Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние цитозинового металирования ДНК на биосинтез резвератрола в клеточной культуре винограда амурского Vitis amurensis Rupr

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Влияние цитозинового металирования ДНК на биосинтез резвератрола в клеточной культуре винограда амурского Vitis amurensis Rupr"

На правах рукописи 005060696

ТЮНИН АЛЕКСЕИ ПЕТРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЦИТОЗИНОВОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК НА БИОСИНТЕЗ РЕЗВЕРАТРОЛА В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ВИНОГРАДА АМУРСКОГО У1Ш АМ1Л1Е№1Б

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ 2013

ВЛАДИВОСТОК - 2013

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биолого-почвенного института ДВО РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Киселев Константин Вадимович

Официальные оппоненты: Гончаров Андрей Анатольевич

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории низших растений, ФГБУН Биолого-почвенного института ДВО РАН

Новикова Галина Викторовна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции, ФГБУН Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", Москва

Защита состоится «£>> июня 2013 г. в «10» часов на заседании диссертационного совета ДМ 005.003.04 при ФГБУН Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостока, 159.

факс: (423)2310-193 e-mail: ibss@eastnet.febrasl.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан «30» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Музарок Т. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Использование культур клеток растений для промышленного получения биологически активных веществ является перспективным направлением биотехнологии. Многие вторичные метаболиты растений обладают фармакологическими свойствами и являются важнейшими компонентами различных лекарственных препаратов. Генетическая модификация клеточных культур растений не является решением проблемы увеличения содержания целевых метаболитов по причине нестабильности высокого уровня биосинтеза искомых вторичных метаболитов. Экспрессия трансгена при длительном культивировании подавляется эпигенетическими механизмами контроля генной экспрессии. Роль эпигенетических механизмов в регуляции биосинтеза вторичных метаболитов in vivo не изучена. Поэтому описание данного аспекта регуляции вторичного метаболизма растений является актуальной задачей.

Резвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) обладает превентивными свойствами против некоторых видов рака, положительно влияет на сердечнососудистую систему (Pervaiz, 2003; Aggarwal et al., 2004; Shankar et al., 2007). Кроме того, описан положительный эффект резвератрола на продолжительность жизни живых организмов (Wood et al., 2004). Резвератрол обнаружен во многих растениях: тутовое дерево, арахис, клюква, голубика и виноград. Виноград, в том числе и дикий виноград Vitis amurensis Rupr., характеризуется наибольшим содержанием резвератрола.

Биосинтез резвератрола происходит по фенилпропаноидному пути вторичного метаболизма. Стильбен синтаза (STS, ЕС 2.3.1.95) — фермент, непосредственно катализирующий реакцию образования резвератрола (Austin et al., 2004). Известно, что в геноме стильбен-продуцирующих растений ферменты STS представлены мультигенным семейством.

Цитозинового метилирования ДНК признано одним из наиболее значимых эпигенетических факторов в контроле дифференциальной экспрессии генов in vivo. Суть данного феномена заключается в энзиматическом присоединении метальной группы к азотистому основанию цитозина (Ванюшин, 2005). Ци-тозиновое метилирование ДНК играет важную роль на протяжении всех стадий онтогенеза, стрессовых адаптации, апоптоза, поддержании стабильности генома. Несмотря на исключительную значимость, роль цитозинового метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов вторичного метаболизма достоверно не установлена. Для изучения влияния цитозинового метилирования ДНК на биосинтез резвератрола нами выбраны клеточные амурского винограда V. amurensis. Каллусные культуры винограда VV и VB2 являются трансгенными клеточными линиями. Клеточная линия VB2 была трансформирована геном rolB из почвенных бактерий Agrobacterium rhizogenes, что в значимой степени увеличило уровень содержания резвератрола в сравнении с контрольной культурой VV, несущей лишь ген устойчивости к канамицину. Каллусная культура V2 была получена в 2004 году из лиан дикорастущего V. amurensis. Содержание резвератрола в каллусах V2 и VV совпадает

с данным показателем лианы растения амурского винограда. Нами выявлена экспрессия десяти генов БТБ в растении и каллусных культурах V. атигегигя. Таким образом, для изучения роли цитозинового метилирования в биосинтезе резвератрола важным является исследование транскрипционной регуляции различных генов мультигенного семейства УаБТБ посредством цитозинового метилирования ДНК.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение роли цитозинового метилирования ДНК в процессе биосинтеза резвератрола в культурах клеток амурского винограда V. атигеп818.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить роль цитозинового метилирования ДНК в биосинтезе резвератрола при помощи индуцируемого снижения уровня цитозинового метилирования;

2. Изучить влияние известных индукторов биосинтеза резвератрола на уровень цитозинового метилирования генов семейства УаБТБ;

3. Изучить изменения в экспрессии генов ДНК-метилтрансфераз и ДНК-деметилаз, под действием индукторов биосинтеза резвератрола.

Научная новизна. Впервые изучено влияние цитозинового метилирования ДНК на биосинтез стильбенов. Показано, что причиной изменения экспрессии генов стильбен синтаз в культурах клеток V. атигетгв является уменьшение уровня цитозинового метилирования в составе последовательностей изучаемых генов. Указана причина снижения уровня сверхпродукции резвератрола при длительном культивировании трансгенной культуры клеток, заключающаяся в гиперметилировании нуклеотидной последовательности трансгена го1В.

Практическая значимость работы. Добавление деметилирующего агента 5А привело к двухкратному увеличению уровня продукции резвератрола в клеточных линиях УУ и УВ2 V. атигетгя. Так, регуляция цитозинового метилирования в составе генов биосинтеза резвератрола может быть использована для получения культур клеток с повышенным уровнем продукции резвератрола.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференции «Механизм и биология сайленсинга» (США, 2011); на X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2011); на конференции «Эпигеномика» (США, 2012); на XI региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2012); на XV международном биотехнологическом симпозиуме-выставке (Ю. Корея, 2012); на VIII международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах (из списка ВАК).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 9 таблиц. Список литературы насчитывает 159 наименований.

Благодарности. Автор искренне благодарит научного руководителя к.б.н. Киселёва К.В. за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах работы, руководителя лаборатории биотехнологии академика Журавлёва Ю.Н. за помощь в подготовке диссертации и ценные консультации в работе. Автор признателен к.б.н. Козыренко М.М., к.б.н. Дубровиной А.С. и Шумаковой О.А. за помощь в подготовки диссертации и работе с культурами клеток растений. Также автор выражает глубокую признательность Маняхину А.Ю. за проведение ВЭЖХ анализов, Далласу К. за помощь в публикации результатов и всем сотрудникам лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН за поддержку. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, ДВО РАН (10-04-00189-а, 12-04-33069-мол_вед, 09-Ш-А-06-169, 09-Ш-В-06-234, 10-Ш-В-06-100, 12-Ш-В-06-053).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал и культура клеток V. атигет1я. В работе использовались клеточные культуры полученные из лиан дикорастущего растения винограда амурского V. атигеп$1в Яирг. (Укасеае). Каллусная культура У2 получена из лиан взрослых растений. Клеточная линия УУ получена в результате обработки клеток У2 V. атигет1з штаммом А. Ште/аает вУЗ 101/рРСУ002 (К1Бе1еу е! а1., 2007). Каллусы представляли собой рыхлую активно растущую гомогенную ткань, не проявляющую тенденции к дифференциации (резвератрол 0.02 ±0.01% от сухой биомассы). Кроме векторной линии УУ была использована го/5-трансгенная клеточная линия УВ2, полученная в результате трансформации клеток У2 штаммом А. Ыте/аыепз СУЗ 101, несущим • бинарную векторную конструкцию рРСУ002-СаМУВ/рМР90ЯК (К1зе1еу & а1., 2007). Изначально гоШ-трансгенная культура содержала до 3% резвератрола от сухой биомассы, однако ко времени проведения данного исследования этот показатель снизился до 0.2 - 1%. Каллусы культивировали в пробирках с 15 мл агаризованной среды \^В/а (Клзе1еу е1 а1., 2007). Определение количественного содержания резвератрола проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в образцах высушенной ткани V. атигетгя (БиЬгоута е! а!., 2010).

Обработка 5-азацитидином и салициловой кислотой. Растворы 5-азацитидина (5А) и салициловой кислоты (СК) добавляли в культуральные среды, как было описано ранее (1<ЛБе1еу е1 а1., 2007; ЮБеку е1 а1., 2011). Рабочие концентрации для 5А - 50 и 200 мкМ; для СК - 50 и 300 мкМ.

Анализ препаратов ДНК. ДНК из высушенных тканей растений выделяли по модифицированному методу Эхта (Киселев и Булгаков, 2009). Для анализа тотального уровня цитозинового метилирования препаратов ДНК была использована рестриктаза ВзЙ1Н I (50 е.а./мкл, Сибэнзим, Новосибирск, Россия).

Обработку образцов ДНК проводили согласно рекомендациям производителя. Анализа уровня цитозинового метилирования генов VaSTS препараты тотальной ДНК в количестве 1.5 мкг выделенных из каллусов клеточных культур V. amurensis, подвергали бисульфитной конверсии с использованием набора Zymo Research (Ирвин, США), согласно протоколу изготовителя. Препараты ДНК подвергали бисульфитной конверсии согласно условиям, оптимизированным для каждого гена (Kiselev et al., 2013). Амплификации фрагментов генов VaSTSl, VaSTS2, VaSTSlO для дальнейшего определения статуса метилирования были использованы вырожденные геноспецифичные праймеры (Kiselev et al., 2013). Полученные ампликоны были выделены из геля при помощи набора Glass Milk (Силекс, Москва, Россия) и клонированы в вектор pTZ57R/T по протоколу фирмы-производителя (Fermentas, Литва).

Обратно-транскрипционная ПЦР (ОТ-ПЦР) и секвенирование ДНК. Тотальную РНК экстрагировали из клеточных линий на 35-40 день культивирования по методу с использованием LiCl (Bekesiova et al., 1999). кДНК получали, используя 1-3 мкг тотальной РНК (предварительно обработав ДНКазой), с помощью набора для обратной транскрипции (Силекс, Россия). Реакцию проводили при +37°С в течение 1-2 часов (Kiselev et al., 2011). Тотальную экспрессию генов семейств VaMet, VaCMT, VaDRM и VaDem оценивали денси-тометрически. За основу при дизайне праймеров для амплификации фрагментов генов были взяты гомологичные участки известных представителей данных генов растений (Vitis vinifera, Arabidopsis tháliana, Zea mays, Brassica rappa, Oryza sativa, Nicotiana tabacum). Праймеры и условия ПЦР опубликованы в Tyunin et al., 2012. Клонированные ПЦР продукты генов стильбен син-таз, метшггрансфераз и деметилаз секвенированы с использованием Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perking-Elmer Biosystems, США), следуя рекомендациям. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности анализировали с помощью программ GENE RUNNER 3.05 и ClustalW 1.8. Секвени-рованные фрагменты генов метшггрансфераз и деметилаз депонированы в GeneBank, номера доступа даны в скобках: VaMetla (JF327773), VaMet2a (JF327775), VaMet За (JF327776), VaCMTla (JF323949), VaCMT2a (JF327768), VaCMT3a (JF327770), VaCMT4a (JF327769), VaDRMla (JF327771), VaDRM2a (JF327772), VaDem la (KC491211), VaDem2a (KC491212), VaDem3a (KC491213).

Условия проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для генов VaMet, VaCMT, VaDRM, VaSTS, rolB ПЦР PB проводился с использованием Taq-man по методике опубликованной ранее (Tyunin et al., 2012). Для генов VaDem ПЦР РВ проводили с использованием SYBR® Green по методике опубликованной ранее (Kiselev et al., 2013). кДНК амплифицировали с помощью Realtime PCR Kit (Синтол, Россия), используя iCycler амплификатор с оптическим блоком ÍQ5 для ПЦР-РВ (Bio-Rad Laboratories, США). Данные анализировали при помощи программного обеспечения Optical system software v.2.0. Обработку результатов проводили при помощи программного обеспечения

Optical system software v.2.0, как описано ранее (Dubrovina et al., 2010). Данные суммировались из 4-х независимых экспериментов с использованием гена VaActinl или GAPDH в качестве эндогенных контролей.

Статистическая обработка результатов. Результаты были обработаны при помощи программы Statistica, версия 10.0. Все данные представлены как среднее значение Ш стандартная ошибка. Полученные данные проверены по спаренному критерию Стьюдента. Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стабильность биосинтеза резвератрола в трансгенных клеточных линиях винограда V. amurensis. Содержание резвератрола в каллусной культуре V. amurensis не велико (до 0.02% от сухой биомассы клеток). Использование элиситоров или добавление в питательные среды предшественников вторичных метаболитов растений способно значительно увеличить продукцию резвератрола в каллусах V. amurensis (Kiselev, 2011). Наибольшего содержания резвератрола удалось добиться путем агробактериальной трансформации геном rolB из A. rhizogenes. Полученная линия VB2 содержала до 3% резвератрола от сухой биомассы клеток, хотя механизм действия белка rolB на вторичный метаболизм растений до сих пор не известен. Проведенный сравнительный анализ кариологических показателей клеток каллусов V2 и VB2 показал, что трансформация геном rolB приводит к увеличению числа хромосом и ядрышек в ядрах клеток V. amurensis. Увеличение ядрышек говорит о том, что rolB вызвал активацию экспрессии многих генов в разных местах генома винограда. Поэтому непосредственное действие белкового продукта гена rolB сложно различимо на фоне вызванных им эффектов. Тем не менее, полученная клеточная линия VB2 является уникальной модельной системой для изучения механизмов биосинтеза резвератрола.

Дальнейшее наблюдение за го/5-трансгенной клеточной линией VB2 показало, что содержание в ней резвератрола со временем культивирования в течение 5 лет уменьшилось до 0.39% от сухой биомассы (Dubrovina and Kiselev, 2012). Показано, что экспрессия трансгена rolB также достоверно уменьшилась в 3.4 раза за 4 года культивирования в каллусах VB2 (рис. 1).

1 л

i

i 0.75

ё

| 0.5__

С

УВ2-2007 УВ2-2011

Рис. 1. Экспрессия трансгена го!В в каллусах УВ2 в 2007 году (УВ2-2007) и в 2011 году (УВ2-2011). Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значение ±С.О. * —р < 0.05.

7

Известно, что причиной уменьшения экспрессии трансгенов в клетках растений считается эпигенетическое подавление, получившее название silencing - «замолкание». В процессе замолкания экспрессия трансгена подавляется системой цитозинового метилирования ДНК в совокупности с другими эпигенетическими факторами. Для того чтобы установить имело ли место замолкание трансгена rolB в клеточной линии VB2, был проанализирован статус цитозинового метилирования его нуклеотидной последовательности. В результате нами было выявлено метилирование до 90% цитозиновых нуклео-тидов в составе белок-кодирующей последовательности гена rolB и промотора 35S. Полученные результаты подтолкнули нас проверить, как цитозиновое метилирование ДНК способно регулировать биосинтез резвератрола в культурах клеток винограда V. amurensis.

Влияние деметилирования ДНК, вызванного с помощью 5А, на биосинтез резвератрола и экспрессию генов STS в культуре клеток винограда V. amurensis. Мы исследовали влияние ингибитора цитозинового метилирования 5А на клеточные линии VV и VB2 V. amurensis. 5 А был добавлен в питательные среды в двух концентрациях: 50 и 200 мкМ. В векторной линии VV прирост сырой биомассы достоверно уменьшился более чем вдвое при добавлении 200 мкМ 5А, а прирост сырой биомассы в rolB-трансгенной клеточной линии под действием 200 мкМ 5А достоверно не изменялся (табл. 1). Добавление 200 мкМ 5А вызвало двукратное увеличение продукции резвератрола в каллусах VV и VB2 в сравнении с необработанными клетками, но описанное увеличение для клеток VV было статистически недостоверно (табл. 1). Возможно, это объясняется методическими сложностями, связанными с низким уровнем продукции резвератрола клетками VV, затрудняющим точное количественное определение.

Таблица 1. Параметры роста каллусов VV и VB2, содержания и продукции резвератрола в контрольной группе каллусов (VVk, VB2k) и при обработке 5А в концентрациях 50 мкМ (YV+50 мКМ 5А, VB2+50 мкМ 5А) и 200 мкМ (VV+200 мКМ 5А, VB2+200 мкМ 5А). Данные получены из 3 независимых

Прирост сырой биомассы, г/л Содержание резвератрола, % от сухой биомассы Продукция резвератрола, мг/л

VVk 151 ±11 0.04 ±0.03 2.5 ±1.3

VV+50 мкМ 5А 98 ±13** 0.06 ±0.01 3.6 ±0.6

VV+200 мкМ 5А 78 ±13** 0.09 ±0.03 4.9 ±1.6

VB2k 114 ±19 0.19 ±0.02 14.3 ±1.4

VB2+50 мкМ 5А 93 ±15 0.19 ±0.03 12.2 ±1.9

VB2+200 мкМ 5А 88 ±9 0.45 ±0.03* 28.2 ±1.9*

Для подтверждения того, что наблюдаемы эффекты связанны с ДНК-деметилирующим действием 5А, препараты ДНК из контрольной и обработанных 200 мкМ 5А каллусов УУ и УВ2 были обработаны эндонуклеазой ВбШШ. Рестриктаза Вз1НН1 проявляет чувствительность к метилированию цитозиновых нуклеотидов в сайте рестрикции (5'-ОСО*С-3'). По результатам рестрикции, нам удалось зарегистрировать видимое уменьшение уровня метилирования в препаратах тотальной ДНК, выделенных из каллусов УУ и УВ2 подвергнутых обработке 200 мкМ 5 А.

Известно, что содержание и продукцию резвератрола можно увеличить либо через ускорение процессов биосинтеза резвератрола, либо через замедление процессов его деградации и олигомеризации в более высокомолекулярные стильбены. Поэтому, для изучения механизма наблюдаемых эффектов при помощи метода ПЦР РВ была измерена экспрессия 10 генов 572?, белковые продукты которых непосредственно участвуют в биосинтезе резвератрола (рис. 2).

Экспрессия генов Уа5Т85, УаБТБб и УаБТБЮ достоверно увеличилась в клеточной линии УВ2 в 3.0, в 1.4 и в 4.3 раза, соответственно, под действием 200 мкМ 5А. В тоже время только экспрессия гена УаЗТЗЮ значительно увеличилась в 5 раз в каллусах УУ при добавлении 200 мкМ 5А. Так было показано, что добавление деметилирующего ДНК 5А вызывало активизацию биосинтеза резвератрола через выборочное увеличение экспрессии упомянутых генов ВТЗ.

Экспрессия метилтрансфераз в культуре клеток винограда V. атигепз15. Мы проанализировали суммарную экспрессию генов семейств ДНК-метилтрансфераз: УаМе1, УаСМТ, УаВЯМ в клеточных линиях УУ и УВ2 под воздействием 5А (рис. 3, А и Б). Экспрессия генов мети-лаз УаМе1 в векторной линии возрастала пропорционально концентрации деметилирующего агента в среде и при дозе в 200 мкМ 5А увеличилась более чем вдвое, по сравнению с контролем. Суммарная экспрессия генов метилаз УаМе1 в го/В-трансгенной культуре также менялась, однако незначительно при дозе в 50 мкМ, и практически не отмечена для каллусов, культивируемых с добавлением 200 мкМ деметилирующего агента. Необходимо отметить четкую тенденцию на увеличение суммарной экспрессии метилтрансфераз семейства УаСМТ по мере возрастания концентрации деметилирующего агента в инкубационной среде. Что может свидетельствовать о важном функциональном значении метилтрансфераз данного семейства в ответ на индуцируемое падение уровня метилирования ДНК. При этом примерно с одинаковой интенсивностью как для векторной линии УУ, так и для трансгенной линии УВ2 - общая экспрессия хромоме-тилтрасфераз при добавлении 200 мкМ 5А увеличивалась в 2.5 раза. Значимое увеличение суммарной экспрессии метилаз семейства УаИЯМ в 2 раза было отмечено только для векторной линии при добавлении в культивационные среды 200 мкМ 5А.

Й 1 1 I

Ш.....(1а.....

■ а

¡йа .. си Ш _ Ш Ш П-..И улчо» чп-к >пи) т-м

лл

и а

I я

Рис. 2. Экспрессия генов ЯТБ в каллусах УУ и УВ2 в норме и под действием 5 А, полученные методом ПЦР РВ. УУ-К/УУ-50/УУ-200 - каллусы УУ, не обработанные 5А или обработанные 50, или 200 мкМ 5А, соответственно; УВ2-К/УВ2-50/УВ2-200 - каллусы УВ2 не обработанные 5А или обработанные 50, или 200 мкМ 5А, соответственно. Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значение ±С.О. ** - р < 0.01; * ~р < 0.05; отн. ед. - относительные единицы.

Но для трансгенной культуры УВ2 не было отмечено значимого увеличения экспрессии. Добавление деметилирующего агента не ведет к значительному изменению экспрессии метилаз семейства УаОКМ в исследуемых клеточных линиях винограда амурского. Важно отметить, что все результаты об экспрессии генов метилтрансфераз, полученные с помощью вырожденных прай-меров, были подтверждены при анализе экспрессии отдельных генов с помощью ПЦР РВ.

Влияние 5А и СК на метилирование генов Уа8ТБ1, УаЗТБ2 и УаЯТБК). Конечная стадия биосинтеза резвератрола осуществляется ферментами БТБ.

10

А УаМЕТ

УУ УУ УУ УВ2 УВ2 УВ2 N0 М

к 5(1 201! к 50 200

¡В 1

УаСМТ уу уу У'У УВ2 УВ2 УВ2 к 50 200 1; 50 200 N0 М

ЩШЙМ

УайШ уу уу уу УВ2 УВ2 УВ2 N0 м

в

1»- щ

Г аЛсн'н 1 УУ УУ УУ УВ2 УВ2 УВ2 к 50 200 к 50 200 N0 м

1

0 и * Й _

г.!||1||

¿А 41

Рис. 3. Суммарная экспрессия генов УаМеУаСМТ и УаВПМ в культуре клеток УУ и УВ2 V. атигепш при добавлении в питательные среды 50 и 200 мкМ 5А. (А) - электрофоретическое разделение ОТ-ПЦР продуктов генов УаМе(, УаСМТ, УаИКМ и УаАсПп1. УУк, УУ50 и УУ200: образцы из контроля и при добавлении 50 и 200 мкМ 5А, полученные из векторной культуры;. УВ2к, УВ250 и УВ2200: образцы из контроля и при добавлении 50 и 200 мкМ 5А, полученные из то/В трансгенной культуры; N0, негативный контроль; М, маркер молекулярного веса. (Б) - количественный анализ суммарной экспрессии генов УаМег, УаСМТ и УаОНМ. Данные получены из 2 независимых экспериментов и представлены как среднее ±С.О. * —р < 0.05.

На данный момент информация о регуляции экспрессии генов БТЗ системой цитозинового метилирования ДНК отсутствует. Нами было изучено влияние 5А на метилирование генов УаБТБ1 и УаБТБЮ в клеточных линиях УУ и УВ2. Как было показано ранее, добавление 5А в концентрации 200 мкМ увеличивало вдвое продукцию резвератрола в клетках УУ и УВ2. Согласно данным количественного метода ПЦР РВ, экспрессия гена УаБТБЮ увеличивалась в 5.1 и 4.3 раз в каллусах УУ и УВ2 (рис. 4).По данным ПЦР РВ УаБТБЮ является единственным геном семейства УаЯТБ, который достоверно увеличил свою экспрессию в каллусах УУ и УВ2, под действием 200 мкМ 5А, поэтому изучение уровня цитозинового метилирования данного гена в норме и под действием 5А является необходимым для описания влияния метилирования ДНК на биосинтез резвератрола. Кроме того изучался статус цитозинового метилирования гена УаБТБ1. Этот ген обладает наивысшим уровнем экспрессии среди остальных, и его экспрессия значительно не изменялась под действием 5А в клетках УУ и УВ2 (рис. 4).

Наиболее достоверным методом определения статуса цитозинового метилирования ДНК является метод бисульфитного секвенирования. Суть метода

Рис. 4. Экспрессия VaSTSl и VaSTSlO (столбцы) и продукция резвератрола (прерывистые линии) в клеточных линиях V. amurensis VV и VB2 в норме, и при действии 200 мкМ 5А (VV+5A, VB2+5A). Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значение ±С.О. * -р < 0.05.

заключается в конверсии цитозиновых нуклеотидов нуклеотидной цепи ДНК в тиминовые в несколько стадий, в свою очередь метилированные цитозино-вые нуклеотиды не подвергаются конверсии, что позволяет определять статус метилирования каждого цитозинового нуклеотида в составе гена с достоверностью 99% (Frommer et al., 1992). С использованием данных бисульфитного секвенирования и ПЦР РВ нами установлена взаимосвязь между экспрессией определенного гена VaSTS и общим уровнем цитозинового метилирования для последовательности данного гена. Уровень экспрессии, гена VaSTSl достоверно не изменялся под действием 5А. При этом общий уровень цитозинового метилирования нуклеотидной последовательности данного гена также достоверно не изменился под действием 5А, оставаясь в пределах 25 - 20% и 34 - 25% в клетках VV и VB2, соответственно (рис. 5). Напротив, экспрессия гена VaSTSlO была значительно индуцирована действием 5А, а общий уровень цитозинового метилирования достоверно снизился в 2.0 и 1.6 раз в каллусах VV и VB2, соответственно под действием 200 мкМ 5А (рис. 5). Полученные данные подтверждают, что цитозиновое метилирование способно влиять на экспрессию генов участвующих в биосинтезе резвератрола. Однако данные об общем статусе цитозинового метилирования не могут являться достоверным ориентиром разности интенсивности влияния цитозинового метилирования на экспрессию в зависимости от расположения анализируемой нуклеотидной последовательности гена.

В связи с ограничениями метода бисульфитного секвенирования для определения статуса метилирования генов VaSTSl и VaSTSlO, нуклеотидные последовательности генов VaSTSl и VaSTSlO были условно разделены на перекрывающиеся фрагменты размером около 400 - 500 н.п. анализируемые отдельно (рис. 6). Данные об уровне цитозинового метилирования в составе отдельных фрагментов генов VaSTSl и VaSTSlO представлены на рис. 7.

Й.1 - = о*

А

—1

?«= I

I!

25 | : 5 < С

V V + 5 А УВ2 \'Ш + 5А

Н I

'-о ,? £ 5 0.5

й

юо

751| I ч

25 - 5

5 I

У'В2 \;В2+эА

Рис. 5. Экспрессия генов (столбцы) УаБТ81 (А) и УаБТБЮ (Б) и общий уровень цитозинового метилирования (линии) в культурах клеток V. атигеп.ы.ч УУ и УВ2 в норме и при действии 200 мкМ 5А (УУ+5А, УВ2+5А). Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значение ±С.О. *-р< 0.05, ** -р < 0.01.

ПЯТЯ!

РЭ1 РБг РА1 рдг 3)

П П 1

УиЗТЗЮ

и А1 вз да 54 АЗ Д4

.п |-Т Г1—^

Рис. 6. Схематическое изображение позиций и направлений праймеров для бисульфитного секвенирования генов КаЗте; и УаБТБЮ. Соответствующие пары праймеров фланкируют области Р1, Р2, С1, С2, СЗ, С4 нуклеотид-ной последовательности гена УаБТЯ! и его промотора. Ген УаБТБЮ и его промотор условно разделены праймерами на области: Р, С1, С2, СЗ, С4. * -отмечены точки инициации транскрипции соответствующего гена.

Наивысший показатель уровня цитозинового метилирования гена УаБТБ! в клетках УУ (16.8%) отмечен для фрагмента протеин-кодирующей части С2, тогда как, фрагмент промотора гена УаБТБ! характеризовался наименьшим (8.2%) уровнем цитозинового метилирования. Обработка каллусов УУ 200 мкМ 5А уменьшила уровень цитозинового метилирования в составе практически всех исследуемых фрагментов УаБТБ!. Средний уровень цитозинового метилирования гена УаБТБ! в каллусах УВ2 в 1.4 раза выше, чем в каллусах УУ. Наибольший уровень цитозинового метилирования гена УаБТБ] отмечен для фрагмента промотора Р1 в каллусах УВ2 (34.1%), а наименьший уровень (14.5%) цитозинового метилирования отмечен в фрагменте С1 протеин-кодирующей части (рис. 7). Действие 200 мкМ 5А уменьшает уровень

цитозинового метилирования во всех исследуемых фрагментах гена УаЗТБ! в каллусах УВ2.

Протеин-кодирующая и промоторная области гена УаБТЯЮ в среднем в 1.3 раза более метилированы в каллусах УУ (рис. 7). Наибольший уровень цитозинового метилирования в норме в составе промотора гена УаБТБЮ был отмечен в каллусах УУ (57%), тогда как данный показатель в культуре УВ2 меньше в 2.5 раза. Наименьший уровень цитозинового метилирования в норме отмечен для фрагмента протеин-кодирующей части гена С2, составив 32 и 35% в культурах УУ и УВ2, соответственно. Наибольший уровень цитозинового метилирования отмечен в составе фрагмента протеин-кодирующей части УаБТБЮ С4, составив 48 и 66% в каллусах УУ и УВ2, соответственно. Обработка 200 мкМ 5А существенно снизила уровень цитозинового метилирования в составе всех исследуемых фрагментов гена УаВТБЮ в каллусах УУ. При этом наиболее сильное падение зарегистрировано в составе промоторно-го фрагмента Р и протеин-кодирующего фрагмента С4, где данный показатель упал более чем вдвое. Падение уровня цитозинового метилирования под действием 5А в составе анализируемых фрагментов гена УаБТБЮ в каллусах УВ2 было менее выражено в сравнении с каллусами УУ. Наиболее сильное падение данного показателя (в 1.5 раза) было зарегистрировано в составе фрагмента С4. Сравнительный анализ количества цитозиновых нуклеотидов в составе различных фрагментов генов УаБТЯ! и УаБТБЮ выявил значительную разницу в количестве цитозиновых нуклеотидов как для фрагментов одного гена, так и в сравнении соответствующих фрагментов выбранных генов. Фрагменты С1 и С4 протеин-кодирующей части гена Кй5Т57 имеют наименьшее содержание цитозиновых нуклеотидов: 13 и 12.6%, соответственно. Наибольший уровень цитозиновых нуклеотидов был отмечен для фрагмента промотора Р2 (23%), а также для фрагмента СЗ протеин-кодирующей области УаБТБ! (19%). Фрагмент протеин-кодирующей области гена УаБТБ! 0 С4 характеризуется наименьшим содержанием цитозиновых нуклеотидов (13.7%). А наибольшее содержание цитозиновых нуклеотидов (22%) отмечено для фрагмента гена УаБТБЮ СЗ, тогда как содержание цитозиновых нуклеотидов в составе фрагментов Р, С1 и С2 было около 19% (рис. 8). В каллусах клеточной линии УУ наибольший уровень цитозинового метилирования в составе фрагментов гена УаБТБЮ был отмечен для фрагментов Р и С4. Действие 5А на каллусы УУ в наибольшей степени уменьшило уровень цитозинового метилирования именно в составе упомянутых фрагментов, что привело к активации экспрессии данного гена. В клетках УВ2, З'-концевой фрагмент гена УаБТБЮ С4 также характеризовался наибольшим уровнем цитозинового метилирования, и действие 5А в наибольшей степени сказалось на уровне метилирования в составе данного фрагмента. При этом З'-концевой фрагмент С4, гена УаБТБЮ, характеризуется наименьшим количеством цитозиновых нуклеотидов. В составе конститутивно-экспрессируемого гена УаБТБ1 фрагменты С1 и С4 характеризуются наименьшим уровнем

лирования (линии), в норме (прерывистая линия) и после обработки 5А (сплошная линия) для генов и промоторов УаБТЗ! в клетках УУ (А) и УВ2 (Б) и УаБТБЮ в клетках УУ (В) и УВ2 (Г). Данные по метилированию представлены как среднее значение ±С.О. * - р< 0.05, ** -р < 0.01.

метилирования в каллусах УВ2, при этом обладая наименьшим содержанием цитозиновых нуклеотидов относительно других фрагментов (рис. 8). В каллусах УУ в норме фрагменты С1 и С4 также обладают одними из самых низких уровней цитозинового метилирования в составе своих нуклеотидных последовательностей (рис. 7).

Для подтверждения данных, полученных в результате ингибиторного эксперимента по действию 5А, нами было изучено влияние салициловой кислоты (СК) на статус метилирования некоторых генов семейства УаБТБ. СК является одной из сигнальных молекул растений, роль которой в процессе развития стресса у растений наиболее изучена. В наших экспериментах СК в концентрациях 50 и 300 мкМ уменьшила прирост сырой биомассы каллусов У2 в сравнении с контролем, в 1.1 и 1.2, соответственно. Содержание резве-ратрола в каллусах У2 достоверно увеличилось в сравнении с контролем в 3 и 6.7 раз при действии 50 мкМ и 300 мкМ СК.

Таблица 2. Параметры роста культуры У2, содержания и продукции резве-ратрола в контрольной группе каллусов (У2к), и при обработке СК в концентрациях 50 мкМ (У2+50 мКМ СК) и 300 мкМ (У2+300 мКМ СК). Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значе-

Прирост сырой биомассы, г/л Содержание резвератрола, % от сухой биомассы Продукция резвератрола, мг/л

V2k 228 ±17 0.007 ±0.001 0.581 ±0.121

V2 + 50 мкМ СК 207 ±19 0.022 ±0.005* 1.738 ±0.435*

V2 + 300 мкМ СК 185 ±20 0.047 ±0.012** 3.478 ±0.871*

При помощи метода количественной ПЦР РВ нами также была изучена экспрессия основных генов УаБТБ. Экспериментальные данные об экспрессии основных генов семейства УаБТБ в каллусах У2 под действием СК в концентрациях 50 и 300 мкМ совпали с данными опубликованными ранее (Киселев и др., 2010). В каллусной культуре У2 достоверно увеличили свою экспрессию гены Ka.ST.S7 и УаБТБЮ, в то время как ген УаБТБ! достоверно не изменил своей экспрессии. Ген УаБТБ2 увеличил свою экспрессию в 4.2 и 4.5 раза в каллусах У2 под действием 50 и 300 мкМ СК (рис. 8). Ген УаБТБЮ увеличил свою экспрессию в 1.7 и 3.2 раза в каллусах У2 под действием 50 и 300 мкМ СК, соответственно (рис. 8). Наибольшее увеличение экспрессии генов Kfl.ST.S7 и Ka.ST.S7 0 в каллусах У2 наблюдалось под действием 300 мкМ СК, что коррелировало с наибольшей продукцией резвератрола каллусами У2.

Нами были получены данные о статусе метилирования промоторов и 3'-концевых последовательностей генов УаБТБ!, УаБТБ2 и Ka.ST.S7 0 в каллусах У2 в норме и под действием 300 мкМ СК Как было показано ранее, метилирование именно данных областей гена наиболее сильно влияет на экспрессию. Нами получены данные о статусе метилирования З'-концевых фрагментов размером 236 п.н., 295 п.н. и 318 п.н. генов Ka.ST.S7, Ka.ST.S7 и УаБТБЮ соответственно, в культуре У2 при нормальных условиях и под действием 300 мкМ СК (рис. 9).

А,

« II.-?

■г й

£ И.5 | 11.25

I Ч 0.5

ГП ! I

I из?;

ж

г 11.75 :

111.25

5

Й

¿1

У2-5|1<Ш \им(си

»'2-5» «.13 ТШП

Рис. 8. Экспрессия УаБТБ! (А), УаБТ82 (Б) и УаЯТБЮ (В) в каллусах У2 в норме (У21с) и под действием СК в концентрациях 50 мкМ (У2-50) и 300 м1сМ (У2-300), полученные методом количественной ПЦР РВ. Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значение ±С.О. * -р< 0.05; отн. ед. — относительные единицы.

Профили метилирования 3'-концевых последовательностей исследуемых генов в норме достоверно различаются между собой в каллусах У2. Обработка СК также в различной степени влияет на статус цитозинового метилирования в исследуемых фрагментах генов УаБТБ1, УаБТБ2 и УаБТБЮ. Отношение общего уровня цитозинового метилирования З'-концевой области в каллусах У2 к общему уровню цитозинового метилирования в составе З'-концевой области гена УаБТБ! в каллусах У2, обработанных 300 мкМ СК составило 0.99, что свидетельствует о том, что уровень метилирования в данном фрагменте не изменился под действием СК. Отношение общего уровня цитозинового метилирования З'-концевой области в каллусах У2 к общему уровню цитозинового метилирования в составе данной области генов УаБТБ2 и УаБТБЮ в каллусах У2, обработанных 300 мкМ СК составило 1.92 и 2.29, соответственно, что свидетельствует о том, что уровень метилирования в данном фрагменте значительно снизился под действием СК. Как было показано ранее, экспрессия генов УаБТБ2 и УаБТБЮ достоверно увеличилась под действием 300 мкМ СК в каллусах У2, что коррелировало с уменьшением уровня цитозинового метилирования в составе З'-концевых фрагментов данных генов. В то же время экспрессия гена УаБТЯ 1 в каллусах У2 достоверно не изменялась под действием СК в концентрации 300 мкМ, как не менялся и общий уровень цитозинового метилирования в З'-концевом фрагменте данного гена.

Кроме анализа профилей метилирования в составе З'-концевых последовательностей генов УаБТБ1, Уа8ТБ2 и УаБТБЮ в каллусах У2 в норме и под действием 300 мкМ СК, нами были проанализированы профили цитозинового метилирования в составе нуклеотидных последовательностей промоторов исследуемых генов в каллусах У2 в норме и под действием 300 мкМ СК. Были получены данные о статусе цитозинового метилирования фрагментов промоторов размером 653 п.н., 598 п.н. и 301 п.н. генов УаБТБ!, и УаБТБЮ, соответственно. Профили цитозинового метилирования исследуемых генов в каллусах У2 в норме, значительно различались (рис. 10). СК в концентрации 300 мкМ, по-разному повлияла на общий уровень

17

метилирования в составе нуклеотидных последовательностей промоторов исследуемых генов в каллусах VI. Действие СК на каллусы У2, не изменило общий уровень метилирования в составе анализируемых фрагментов промоторов УаБТБІ и УаБТБЮ, увеличив общий уровень цитозинового метилирования во фрагменте промотора гена УаБТ$2 в 1,6-раз._

А 1<ш

1посігцоііяті'ІМИК ц. акт......шшііі|кпсніі-

ммируишк-н части гена ЧіХГ.ЧІ. чи.

Ііуьяйткімаяііасяеііоітїа.'їііиіісті.окінсюиніїиіміі«!«-кч.иірчпнісіі чаєш гміа ! и.іїХІ. « к

В 11Н)

I о !І"

I в4 ЯО

І £ 70

І І 611

£ І 811

к--------------v. v.. ~ г ..........................................к................. гі ........................

г 1 і і ¡\J\l\ я у................ ... п iv.. ....

ІрДч .ППі/їп Ш У

Ну»сіеотнл>п»я паы«;|МШ1('Ш1«Пь окончания притиш-ІС0;І1І|>УЮііи-іі мас > II гыщ ЧіЗТЯМ, н.п

Рис. 9. Сравнение профилей цитозинового метилирования нуклеотидной последовательности З'-концевых областей генов УаБТБ1 (А), (Б) и УаБТБЮ (В) в каллусах У2 в норме (прерывистая линия) и под действием 300 мкМ СК (сплошная линия).

Известно, что деметилирование цитозиновых нуклеотидов в молекуле ДНК может достигаться либо при неправильном копировании статуса метилирования системами поддерживающего метилирования ДНК, либо за счет активного действия ферментов ДНК-деметилаз. Для выяснения причины описанного падения уровня цитозинового метилирования в составе фрагментов анализируемых генов под действием СК, нами при помощи метода количественной ПЦР РВ была измерена экспрессия генов ДНК-деметилаз в каллусах У2 обработанных 300 мкМ СК в сравнении с нормой (рис. 11). У близкородственного вида, исследуемому У. атигет'и, У. vinifera были обнаружены

a liiSTO». itu.

Рис. 10. Сравнение профилей цитозинового метилирования нуклеотидной последовательности промоторных областей генов Fa.ST.S7 (А), Га£Т5'2 (Б) и УаБТБЮ (В) в каллусах У2 в норме (прерывистая линия) и под действием 300 мкМ СК (сплошная линия).

и охарактеризованы три аналога ДНК-деметилаз: DML3 (ХМ 002270849), DEMETER (ХМ 002267274), Rosi (ХМ 002277365). В составе матриц кДНК из каллусов V2, VV и VB2, а также лиан дикорастущего V. amurensis нам удалось выделить 3 транс крипта, получивших названия: VaDeml (гомолог VvRosl), VaDem2 (гомолог VvDML3), VaDem3 (гомолог VvDEMETER). Экспрессия гена VaDem3 достоверно не изменялась в культуре клеток V2 под действием CK в концентрациях 50 и 300 мкМ. Экспрессия генов VaDeml и VaDem2 достоверно увеличилась в 2.5 и 10.0 раз в сравнении с контролем. Полученный результат свидетельствует об активном характере деметилирования ДНК в клетках V2 под действием CK.

Рис. 11. Экспрессия УаОет1, УаОет2 и УаОетЗ в клеточной культуре V. атигетгз У2 в норме (У2к) и при обработке СК в концентрации 50 мкМ (У2-СК(50)) и 300 мкМ (У2-СК(300)), полученных с помощью количественной ПНР РВ. отн. ед. - относительные единицы. Данные получены из 3 независимых экспериментов и представлены как среднее значение ±С.О. * - р < 0.05; ** -р< 0.01.

ОБСУЖДЕНИЕ

Трансформация клеточной культуры V. amurensis геном rolB из A. rhizogenes активирует биосинтез резвератрола в культивируемых клетках (Kiselev et al., 2007). Механизм влияния белка rolB на биосинтез резвератрола неизвестен (Kiselev and Dubrovina, 2012). Нами был показан ранее неизученный эффект трансформации растительных клеток геном rolB из A. rhizogenes, ведущий к полиплоидизации растительного генома. Вероятно, полиплоидиза-ция генома индуцируемая rolB является одной из причин, ведущих к увеличению уровня продукции резвератрола. Описанный ранее спад продукции резвератрола в клеточной линии VB2 (Kiselev and Dubrovina, 2012) по нашим данным связан с высоким уровнем цитозинового метилирования нуклеотвд-ной последовательности rolB. Однако даже после 7 лет культивирования клеток VB2 нам удается детектировать транскрипты мРНК rolB. Эффект уменьшения уровня экспрессии трансгена обусловленный метилированием его последовательности, но не связанный с полным «замолканием», отмечался и ранее для березы и апельсина (Zeng et al., 2010; Fan et al., 2011).

Согласно литературным данным, эпигенетические механизмы, регулирующие биосинтез растительных фенолов и, в частности, резвератрола, в клетках растений не изучены. Веществом, способным ингибировать процесс цитозионового метилирования ДНК в клетках растений, является деметили-рующий агент 5A (Vanslogteren et al., 1984). Согласно полученным данным 5А в концентрации 200 мкМ увеличивает продукцию резвератрола вдвое в каллусах VV и VB2. Увеличение продукции резвератрола обусловлено увеличением экспрессии отдельных генов семейства стильбен синтаз: VaSTS5, VaSTS6 и VaSTSlO. Важно отметить, что из названных генов лишь экспрессия гена VaSTSlO достоверно увеличилась в каллусах обеих клеточных линий VV действием 5А. Деметилирующий эффект 5А на ДНК клеток VV и VB2 был подтвержден при помощи рестрикционного анализа.

Ключевым в понимании эпигенетического аспекта регуляции биосинтеза резвератрола является описание статуса цитозинового метилирования генов

семейства стильбен синтаз. Метод бисульфитного секвенирования позволяет определять статус цитозинового метилирования полинуклеотидной последовательности. Исходя из поставленных задач, нами были составлены профили цитозинового метилирования генов и промоторов VaSTSl и VaSTSlO в клеточных линиях VV и VB2 в норме и под действием 200 мкМ 5А. Ген VaSTSl был взят в анализ как ген, отличающийся наивысшей экспрессией в норме и под действием индукторов биосинтеза резвератрола. Ген VaSTSlO, напротив, в норме экспрессируется слабо, а действие 5А в концентрации 200 мкМ значительно увеличивает его экспрессию. По нашим результатам ген VaSTSl характеризуется низким уровнем общего цитозинового метилирования: 25 и 34% в каллусах VV и VB2, соответственно. Действие 5А снижает данный показатель, но не достоверно. Общий уровень цитозинового метилирования гена VaSTSlO значительно выше: 47 и 38% в клеточных линиях VV и VB2, соответственно, а добавление 5А уменьшает данные показатели до 25% в обеих культурах. Яркая разница, выявленная при сравнении уровней цитозинового метилирования ДНК в составе определенных фрагментов генов VaSTSl и VaSTSlO, подтверждает предположения о дифференциальной регуляции данных генов in vivo. Установлено, что промоторные, 5'- и 3'-концевые фрагменты гена VaSTSl имеют наименьшее процентное содержание цитозиновых нуклеотидов, и только З'-концевой фрагмент гена VaSTSlO характеризуется наименьшим содержанием цитозиновых нуклеотидов. При этом, активация экспрессии гена VaSTSlO под действием 200 мкМ 5А связана с наибольшим уменьшением цитозинового метилирования в составе промоторной, 5'- и З'-концевых фрагментов гена. Данная тенденция характерна для клеток VV, и менее выражена в клетках VB2. Предположительно, метилирование нуклеотидной последовательности промотора, а также 5'- и З'-концевых участков протеин-кодирующей последовательности гена, наиболее сильно влияет на экспрессию генов STS в клеточных культурах V. amurensis.

Ранее было показано, что СК является одним из наиболее сильных индукторов продукции резвератрола в исследуемых культурах клеток V. amurensis (Kiselev et al., 2007). В данном исследовании клеточная культура V2 была обработана СК в концентрациях 50 и 300 мкМ. В результате продукция резвератрола клетками V2 увеличивалась дозозависимо в 3 и 6 раз под действием 50 и 300 мкМ СК, соответственно. Количественный анализ ПЦР РВ, выявил увеличение экспрессии генов VaSTS2 и VaSTSlO в 4.5 и 3.2 раз под действием 300 мкМ СК. Для проверки гипотезы о влиянии уровня цитозинового метилирования ДНК в составе промоторной, а также 5'- и З'-концевых частях генов VaSTS на их экспрессию, был проведен анализ уровня цитозинового метилирования в указанных частях генов VaSTS2 и VaSTSlO в клетках V2 в норме и под действием 300 мкМ СК. Для корректной оценки результатов, в анализ был включен VaSTSl, который достоверно не изменял высокий уровень экспрессии под действием 300 мкМ СК в клетках V2. Общий уровень цитозинового метилирования в составе З'-концевых частей генов VaSTS2

и УаБТБЮ снизился в 1.9 и 2.3 раза, соответственно, и достоверно не изменился для анализируемого фрагмента УаБТБ! под действием 300 мкМ СК. Полученные данные доказывают влияние цитозинового метилирования в данной части анализируемых генов УаБТБ на их экспрессию. Данные об изменении уровня цитозинового метилирования в составе промоторов анализируемых генов и их экспрессии в клетках У2 под действием 300 мкМ СК не показали зависимости между данными параметрами. Мы предполагаем, что наибольшее значение для генной экспрессии имеет метилирование отдельных регуляторных участков в составе промотора, в том числе сайтов связывания факторов транскрипции. К сожалению, на данный момент ск-регуляторные элементы не описаны ни для одного из генов семейства также как и факторы транскрипции, регулирующие их экспрессию.

По результатам, полученным при помощи метода количественной ПЦР-РВ, экспрессия генов Уайет1 и УаБет2 увеличилась достоверно. Мы предполагаем, что эффект деметилирования цитозиновых нуклеотидов в составе З'-концевых частей генов УаБТБ2 и УаБТБЮ в каллусах VI обусловлен действием данных ферментов.

Мы предполагаем, что нами были описаны основные факторы, касающиеся регуляции экспрессии путем цитозинового метилирования, но детальное исследование роли других эпигенетических факторов и сй-регуляторных элементов способно значительно дополнить полученные выводы.

ВЫВОДЫ

1. 5А-индуцируемое деметилирование ДНК двукратно увеличивает продукцию тиранс-резвератрола и экспрессию генов стильбен синтаз (УаБТБ5, УаЗТБб и УаБТВЮ) в каллусных культурах V. атигет'к.

2. Увеличение экспрессии гена УаБТБЮ в каллусных культурах V. атигет'я, вызванное деметилирующим агентом 5А, связано с уменьшением цитозинового метилирования в составе промотора, 5'- и З'-концевых частей данного гена.

3. Паттерны метилирования генов УаБТ81, УаБТБ2 и УаЗТБЮ значительно различаются при сравнении между собой в норме, а также в разной степени изменяются при действии 5А и СК, изменяющих уровень их экспрессии. Эти данные указывают на дифференциальный контроль экспрессии данных генов системой цитозинового метилирования ДНК.

4. Увеличение экспрессии генов УаБТБ2 и УаБТБЮ, связанное с повышением уровня продукции резвератрола в культуре V. атигепзгъ под действием СК, сопряжено с активным деметилированием З'-концевых участков данных генов.

5. В течение длительного времени культивирования го/Я-трансгенной культуры уменьшение уровня сверхпродукции /иранс-резвератрола обусловлено снижением экспрессии трансгена го1В. Данный эффект обусловлен гиперметилированием последовательности трансгена го1В.

Список работ по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах из списка ВАК:

1. Kiselev K.V.*,Tyuiiin А.Р., Manyakhin A.Y., Zhuravlev Y.N. Resveratrol content and expression patterns of stilbene synthase genes in Vitis amurensis cells treated with 5-Azacytidine // Plant Cell Tissue Organ Culture. 2011.Vol. 105 № 1 P. 65-72.

2. Tyunin A.P.*, Kiselev K.V., Zhuravlev Y.N. Effects of total DNA demethy-lation on methyltransferase gene expression and resveratrol production in cell cultures of Vitis amurensis II Plant Cell Tissue Organ Culture. 2012. Vol. 111 № 1 P. 91-100.

3. Тюнин А.П.*, Лауве JI.C., Киселев K.B. Влияние 5-азацитидина на ка-риологические показатели в клеточных культурах винограда амурского Vitis amurensis II Вестник КрасГАУ. 2012. № 10. С. 48-54.

4. Kiselev K.V.*, Tyunin А.Р., Zhuravlev Y.N. Involvement of DNA methyla-tion in the regulation of STS10 gene expression in Vitis amurensis И Planta. 2013. Vol. 237 №4. P. 933-941.

5. Киселев K.B.*, Лауве Л.С., Тюнин А.П. Хромосомная вариабельность клеток винограда Vitis amurensis Rupr., трансформированных растительным онкогеном rolB II Генетика. 2013. Т. 49 № 6. С. 712-717.

6. Kiselev K.V.*, Tyunin А. P., Karetin Y.A. Influence of 5-azacytidine and salicylic acid on demethylase gene expression in cell cultures of Vitis amurensis Rupr. // Acta Physiologiae Plantarum. 2013. DOI: 10.1007/sl 1738-013-1222-0.

Работы, опубликованные в материалах региональных, всероссийских и международных научных конференций:

7. Tyunin А.Р., Kiselev K.V. 2011. The role of DNA methylation in resveratrol production by rolB transgenic grape cell culture // Mechanism and Biology of silencing. Monterey. P. 336.

8. Тюнин А.П., Киселев K.B. 2011. Биосинтез резвератрола и экспрессия метилаз в клеточных культурах винограда амурского V. amurensis Rupr. в условиях индуцируемого падения общего статуса метилирования ДНК // X региональная конференция студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России. Владивосток. С. 270.

9. Tyunin А.Р., Kiselev K.V. 2012. Effects of induced by 5-azacytosine DNA demethylation on methyltransferase gene expression and resveratrol biosynthesis in cell cultures of Vitis amurensis II Epigenomics. Keystone. P. 123.

10. Тюнин А.П., Киселев K.B. 2012. Цитозиновое метилирование гена VaSTSlO и его промотора в клеточных культурах амурского винограда Vitis amurensis IIXI региональная конференция студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России. Владивосток. С. 279.

11. Tyunin А.Р., Kiselev K.V. 2012. Effects of VaSTSl and VaSTSlO genes methylation on resveratrol biosynthesis in cell culture of Vitis amurensis II IBS 2012. Daegu. P. 180 (P-S8-0006).

12. Тюнин А.П., Киселев K.B. 2012. Регуляция биосинтеза резвератрола посредством цитозинового метилирования ДНК генов STS в клеточных культурах V. amurensis Rupr. // VIII международный симпозиум «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва. С. 463-466.

Тюнин Алексей Петрович

ВЛИЯНИЕ ЦИТОЗИНОВОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК НА БИОСИНТЕЗ РЕЗВЕРАТРОЛА В КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЕ ВИНОГРАДА АМУРСКОГО УГГ1БАМиЯЕКШЖ№Ъ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 30.05.2013 г. Формат 60 х 84/16. Усл. печ. л. 1.0. Уч. изд. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ №. 45 Отпечатано в типографии "БАЛС". Лицензия ПД № 20-0035. Владивосток

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тюнин, Алексей Петрович, Владивосток

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ИНСТИТУТ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ТЮНИН АЛЕКСЕЙ ПЕТРОВИЧ

влияние цитозииового метилирования днк на биосинтез резвератрола в клеточной культуре

винограда амурского у1ш лмияетк кцрк.

0420135839П

На правах рукописи

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ь

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

к.б.н. Киселёв К.В.

ВЛАДИВОСТОК 2013

содержание

список сокращений..................................................................................4

введение.............................................................................................................5

глава 1. обзор литературы...................................................................11

1.1. Резвератрол и другие стильбены растений..............................................11

1.2. Биосинтез резвератрола в клетках растений............................................12

1.3. Биологически-активные свойства резвератрола......................................15

1.4. Регуляция биосинтеза резвератрола..........................................................17

1.5. Биотехнологические методы получения резвератрола...........................19

1.6. Цитозиновое метилирование ДНК............................................................23

1.7. Биологическая значимость цитозинового метилирования ДНК и гистонов у растений...........................................................................................25

1.8. Цитозиновые метилтрансферазы растений..............................................29

1.9. Деметилирование ДНК в клетках растений.............................................32

глава 2. материалы и методы...........................................................35

2.1.Растительный материал и культура клеток V. атигет18.........................35

2.2. Питательная среда для пассирования клеточной культуры...................36

2.3. Выделение ДНК...........................................................................................37

2.4. Обработка метил чувствительной рестриктазой......................................37

2.5. Реакция бисульфитной конверсии.............................................................38

2.6. Выделение РНК и получение кДНК..........................................................40

2.7. Анализ общей экспрессии генов УаМе1, УаСМТ, УаОЯМ, ¥аОет с помощью вырожденных праймеров.................................................................41

2.8. Секвенирование ДНК и анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей..........................................................................................44

2.9. Количественный анализ экспрессии генов УаМе1, УаСМГ, УаОЯМ, УсгБет, го1В, УаБТБ с помощью ПЦР РВ.........................................................44

2.9. Определение содержания стильбенов в культурах клеток V. атигет'гх. ..............................................................................................................................48

2.10. Статистическая обработка полученных результатов............................48

глава 3. результаты..................................................................................49

3.1. Стабильность биосинтеза резвератрола в трансгенных клеточных линиях винограда V. атигет18.........................................................................49

3.2. Влияние деметилирования ДНК, вызванного с помощью 5-азацитидина (5А), на биосинтез резвератрола и экспрессию генов стильбен синтаз (8Т8) в культуре клеток винограда V. атигепзгя.......................................................50

3.3. Экспрессия метилтрансфераз в культуре клеток винограда V. атигет1$ ..............................................................................................................................56

3.4. Влияние 5А и СК на метилирование генов УоБТЯИ, УаБТ82 и УаБТБЮ. ..............................................................................................................................64

глава 4. обсуждение................................................................................82

выводы..............................................................................................................92

список литературы.................................................................................93

список сокращений

5 А - 5-азацитидин

БАВ - биологически активные вещества

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

ОТ-ПЦР - обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция

СК - салициловая кислота

С.О. — стандартная ошибка измерений

4CL - кумарат-КоА-4-лигаза

С4Н - циннамат-4-гидроксилаза

CHS — халкон синтаза

PAL — фенилаланин-аммиак-лиаза

РМТ - пиносильвин-О-метилтрансфераза

Phe - фенилаланин

STS — стильбен синтаза

введение

Использование клеточных культур растений для промышленного получения биологически активных веществ (БАВ) является перспективным направлением в биотехнологии. Большинство вторичных метаболитов растений обладают ценными фармакологическими свойствами и поэтому являются важнейшими компонентами различных лекарственных препаратов. Генетическая модификация клеточных культур растений часто не является решением проблемы увеличения содержания целевых метаболитов. Причиной этому является нестабильность высокого уровня биосинтеза нужных вторичных метаболитов. Многократно показано, что экспрессия трансгена, внесенная в геном клеточных культур растений, при длительном культивировании подавляется действием эпигенетических механизмов контроля генной экспрессии. На данный момент нет универсального понимания как эпигенетические механизмы вовлечены в регуляцию биосинтеза вторичных метаболитов in vivo, поэтому изучение эпигенетической регуляции вторичных метаболитов растений является актуальной задачей.

Известно, что резвератрол (3,5,4'-тригидроксистильбен) обладает превентивными свойствами против некоторых видов рака, положительно влияет на сердечнососудистую систему, а также обладает высоким фармакологическим потенциалом в лечении нейродегенеративных заболеваний (Pervaiz, 2003; Aggarwal et al., 2004; Shankar et al., 2007). Кроме того, существуют данные о положительном эффекте резвератрола на продолжительность жизни живых организмов (Wood et al., 2004). В настоящее время на основе этого вещества активно создаются биологически активные добавки к пище. Резвератрол обладает высоким потенциалом для применения в фармакологии (Shankar et al., 2007). Резвератрол обнаружен во многих растениях, таких как тутовое дерево, арахис, клюква, голубика и

виноград. Виноград, в том числе и дикий виноград Vitis amiirensis Rupr., характеризуется наибольшим содержанием резвератрола.

Биосинтез резвератрола происходит по фенилпропаноидному пути вторичного метаболизма. Стильбен синтаза (STS, ЕС 2.3.1.95) - фермент, непосредственно катализирующий реакцию образования резвератрола (Austin et al., 2004). Известно, что в геноме стильбен-продуцирующих растений гены STS представлены мультигенным семейством. При этом разные гены данного семейства в различной степени изменяют паттерн экспрессии в ответ на факторы стимулирующие продукцию резвератрола в клетках растений. На сегодняшний день установлена важнейшая роль эпигенетического фактора - цитозинового метилирования ДНК в контроле дифференциальной экспрессии генов in vivo. Суть данной эпигенетической модификации заключается в энзиматическом присоединении метальной группы к азотистому основанию цитозина. Исследования роли данной эпигенетической модификации в онтогенезе растений доказывают исключительную важность и наибольшее распространение цитозинового метилирования ДНК для растений (Ванюшин, 2005). Ранее была доказана важная роль цитозинового метилирования ДНК на протяжении всех стадий онтогенеза, стрессовых адаптаций, апоптоза, поддержания стабильности генома. Несмотря на описанную исключительную значимость данной эпигенетической модификации, роль цитозинового метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов вторичного метаболизма достоверно не установлена.

Для изучения влияния цитозинового метилирования ДНК на биосинтез резвератрола нами были выбраны клеточные амурского винограда V. amurensis, отличающиеся по уровню продукции резвератрола. Каллусные культуры VV и VB2 являются трансгенными клеточными культурами. Клеточная линия VB2 была трансформирована геном rolB из почвенных бактерий Agrobacíerium rhizogenes, что в значимой степени увеличило уровень содержания резвератрола в сравнении с контрольной культурой W,

несущей лишь ген устойчивости к канамицину. Каллусная культура У2 была получена в 2004 году из лиан дикорастущего V. атигет18, уровень содержания резвератрола в каллусах У2 и УУ не отличается от уровня содержания характерного для лианы растения амурского винограда. В ходе ранее проведенных исследований удалось детектировать экспрессию десяти генов в препаратах кДНК полученных из растения и каллусных культур V. атигет1з. Таким образом, для изучения роли цитозинового метилирования в биосинтезе резвератрола важным является исследование транскрипционной регуляции различных генов мультигенного семейства УаБТБ посредством цитозинового метилирования ДНК. Кроме того, ввиду энзиматической природы поддержания статуса цитозинового метилирования важной задачей является описание экспрессии генов, белковые продукты которых участвуют в процессах цитозинового метилирования полинуклеотидной цепи в норме и под действием факторов индуцирующих биосинтез резвератрола.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучение роли цитозинового метилирования ДНК в процессе биосинтеза резвератрола в культурах клеток амурского винограда V. атигет1з.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить роль цитозинового метилирования ДНК в биосинтезе резвератрола при помощи индуцируемого снижения уровня цитозинового метилирования;

2. Изучить влияние известных индукторов биосинтеза резвератрола на уровень цитозинового метилирования генов семейства УаЗТБ;

3. Изучить изменения в экспрессии генов ДНК-метилтрансфераз и ДНК-деметилаз, под действием индукторов биосинтеза резвератрола.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. 5-азацитидин-индуцируемое деметилирование ДНК двукратно увеличивает продукцию «трш/с-резвератрола и экспрессшо генов стильбен синтаз в каллусных культурах клеток V. апшгет1$.

2. Увеличение экспрессии генов стильбен синтаз, вызванное деметилирующим агентом 5-азацитидином (5А), связано с уменьшением цитозинового метилирования в составе промотора, 5' и 3'-концевых частей исследуемых генов.

3. Паттерны метилирования генов стильбен синтаз значительно различаются при сравнении между собой в норме, а также в разной степени изменяются при действии деметилирующего агента 5А и салициловой кислоты (СК), изменяющих уровень их экспрессии. Эти данные указывают на дифференциальный контроль экспрессии данных генов системой цитозинового метилирования ДНК.

4. Увеличение экспрессии генов стильбен синтаз, связанное с повышением уровня продукции резвератрола в культуре V. атигет18 под действием СК, связано с активным деметилированием 3'-концевых участков данных генов.

5. В течение длительного времени культивирования го/£-трансгенной культуры уменьшение уровня сверхпродукции /и/>я//с-резвератрола обусловлено снижением экспрессии трансгена го1В. Данный эффект обусловлен гиперметилированием последовательности трансгена го1В.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые изучено влияние цитозинового метилирования ДНК на биосинтез стильбенов. Добавление деметилирующего агента 5А привело к двухкратному увеличению уровня продукции резвератрола в клеточных линиях УУ и УВ2 V. атигегшБ. Впервые было показано, что гены стильбен синтаз в различной степени изменяют свою экспрессию под действием деметилирующего агента 5А. Основной причиной изменения экспрессии генов стильбен синтаз в культурах клеток V. атигет15 является уменьшение уровня цитозинового метилирования в составе последовательностей изучаемых генов. Впервые указана причина снижения уровня сверхпродукции резвератрола при длительном культивировании трансгенной

культуры клеток, заключающаяся в гиперметилировании нукпеотидной последовательности трансгена rolB.

Апробация работы и публикации.

Результаты работы были представлены на конференции «Механизм и биология сайленсинга» (США, 2011); на X региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2011); на конференции «Эпигеномика» (США, 2012); на XI региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2012); на XV международном биотехнологическом симпозиуме-выставке (Ю. Корея, 2012); на VIII международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012). Материалы диссертации изложены в 12 публикациях, из них 6 опубликованы в журналах из списка ВАК.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 9 таблиц. Список литературы насчитывает 157 наименований.

Благодарности. Автор искренне благодарит научного руководителя к.б.н. Киселёва К.В. за всестороннюю помощь и поддержку на всех этапах работы, руководителя лаборатории биотехнологии академика Журавлёва Ю.Н. за помощь в подготовке диссертации и ценные консультации в работе. Автор признателен к.б.н. Козыренко М.М., к.б.н. Дубровиной A.C. и Шумаковой O.A. за помощь в подготовке диссертации и работе с культурами клеток растений. Таюке автор выражает глубокую признательность Маняхину A.IO. за проведение ВЭЖХ анализов, Далласу К. за помощь в публикации результатов и всем сотрудникам лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН за поддержку на всех этапах работы. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, ДВО РАН (10-04-

00189-а, 12-04-33069-мол_вед, 09-III-A-06-169, 09-III-B-06-234, 10-III-B-06-100, 12-III-B-06-053).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рсзвератрол и другие стильбены растений

Стильбены - малочисленная группа низкомолекулярных фенольных соединений, производных фенилпропаноидного пути биосинтеза вторичных метаболитов. Стильбены продуцируются небольшим кругом таксономически отдаленных растений, таких как виноградные (Vitaceae), сосновые (Pinaceae), бобовые (Fabaceae) и мятликовые (Роасеае) (Chong et al., 2009). Химические структуры большинства стильбенов растений, и всех стильбенов растений семейства Vitaceae, основываются на структуре /ирш/с-резвератрола (3,5,4'-тригидроксистильбен).

В растениях, в том числе и в винограде стильбены накапливаются как в свободной, так и в гликозилированной форме. Гликозилирование стильбенов служит для их безопасного хранения и транспорта из цитоплазмы в апопласт, а также защищает от разрушения (Regev-Shoshani et al., 2003; Chong et al., 2009). Вторичные метаболиты растений, в том числе и стильбены у представителей семейства Vitaceae, играют ключевую роль в защите растения от стрессовых воздействий окружающей среды, таких как ультрафиолетовое излучение или фитопатогены (бактерии, грибы, насекомые и вирусы растений). Установлено, что in planta стильбены могут накапливаться в тканях винограда в концентрациях достаточных для ингибирования роста таких грибов, как серая плесень Botrytis cinerea или ложная мучнистая poca Plasmopara vitícola, а также некоторых других известных патогенов винограда (Jeandet et al., 2002). Однако стильбены могут синтезироваться и в естественных условиях, например, в здоровых ягодах винограда (Jeandet et al., 1991; Versari et al., 2001). Анализ содержания стильбенов в различных тканях ягод показал, что цис- и /ираяс-резвератрол накапливался преимущественно в кожице (Fornara et al., 2008). Результаты этого исследования свидетельствуют о роли стильбенов как конститутивного

барьера против фитопатогенов во время созревания ягод (Gatto et al., 2008). Так как виноград имеет важное хозяйственное значение, поэтому изучение механизмов защиты винограда от фитопатогенов актуально. Кроме того, стильбены обладают ценными биологически активными свойствами и представляют огромный интерес для медицины.

1.2. Биосинтез резвератрола в клетках растений

Биосинтез стильбенов, в том числе и резвератрола, протекает фенилпропаноидным путем вторичного метаболизма (Langcake and Pryce,

Рис. 1. Схема биосинтеза резвератрола и халкона (по: Jeandet et al., 2002). PAL - фенил ал анин-аммиак-лиаза, С4Н - циннамат-4-гидроксилаза, 4CL — кумарат-СоА-4-лигаза, STS — стильбен синтаза, CHS - халкон синтаза.

В процессе фенилпропаноидного пути аминокислота фенилаланин (Phe) превращается в огромное количество уникальных растительных соединений (фенольные кислоты, флавоноиды, лигнины и стильбены и др.) (Ferrer et al., 2008). Как показано на рис. 1 важнейшими ферментами данного пути

1977) (рис. 1).

являются PAL (Е.С. 4.3.1.5), циннамат-4-гидроксилаза (С4Н, Е.С. 1.14.13.11), а также кумарат-КоА-4-лигаза (4CL, Е.С. 6.2.1.12). PAL является ключевым ферментом данного пути, им катализируется дезаминирование Phe, с последующим превращением в коричную кислоту (рис. 1). С4Н катализирует присоединение гидроксильной группы в пара-положение фенольного кольца коричной кислоты, образуя 4-кумаровую кислоту (рис. 1). Далее фермент 4CL катализирует формирование тиоэфирной связи между карбоксильной группой 4-кумаровой кислоты и коэнзимом А (рис. 1). Стильбен синтаза (STS, ЕС 2.3.1.95) — фермент, непосредственно катализирующий реакцию образования резвератрола. STS конденсирует три молекулы малонил-КоА с одной молекулой кумарил-КоА, конечным продуктом этой реакции (С2—>С7 альдоль�