данных относительной общей экспрессии генов CYP и количественного распределения секвенированных клонов в культурах Es-vector и Es-rolC

Фармакологические свойства клеточной биомассы Е. зепсеит и возможность её применения в медицине

Влияние препаратов из клеточной культуры Е. зепсеит на функцию почек у крыс

В условиях длительного применения препарат из сухой биомассы клеток Е. зепсеит в дозе 100 мг/кг/день оказал выраженное воздействие на функцию почек экспериментальных животных, что выражалось в достоверном увеличении показателей диуреза, а так же натрийуретической и калийуретической реакции (табл.5). Тем не менее, прирост экскреции электролитов значительно уступал по степени выраженности диуретическому действию: двукратное возрастание суточного диуреза сопровождалось менее выраженным натрийурезом (+45%) и калийурезом (+48%). Возрастание диуреза, сопровождающееся уменьшением реабсорбции электролитов, на фоне увеличения экскреции креатинина (до 59% по сравнению с контролем) позволяет связать мочегонное действие препарата незабудочника шелковистого с усилением скорости клубочковой фильтрации и угнетением канальцевой реабсорбции при доминировании последнего, о чем свидетельствует более существенный рост диуретической реакции

Таблица 5. Влияние длительного введения препарата из биомассы клеток Е. зепсеит на функцию почек у крыс

Показатель, Контроль Дни введения препарата Через

сутки 3 5 7 9 11 13 2 дня1

Диурез, мл/сутки 7 4±0 5 10.1 ±1 3 12 ± 1.3* 13 1 ±1.49* 15 1 ±1.6* 138 ±1 3* 14 6 ±1 6* 135 ±1.2*

Экскреция №+, м кМ/сутки 56 73 77 81 71 71 75

56±4 0 ±10 8 ± 10 ±9 8 ±6 2* ±6 2 ±5 2* ±5*

Экскреция К', м кМ/сутки 763 722 755 898 929 950 900

640±358 ±67 3 ±76 5 ±77 ±81.6* ±101.2* ±85.6* ±81.4*

Экскреция креатинина мкМ/сутки 42 ±4 2 45 ±58 51 ±6 1 64 ±63* 65 ±5 7* 63 ±5* 67 ±7 1* 60 ±5.2*

1 после окончания эксперимента * р < 0 05

Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. зепсеит на течение экспериментального острого воспаления

Применение препарата из сухой биомассы клеток Е зепсеит (линия Е-4) ослабляло формирование воспалительного отека лапы крыс после введения флогистика (табл. 6).

Таблица 6. Влияние препарата из биомассы клеток Е. эепсеит на развитие каррагенинового отека конечностей крыс

Группы животных Часы наблюдения

1 2 4

Прирост отека, см3 Противовоспалительная активность, % Прирост отека, см3 Противовоспалительная активность, % Прирост отека, см3 Противовоспалительная активность, %

I 0.49±0 04 — 0 55±0 04 — 0 67±0.05 —

II 0 35±0 03* 28.6 0.35Ю.04* 36.4 0.50±0 05* 25.3

I - крысы с индуцированным воспалительным отеком, которые не получали препарат из сухой биомассы Е. зепсеит, II - крысы с индуцированным воспалительным отеком, которые получали данный препарат

Учитывая эффективность препарата из биомассы Е-4 в период энергичного нарастания отека, его действие, по-видимому, обусловлено вмешательством в пусковые механизмы воспалительного процесса с угнетением сосудистого компонента воспаления. Антиэкссудативное действие препарата из биомассы Е. sericeum можно связать с содержанием в ткани комплекса полифенольных соединений, представленных олигомерами кофейной кислоты, противовоспалительное действие которых реализуется за счет стабилизации мембран клеток (Барабой, 1984).

Влияние клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления

Изученные in vitro спиртовые извлечения (50% и 70% экстракты) из клеточной культуры незабудочника шелковистого оказывали существенное воздействие на активность свободно-радикального окисления, влияя на состояние как антиоксидантной, так и прооксидантной систем

Эксперименты in vivo проводили на модели острой экспериментальной ишемии одной почки, что позволяет оценить активность оксидантной и антиоксидантной систем в почечной ткани в условиях кратковременной ишемии. Было выявлено, что общая прооксидантная активность в ишемизированной почке по сравнению с интактной увеличилась у контрольных животных в 1.2 раза, у принимавших препарат - в 1.4 раза. Таким образом, применение препарата из биомассы клеток незабудочника шелковистого вызвало активацию перекисного окисления липидов в ишемизированной почке (р<0.001). Ишемия почки индуцировала резкую активизацию перекисного окисления липидов, что выразилось в увеличении образования тиобарбитуровых продуктов более чем в 3 раза как в контрольной группе, так и в группе животных, длительно принимавших препарат. При определении антиоксидантного статуса была зафиксирована активация процесса антиоксидантной защиты в почке, подвергнутой ишемии,

что объясняется увеличением образования продуктов свободно-радикального окисления в ишемизированной почке. При длительном препарата введении была обнаружена способность стимулировать активность свободно-радикального окисления в условиях непродолжительной ишемии почки. Это, в свою очередь, обусловливало активацию ферментов антиоксидантной защиты, что выражалось в увеличении содержания каталазы, глутатионпероксидазы, а также интегративного показателя общей антиоксидантной активности.

Таким образом, обнаруженные в эксперименте усиление экскреторной функции почек и угнетение экссудативной стадии воспаления под действием препарата из клеточной культуры Eritrichium sericeum, а также данные об эффективности препарата при нефрите Масуги (Inyushkíria et al., 2007), делают препарат перспективным для применения при воспалительных заболеваниях почек.

Полученные результаты позволяют считать углубленное изучение фармакологической активности препарата, полученного из культуры клеток незабудочника шелковистого (линия Е-4) перспективным. Возможное использование каллусной культуры Е sericeum в медицине - это разработка препаратов для лечения заболеваний почек и препаратов, связанных с антиоксидантным действием, например, для лечения ревматоидных артритов и создания антиаллергических средств

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее в нашей лаборатории были получены клеточные культуры таких растений, как Lithospermum erythrorhizon, Rubia cordifolia, Pan; x ginseng, Vitis amurensis (Rupr.), Maackia amurensis (Rupr. et Maxirr), стабильно синтезирующие вторичные метаболиты. Особенностью работа с культурами Е sericeum явилось то, что пои кажущейся простоте получения высокопродуктивной гомогенной культуры, эта задача выполн пась с трудом и на протяжении ряда лет. Действительно, первичные аллусы были чрезвычайно гетерогенны, мы наблюдали расщепление ткани на агрегаты различные по морфологии, скорости роста и содержаню вторичных метаболитов в течение не отдельных пассажей (как происхо/" и обычно), а многих лет. Этот факт заставлял задумываться о том, можно ли вообще использовать в биотехнологии этот вид растения.

Другое обстоятельство и необычность объект-' юследо-зчния заключались в том, что клетки незабудочника шелков то ответили парадоксальным образом на введение гена го/С - признаки- о активатора вторичного метаболизма. Долговременное подавление продукт! -¡ости в rolC-трансгенных культурах незабудочника шелковистого наводило í мысль о то, что ген го/С не является классическим активатором вторичного зтаболизма (как другие гены, используемые в настоящее время в биотг нологии), а скорее это модулятор, реализующий свой потенциал в зав, -имости от регуляторного и биохимического контекста клетки каждого отдельно взятого

вида растений. Представлялось, что исследование механизма действия гена в разных модельных системах - в случае явного стимулирования и в случае явного ингибирования процессов вторичного метаболизма, может пролить свет на механизм его действия

Подытожим, как эти задачи решались в процессе настоящего исследования. Решению первой - созданию высокопродуктивного штамма клеток, помогло то обстоятельство, что метаболиты кофейной кислоты - это группа постоянно экспрессируемых вторичных метаболитов ("preformed secondary metabolites"), которые находятся под жестким регуляторным контролем растительной клетки. Это означает практически гарантированную стабильность биосинтеза вторичных метаболитов в том случае, если бы удалось отобрать стабильные активно-растущие агрегаты. Эта задача была выполнена путем долговременной селекции. Но это же свойство биосинтетического аппарата незабудочника шелковистого означало и то, что будет очень трудно влиять на синтез вторичных метаболитов путем стандартных воздействий элиситорами, что и оказалось в действительности. Только два элиситора - метилжасмонат и ионы меди могли каким-то образом повлиять на увеличение продуктивности культуры В итоге получена линия Е-4, которая показала обнадеживающие фармакологические результаты

В плане исследования регуляторной функции гена го/С получено два принципиальных результата. Первый заключается в том, что ген оказывает влияние на экспрессию отдельных форм ключевых генов биосинтеза вторичных метаболитов. В этом плане обстоятельства складывались удачно -уже был известен ключевой ген в цепочке биосинтеза розмариновой кислоты, CYP98A6. Идентификация аналога этого гена у незабудочника шелковистого (CYP98A3) и изучение его экспрессии показали уникальную картину увеличения экспрессии отдельного гена в ro/C-культуре, сопровождаемую увеличенным накоплением полифенолов Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными на других объектах. Так, в культурах клеток марены, го/С активировал экспрессию гена изохоризматсинтазы, ключевого в биосинтезе антрахинонов (Shkryl et al., 2008). На модели трансгенных клеток марены не удалось выявить какую-либо специфичность действия гена, так как гены изохоризматсинтазы были представлены лишь двумя высоко гомологичными формами.

Второй результат - это выявление медленнотекущих процессов в го/С-трансгенных культурах. Первоначально экспрессия гена га/С в культуре трансгенных клеток растений семейства бурачниковые (Е. sericeum, L. erythrorhizon) привела к супрессии вторичного метаболизма. Далее, при продолжительном культивировании, ro/C-трансгенные каллусы Е sericeum стали аккумулировать значительные количества метаболитов кофейной кислоты Следует отметить, что сходный эффект наблюдался также для культур клеток женьшеня, трансформированных геном го/С (Булгаков и др., 1993), однако в то время его посчитали случайностью. Для женьшеня период уменьшенной (по сравнению с контролем) продукционной способности трансгенных каллусов составлял 6 мес., затем наблюдали быстрое

увеличение содержания гинзенозидов в га/С-культурах женьшеня и превышение их уровня над контрольной культурой стабилизировалось. Аналогичная ситуация наблюдалась и для других эффектов гена rolC, например, образования трансгенных корней и апикальных меристем га/С-каллусами женьшеня (Gorpenchenko et al., 2006). Эти долговременные процессы требуют отдельного изучения.

Результаты настоящего исследования показывают, что в будущих исследованиях будет необходимо привлечь методы глобальной протеомики и геномики и построить интерактому белковых взаимодействий в нормальных и го/С-трансгенных клеточных культурах растений для более глубокого изучения специфичности взаимодействия RolC с ростовым и биосинтетическим аппаратом клетки.

ВЫВОДЫ

1. Получена высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4), накапливающая метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухого веса ткани, что в 16 раз превысило содержание этих веществ в корнях и в 635 раз - в надземных частях природного растения

2. В результате селекции и действия индукторов вторичного метаболизма (метилжасмонат и глицерат меди) на 38% повышено содержание полифенолов в культуре клеток Е. sericeum и изменено соотношение метаболитов кофейной кислоты за счет увеличения пропорции рабдозина Содержание рабдозина достигло 4.1%.

3. Экспрессия агробактериального гена га/С вызывает активацию продукции метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum.

4. В трансформированной геном га/С культуре клеток Е. sericeum отмечено увеличение экспрессии гена CYP98A3, ключевого в биосинтезе метаболитов кофейной кислоты.

5. Повышение экспрессии гена CYP98A3 в го/С-трансгенной культуре клеток Е. sericeum коррелирует с активацией продукции полифенолов.

6. Показано отсутствие в каллусах незабудочника шелковистого ограничения потока метаболитов со стороны реакции, катализируемой PAL.

7. Возможное использование каллусной культуры Е. sericeum в медицине -это разработка препаратов для лечения заболеваний почек и препаратов, нормализующих окислительно-восстановительные реакции

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных

журналах

1. Inyushkina Y.V., Bulgakov VP, Veselova MV, Bryukhanov V.M., Zverev Y.F., Lampatov V.V., Azarova O.V., Tchemoded G.K., Fedoreyev S.A., Zhuravlev

Y N High rabdosiin and rosmarimc acid production in Eritrichium sericeum callus cultures and the effect of the calli on Masugi-nephritis in rats II Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2007 V 71 P 1286-1293

2. Инюшкина Ю.В Создание биотехнологического источника метаболитов кофейной кислоты//Вестник ДВО РАН 2008 №3 С 88-93

3 В.М Брюханов, В П Булгаков, Я Ф. Зверев, С А Федореев, В.В Лампатов, М В Веселова, О В Азарова, О Н Зяблова, Ю В Инюшкина. Клеточная культура Eritrichium sericeum Lehm (Boraginaceae) - источник полифенольных соединений, обладающих фармакологической активностью // Хим-фарм журнал 2008 Т42,№6 С.32-35.

Работы, опубликованные в материалах всероссийской и международных конференций и симпозиума

4. Inyushkina Y V, Tchernoded G К, Kiselev К V, Bulgakov V P. 2007 Inhibition of phytoalexin production in Eritrichium sericeum cell cultures by rolC oncogene // The 2nd International Conference on Plant Molecular Breeding, Sanya, Hainan, China, March 23-27, 2007 Proceedings of ICPMB Sanya, Hainan, China Editors Z.K Li & X.J Fang, 2007 P 188

5 Инюшкина Ю В , Веселова M В , Зверев Я.Ф., Булгаков В П Высокий уровень биосинтеза рабдозина и розмариновой кислоты в каллусах незабудочника шелковистого (Eritrichium sericeum Lehm. DC) и действие каллусов на крыс с индуцированным нефритом Масуги // Тезисы докладов Всероссийской конференции молодых учёных "Экология в современном мире' взгляд научной молодежи" Улан-Удэ, 2007 С. 359-360

6 Inyushkina Y.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Yu.N. Overproduction of caffeic acid metabolites in Eritrichium sericeum callus cultures and effect of the calli on Masugi-nephritis in rats //21st Pacific Science Congress "Diversity and Change Challenges and Opportunities for Natural and Social Systems in Asia-Pacific", Okinawa, Okinawa Conventional Center, Japan, June 12-18, 2007.

Abstracts Okinawa, Japan University of Ryukyus, 2007 P 127.

7. Bulgakov VP, Gorpenchenko TY, Inyushkina YV, Koren О G , Kiselev K.V,

Shkryl Y N , Zhuravlev Y N. Agrobacterial plant-transforming oncogenes: emerging complexity of their action and a functional parallelism with some animal protooncogenes // International MultiConference of Engineers and Computer Scientists, Regal Kowloon Hotel, Hong Kong, March 19-21, 2008 Lecture Notes in Engineering and computer Science. Hong Kong-1AENG, 2008 Vol 1 P 185-189

8 Inyushkina YV Biotechnological studies of caffeic acid metabolites possessing potent anti-nephritic activity // 13th International Biotechnology Symposium and Exibition (IBS-2008) "Biotechnology for the Sustainability of Human Society", Dalian, China, October 12-17,2008 J Biotechnol Abstracts of IBS. 2008 Vol 136S P S131

Юлия Витальевна ИНЮШКИНА

ПРОДУКЦИЯ МЕТАБОЛИТОВ КОФЕЙНОЙ КИСЛОТЫ В ОБЫЧНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ГЕНОМ ROLC КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК ERITRICHIUM SERICEUM (Lehm. CD.)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СПЕЦЗАКАЗ. УСЛ П Л. 1 0. УЧ -ИЗД Л. 0 8

ФОРМАТ 60X84/16 ТИРАЖ 100 ЭКЗ ЗАКАЗ 1111/1 ИЗДАНО ООО «МК-СЕРВИС» 690041, Г ВЛАДИВОСТОК, УЛ. РАДИО, 5 ОТПЕЧАТАНО ООО «МК-СЕРВИС», ТЕЛ 310-687

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Инюшкина, Юлия Витальевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

X. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ботаническая характеристика семейства Во^тасеае бурачниковые).

1.2. Фотохимическая характеристика семейства Вог

§тасеае.

1.3. Фармакологические свойства метаболитов кофейной кислоты.

1.4. Биосинтез розмариновой кислоты и ее производных.

1.5. Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы растений.

1.6. Влияние гена го1С на трансформированные клетки растений.

1.7. Влияние элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в клетках растений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Бактерии и плазмиды.

2.3. Культивирование бактериальных штаммов.

2.4. Питательные среды.

2.5. Получение клеточных культур Е. яепсеит.

2.5.1. Получение контрольных и го/С-трансгенных культур

Е. йепсеит.

2.5.2. Получение культуры трансгенных корней Е. зепсеит.

2.5.3. Получение клеточной линии Е-4.

2.5.4. Динамика роста каллусных культур Е. хепсеит и накопления ими полифенолов.

2.6. Эксперименты с активаторами биосинтеза полифенолов.

2.7. Выделение плазмидной ДНК.

2.8. Доказательство трансгенности и экспрессия генов.

2.8.1. Выделение растительной ДНК.

2.8.2. Полимеразная цепная реакция на препаратах ДНК.

2.8.3. Выделение тотальной растительной РНК.

2.8.4. Реакция обратной транскрипции.

2.8.5. Полимеразная цепная реакция на препаратах кДНК.

2.8.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real-time PCR).

2.9. Секвенирование ДИК и кДНК.

2.10. Определение содержания полифенолов в культурах клеток

Е. sericeum.

2.11. Исследование фармакологической активности метаболитов кофейной кислоты из каллусной культуры Е. sericeum.

2.11.1. Влияние препаратов из клеточной культуры

Е. sericeum на функцию почек у крыс.

2.11.2. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления.

2.11.3. Влияние препаратов из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления.

2.12 Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика клеточных культур Е. sericeum.

3.1.1. Клеточные культуры Е. sericeum.

3.1.2. Доказательство трансгенности культур Е. sericeum.

3.1.3. Доказательство экспрессии гена rolC в го/С-трансгенных культурах Е. sericeum.

3.2. Накопление полифенолов в культуре клетокЕ. sericeum.

3.2.1. Содержание метаболитов кофейной кислоты в культурах корней и каллусов Е. sericeum.

3.2.2. Получение высокопродуктивной каллусной культуры Е. sericeum методом селекции.

3.2.3. Влияние метилжасмоната и глицерата меди на продукцию метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток sericeum.

3.3. Изменение содержания метаболитов кофейной кислоты при длительном культивировании каллусов.

3.4. Дифференциальная активация транскрипции специфических изоформ генов вторичного метаболизма под действием гена rolC.

3.4.1. Экспрессия генов PAL.

3.4.2. Экспрессия генов CYP.

3.5. Фармакологические свойства препарата из клеточной культуры

Е. sericeum и возможность ее применения в медицине.

3.5.1. Стабильность рабдозина и розмариновой кислоты в процессе сушки каллусов.

3.5.2. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на функцию почек у крыс.

3.5.3. Влияние метаболитов кофейной кислоты из клеточной культуры Е. sericeum на течение экспериментального острого воспаления.

3.5.4. Влияние препарата из клеточной культуры Е. sericeum на процессы свободно-радикального окисления.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Продукция метаболитов кофейной кислоты в обычных и трансформированных геном rolC культурах клеток Eritrichium sericeum (Lehm. DC.)"

Одним из перспективных направлений биотехнологии растительной клетки является получение вторичных метаболитов для фармацевтической промышленности. Это подход получает распространение в нашей стране и мире, поскольку создает воспроизводимый источник сырья для получения биологически активных веществ. Биотехнологическое получение вторичных метаболитов основано на том, что клеточные культуры растений сохраняют свойство целого растения синтезировать и накапливать эти вещества. Клетки растений можно выращивать неопределенно долго (каллусы женьшеня растут в культуре in vitro уже более 50 лет), состав сред для них относительно прост, путем различных манипуляций часто удается повысить содержание вторичных метаболитов. Кроме того, система растительной клетки in vitro - это удобная модель для изучения вторичного метаболизма клетки, поскольку исследователь может управлять ее функционированием через изменение условий культивирования или экспрессии генов.

В настоящее время растет спрос на лекарственные препараты природного происхождения (Dixon and Sumner, 2003). Экстракты лекарственных растений широко применяют в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности (Ullah and Khan., 2008). Активно изучаются антиоксидантные и противовоспалительные свойства растительных полифенолов, в том числе метаболитов кофейной кислоты (Ivanauskas et al., 2008; Ueda et al., 2002). Известно, что полифенолы растений перспективны для профилактики и лечения заболеваний почек, связанных с нефритом. Так, при лечении диабетической нефропатии применяются метаболиты кофейной кислоты: розмариновая кислота и литоспермовая кислота Б (Makino et al., 2002), содержащиеся в растениях семейства Boraginaceae.

На Дальнем Востоке это семейство представлено несколькими видами, в том числе незабудочником шелковистым (Eritrichium sericeum Lehm. DC.) и воробейником краснокорневым (.Lithospermum erythrorhizon Sieb, et Zucc.). Эти виды растений являются редкими и их промышленное использование невозможно. Поэтому разработка новых лекарственных средств на основе клеточных культур этих растений является перспективной задачей для биотехнологии.

Современная биотехнология растений широко использует методы генетической инженерии. Так, например, в последние годы выявлены гены, оказывающие существенное влияние на продукцию вторичных метаболитов в культурах клеток растений, в том числе гены rol Agrobacterium rhizogenes. В большинстве случаев эти гены активируют биосинтетическую способность культур, однако также известны случаи ингибирования (Bulgakov, 2008). К сожалению, информация о механизме действия продуктов этих генов на вторичный метаболизм очень ограничена. Влияние генов rol на биосинтез вторичных метаболитов фенилпропаноидного пути ранее не исследовалось. В настоящей работе приведена сравнительная характеристика продукции метаболитов кофейной кислоты в обычной и го/С-трансгенной культурах клеток Е. sericeum.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в культурах клеток незабудочника шелковистого и получение продуктивной клеточной линии.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Получить контрольную и экспрессирующую ген rolC культуры клеток Е. sericeum.

2. Увеличить выход метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum посредством селекции и воздействия элиситоров.

3. Исследовать связь между экспрессией гена rolC и экспрессией некоторых ключевых генов биосинтеза метаболитов кофейной кислоты.

4. Исследовать фармакологическое действие полифенолов из культуры клеток Е. sericeum.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4) накапливает метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухой массы ткани.

2. Экспрессия гена rolC в клетках Е. sericeum приводит к активации биосинтеза метаболитов кофейной кислоты в длительно-пассируемых культурах и увеличению продуктивности культуры.

3. Ген rolC вызывает активацию экспрессии специфической формы гена CYP98 (CYP98A3), ответственной за биосинтез розмариновой кислоты.

4. Полифенолы культуры клеток Е. sericeum обладают выраженным антиоксидантным и противовоспалительным действием.

Научная новизна. Показано, что клеточные культуры незабудочника шелковистого синтезируют метаболиты кофейной кислоты в больших количествах, многократно превышающих содержание этих веществ в природных растениях. Установлена зависимость действия гена rolC на продукцию метаболитов кофейной кислоты от времени культивирования каллусов - с возрастанием числа пассажей ген проявляет активирующее действие на вторичный метаболизм. В культурах клеток незабудочника шелковистого обнаружен ген CYP98A3, кодирующий специфическую форму цитохром Р450-зависимой монооксигеназы, вовлеченную в биосинтез розмариновой кислоты. Установлена взаимосвязь экспрессии CYP98A3 с экспрессией гена rolC и повышением содержания метаболитов кофейной кислоты в rolC-трансгенной культуре клеток.

Практическая значимость. Получена клеточная культура незабудочника шелковистого, которая является воспроизводимым источником метаболитов кофейной кислоты. Максимальное содержание рабдозина в ней составляет 4.11% от сухого веса ткани, что является самым высоким содержанием этого вещества в природных и биотехнологических источниках. Показано, что полифенолы из культуры клеток незабудочника шелковистого обладают выраженным антиоксидантным действием, снижают симптомы при остром воспалении, что делает их перспективными для углубленного фармакологического изучения с целью создания в дальнейшем медицинских препаратов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2006), II Международном конгрессе по молекулярному размножению растений (2nd International Conference on Plant Molecular Breeding) (КНР, Санья, 2007), 21-м Тихоокеанском научном конгрессе (21st Pacific Science Congress) (Япония, Окинава,

2007), Международной конференции по биоинформатике (International Multiconference of Engineers and Computer Scientists) (Гонконг, 2008), 13-м Международном симпозиуме по биотехнологии "13th International Biotechnology Symposium (IBS

2008)" (КНР, Далянь, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 12 таблиц. Список литературы содержит 90 наименований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Инюшкина, Юлия Витальевна

ВЫВОДЫ

1. Получена высокопродуктивная культура клеток Е. sericeum (линия Е-4), накапливающая метаболиты кофейной кислоты в количестве до 6% от сухого веса ткани, что в 16 раз превысило содержание этих веществ в корнях и в 635 раз — в надземных частях природного растения.

2. В результате селекции и действия индукторов вторичного метаболизма (метилжасмонат и глицерат меди) на 38% повышено содержание полифенолов в культуре клеток Е. sericeum и изменено соотношение метаболитов кофейной кислоты за счет увеличения пропорции рабдозина. Содержание рабдозина достигло 4.1%.

3. Экспрессия агробактериального гена rolC вызывает активацию продукции метаболитов кофейной кислоты в культуре клеток Е. sericeum.

4. В трансформированной геном rolC культуре клеток Е. sericeum отмечено увеличение экспрессии гена CYP98A3, ключевого в биосинтезе метаболитов кофейной кислоты.

5. Повышение экспрессии гена CYP98A3 в го/С-трансгенной культуре клеток Е. sericeum коррелирует с активацией продукции полифенолов

6. Показано отсутствие в каллусах Е. sericeum ограничения потока метаболитов со стороны реакции, катализируемой PAL.

7. Возможное использование каллусной культуры Е. sericeum в медицине — это разработка препаратов для лечения заболеваний почек и препаратов, нормализующих окислительно-восстановительные реакции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ранее в нашей лаборатории были получены клеточные культуры таких растений, как Lithospermum erythrorhizon, Rubia cordifolia, Panax ginseng, Vitis amurensis (Rupr.), Maackia amurensis (Rupr. et Maxim.), стабильно синтезирующие вторичные метаболиты. Особенностью работы с культурами Е. sericeum явилось то, что при кажущейся простоте получения высокопродуктивной гомогенной культуры, эта задача выполнялась с трудом и на протяжении ряда лет. Действительно, первичные каллусы были чрезвычайно гетерогенны, мы наблюдали расщепление ткани на агрегаты различные по морфологии, скорости роста и содержанию вторичных метаболитов в течение не отдельных пассажей (как происходит обычно), а многих лет. Этот факт заставлял задумываться о том, можно ли вообще использовать в биотехнологии этот вид растения.

Другое обстоятельство и необычность объекта исследования заключались в том, что клетки незабудочника шелковистого ответили парадоксальным образом на введение гена rolC - признанного активатора вторичного метаболизма. Долговременное подавление продуктивности в пэ/С-трансгенных культурах незабудочника шелковистого заставило задуматься о том, что ген rolC не является классическим активатором вторичного метаболизма (как другие гены, используемые в настоящее время в биотехнологии), а скорее это модулятор, реализующий свой потенциал в зависимости от регуляторного и биохимического контекста клетки каждого отдельно взятого вида растений. Представлялось, что исследование механизма действия гена в разных модельных системах - в случае явного стимулирования и в случае явного ингибирования процессов вторичного метаболизма, может пролить свет на механизм его действия.

Подытожим, как эти задачи решались в процессе настоящего исследования. Решению первой - созданию высокопродуктивного штамма клеток, помогло то обстоятельство, что метаболиты кофейной кислоты — это группа постоянно экспрессируемых вторичных метаболитов (так называемых "preformed secondary metabolites"), которые находятся под жестким регуляторным контролем растительной клетки. Это означает практически гарантированную стабильность биосинтеза вторичных метаболитов в том случае, если бы удалось отобрать стабильные активно-растущие агрегаты. Эта задача была выполнена путем долговременной селекции. Но это же свойство биосинтетического аппарата незабудочника шелковистого означало и то, что будет очень трудно влиять на синтез вторичных метаболитов путем стандартных воздействий элиситорами. что и оказалось в действительности. Только два элиситора — метилжасмонат и ионы меди, могли каким-то образом повлиять на увеличение продуктивности культуры. В итоге получена линия Е-4, которая показала обнадеживающие фармакологические результаты.

В плане исследования регуляторной функции гена го1С получено два принципиальных результата. Первый заключается в том, что ген оказывает влияние на экспрессию отдельных форм ключевых генов биосинтеза вторичных метаболитов. В этом плане обстоятельства складывались удачно — уже был известен ключевой ген в цепочке биосинтеза розмариновой кислоты, СУР98А6. Идентификация аналога этого гена у незабудочника шелковистого (СУР98АЗ) и изучение его экспрессии показали действительно уникальную картину увеличения экспрессии в го/С-культуре, сопровождаемую увеличенным накоплением полифенолов. Эти данные хорошо согласуются с данными, полученными на других объектах. Так, в культурах клеток марены, уровень экспрессии го1С определял уровень экспрессии гена изохоризматсинтазы, ключевого в биосинтезе антрахинонов (8Ькгу1 е1 а1., 2008). На модели трансгенных клеток марены не удалось выявить какую-либо специфичность действия гена, так как гены изохоризматсинтазы были представлены лишь двумя высоко гомологичными формами. Аналогичная ситуация отмечена в культурах го1В-трансгенных клеток винограда, где трансформация привела к увеличению продукции резвератрола (КлБе1еу а1., 2007). В этой культуре выявлены транскрипты новых изоформ гена стильбенсинтазы, которых не было в контрольной культуре (Киселев, неопубликованные данные).

Второй результат - это выявление медленнотекущих процессов в го1С-трансгенных культурах. Первоначально экспрессия гена го1С в культуре трансгенных клеток растений семейства бурачниковые (Е. Бегюеит, Ь. егуШгогЫгоп) привела к супрессии вторичного метаболизма. Далее, при продолжительном культивировании, го/С-трансгенные каллусы Е. яепсеит стали аккумулировать значительные количества метаболитов кофейной кислоты. Следует отметить, что сходный эффект наблюдался также для культур клеток женьшеня, трансформированных геном го1С (Булгаков и др., 1993), однако в то время его посчитали случайностью. Для женьшеня период уменьшенной (по сравнению с контролем) продукционной способности трансгенных каллусов составлял 6 мес., затем наблюдали быстрое увеличение содержания гинзенозидов в го/С-культурах женьшеня и превышение их уровня над контрольной культурой стабилизировалось. Аналогичная ситуация наблюдалась и для других эффектов гена го1С, например, образования трансгенных корней и апикальных меристем го1С-каллусами женьшеня (вогрепсЬепко е1 а1., 2006).

Результаты настоящего исследования показывают, что в будущих исследованиях будет необходимо привлечь методы глобальной протеомики и геномики и построить интерактому белковых взаимодействий в нормальных и го1С-трансгенных клеточных культурах растений для более глубокого изучения специфичности взаимодействия Яо1С с ростовым и биосинтетическим аппаратом клетки.

89

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Инюшкина, Юлия Витальевна, Владивосток

1. Барабой В. А. Растительные фенолы и здоровье человека. М.: Наука, 1984.

2. Беленький M.J1. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Изд-во АН ЛатвССР, Рига. 1971.

3. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М. и др.: тез. докл. конф. «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология», Алма-Ата, 1993 г. С. 170.

4. Воробьев Д.П., Ворошилов В.Н., Гурзенков H.H., Дорониеа Ю.А., Егорова Е.М., Нечаева Т.И., Пробатова Н.С., Толмачев А.И., Черняева A.M. Определитель высших растений Сахалина и Курильских островов. JL: Изд-во АН СССР, 1974.

5. Дрейпер Д., Скот С., Армитидж Ф., Дьюри Г., Джэкоб JL, Уолден Р., Кумар А., Джефферсон Р., Хэмил Д. Генная инженерия растений. М.: Мир, 1991.

6. Ибрагимов Ф.Н., Ибрагимова B.C. Основные лекарственные средства китайской медицины. М., 1960.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

8. Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 2. С. 321-331.

9. Федореев С. А. Химическое исследование хиноидных пигментов дальневосточных представителей семейства Boraginaceae (бурачниковые). Владивосток, 1980. 151с.

10. Шварц Г. Я., Сюбаев Р. Д. Фармакол. и токсикол. 1982. Т. 45. Вып. 1. С .46-49.

11. Щербановский J1.P., Нилов Г.И., Рабинович В.Д., Горина B.J1. Растительные нафтохиноны ингибиторы дрожжей, молочнокислых и уксуснокислых бактерий // Растит, ресурсы. 1972. Т. VIII. С. 112 - 115.

12. Щербановский JI.P., Шубина Л.С., Бензо-, нафто- и антрахиноны цветковых растений как антимикробные вещества // Растит, ресурсы. 1975. Вып. 3.

13. Agata I., Hatano Т., Nishibe S., Okuda Т. Rabdosiin, a new rosmarinic acid dimerwith a lignan skeleton, from Rabdosia japónica II Chem Pharm Bull. 1988. Vol. 36. P. 3223-3225.

14. Aquino R., Morelli S., Lauro R., Abdo S., Saija A., Tomaino A. Phenolic constituents and antioxidant activity of an extract of Anthurium versicolor leaves // J. Nat. Prod. 2001. Vol. 64. P. 1019-1023.

15. Basnet D., Park J.,Yoon Y. Combinatorial biosynthesis of 5-O-desosaminyl erythronolide A as a potent precursor of ketolide antibiotics // J. Biotechnol. 2008. Vol. 347. P. 321-337.

16. Bekesiova I., Nap J.P., Mlynarova L. Isolation of high quality DNA and RNA from leaves of the carnivorous plant Drosera rotundifolia II Plant Mol Biol Reprt. 1999. Vol. 17. P. 269-277.

17. Benveniste I., Tijet N., Adas F., Philipps G., Salaün J.P, Durst F. CYP86A1 from Arabidopsis thaliana encodes a cytochrome P450-dependent fatty acid omega-hydroxylase // Biochem Biophys Res Commun. 1998. Vol. 243, No. 3. P. 688-693.

18. Bonhomme V., Laurain Mattar D., Fliniaux MA. Effect of rolC gene on hairy root: Induction development and tropane alkaloid production by Atropa belladonna II J. Nat. Prod. 2000. Vol. 63. P. 1249-1252.

19. Bulgakov V.P., Khodakovskaya M.V., Labetskaya N.T., Tchernoded G.K., Zhuravlev Y.N. The impact of plant rolC oncogene on ginsenoside production by ginseng hairy root cultures // Phytochemistry. 1998. Vol. 49. P. 1929-1934.

20. Bulgakov, V.P. Functions of rol genes in plant secondary metabolism // Biotechnol. Adv. 2008. Vol. 26. P. 318-3245.

21. Cochrane FC, Davin LB, Lewis NG. The Arabidopsis phenylalanine ammonia lyase gene family:kinetic characterization of the four PAL isoforms // Phytochemistry. 2004. Vol. 65. P.1557-1564.

22. Dixon R.A., and Sumner L.W. Legume natural products: understanding and manipulating complex pathways for human and animal health // Plant Physiol. 2003. Vol. 131. P. 878-885.

23. Driscoll J., Hasard G., Wood H., Goldin A. Structure antitumor activity relationships among quinone derivatives // Cancer Chemother. Repts. 1974. Vol.4. P. 1-362.

24. Englberger W., Hadding U., Etschenberg E., Graf E., Leyck S., Winkelmann J., Parnham M. Rosmarinic acid: a new inhibitor of complement C3-convertase with antiinflammatory activity // Int J Immunopharmacol. 1988. Vol. 10, No. 6. P. 729-737.

25. Estabrook R. A passion for P450s (remembrances of the early history of research on cytohrome P450) // Drug Metab. Dispos. 2003. Vol. 31, No. 12. P. 1461-1473.

26. Filippini F., Rossi R., Marin O., Trovato M., Costantino P., Downey P.M., et al. A plant oncogene as a phosphatase // Nature. 1996. Vol. 379. P. 499-500.

27. Fukasawa-Akada T., Kung S., Watson J.C. Phenylalanine ammonia-lyase gene structure, expression, and evolution in Nicotiana II Plant Molecular Biology. 1996. Vol. 30. P.711-722.

28. Fujita Y., Hara Y., Suga C., Morimoto T. Production of shikonin derivatives by cell suspension cultures of Lithospermum erythrorhizon II Plant Cell Rep. 1981. Vol. 1. P. 6163.

29. Fung KP., Wu J., Zeng LH., Wong HN., Lee CM., Hon PM., Chang HM., Wu TW. Lithospermic acid B as an antioxidant-baset protector of cultured ventricular myocytes and aortic endothelial cells of rabbits // Life Sci. 1993. Vol. 53, No. 12. P. 189-93.

30. Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu,C. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression // Methods. 2001. Vol. 25. P. 386-401.

31. Greenman C., Stephens P., Smith R., Dalgliesh GL., Hunter C., Bignell G., et al. Patterns of somatic mutation in human cancer genomes // Nature. 2007. Vol. 446. P. 153158.

32. Grzegorczyk I., Krolicka A., Wysokinska H. Establishment of Salvia officinalis L.hairy root cultures for the production of rosmarinic acid // Z Naturforcsh C. 2006. Vol. 61. P. 351 -356.

33. Honkakoshi P., Negishi M. Regulation of P450 (CYP) genes by nuclear receptors // Biochem. J. 2000. Vol. 347. P. 321-337.

34. Inyushkina Y.V., Bulgakov V.P., Veselova M.V. et al. High rabdosiin and rosmarinic acid production in Eritrichium sericeum callus cultures and effect of the calli on Masugi-nephritis in rats // Biosci. Biotecnol. Biochem. 2007. Vol. 71. P. 1286-1293.

35. Ito H., Miyazaki T., Ono M., Sakurai H. Antiallergic activities of rabdosiin and its related compounds: chemical and biochemical evaluations // Chem. 1998. Vol. 6, No. 7. P. 1051-1056.

36. Ivanauskas L., Jakstas V., Radusiene J., Lukosius A., Baranauskas A. Evaluation of phenolic acids and phenylpropanoids in the crude drugs // 2008 Medicina (Kaunas). 2008. Vol. 44, No.l.P. 48-55.

37. Kamata K., Iizuka T., Nagai M., Kasuya Y. Endothelium-dependent vasodilator effect of the extract from Salvia miltiorrhiza radix. A study on the identification of lithospermic acid B in the extracts // Gen Pharmacol. 1993. Vol. 24, No. 4. P. 977-981.

38. Kamata K., Noguchi M., Nagai M. Hypotensive effect of lithospermic acid B isolated from the extract of Salvia miltiorrhiza radix in the rat // Gen Pharmacol. 1994. Vol. 25, No. l.P. 69-73.

39. Kiselev K.V, Kusaykin M.I, Dubrovina A.S, Bezverbny D.A, Zvyagintseva T.N,

40. Bulgakov V.P. The rolC gene induces expression of a pathogenesis-related P-l,3-glucanase in transformed ginseng cells // Phytochemistry. 2006. Vol. 67. P. 2225-2231

41. Kiselev K.V., Dubrovina A.S., Veselova M.V., Bulgakov V.P., Fedoreyev S.A., Zhuravlev Y.N. The rolB gene-induced overproduction of resveratrol in Vitis amurensis transformed cells // J. Biotechnol. 2007. Vol. 128. P. 681-692.

42. Li L., Cheng H., Gai J., Yu D. Genome-wide identffcation and characterization of putative cytochrome P450 genes in the model legume Medicago truncatula II Planta. 2007. Vol. 226. P. 109-123.

43. Li H., Lee H., Jung M., Shah S., U.S. Patent 6267992 (Jul. 31, 2001).

44. Makino T., Ono T., Muso E., Yoshida H., Honda G., Sasayama S. Inhibitory effects of rosmarinic acid on the proliferation of cultured murine mesangial cells // Nephrol. Dialysis Transplant. 2000. Vol. 15. P. 1140-1145.

45. Makino T., Ito M., Kiuchiu F. et al. Inhibitory effect of decoction of Perilla frutescens on cultured murine mesangial cell proliferation and quantative analysis of its active constituents // Planta Med. 2001. Vol. 67. P. 24-28.

46. Makino T., Ono T., Liu N., Nakamura T., Muso E., Honda G. Suppressive effects of rosmarinic acid on mesangioproliferative glomerulonephritis in rats // Nephron. 2002. Vol. 92. P. 898-904.

47. Matsuno M., Nagatsu A., Ogihara Y., Mizukami H. Synthesis of 2-0-(4-Coumaroyl)-3-(4-hydroxyphenyl)lactic acid, an important intermediate of rosmarinic acid biosynthesis // Chem. Pharm. Bull. 2001. Vol. 49, No. 12. P. 1644-1646.

48. Matsuno M., Nagatsu A., Ogihara Y., Ellis BE., Mizukami H. CYP98A6 from Lithospermum erythrorizon encodes 4-coumaroy-4'-hydroxyphenyllactic acid 3-hydroxylase involved in rosmarinic acid biosynthesis // FEBS Lett. 2002. Vol. 13, No. 514. P. 219-224.

49. Mizukami H., Ogawa T., Ohashi H., Ellis B. E. Induction of rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures by yeast extract // Plant Cell Reports. 1992. Vol. 11. P. 480.

50. Mizukami H., Tabira Y., Ellis B. E. Methyl jasmonate-induction of rosmarinic acid biosynthesis in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures // Plant Cell Reports. 1993. Vol. 12. P. 706.

51. Morant M., Hehn A., Werck-Reichhart D. Conservation and diversity of genefamilies explored using the CODEHOP strategy in higher plants // BMC Plant Biology. 2002.Vol. 2, No. 7.

52. Morant M., Schoch G., Ullmann P., Ertunc T., Little D., Olsen C., Petersen M., Negrel J., Werck-Reichhar D. Catalytic activity, duplication and evolution of the CYP98 cytochrome P450 family in wheat // Plant Mol. Biol. 2007. Vol. 63. P. 1-19.

53. Nishizava M., Tsuda M., Hayashi K. Two caffeic acid tetramers having enantiomeric phenyldihydronaphthalene moieties from Macrotomia euchroma II Phytochemistry. 1990. Vol. 29. P. 2645.

54. Palazon J., Cusido RM., Gonzalo J., Bonfill M., Morales S., Pinol MT. Relation between the amount the rolC gene product and indole alkaloid accumulation in Catharantus roseus transformed root cultures // J. Plant Physiol. 1998. Vol. 153. P. 712.

55. Petersen M. Cytochrome P450-dependent hydroxylation in the biosynthesis of rosmarinic acid in Coleus II Ptytochemistry. 1997. Vol. 45, No. 6. P. 1165-1172.

56. Petersen M., Simmonds MS. Rosmarinic acid II Ptytochemistry. 2003. Vol. 62, No. 2. P. 121-125.

57. Sevon N., Drager B., Hiltunen R., Caldentey KM. Characterization of transgenicplants drived from hairy roots of Hyoscyamus muticus II Plant Cell Rep. 1997. Vol. 16. P. 605-611.

58. Siminszky B., Corbin F.T., Ward E.R., Fleischma T.J., Dewey R.E. Expression of a soybean cytochrome P450 monooxygenase cDNA in yeast and tobacco enhances the metabolism of phenylurea herbicides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 17501755.

59. Sumaryono W., Proksch P., Hartmann T., Nimtz M., Wray V. Induction of rosmarinic acid accumulation in cell suspension cultures of Orthosiphon aristatus after treatment with yeast extract // Phytochemistry. 1991. Vol. 30. P. 3267-3271.

60. Szabo E., Thelen A., Petersen M. Fungal elicitor preparations and methyl jasmonate enhance rosmarinic acid accumulation in suspension cultures of Coleus blumei II Plant Cell Reports. 1999. Vol. 18. P. 485-489.

61. Ueda H., Yamazaki C., Yamazaki M. Luteolin as an anti-inflammatory and antiallergic constituent of Perilla frutescens II Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol. 25, No. 9. P. 1197—1202.

62. Ullah M., Khan M. Food as medicine: potential therapeutic tendencies of plant derived polyphenolic compounds // Asian Pac J Cancer Prev. 2008. Vol. 9, No. 2. P. 187196.

63. Werch-Reichhard D. and Feyereisen R. Cytochromes P450: a success story // Genome Biology. 2000. Vol. 1, No. 6.

64. Winterhoff H., Gumbinger H., Sourgens H. On the antigonadotropic activity of Lithospermum and Lycopus species and some of their phenolic constituents // Planta Med. 1988. Vol. 54, No. 2. P. 101-106.

65. Yamamoto H., Kenichiro I., Kazufumi Y. Caffeic acid oligomers in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures // Phytochemistry. 2000a. Vol. 53. P.651-675.

66. Yamamoto H., Yazaki K., Inoue K. Simultaneous analysis of shikimate-derived secondary metabolites in Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures by highperformance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 2000b. Vol. 738. P. 3-15.

67. Yamamoto H., Zhao P., Yazaki K., Inoue K. Regulation of lithospermic acid B and shikonin production in Lithospermum erythrorizon cell suspension cultures // Chem. Pharm. Bull. 2002. Vol. 50, No. 8. P. 1086-1090.

68. Yazaki K., Inushima K., Kataoka M., Tabata M. Intracellular localization of UDPG:p-hydroxybenzoate glucosyltransferase and its reaction product in Lithospermum cell cultures // Phytochemistry. 1995. Vol. 38. P. 1127.

69. Zhao J., Davis L.C., Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites // Biotechnology Advances. 2005. Vol. 23. P. 283-333.