Изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда

Звягин, Андрей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда
ВАК РФ 06.01.07, Плодоводство, виноградарство

Автореферат диссертации по теме "Изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда"

На правах рукописи

Звягин Андрей Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ЧЕРИОЯГОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ВИНОГРАДА

Специальность 06,01.07 - плодоводство и виноградарство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар-2006

Работа выполнена на кафедре виноградарства ФГОУ ВПО «Кубанского государственного аграрного института» в 2003-2005 гг.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Трошин Леонид Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Щеглов Николай Иванович

Защита диссертации состоится «9» ноября 2006 года в 14 час, на заседании диссертационного совета Д 220, 038. 04 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, Краснодарский край, г. Краснодар, ул. Калинина 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанского государственного аграрного университета».

Автореферат разослан «7» октября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Хвостова Ирина Валерьевна

Ведущая организация: ВНИИ цветоводства и

субтропических культур

профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Виноград является многолетней вегетативно размножаемой культурой и одним из наиболее возделываемых растений в мире. Эта культура выделяется большим генетическим разнообразием, поэтому характеристика и идентификация популяции являются важным шагом в познании биологии винограда для использования ее особенностей на практике [Конарев В.Г, 1998].

С точки зрения генетики виноград как объект исследований является многолетним аллогамным поликарпическим полигетерозиготным вегетативно размножаемым растением, характеризующимся продолжительностью генераций при половом размножении и высоким полиморфизмом. Эти особенности обуславливают широкие возможности к самоопылению, неограниченное вегетативное размножение, легкость скрещивания представителей видов рода УШв Ь., проявляющийся спонтанный мутагенез (именно поэтому необходима клоновая селекция), плохую всхожесть семян и др. [Трошин Л.П., 1997; 2001],

Исторический взгляд и биометрическая информация, комбинированная с ампелографическими данными, часто используется для описания возделываемых сортов и определяет их взаимосвязи. Однако выводы, базирующиеся на этих данных, часто вызывают вопросы, достаточно много ошибок делается при идентификации сортов и клонов. Синонимы и омонимы требуют тщательной проверки на генетическом уровне.

Возможности молекулярных средств, показывающие взаимосвязи между геномами растений, предоставляют ответ на эти и другие вопросы. Некоторые из наиболее используемых средств уже доказали свою эффективность при исследованиях культуры винограда.

Именно развитие и применение ДНК-технологий изменяет суть генетики винограда, ДНК-маркеры способствуют исследованию происхождения изучаемых культур и представляют собой мощное средство для идентификации генотипов винограда.

Среди всех генетических маркеров микросателлиты являются самым мощным типом ДНК-маркеров, предоставляя уникальную генетическую структуру по каждой культуре, что позволяет более точно идентифицировать исследуемые популяции и группы растений.

Это связано с тем, что они являются локус-специфичными и кодоминантными, отсюда микросателлитяые маркеры позволяют определить взаимосвязь между видами или родами и дают возможность гипотетически определить ареал происхождения самых популярных и важных мировых винных сортов.

Генетическое картирование винограда только сейчас получило распространение, а генотипирование клонов - совсем недавно. Длительный срок возделывания, генетическая гетерозиготность и недостаток обычных морфологических генетических маркеров препятствовали картированию в прошлом. Сейчас молекулярные маркеры являются базовыми, ускоряющими процессы отбора и размножения винограда на раннем этапе селекции. Генетическое картирование в комбинировании с физическим изучением может позволить найти гены, контролирующие важные процессы, механизм которых еще неизвестен. Другие гены винограда будут изучены с помощью сравнения полученной ДНК-последовательности с большой базой данных хорошо охарактеризованных генов из других популяций растений.

Методы ввода генов в виноград или другие организмы сейчас хорошо представлены и описаны и позволяют создавать модификации в существующих генотипах. Они могут дать возможность устранить болезни и уменьшить использование пестицидов при классическом культивировании винограда без изменения основных атрибутов вина, производимого из этих сортов [Carole P.M., 2001].

Объективно возрастающая потребность в пополнении сортимента винограда и недостаточная разработанность теоретического аспекта изучения полиморфизма популяций как элементарной единицы процесса эволюции, способной реагировать на изменения среды перестройкой своего генофонда обусловили выбор темы диссертационного исследования.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда для отбора высокопродуктивных клонов на основе использования ампелографических и молекулярно-генетических методов.

В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнения клонов у черноягодных популяций Каберне-Совиньон и Мерло по морфологическим параметрам листьев как основным ампелографическим признакам.

2. Изучить агробиологические и технологические показатели клонов двух черноягодных популяций Каберне-Совиньон и Мерло.

3. Проанализировать полевую устойчивость популяционных групп Каберне-Совиньон и Мерло к основным грибным болезням и вредителям.

4. Оценить уровень полиморфизма у клонов и сортов в обеих популяциях • на основе использования полиморфизма микросателлитных локусов.

5. Исследовать генетические взаимосвязи в популяциях Каберне-Совиньон и Мерло и с помощью микросателлитных маркеров.

6. Описать исследованные клоны винограда по ампелографической схеме и передать лучшие их них на гос испытания в Российской Федерации.

Научная новтпи исследований. Впервые в отечественном виноградарстве с помощью микросателлитных маркеров паспортизированы черноягодные популяции винограда Каберне-Совиньон и Мерло, выполнена оценка генетического родства клонов и их исходных сортов, описаны по ампелографической схеме 4 клона Каберне-Совиньона и 3 клона Мерло.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Оценка изменчивости морфологических признаков листьев

клонов у популяций Каберне-Совиньон и Мерло.

2. Сравнение клонов двух черноягодных популяций винограда

по агробиологическим и технологическим показателям.

3. Анализ полиморфизма у клонов и сортов обеих популяций.

Научно-практическая ценность работы. Модифицированная методика оценки генетической дистанции между клонами и сортами винограда позволила дифференцировать популяции Каберме-Совнньон и Мерло, произрастающие в коллекции учхоза «Кубань» КубГАУ, по комплексу признаков отобран высокопродуктивный клон Каберне-Совкньон-14 и передан на госиспытания в Российской Федерации под названием Кабернек, подтвержден статус ранее переданных на госиспытания клонов Мерло Грамотенко и Рислиналк.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на заседаниях кафедры, научных конференциях и региональных научно-практических конференциях молодых ученых КубГАУ (2003-2005 гг.), на международном симпозиуме в университете Удины (Италия, 2006), во время стажировки в Исследовательском центре герцогства Люксембург. За активное участие в научных исследованиях по приоритетным направлениям развития агропромышленного комплекса получена грамота.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ и поданы две заявки на изобретения.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, выводов и предложений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 164 страницах 1ВМ-текста, содержит 17 таблиц и 35 рисунка. Список литературы включает 186 наименований, в том числе 125 иностранных авторов.

2. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводились в 2003-2005 гг. в соответствии с тематическим планом Кубанского госагроуниверситета (№ госрегистрации 01200113471) на первом отделении учхоза «Кубань» Кубанского государственного аграрного университета, которое находится в черте города Краснодара (территориально относится к центральной зоне Краснодарского края) и в лаборатории биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института риса.

2.1 Исходный материал и методы описания

Объектами исследований являлись две черноягодные популяции сортов Мерло и Каберне-Совиньон: Мерло-2 № 49 - 10 кустов, Мерло-343 - 43 куста, Мерло-181 - 46 кустов и Мерло (контроль) - 30 кустов; Каберне-Совиньон-5А - 20 кустов, Кабернек (Каберне-Совиньон-14) - 12 кустов, Каберне-Совиньон-15А - 22 куста, Каберне-Совиньон-15Б - 10 кустов и Каберне-Совиньон (контроль) -43 куста. Всего было исследовано в учхозе «Кубань» 236 учетных кустов.

Клоны Мерло-343 и Мерло-181 были завезены из Франции, остальные отобраны профессором Трошиным Л.П. за 30 лет его работы в этом направлении.

Предмет исследования - детальное изучение агробиологических и хозяйственно-технологических характеристик исследуемых популяций. Схема посадки корнесобственных насаждений 3,0 х 1,0 м, год - 1999.

Культура возделывания исследуемых генотипов укрывная, кусты сформированы по типу бесштамбового многорукавного веера. Участки не орошаемые. Технология возделывания является общепринятой для южной зоны промышленного виноградарства РФ.

Показатели плодоношения и плодоносности изучались путем проведения учета глазков, соцветий, плодоносных побегов, недоразвитых побегов, количества гроздей на кусте в период сбора урожая [Лазаревский М.А., 1963].

На основе собранных материалов определялись и рассчитывались [Амирджанов А.Г., 1986]:

- процент распустившихся глазков;

- процент плодоносных побегов;

- коэффициент плодоношения;

- коэффициент плодоносности;

- средняя масса грозди, г;

- продуктивность побега, г;

- теоретическая урожайность, г.

Также изучалась мстамерная изменчивость листа. Описывались и сравнивались листья по следующему комплексу из девяти признаков:

- длина листовой пластинки - от верхней точки зубца центральной лопасти до нижнего зубца нижней лопасти;

- ширина листовой пластинки - между выступающими зубцами верхних боковых жилок;

- длина черешка;

- длина срединной жилки;

- расстояние от верхнего бокового выступа до черешковой выемки;

- расстояние от нижнего бокового выступа до черешковой выемки;

- добухтовое верхнее расстояние - от дна верхней боковой вырезки до черешковой выемки;

- добухтовое нижнее расстояние - от дна нижней боковой вырезки до черешковой выемки;

- угол а - угол между центральной и выступающей верхней боковой жилкой;

- угол Р — угол между центральной и выступающей нижней боковой жилкой.

Устойчивость и восприимчивость сортов и клонов винограда к болезням и вредителям оценивались визуально в течение сезона на протяжении трех лет по стандартной методике, разработанной заведующей лабораторией мониторинга и методов управления энтомо-палиосистемами ампелоценозов Государственного научного учреждения Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского института садоводства и виноградарства Россельхозакадемии (ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии) Анной Ивановной Талаш [Талаш А.И., 1999].

Приготовление виноматериалов в условиях микровиноделия из урожая изучаемых нами технических красных популяций проводилось

по технологической схеме для красных сухих вин в цехе лаборатории виноделия ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии. Там же определяли массовую концентрацию Сахаров и массовую концентрацию титруемых кислот.

Качество виноматериалов оценивалось членами дегустационной комиссии ГНУ СКЗНИИСиВ Россельхозакадемии по методике Саришвили Н.Г. (1998).

Для проведения исследований по оценке генетического родства с использованием микросателлитного анализа были взяты выше перечисленные клоны и сорта, а также образцы из Национальной ампелографической коллекции России при Анапской зональной опытной станции: Мерло-14, Мерло-35, Мерло-347, Мерло-348, Каберне-Совиньон-169 и Каберне-Совиньон-217.

2,2 Почвеино-клпматические условия района проведения

исследований

По компонентному составу почва под виноградником учхоза «Кубань» является типичной для центральной зоны Кубани и, как известно, благоприятной для выращивания виноградной лозы.

2.3 Метеорологические условия в годы наблюдений;

Краснодар входит в третью агроклиматическую зону. Поэтому климат характеризуется резко выраженным годовым ходом температуры. По данным Краснодарской метеостанции в 2003 была замечена максимальная сумма активных температур, больше всего осадков выпало в 2003-2004 году н составила 956 мм. Проведённый анализ метеорологических условий показывает, что в целом годы отличались от среднемноголетних данных, но все же были благоприятны для возделывания виноградной культуры.

2.4 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК

Для выделения ДНК использовали листья вышеперечисленных генотипов, которые были собраны с кустов в учхозе «Кубань» и на анапской коллекции, затем помещены в азот при - 70 СО.

Экстракцию ДНК проводили, используя СТАВ-метод» модифицированный по следующей схеме [Murray M.G., 1980].

Концентрацию выделенной ДНК определяли спсктрофотометрически по стандартной методике [Маниатис Т., 1984], а также методом разведений полученных препаратов с последующим их электрофорезом в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия и визуализацией в ультрафиолете. При этом исходили из того, что порог чувствительности бромистого этидия в агарозных гелях составляет 10 нг ДНК [Остерман Л.А., 1981].

2.5 Молекулярные маркеры, использованные в работе

Для анализа генетического разнообразия генотипов коллекции учхоза «Кубань» и анапской были использованы 6 нейтральных микросатсллитных (SSR) маркеров: VRTAG79, WMD5, WMD7, WMD27, VR2AG62, WS2 [Bowers J E., 1996, 1999].

2.6 Проведение полимера! ной цепной реакции н электрофореза

продуктов амплификации

В ходе работы по отбору микросателлитных маркеров, полиморфных между исследуемыми генотипами для всех маркеров, были использованы одинаковые условия ПЦР, позволяющие получить максимальное количество продукта реакции: 9 минут при 94 СО -начальная денатурация, затем следующие 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94 СО, 1 минута - отжиг лраймеров при 55 СО, 2 минуты - синтез при 72 СО, последний цикл синтеза 5 минут при 72 СО.

ПЦР-смесь включала 10 нг ДНК, 2,5 mM MgCI2, 0,2 тМ дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTPs) , 50 mM KCl, 10 шМ Tris-HCI, pH 9,0, 0,1 % Тритон Х-100, 0,23 цМ каждого праймера, 0,25 единицы Taq-полимеразы, в общем объеме 5мкл.

Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 3 % агарозном геле, на основе 0,5 *Трнс-боратного буфера (0,045 М Трис, 0,045 М Борной кислоты, 1 мМ ЭДГА, рН=8,2) при напряжении 120V в течение 2,5 часов, в камерах для горизонтального электрофореза Sub Cell GT фирмы Bio-Rad.

Определение степени генетического родства с применением микросателлитных маркеров требует определения точной разницы в размерах амплифицнрованного участка ДНК у исследуемых сортов,

поэтому необходим более детальный подход к установке параметров ПЦР, прежде всего это относится к температуре отжига праймерной пары. В связи с этим, экспериментально были подобраны оптимальные условия ПЦР» обеспечивающие высокий выход амплифицированного продукта наряду с минимальным количеством неспецифики: 5 минут при 94 СО - начальная денатурация, затем следующие 30 циклов: 30 секунд - денатурация при 94 СО, 30 секунд -отжиг праймеров при N СО, 30 секувд - синтез при 72 СО, последний цикл синтеза 3 минуты при 72 СО. Где N=50 СО для маркеров VrZag 62 и VrZag79; 52 СО для маркера WS2; 55 СО для маркеров VVMD5 и WMD7; 56 СО для маркера WMD27. В состав ПЦР-смесь входили: 40 нг ДНК, 0,05мМ dNTPs, 0,2(лМ каждого праймера, 1 единица Taq-полимеразы, 25 mM KCl, 60 тМ Tris-HCI, pH 8,5, 0,1% Тритон X-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5мМ MgCI2, в общем объеме реакционной смеси 25 мкл.

Для элекгрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали В % акриламидный гель на основе 1 хТрис-боратного буфера.

Электрофорез проводили при напряжении 250 V в течение 3-4 часов, В работе был использован аппарат вертикального электрофореза VE-3 фирмы Хеликон. После электрофореза гелевые пластины помещали на 30 минут в раствор бромистого этндия 5 мкг/мл и фотографировали в ультрафиолете.

2.7 Анализ электр о форе грамм

Идентификацию и определение размеров аллелей микросателлитных локусов проводили с использованием программы Gel-Pro Analyzer 3.1.

2.8 Статистическая обработка данных

Математическую обработку экспериментальных данных проводили по методикам, описанным Б.А. Доспеховым [Доспехов Б.А., 1979|, В.О. Островерховым и Л.П. Трошиным [Трошин Л,П., 1999].

Все вычисления были выполнены в программе STATISTICA 6.0 (ht(p://\v\vw.drmed.rus/s. php/377. html) и Data Pilot (hUp://vv\vw. col orpilot.com/datapilot.htinl).

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Биометрическая оценка морфологических признаков сравниваемых генотипов винограда

Изучение изменчивости морфологических признаков листа традиционно является важнейшим вопросом селекционно-генетических исследований в виноградарстве. Это связано с проблемой использования морфометрии листа как основного информативного признака. Наследственно новые вариации могут отличаться от исходной популяции по большому числу количественных признаков, определяемых интегрированной системой генов. И если даже по каждому из признаков в отдельности эти отличия невелики, суммарно они могут быть выделены на основе анализа комплекса признаков. А именно это и требуется при отборе высокопродуктивных клонов, т.к. необходимо улучшение сорта по комплексу признаков урожайности, устойчивости к неблагоприятным условиям, периоду вегетации, сахаронакоплению и др. При этом следует ориентироваться на поиск растений, отклоняющихся от средних популяционных значений признаков, так как среди них более вероятно нахождение мутаций и редких комбинаций генов [Драновский В.А., Трошин Л.П., 1995].

С целью выявления генетически новых высокопродуктивных клонов среди 5-6% выделенных на маточнике первичного отбора материнских кустов или среди всех изучаемых кустов на маточниках последующих отборов и предложена методика, основанная на методах многомерного биометрического анализа изучаемого комплекса количественных признаков. Важным условием для такого выявления мы считаем включение в анализ не только культурных признаков (урожай с куста, массовая концентрация Сахаров, линейный прирост, средняя масса грозди, титруемая кислотность и др.), но также и морфологических признаков, возможно и не связанных непосредственно с продуктивностью [Рисованная В.И., Трошин Л.П, 1994].

Поэтому нами последовательно изучалась метамерная, внутрисортовая и межсортовая изменчивость по 10 признакам листа, включающим линейные и угловые параметры.

Биомстрико-ампелографнчсское изучение морфометри-ческих признаков двух черноягодных популяций винограда показало, что выявлено 100%-ное отличие всех клонов винограда от исходных сортов в обеих группах, за исключением клона Мерло-2 № 49, у которого лишь три показателя (длина, углы а и 3 листовой пластинки) оказались одинаковыми с контрольным сортом.

3.2 Анализ агробиологических показателей сравниваемых

генотипов винограда

Для определения наличия различий в группах Каберне-Совиньон и Мерло и наглядности преимуществ того или иного клона был усреднен материал за 2003-2005 годы по основным показателям продуктивности винограда.

Хозяйственную продуктивность (урожай) составляет масса урожая гроздей с единицы площади насаждения или куста. По такому важному признаку как урожай с куста генотипы классифицированы в следующем убывающем порядке: в популяции Каберне-Совиньон -Кабернек 2,4 кг, Каберне-Совиньон-15А 1,7 кг, контроль 1,6 кг, Каберне-Совиньон-15Б 1,3 кг и Каберне-Совиньон-5А 1,3 кг, при этом превышение над контрольным сортом было обнаружено у клона Кабернек на 14,3 % и у клона Каберне-Совиньон-15А на 7 %; в пределах сортогруппы Мерло - клон Мерло-343 2,9 кг, Мерло-^81 1,6 кг и Мерло-2 № 49 1,6 кг, контроль 1,2 кг, при этом превышение составило в среднем 1,5-2,3 раза по сравнению с контрольным сортом.

Важнейшим критерием характеристики отдельных сортов, кустов и насаждений является продуктивность - способность формировать определенный биологический и хозяйственный урожай, число побегов на кусте, процент плодоносных побегов, коэффициенты плодоношения и плодоносности, масса грозди [Смирнов К.В., 1998]. При анализе группы Каберне-Совиньон по числу глазков и числу побегов на кусте по критерию Стьюдента достоверность разности оказалась у Каберне-Совиньон-5А и у Каберне-Совниьон-15Б на 1 %-ном уровне значимости (Р < 99%); у генотипов группы Мерло - только у клона Мерло-324 (I = 2,20**).

Изучение плодоносности побегов позволяет наиболее правильно оценить урожайность сорта. По этому важному признаку среди всех клонов популяции Каберне-Совиньон лишь один клон Кабернек превышал контрольный сорт на 12,5 %, при этом достоверной оказалось лишь одна разность между контролем и клоном Каберне-Совиньон-15Б.

В сортогруппе Мерло все клоны имели превышение над контрольным сортом в пределах от 22 % до 89 %. Критерий Стьюдента по этому показателю показал достоверность разности между контролем и клоном Мерло-343 ((= 5,04**).

Коэффициент вариации в группах варьировал от 47,4 до 67,3% - свидетельство естественной невыравненности растений. При этом наименьшее варьирование всех изучаемых показателей плодоносности, а следовательно, стабильная урожайность характерна для клона Мерло-2 № 49 и Мерло-343, в группе Каберне-Совиньон - Кабернек и Каберне-Совиньон-5 А.

Клон Мерло-2 № 49 оказался продуктивнее контрольного сорта на 40 %, но как показал критерий Стьюдента, достоверной оказалась лишь одна разность между клоном Мерло-343 и контролем (( = 6,56**), остальные два генотипа по урожайности существенно не отличались от контрольного сорта 0: = 1,5 и I = 1,9) при (Р > 95 %).

Существенные различия в группе Каберне-Совиньон в сравнении с контрольным сортом были обнаружены при использовании метода бутстрепа:

у клона Каберне-Совиньон-5А - по числу глазков, количеству побегов, количеству плодоносных побегов, числу соцветий, урожайности, массе грозди, теоретическому урожаю;

Каберне-Совиньок-15А - по числу глазков, количеству побегов, средней массе грозди;

Кабсрне-Совиньон-15Б - по числу глазков, количеству побегов, количеству плодоносных побегов, числу соцветий, коэффициенту плодоношения, количеству гроздей.

В сортогруппе Мерло: у генотипа Мерло-2 № 49 по числу глазков и у клона Мерло-181 по средней массе грозди.

Важным показателем, характеризующим продуктивность виноградного растения, является средняя масса грозди. На ее величину влияют условия произрастания и применяемая агротехника, а именно -нагрузка кустов урожаем, уровень питания, применение регуляторов роста.

Средняя масса грозди является одним из ключевых элементов при прогнозировании и программировании урожаев винограда, в настоящее время основная часть урожая технических сортов убирается вручную и поэтому производительность труда при уборке в значительной степени зависит от этого показателя [Амирджанов А.Г., 1986].

У всех изучаемых клонов масса грозди отличалась от контрольного сорта в группе Каберне-Совииьон, при этом два клона показали превышение на 21 % у Кабернека (1 = 6,66**) и на 23 % у Каберне-Совиньона-15Б -1 = 2,89**.

Наряду с оценкой урожайности и продуктивности изучаемых генотипов не меньшее значение имеет оценка качества винограда. Вкусовые качества в значительной степени определяются соотношением содержания Сахаров и кислот.

За годы исследований среди популяции технического сорта Кабсрне-Совиньон все клоны превышали по массовой концентрации Сахаров контрольный сорт: на 9 % клон Каберне-Совиньон-5А, Кабернек - 8 %, Каберне-Совиньон-15А - 8,2 % и Каберне-Совиньон-15Б- 23 %.

По массовой концентрации титруемых кислот: высокий показатель был у клона Каберне-Совиньон-15А (8,0) и Каберне-Совиньон-15Б (8,2), при этом умеренный - был у Каберне-Совиньона-5А и Кабернека.

В группе Мерло наблюдалась аналогичная стуация, что и в группе Каберне-Совиньон, а именно все исследуемые генотипы превышали контрольный сорт по сахаронакоплению.

В результате комплексного исследования агробиологических признаков было установлено, что по совокупности показателей все клопы отличались от контрольных сортов по определенным признакам, наибольшие отличия были найдены у клонов в следующем убывающем порядке:

в первой популяции Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15Б, Каберне-Совиньон-15А, Кабернек;

во второй - Мерло-342, Мерло-2 № 49, Мерло-181.

Использование статистического метода бутстрепа для поиска отличий между исследуемыми генотипами по данным агробиологических показателей показало практически идентичные результаты, что и оценка разности критерием Стьюдента.

3.3 Анализ устойчивости сравниваемых генотипов винограда к вредителям н грибным болезням

Болезни и вредители могут снижать урожай на 50 % и более, наносимый ими вред вызывает также снижение качества продукции, долговечности насаждений и эффективности виноградарства в целом.

Изучение черноягодной популяции Мерло (табл. 1) выявило устойчивость у контрольного сорта и клона Мерло-2 № 49, в популяции Каберне-Совиньона - Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15А и Б (табл. 1). Однако не выявлено среди обеих исследуемых популяции устойчивых к милдью и оидиуму.

Таблица 1 - Полевая устойчивость черноягодных популяций винограда к вредным организмам (2003-2005 гг.)_

Генотип Болезни, балл Вредители, балл

Милдью Оидиум Ант-ракноз Зудень Ци- кадки *ЛФФ

Мерло 0,1-1 0,1 4 — — 4

Мерло-2 № 49 0,1-1 0,1-1 4 — — 4

Мерло-343 0-0,1 0-1 3 4 — _

Мерло-181 0-0,1 0,1-1 3 - — —

Каберне-Совниьон (контроль) 0-0,1 0-0,1 4 — — —

Каберне-Совниьон-15А 0,1 - 1 0-0,1 4 — — —

Кабсрне-Совниьон-15Б 0,1-1 0-0,1 4 — — 4

Кабернек (Каберне-Совиньон-14) 0 0-0,1 4 — — —

Каберне-Совниьон-5А — — — 4

За годы наблюдений у большинства сортов не отмечено проявления антракноза. Однако при этом нельзя утверждать, что сорта и клоны иммунны к возбудителю. Наиболее вероятно, что в данной микрозоне не сложились условия для развития антракноза.

Слабая поражаемость антракнозом среди исследуемых генотипов была зафиксирована у клонов Мерло-343 и Мерло-181, что говорит о возможной слабой устойчивости этих клонов винограда к болезни.

Отсутствие зудня было зафиксировано у клона Мерло-343, но это не значит, что клон устойчив к вредителю, так как поражаемость вредителем в большей степени зависит от исходной заселенности яйцами саженцев.

Листовая форма филлоксеры была зафиксирована у многих генотипов, за исключением Мерло (контроль), Мерло-2 № 49, Каберне-Совиньон-15Б и Каберне-Совиньон-5А. В сложившихся экологических условиях сорта и клоны группы Мерло и Каберне-Совиньон стали повреждаться наряду с корневой также и листовой формой филлоксеры.

Таким образом, среди изучаемых сортов и клонов не выявлено иммунных к милдью и оидиуму. Слабое проявление антракноза у генотипов Мерло-343 и Мерло-181 свидетельствует о возможности их использования в качестве источников в селекционной работе на устойчивость.

3.4 Технологическая оценка вин сравниваемых генотипов

винограда

За годы исследований установлено, что вина из изучаемых клонов и сортов имеют разные органолептические характеристики и дегустационные баллы (табл. 2 и 3).

Органолептическую оценку проводили по десятибалльной системе.

В среднем за три года из представленных красных сухих виноматсриалов, приготовленных из сорта винограда Мерло (табл. 2), все образцы получили оценку более высокую, чем у контроля (7,41 балла). Лучшими образцами были Мерло-2 № 49 (7,63 балла) и Мерло-181 (7,72 балла).

В течение всего периода изучения виноматериалы отличались нарядной рубиновой окраской, слаженностью и ярко выраженными сортовыми особенностями в аромате и вкусе.

Из представленных красных сухих виноматериалов, приготовленных из сорта винограда Каберне-Совиньон (табл. 3), все варианты отличались высокими органолептическими показателями и набрали высокий балл - более 7,70. Лучшими оказались варианты Кабернек - 7,85 балла и Каберне-Совиньон-15А - 7,82 балла.

Эти виноматериалы отличались яркой нарядной рубиновой окраской, более выраженным ароматом с тонами черной и красной смородины, терна и гармоничным, полным, с легким танинным вкусом. Качество виноматериалов свидетельствовало о возможности использования изученных клонов винограда в производстве натуральных красных сухих вин.

Таблица 2 - Органолептическая оценка вин изученных клонов и сортов винограда популяции Мерло (Краснодар, учхоз «Кубань», 2003-2005 гг.)___

Образец вина Балл

Характеристика год средний

2003 2004 2005

1 2 3 4 5 6

Мерло Цвет - светло-красный; аромат - развит, с тонами чернослива, черной смородины; вкус - полный, бархатистый, экстрактивный так. 7,20 7,41 7,64 7,41

Мерло-2 №49 Цвет - темно- рубиновый; аромат - дымные тона с пасленовым оттенком; вкус — полный, с легкой танинностью. 7,60 7,63 7,69 7,63

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6

Мерло- 343 Цвет - рубиновый с гранатовым оттенком; аромат - чистый, с тонами красных сортов винограда; вкус- полный, танинный. 7,50 7,58 7,73 7,58

Мерло-181 Цвет - темно-рубиновый; аромат — чистый, с тонами красной смородины; вкус - полный, танинный. 7,65 7,72 7,80 7,72

Таблица 3 - Органолептическая оценка вин изученных клонов и сортов винограда популяции Каберне-Совиньон (Краснодар, учхоз «Кубань», 2003-2005 гг.)_

Образец вина Балл

Характеристика год средний

2003 2004 2005

1 2 3 4 5 6

Каберне-Совиньон (контроль) Цвет - темно-рубиновый; аромат - чистый, сортовые тона выражены слабо; вкус - малогармоничный из-за выступающей терпкости и грубости. 7,70 7,55 7,83 7,69

Продолжение таблицы 3

1 2 3 4 5 6

Каберне-Совииьон-15А Цвет - темно-рубиновый; аромат - чистый, слаженный, со сливочно-смородиновыми, фиалковыми, черносмородиновыми тонами; вкус - полный, слаженный, шелковистый. 7,85 7,65 7,97 7,82

Каберне-Совниьон-15Б Цвет — темно-рубиновый; аромат - яркий, с тонами красных ягод и оттенками фиалки; вкус- недостаточно гармоничный из-за излишней свежести. 7,83 7,60 7,90 7,78

Каберне-Совиньон-5А Цвет - темно-рубиновый; аромат - сортовой, с фиалковыми тонами; вкус — гармоничный, недостаточно полный 7,79 7,50 7,80 7,70

Кабернек (Каберне-Совниьон-14) Цвет - темно -рубиновый; аромат-чистый, сортовой, с ярко выраженными пасленовыми тонами и легкими оттенками фиалки; вкус умеренно полный, гармоничный. 7,85 7,75 7,95 7,85

3.5 Анализ генетического разнообразия сортов и клонов винограда амислографнческон коллекции КубГАУ с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров

Как известно [Конарев А.В., 1998], при исследовании генетических ресурсов растений с помощью микросателлитных маркеров преследуются разнообразные цели, среди наиболее значимых выделяют следующие.

1. Определение структуры популяции коллекции и степени сродства генотипов для наиболее эффективного подбора родительских пар при гибридизации,

2. Определение, идентификация, паспортизация и регистрация источников и доноров ценных признаков.

3. Решение спорных вопросов авторства сортов и образцов растений.

4. Идентификация и паспортизация сортов может выполняться на основании данных об аллельных состояниях использованных маркеров у каждого отдельно взятого генотипа, сорта или клона.

Вследствие изложенного, для исследования генетического разнообразия и составления их ДНК-фингерпринта среди избранных генотипов ампелографической коллекции учхоза «Кубань» нами были использованы 6 нейтральных (табл. 4), т.е. не сцепленных с каким либо геном, микросателлитных маркеров (Greek Vitis Database,

http://wnv.biology.uch.gr/gvd).

Таблица 4 - SSR-локусы, использованные для идентификации клонов и сортов винограда__

Маркер Молекулярный вес (п.н.) Число выявленных аллелей

WS2 141-147 3

VrZag62 188-199 5

VrZag79 242-255 2

WMD5 239-257 5

WMD7 239-243 3

VVMD27 174г186 6

Нумерацию аллелей по каждому из маркеров проводили следующим образом: аллель с минимальным значением молекулярного веса принимали за нулевой и обозначали как 0, аллели с большим молекулярным весом нумеровали по разнице между ним и нулевым аллелем (табл. 5).

Таблица 5 - Нумерация аллелей

Маркер Аллели

УУБ2 141*- 0** 143-2, 147-6

Уггаёб2 189-0, 191-2, 193-4, 195-6, 197-8

УтЪь&Ъ 251-0, 255-4

УУМ05 239 - 0, 245 - 6,247 - 8, 255 - 16,257-18

УУМ07 239-0,241-2,243-4

УУМ1)27 174 - 0, 176 - 2,178 - 4, 180 - 6, 184 - 10, 186 - 12

Примечание: *- размер аллелей указан а парах яуклеотидов (п.н.), ** - после размера аллеля через тире указан номер, ему присвоенный.

Как вддно из таблицы 4, .маркеры проявили различный уровень полиморфизма: от двух (локус Уг5!а§79) до шести (локус УУМ027) аллелей на один микросателлитный локус с максимальным полиморфизмом по маркерам УУМ027 и УУМШ, Уг2^62, что свидетельствует о дальнейшем использовании этих маркеров в будущей селекции винограда и определение генетической идентификации клонов.

По результатам анализа о наличии аллелей исследовавшихся популяций, были составлены их ДНК-паспорта, содержащие информацию о номере микросателлитного маркера и его аллельном состоянии у конкретного генотипа (табл. 6 и 7).

Таблица 6 - ДНК-паспорта клонов и сортов популяции Каберне-Совниьон, составленные по данным об аллельных комбинациях микросателлитных маркеров____

Маркер *К-С (к) ♦К-С-5А *к-с- 15А *Кабернек *К-С-217 *К-С-169

Уггаф! *4 0 0 2 2 2

УУБ2 6 6 6 6 6 6

Уутс127 4 0 0 4 2 6

Уупм!5 6 16 16 18 16 16

У|^79 0 0 0 0 0 0

УУШСП 4 0 4 4 2 2

*Примечание; для каждого генотипа указаны аллели, выявленные и о отдельному маркеру.

Анализ данных ДНК-отпечатков популяции Кабсрне-Совиньон (табл. 6) показал, что исследуемые нами генотипы имеют отличающиеся наборы аллелей: генотип Каберне-Совиньон-5А отличается от контрольного сорта на 22 аллсля, клон Каберне-Совиньон-15А - 18 аллелей, Каберне-Совиньон-169 - 16 аллелей, Кабернек - 14 аллелей, Каберне-Совиньон-217 - 14 аллелей. Таблица 7 - ДНК-паспорта клонов и сортов популяции Мерло, составленные по данным об аллсльных комбинациях

Маркер *М (к) *М-14 *М- 348 *М- 343 *М-181 *М-347 *М-2 №49 ♦М-35

У1^62 *2 2 6 8 8 8 8 2

2 2 2 2 2 2 2 0

\\шс127 0 0 2 12 10 10 10 0

\Чтп(15 8 6 18 8 6 0 0 0

0 0 0 4 4 4 0 0

Ууш<17 2 2 0 0 0 2 2 0

*Примечание: для каждого генотипа указаны аллели, выявленные по отдельному маркеру.

Анализ данных ДНК-отпечатков группы Мерло (табл. 7) показал, что исследуемые формы отличаются от контрольного сорта, при этом клон Мерло-347 - на 28 аллелей, Мсрло-343 - 24 аллеля, Мерло-2 № 49 - 24 аллеля, Мерло-181 - 24 аллеля, Мерло-348 - 18 аллелей, Мерло-35 - 12 аллелей и Мерло-14 отличается на 2 аллеля.

При рассмотрении ДНК-отпечатков видно, что исследуемые нами генотипы популяций Кабсрне-Совиньон и Мерло, несмотря на высокую степень генетического родства, имеют отличающиеся наборы аллелей.

На основании комплекса данных о частоте встречаемости аллелей у исследованных сортов и о размере аллелей, что отражено в их нумерация, была проведена оценка степени их генетического сходства. Для этой цели использовали кластерный анализ-метод, основное назначение которого заключается в проведении классификации объектов.

Результаты кластеризации представлены на рисунках 1 и 2.

... TreeDiagramfor Variables Unweighted pair-group average Euclidean distance«

♦K-C169 •К»берквс "K-C 15A. -K-C217 *K.C 5A *K-C (к)

Рисунок 1 - Кластерный анализ изученных клонов группы Каберне-Совиньон по микросателлитным маркерам

1В

Ш .'

о;;

а 2 : о

-7!т Я:

:'■. *

: Tree otsaram ror variaoiee :

.; ; "М 348 «МЭИИ* "М 347 "М 181 "М 343 *М 35 *М М >М<к)

Рисунок 2 - Кластерный анализ изученных клонов группы Мерло по микросателлитным маркерам

Анализ полученного в результате кластеризации иерархического дендрита методом ИРвМА [161] позволяет выделить в выборке исследованных генотипов популяции Каберне-Совиньон (рис. 7) две основные группы (кластера).

К кластеру номер один отнесены клоны Кабсрнек и Каберне-Совиньон-169.

В состав второго вошли клоны Каберне-Совиньон-15А, Каберне-Совиньон-217 и Каберне-Совиньон-5А. При рассмотрении этих кластеров можно заметить, что исследуемые генотипы являются между собой генетически близкими.

Анализ полученного в результате кластеризации иерархического дендрита исследованных генотипов популяции Мерло (рис. 8) позволяет выделить два основных кластера и 3 вспомогательных.

. К кластеру номер один отнесены клоны Мерло-2 № 49, Мерло-347, Мер л о-181 и Мерло-343, при этом эти клоны образуют 2 вспомогательных подкластера (Мерло-2 № 49 и Мерло-347; Мерло-181 и Мерло-343). Это говорит об их наибольшей генетической близости.

В состав второго вошли клоны Мерло-35, Мерло-14 и Мерло (контроль). При рассмотрении этого кластера можно заметить, что исследуемые клоны Мсрло-14 и Мерло-35 наиболее генетически близки к контрольному сорту Мерло, при этом наибольшей генетической отдаленностью обладает генотип Мерло-348.

В целом проведенный в рамках данной работы анализ степени генетического родства между клонами популяций Каберне-Совиньон и Мерло позволяет говорить о достоверности данных, получаемых при использовании полиморфизма микросателлитных маркеров.

Информацию о генетическом родстве исследуемых генотипов можно использовать для улучшения сортимента винограда Кубани и получения представлений о спектре изменчивости популяций.

3.6 Амиелографпчсскос описание исследуемых генотипов винограда

Детальное описание и фотографии исследуемых популяций Каберне-Совиньон и Мерло приведены в диссертационной работе.

выводы

Как действенный рычаг подъема урожайности виноградных насаждений, клоновой селекции, качества и повышения адаптивности сортов винограда к конкретным условиям произрастания предложена стратегия, включающая новые элементы отбора клонов по комплексу признаков и тестирования их по ДНК ПЦР-анализом, что позволяет сократить этот процесс до 3-5 лет.

В соответствии с полученными результатами диссертационного исследования можно сделать следующие выводы:

1. По морфометрическим признакам выявлено 100%-ное отличие всех клонов винограда от контрольных сортов в обеих популяциях винограда; за исключением клона Мерло-2 № 49, у которого лишь три показателя (длина, углы аир листовой пластинки) оказались одинаковыми с контрольным сортом.

2. По совокупности агробиологических показателей все клоны отличались от контрольных сортов по определенным признакам; наибольшие отличия были обнаружены у клонов в следующем убывающем порядке:

- в популяции Каберне-Совиньон: Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15Б, Каберне-Совиньон-15 А, Кабернек;

- в популяции Мерло: Мерло-342, Мерло-2 № 49, Мерло-181, При этом во второй популяции было зафиксировано превышение над контрольным сортом у всех клонов по урожайности в 1,5-2,6 раза.

3. Использование биометрического метода бутстрепа для поиска отличий между исследуемыми генотипами по агробиологическим и морфологическим данным показало практически идентичные результаты с оценками, полученными критерием Стьюдента, что говорит о взаимозаменяемости использования обоих методов в ампелографических исследованиях.

4. Иммунологическое изучение позволило выявить уровень устойчивости к болезням клонов на фоне контрольных сортов винограда:

- наибольшей устойчивостью к милдью характеризовались клоны Мерло-2 № 49, Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15А и Каберне-Совиньон-15Б;

- наибольшей устойчивостью к оидиуму обладали клоны Мерло-2 № 49 и Мерло-181;

- слабая поражаемость антракнозом была отмечена у клонов Мерло-343 и Мер л о-181, у других генотипов эта болезнь обнаружена не была;

- зуднем повреждались все генотипы, кроме клона Мерло-343;

- листовая форма филоксеры была зафиксирована у всех генотипов, за исключением Мерло-2 № 49, Каберне-Совиньон-15Б и Каберне-Совиньон-5А.

5. Технологическая оценка виноматериалов, приготовленных по красному способу, оказалась выше у клонов, чем у контрольных сортов. При этом лучшими являлись Кабернек - 7,85 балла, Кабсрне-Совиньон-15А - 7,82 балла, Мерло-181 - 7,72 балла, Мерло-2 № 49 -7,63 балла, Данные виноматериалы отличались в течение всего периода изучения нарядной рубиновой окраской, слаженностью в аромате и вкусе и ярко выраженными генотипичсскими особенностями.

6. Использованные в работе по изучению генетического разнообразия популяций Каберне-Совиньон и Мерло 6 микросателлитных маркеров показали различный уровень полиморфизма: от двух до шести аллелей на один микросатсллитный локус; наиболее высокий уровень полиморфизма обнаружен у маркеров УУМ027, У\ГМВ5 и \ZrZag62 - 6, 5 и 5 аллелей по каждому из маркируемых локусов соответственно.

7. На основании данных об аллельных комбинациях выявлено, что каждый из исследуемых генотипов винограда популяций Каберне-Совиньон и Мерло обладает уникальным, свойственным лишь ему набором аллелей, что свидетельствует о наличии отличий между исследуемыми клонами и о том, что микросателлитные маркеры обладают достаточным уровнем полиморфизма для использования их в клоновой идентификации.

8. Анализ полученного в результате кластеризации иерархического дендрита методом ЦРвМА позволил выделить в исследованной популяции Каберне-Совиньона два основных кластера близкородственных генотипов:

- к кластеру номер один отнесены клоны Кабернек и Каберне-Совиньон-169;

- в состав второго вошли клоны Каберне-Совиньон-15А, Кабсрне-Совиньон-217 и Каберне-Совиньон-5А.

В составе же популяции Мерло выделено два основных кластера и 3 дополнительных;

- к кластеру номер один отнесены клоны Мерло-2 № 49 и Мерло-347 (подкластер 1), Мерло-181 и Мерло-343 (подкластер 2);

- в состав второго вошли генетически близкие клоны Мерло-35, Мерло-14 и Мерло (контроль), генетически наиболее отдаленным является генотип Мерло-348.

Подтверждена обоснованность отбора клонов Мерло Грамотенко и Рислиналк, ранее переданных на госиспытания в РФ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ НАУКИ И ПРАКТИКИ

Для повышения эффективности отбора необходимо проводить оценку генетического родства исходного селекционного материала с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров с целью выявления спектра изменчивости виноградных популяций и использования его в клоповой селекции.

В качестве источника улучшения качества виноматериалов и повышения урожайности насаждений рекомендуется использовать следующие генотипы из числа изученных:

- из популяции Мерло клоны Мерло-2 № 49 и Мерло-181;

- из популяции Каберне-Совиньона клон Кабернек, переданный на госиспытание в Российской Федерации в 2005 году, и Каберне-Совиньон-15А.

Клоны Мерло-2 № 49, Мерло-181 и Каберне-Совиньон-15 А как лучшие среди изученных по комплексу бнолого-хозяйственных признаков следует передать на госиспытания и параллельно размножать методами in vitro и зеленого черенкования для освоения их производством в Северо-Кавказском регионе.

Внедрение в производство высокопродуктивных клонов обеспечит повышение рентабельности виноградовинодельческой отрасли и будет способствовать улучшению сортимента винограда за счет расширения набора уникальных натуральных красных сухих вин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Звягин A.C., Трошин Л.П. Паспортизация сортов и клонов винограда // Материалы шестой региональной научно-практической конференции молодых ученых. Научное обеспечение агропромышленного комплекса. - Краснодар, 2004. - С. 116-117.

2. Адаптация методики микросатсллитного анализа для изучения генетического разнообразия сортов винограда Пино белый, Рислинг и их клонов / A.C. Звягин, Л.П. Трошин, Ж.М. Мухина, И.И. Супрун // Новации и эффективность производственных процессов в виноградарстве и виноделии. - Т. I. Виноградарство. - Краснодар, 2005.-С. Ш-117.

3. Звягин A.C., Трошин Л.П. Паспортизация сортов и клонов винограда молекулярно-генетическим методом // Научное обеспечение агропромышленного комплекса. - Краснодар, 2005. - С. 128-132,

4. Итоги изучения сортов и клонов винограда в разных зонах Краснодарского края / Л.П. Трошин, Д.Е. Хлевный, A.C. Звягин, П.П. Подваленко, Т.Н. Гугучкина, А.И, Мисливский // Технологии производства элитного посадочного материала и виноградной продукции, отбора лучших протоклонов. - Краснодар: АлВи-Дизайн, 2005.-С. 96-107.

5. Трошин Л.П., Звягин A.C. Технология отбора лучших протоклонов винограда // Технологии производства элитного посадочного материала и виноградной продукции, отбора лучших протоклонов. - Краснодар: АлВи-Дизайн, 2005. - С. 75-95.

6. Troshin L.P., Zvjagin A. Clone identification of four grapevine varieties // 9tli International Conference on Grape Genetics and Breeding, 26 July 2006. - Udine / Italy. - P. 38.

ЗАЯВКИ НА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Кабернек / Л.П. Трошин, A.C. Звягин, П.П. Подваленко // Заявка № 44001 / 9463945 от 05.12.2005.

2. Рислиналк / Л.П. Трошин, A.C. Звягин, П.П, Подваленко и др. //Заявка №44002/9463946 от05.12.2005.

Подписано в печать 6.10.2006 г. Формат 60x84 X«

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ. л. 1 Заказ Ла 540 Тираж 100' экз.

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044» г. Краснодар, ул. Калинина, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Звягин, Андрей Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Понятие молекулярного маркера и основные типы маркерных систем.

1.2 ДНК-полиморфизм на основе использования различных

• маркерных систем.

1.3 Использование ДНК маркеров в селекции и генетике винограда.

1.4 Основы клоновой селекции.

2. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Исходный материал и методы описания.

2.2 Почвенно-климатические условия района проведения исследований.

2.3 Метеорологические условия в годы наблюдений.

2.4 Подготовка растительного материала и экстракция ДНК.

2.5 Молекулярные маркеры, использованные в работе.

2.6 Проведение полимеразной цепной реакции и электрофореза продуктов амплификации.

2.7 Анализ электрофореграмм. 2.8 Статистическая обработка данных.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Биометрическая оценка морфологических признаков сравниваемых генотипов винограда.

3.2 Анализ агробиологических показателей сравниваемых генотипов винограда.

3.3 Анализ устойчивости сравниваемых генотипов винограда к вредителям и грибным болезням.

3.4 Технологическая оценка вина сравниваемых генотипов винограда.

3.5 Анализ генетического разнообразия сортов и клонов винограда ампелографической коллекции КубГАУ с использованием полиморфизма микросателлитных маркеров.

3.6 Ампелографическое описание исследуемых генотипов винограда.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ. 105 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ

ИСТОЧНИКОВ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда"

С точки зрения генетики виноград как объект исследований является многолетним аллогамным поликарпическим полигетерозиготным вегетативно размножаемым растением, характеризующимся продолжительностью генераций при половом размножении и высоким полиморфизмом. Эти особенности обуславливают широкие возможности к самоопылению, неограниченное вегетативное размножение, легкость скрещивания представителей видов рода УШэ Ь., проявляющийся спонтанный мутагенез (именно поэтому необходима клоновая селекция), плохую всхожесть семян и др. [48, 50].

Именно развитие и применение ДНК-технологий изменяет суть генетики винограда. ДНК-маркеры способствуют исследованию происхождения изучаемых культур и представляют собой мощное средство для идентификации генотипов винограда.

Это связано с тем, что они являются локус-специфичными и кодоминантными, отсюда микросателлитные маркеры позволяют определить взаимосвязь между видами или родами и дают возможность гипотетически определить ареал происхождения самых популярных и важных мировых винных сортов.

В связи с этим в ходе исследований были поставлены следующие задачи:

4. Оценить уровень полиморфизма у клонов и сортов в обеих популяциях на основе использования полиморфизма микросателлитных локусов.

6. Описать исследованные клоны винограда по ампелографической схеме и передать лучшие их них на госиспытания в Российской Федерации.

Научная новизна исследований. Впервые в отечественном виноградарстве с помощью микросателлитных маркеров паспортизированы черноягодные популяции винограда Каберне-Совиньон и Мерло, выполнена оценка генетического родства клонов и их исходных сортов, описаны по ампелографической схеме 4 клона Каберне-Совиньона и 3 клона Мерло.

Основные положения выносимые на зашиту:

1. Оценка изменчивости морфологических признаков листьев клонов у популяций Каберне-Совиньон и Мерло.

2. Сравнение клонов двух черноягодных популяций винограда по агробиологическим и технологическим показателям.

3. Анализ полиморфизма у клонов и сортов обеих популяций.

Научно-практическая ценность работы. Модифи-цированная методика оценки генетической дистанции между клонами и сортами винограда позволила дифференцировать популяции Каберне-Совиньон и Мерло, произрастающие в коллекции учхоза «Кубань» КубГАУ, по комплексу признаков отобран высокопродуктивный клон Каберне-Совиньон-14 и передан на госиспытания в Российской Федерации под названием Кабернек, подтвержден статус ранее переданных на госиспытания клонов Мерло Грамотенко и Рислиналк.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ и поданы две заявки на изобретения.

Заключение Диссертация по теме "Плодоводство, виноградарство", Звягин, Андрей Сергеевич

выводы

В соответствии с полученными результатами диссертационного исследования можно сделать следующие выводы:

1. По морфометрическим признакам выявлено 100%-ное отличие всех клонов винограда от контрольных сортов в обеих популяциях винограда; за исключением клона Мерло-2 № 49, у которого лишь три показателя (длина, углы а и (3 листовой пластинки) оказались одинаковыми с контрольным сортом.

- в популяции Каберне-Совиньон: Каберне-Совиньон-5А, Каберне-Совиньон-15Б, Каберне-Совиньон-15А, Кабернек;

- в популяции Мерло: Мерло-342, Мерло-2 № 49, Мерло-181. При этом во второй популяции было зафиксировано превышение над контрольным сортом у всех клонов по урожайности в 1,5-2,6 раза.

- наибольшей устойчивостью к оидиуму обладали клоны Мерло-2 № 49 и Мерло-181;

- слабая поражаемость антракнозом была отмечена у клонов Мерло-343 и Мерло-181, у других генотипов эта болезнь обнаружена не была;

- зуднем повреждались все генотипы, кроме клона Мерло-343;

5. Технологическая оценка виноматериалов, приготовленных по красному способу, оказалась выше у клонов, чем у контрольных сортов. При этом лучшими являлись Кабернек - 7,85 балла, Каберне-Совиньон-15А - 7,82 балла, Мерло-181 - 7,72 балла, Мерло-2 № 49 - 7,63 балла, Данные виноматериалы отличались в течение всего периода изучения нарядной рубиновой окраской, слаженностью в аромате и вкусе и ярко выраженными генотипическими особенностями.

6. Использованные в работе по изучению генетического разнообразия популяций Каберне-Совиньон и Мерло 6 микросателлитных маркеров показали различный уровень полиморфизма: от двух до шести аллелей на один микросателлитный локус; наиболее высокий уровень полиморфизма обнаружен у маркеров УУМ027, УУМ05 и VrZag62 - 6, 5 и 5 аллелей по каждому из маркируемых локусов соответственно.

8. Анализ полученного в результате кластеризации иерархического дендрита методом ИРОМА позволил выделить в исследованной: популяции Каберне-Совиньона два основных кластера близкородственных генотипов:

- к кластеру номер один отнесены клоны Кабернек :и Каберне-Совиньон-169;

- в состав второго вошли клоны Каберне-Совиньон-15/^, Каберне-Совиньон-217 и Каберне-Совиньон-5А.

В составе же популяции Мерло выделено два основных кластера и 3 дополнительных:

- к кластеру номер один отнесены клоны Мерло-2 № 49 и: Мерло-347 (подкластер 1), Мерло-181 и Мерло-343 (подкластер 2);

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ НАУКИ И ПРАКТИКИ

- из популяции Мерло клоны Мерло-2 № 49 и Мерло-181;

Клоны Мерло-2 № 49, Мерло-181 и Каберне-Совиньон-15А как лучшие среди изученных по комплексу биолого-хозяйственных признаков следует передать на госиспытания и параллельно размножать методами in vitro и зеленого черенкования для освоения их производством в СевероКавказском регионе.

Внедрение в производство высокопродуктивных клонов обеспечит повышение рентабельности виноградо-винодельческой отрасли и будет способствовать улучшению сортимента винограда за счет расширения набора уникальных натуральных красных сухих вин. к

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ТЕРМИНОВ И СОКРАЩЕНИЙ1

Аминокислота — мономер белка, органическое соединение, имеющее в своем составе аминогруппу NH2 и карбоксильную группу СООН.

Аллель (от греческого аа allelon - друг друга, взаимно) - одна из возможных форм одного и того же гена. Аллели расположены в одинаковых участках (локусах) гомологичных (парных) хромосом; определяют варианты развития одного и того же признака, контролируемого данным геном. Новые аллели (их число практически неограниченно) возникают в результате изменения структуры гена - мутации. Свойство гена находиться в различных аллельных состояниях называется аллелизмом. В генетической литературе термин "аллель" употребляют как в мужском, так и в женском роде.

Аллогамия (от греч. alios - другой и gamos - брак) - чуявсеопыление, опыление одного цветка пыльцой с другого цветка. Если цветок расположен на том же растении, то называется гейтоногамией (соседнее опыление), а если на другом растении, то ксеногамией (перекрёстное опыление).

Анализируемый образец — подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Буфер — смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.

Генотип — набор генов, характеризующих конкретный организм.

Дупликация — хромосомная мутация, при которой фрагмент хромосомы удваивается.

Инверсия — хромосомная мутация, при которой фрагмент хромосомы отрывается и вставляется в обратном порядке. т

Кариология — раздел цитологии, изучающий клеточное ядро и его эволюцию.

Кариотип — схема хромосомного набора организма, получаемая в результате специальной обработки клеток, фотографирования и распределения хромосом по порядку.

Кодоминантный — два аллеля кодоминантны, если в гетерозиготном организме они выражаются в равной степени.

Квази-изогенных — Квази. (от лат. quasi — нечто вроде, как будто, как бы), составная часть сложных слов, соответствующая по значению словам: «якобы», «мнимый», isogenic strain - изогенная линия. Линия (группа) особей, характеризующихся идентичными (иногда кроме пола) генотипами: клон <clone>, инбредная гомозиготная линия.

Клон — группа организмов, происшедших от общего предка путем бесполого размножения (например, в результате клеточного деления);

Локус — местоположение гена или регуляторного элемента на хромосоме или на генетической карте.

Маркер — нуклеиновая кислота с мутацией или другой заметной особенностью, используемая для определения положения гена или других генетических элементов.

Полиморфизм — в биологии, наличие в пределах одного вида резко отличных по облику особей, не имеющих переходных форм.

Поликарпия — свойство растений, неоднократно цвести и плодоносить в течение своей жизни. Большинство многолетних растений обладает свойством поликарпии.

Полигетерозиготным — Поли. (от греч. polys — многий, многочисленный, обширный), часть сложных слов, указывающая на множество, всесторонний охват или разнообразный состав. Гетерозигота -биологический объект (клетка или организм), содержащий два различных аллеля в данном локусе гомологичных хромосом.

Популяция — в биологии совокупность особей одного вида, длительно занимающая определенное пространство и воспроизводящая себя в течение большого числа поколений. В современной биологии популяция рассматривается как элементарная единица процесса эволюции, способная реагировать на изменения среды перестройкой своего генофонда.

Праймеры — искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) — смесь из дезоксиаденозинтрифосфата (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) -«строительный материал», используемый Тад-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Транслокация — хромосомная аберрация, при которой часть одной хромосомы присоединяется к другой, не гомологичной ей хромосоме.

Трансгенный организм — организм, геном которого был изменен путем внедрения чужеродного гена.

Филогенез — (рЬу1оп - род, племя), процесс исторического развития мира живых организмов как в целом, так и отдельных групп - видов, родов, семейств, отрядов (порядков), классов, типов (отделов), царств. Ф. изучается в единстве взаимообусловленности с индивидуальным развитием организмов онтогенезом.

Фенотип — совокупность признаков и свойств организма.

Филетическая эволюция — эволюционный процесс, в ходе которого вид постепенно меняет свои признаки. V

1 В кн.: Бартон Г., Энтони Г., Дэвид С., Тара К. Генетика. - Москва: ФАИР -ПРЕСС. - 2004. - 448с.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Звягин, Андрей Сергеевич, Краснодар

1. Амирджанов А.Г., Сулейманов Д.С. Оценка продуктивности сортов винограда и виноградников. Баку, 1986. - С. 20-22.

2. Агапова С.И., Бурдинская В.Ф., Вошедский В.Н. Атлас болезней и вредителей винограда.- Новочеркасск, 2002. С. 3-69.

3. Барышева И.А., Тулаева М.И., Чисников B.C. Исследование внутрисортовой изменчивости ДНК винограда ПДРФ и ПЦР методами // Цитология и генетика. 2003. - Т. 37, № 6. - С. 31-38.

4. Блажний Е.С. Почвы равнинной и предгорно-степной части Краснодарского края. Краснодар: Тр. Кубан. СХИ, 1958. - № 4. - С. 25-28.

5. Вальков В.Ф., Штомпель Ю.А., Трубилин И.Т. Почвы Краснодарского края, их использование и охрана. Ростов на Дону: САНЦ ВШ, 1996. - 56 с.

6. Вердеревская Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда. Кишинев: Штиинца, 1985. - 311с.

7. Глазко В.И. Введение в генетику. Киев, 2003. - С. 226-256.

8. Глотов Н.В. Оценка генетической гетерогенности природных популяций: количественные признаки // Экология. 1983. - № 1. - С. 3-10.

9. Голодрига П.Я. и др. Методические рекомендации по массовой и клоновой селекции винограда. Ялта, 1976. - 31 с.

10. Голодрига П.Я., Дубовенко Н.П., Нилов Н.Г. Методика изучения генофонда винограда по унифицированным матрицам для создания "банка данных". Ялта, 1983. - 12 с.

11. Голодрига П.Я., Суятинов И.А., Трошин Л.П. Современные вопросы клоновой и генетической селекции винограда // Тр. по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1975. - Т. 54, № 2. - С. 101-112.

12. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений // Генетика. 1999. - Т. 35.-С. 1538-1549.

13. Грамотенко П.М. Естественные сортотипы восточной эколого-географической группы сортов винограда (convar. orientaüs Negr.) // Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1975. - Т.54. - С. 156-166.

14. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. Москва: Колос, 1979. - С. 170-220.

15. Драновский В.А., Трошин Л.П. Массовая и фитосанитарная селекция -необходимость современного виноградарства // Виноград и вино России. -1995.-№4.-С. 20-23.

16. Кискин П.Х. Филлоксера. Кишинев: Штиинца, 1977. - 211 с.

17. Клочнева В.И., Трошин Л.П., Шурхал A.B., Ракицкая Т.А., Животовский Л.А. Идентификация видов, сортов и клонов винограда по белкам как маркерам генов (Методические указания). Москва, 1990. - 35 с.

18. Клочнева В.И., Трошин Л.П., Шурхал A.B., Ракицкая Т.А. Межвидовая и внутривидовая изменчивость винограда по аллозимным локусам // Научные труды ВНИИВиПП «Магарач». 1989. - № 9. - С. 109-114.

19. Конарев A.B. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений // Сельскохозяйственная биология. 1998. -№ 5.- С. 3-25.

20. Конарев В.Г. Морфогенез и молекулярно-биологический анализ растений.- Санкт-Петербург: ВИР, 1998. 370 с.

21. Конарев В.Г. Белки как генетические маркеры растений. Москва: Колос, 1983.- 320 с.

22. Лазаревский М.А. Изучение сортов винограда. Ростов-н/Д.: РГУ, 1963.- 150 с.

23. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Мир, 1990. - 352 с.

24. Льюин Б. Гены. Москва: Мир, 1987. - 544 с.

25. Малтабар Л.М. Технология производства привитого посадочного материала. Краснодар, 1983. - ч.1, ч.2. -190 с.

26. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -Москва: Мир, 1984.-480 с.

27. Мелконян M.B. О виноградарстве Франции. Ереван: Айастан, 1976.63 с.

28. Мнацаканян М.К. Влияние густоты посадки и нагрузки виноградного куста на прирост лозы, качество и количество урожая // Труды Арм. НИИ виноградарства, виноделия и плодоовощеводства. 1975. - № 11. - С. 38-66.

29. Никифорова JI.T. Справочник по виноградарству. Киев: Урожай, 1988.-201 с.

30. Никифорова JI.T., Забияко В.А. К вопросу изучения густоты посадки винограда // Садоводство, виноградарство и виноделие Молдавии. 1975. - № 9. -С. 17-19.

31. Остерман JI.А. Методы исследования нуклеиновых кислот. Москва: Наука, 1981.-288 с.

32. Панарина A.M. Изучение изменчивости признаков листа с целью выявления их ценности для ампелографических исследований // Научные труды института "Магарач". 1967. - Т. 16. - С. 167-182.

33. Петрова В.А. Оценка устойчивых сортов и элитных форм винограда для производства игристых вин Молдовы. Ялта, 1991. - 10 с.

34. Рисованная В.И., Полулях A.A. Генетическая изменчивость винограда // Тез. док. 6 Международного симпозиума по селекции винограда. 1994. - 78 с.

35. Рисованная В.И., Трошин Л.П. Анализ фенофонда винограда методами биохимической генетики // Совершенствование сортимента, производство посадочного материала и винограда: Сборник научных трудов КГАУ, 2002. -№ 394.- С. 67-75.

36. Рисованная В.И., Трошин Л.П. Характеристика видов и сортов рода Vitis с использованием молекулярно-генетических маркеров // Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений. 1994. - 56 с.

37. Рисованная В.И., Трошин Л.П., Ракицкая Т.А. Идентификация фенотипов винограда по спектрам изоферментов // Виноград и вино России. -1996.-№4.-С. 14-17.

38. Рисованная В.И., Шурхал A.B. Изучение коллекционных форм винограда по изоферментным признакам // Тез. док. 6 съезда ВОГИС, 1994. 77 с.

39. Саришвили Н.Г. Сборник основных правил, технологических инструкций и нормативных материалов по производству винодельческой продукции.- Москва: Пищепромиздат, 1998. 242 с.

40. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.П. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgare L.) // Генетика. 1997. - T. 33. - С. 53-60.

41. Сиволап Ю.М., Чеботарь C.B., Топчиева Е.А., Корзун В.Н., Тоцкий В.Н. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма сортов Triticum aestivum L. с помощью RAPD- и SSRP-анализа // Генетика. 1999. - Т. 35. - С. 1665-1673.

42. Симакин А.И. Агрохимическая характеристика Кубанских черноземов и удобрения. Москва: Колос, 1979. - 367 с.

43. Смирнов К.В., Малтабар JI.M., Раджабов А.К., Матузок Н.В. Виноградарство. Москва: МСХА, 1998.- 510 с.

44. Созинов A.A. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. Москва, 1985. - 245 с.

45. Суворова Г.Н., Фунатсуки X., Терами Ф. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopyrum Mill., установленное RAPD-анализом //Генетика. 1999. - Т. 35. - С. 1659-1664.

46. Талаш А.И. Проблемы защиты винограда от вредителей и болезней в Краснодарском крае // Ресурсосбережение и экология в адаптивной системе садоводства и виноградарства: Материалы науч. конф. СКЗНИИСиВ, 1999. С. 95-95.

47. Топалэ Ш.Г. Полиплоидия у винограда. К.: Штиинца, 1983. - 215 с.

48. Трошин Л.П. Методология клоновой селекции винограда // Юбилейный тематический сборник научных трудов. Часть 2. ВИНОГРАДАРСТВО. Краснодар, 2001. - С. 92-94.

49. Трошин JI.П. Ампелография и селекция винограда. Краснодар: РИД «Вольные мастера», 1999. - 138 с.

50. Трошин Л.П. Анализ наследственной информации винограда // Виноград и вино России. 1997. - № 1. - С. 17-19.

51. Трошин Л.П., Полулях A.A., Рисованная В.И. Оценка таксономических отношений сортов V.v.s.p. balcanica Negr. и V.v.s.p. meridionali-balcanica Trosh. по морфометрическим признакам листа // Виноград и вино России. 1998. - № 3.- С. 41-42.

52. Трошин Л.П., Радчевский П.П. Сортимент винограда России // Виноделие и виноградарство. 2001. - № 3. - С. 24-25.

53. Трошин Л.П., Рисованная В.И., Полулях А.И. Ампелографические признаки в изучении таксономических отношений сортов Vitis vinifera sativa pontica Negr. // Труды Научного центра виноградарства и виноделия. 1999. - С. 10-12.

54. Трошин Л.П., Рисованная В.И., Полулях A.A. Изменчивость признаков листа сортов винограда Vitis vinifera pontica balcanica Negr. // Виноградарство и виноделие. 1996. - № 1. - С. 15-20.

55. Трошин Л.П., Суятинов И.А., Чупраков М.А. Статистический анализ количественных признаков популяции винограда сорта Рислинг // Пути совершенствования питомниководства и селекционного процесса в виноградарстве. 1986. - С. 77-86.

56. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве // Сельскохозяйственная биология. 1997. - № 5. - С. 3-19

57. Чан В-Т.В. Выделение нуклеиновых кислот из клинических образцов и клеточных культур // Молекулярная клиническая диагностика. Москва: Мир, 1999. - С. 303-328.

58. Чан В-Т.В. Гибридизация нуклеиновых кислот// Молекулярная клиническая диагностика. Москва: Мир, 1999. - С. 375-394.

59. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика. -Москва: Мир, 1999. С. 395-427.

60. Янковский Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива // Соросовский образовательный журнал. 1996. - № 2. - С. 21-27.

61. Adam-Blondon A.F., Roux С., Claux D., Butterlin G., Merdinoglu D. and This. Mapping 245 SSR markers on the Vitis vinifera genome: a tool for grape genetics // Theor. Appl. Genet. 2004. - V. 109, № 5. - P. 1017-27.

62. Alleweldt G., Spiegel-Roy P. and Reisch B. Grapes (Vitis). In: Moore J. N. and J. R. Ballington (Eds.): Genetic Resources of Temperate Fruit and Nut Crops // Acta Hortic. 1990. - V. 290. - P. 291-337.

63. Alleveldt G., Dettweiler E. A model to differentiate grapevine cultivars with the aid of morfological characteristics // Rivista di Viticultura e di Enologia. -1989.-V. l.-P. 59-63.

64. Bauer F. and Zyprian E. Identification of grapevine rootstock cv. Borner and differentiation of 125 AA from 5 BB and S04 // Vitis. 1997. - V. 36. - P. 185189.

65. Bellin D., Velasco R. and Grando M. S. Intravarietal DNA polymorphisms in. grapevine (Vitis vinifera L.) // Acta horticulture. 2001. - V. 546. - P. 343-349.

66. Benin M., Gasquez J., Mahfoudi A. and Bessis R. Caractérisation biochimique des cépages de Vitis vinifera L. par électrophorèse d' isoenzymes foliaires: essai de classification des variétés // Vitis. 1988. - V. 27. - P. 157-172.

67. Benter T., Papadopoulos S., Pape M., Manns M. and Poliwoda H. Optimization and reproducibility of random amplified polymorphic DNA in human // Anal. Biochem. 1995. - V. 230. - P. 92-100.

68. Boccacci P., Marinoni D. T., Gambino G., Botta R. and Schneider A. Genetic Characterization of Endangered Grape Cultivars of Reggio Emilia Province // Am. J. Enol. Vitic. 2005. - V. 56, № 4. - P. 411- 416.

69. Borrego J., Rodriguez M.T., Martin J., Chavez J., Cabello F. and Ibanez J. Characterization of most important Spanish grape varieties through Isozyme and microsatellite analysis // Acta Horticulturae Belgium. 2001. - P. - 371-375.

70. Bourquin J.-C., Otten L. and Walter B. PCR-RFLP analysis of Vitis, Ampelopsis and Parthenocissus and its application to the identification of rootstocks // Vitis. 1995. - V. 34, № 2. - P. 103-108.

71. Bourquin J.-C., Otten L. and Walter B. Identification of grapevine root-stocks by RFLP // C.-R. Acad. Sci. Paris, Ser. III. 1991. - V. 312. - P. 593-598.

72. Bourquin J.-C., Sonko A., Otten L. and Walter B. Restriction fragment length polymorphism and molecular taxonomy in Vitis vinifera L // Theor. Appl. Genet. 1993. - V. 87. - P. 31- 438.

73. Bourquin J.-C., Tournier P., Otten L. and Walter B. Identification of sixteen grapevine rootstocks by RFLP and RFLP analysis of nuclear DNA extracted from the wood//Vitis. 1992.-V. 31.-P. 157-162.

74. Botta R., Schneider A., Akkak A., Scott N. and Thomas M.R. Within grapevine cultivar variability studied by morphometrical and molecular marker based techniques // Acta Hortic. 2000. - V. 528. - P. 91-96.

75. Botta R., Scott N.S., Eynard I., Thomas M.R. Evaluation of microsatellite sequence-tagged site markers for characterizing Vitis vinifera cultivars // Vitis. -1995.-V. 34.-P. 99-102.

76. Bowers J.E., Dangl G.S. and Meredith C.P. Development and characterization of additional microsatellite DNA markers for grape // Am J Enol Vitic. 1999. - V. 50, № 30. - P. 243-246.

77. Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R. and Meredith C.P. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.) // Genome. 1996. - V. 39. - P. 628-633.

78. Bowers J.E. and Meredith C.P. Comparison of RFLP, AFLP and SSR markers for analyzing phenetic relationships among cultivars of Vitis vinifera // Plant & Animal Genome V Conference. 1997. - P. 39.

79. Buscher N., Zyprian E. and Blaich R. Identification of grapevine cultivars by DNA analysis: Pitfalls of random amplified polymorphic DNA techniques using lOmer primers // Vitis. 1993. - V. 32. - P. 187-188.

80. Calo A., Costacurta A., Paludetti G., Calo G., Aruselkar S., Parfit D. The use of isoenzyme markers to characterize grape cultivars // Rivista Vitic. Enol. -1989.-V. 42, № l.-P. 15-22.

81. Carole P.M. Grapevine Genetics: Probing the Past and Facing the Future // Agriculturae Conspectus Scientificus. 2001. - V. 66, № 1. - P. 21-25.

82. Castiglioni P., Pozzi C., Heun M., Terzi V., Muller K. J., Rohde W. and Salamini F. An AFLP-Based Procedure for the Efficient Mapping of Mutations and DNA Probes in Barley // Genetics. 1998. - V. 149. - P. 2039-2056.

83. Chen J., Lamikanra O., Chang C. J. and Hopkins D. L. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of Xylella fastidiosa: Pierce's disease and oak leaf scorch pathotypes // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 1688-1690.

84. Chen M., Presting G., Barbazuk W.B. et al. An integrated physical and genetic map of the rice genome // The Plant Cell. 2002. - V. 14. - P. 537-545.

85. Chin E.C.L., Senior M.L., Shu H. Maize simple repetitive DNA sequences: abundance and allele variation // Genome. 1996. - V.39. - P. 866-873.

86. Collins G.G. and Symons R.H. Polymorphisms in grapevine DNA detected by the RAPD PCR technique // Plant Mol. Biol. Rep. 1993. - V. 11. - P. 105-112.

87. Crespan M., Botta R. and Milani N. Molecular characterization of twenty seeded and seedless table grape cultivars (Vitis vinifera L.) // Vitis. 1999. - V. 38. -P. 87-92.

88. Crespan M. and Milani N. The Muscats: A molecular analysis of synonyms, homonyms and genetic relationships within a large family of grapevine cultivars // Vitis. 2001. - V. 40.-P. 23-30.

89. Dangl G.S., Mendum M.L., Prins B.H., Walker M.A., Meredith C.P. and Simon C.J. Simple sequence repeat analysis of a clonally propagated species: A tool for managing a grape germplasm collection // Genome. 2001. - V. 44. - P. 432-438.

90. Debener T., Janakiram T. and Mattiesch L. Sport and seedlings of rose varieties analysed with molecular markers // Plant Breeding. 2000. - V. 119. - P. 7174.

91. Delseny M., Laroche M. and Penon P. Detection of sequences with Z-DNA forming potential in higher plants // Biochem. Bioph. Res. Commun. 1983. - V. 116. -P. 113-120.

92. Di Gaspero G., Peterlunger E., Testolin R., Edwards K.J. and Cipriani G. Conservation of microsatellite loci within the genus Vitus // Theor. Appl. Genet. -2000.- V. 101.-P. 301-308.

93. Diwan N. and Cregan P.B. Automated sizing of fluorescent-labeled simple sequence repeat (SSR) markers to assay genetic variation in soybean // Theor. Appl. Genet. 1997. - V. 95. - P. 723-733.

94. Dudley J.W. Molecular markers in plant improvement-manipulation of genes affecting quantitative traits // Crop science. 1993. - V. 33. - P. 660-668.

95. Eiras-Dias J.E., Sousa S., Cabral F. and Carralho I. Isoenzymatic characterization of Portuguese vine varieties of Vitis vinifera L. // Rivista Vitic. Enol. 1989. - V. 42, №1.-P. 23-26.

96. Franks Т., Botta R. and Thomas M.R. Chimerism in grapevine: Implications for cultivar identity, ancestry and genetic improvement // Theor. Appl. Genet. 2002. - V. 104. - P. 192-199.

97. Francois L., Marianna M., Gorislavets S.S, Risovannaya V. and Troshin ^ L. Genetic profiling of Moldavian, Crimean and Russian cultivars of Vitis Vinifera L.with nuclear microsatellite markers // Тезисы IV международной конференции. -2003.-С. 25.

98. Garaglio P.G. Enciclopedia vifivinicola mondiale La vifi eil vinonella legenda, nelle fradizioni e nella sforin // Enciclopedia vifivinicola mondiale. 1973. -P. 11-18.

99. Gogorcena Y., Arulsekar S., Dandekar A.M. and Parfitt D.E. Molecular markers for grape characterization // Vitis. 1993. - V. 32. - P. 183-185.

100. Gonzalez A., Jubany S., Ponce I. De Leon., Dellacassa E., Carrau F.M., Hinrichsen P. and Gaggero C.A. Molecular diversity within clones of cv. Tannat (Vitis vinifera) // Vitis. 2004. - V. 43, № 4. - P. 179-185.

101. Goto-Yamamoto N. Phenetic clustering of grapes (Vitis spp.) by AFLP analysis // Breed. Sci. 2000. - V. 50, № 1. - P. 53-57.

102. Grando M.S. and Frisinghelli C. Grape microsatellite markers: Sizing of DNA alleles and genotype analysis of some grapevine cultivars // Vitis. 1998. - V. 37.-P. 79-82.

103. Guerra B. and Meredith C.P. Comparison of Vitis berlandieri x Vitis riparia rootstock cultivars by restriction fragment length polymorphism analysis // Vitis. 1995. - V. 34, № 2. - P. 109-112.

104. Jansen R.C., Geerlings H.A., Oeveren J.V. and Van Schaik R.C.A. Comment on Codominant Scoring of AFLP Markers // Genetics. 2001. - V. 158. -P. 925-926.

105. Jean-Jacques I., Defontaine A. and Hallet J.N. Characterization of Vitis vinifera cultivars by random amplified polymorphic DNA markers // Vitis. 1993. -V. 32.-P. 189-190.

106. Hill M., Witsenboer H., Zabeau Vos P., Kesseli R. and Michelmore R. Polymerase chain reaction based fingerprinting using AFLPs as a tool for studying genetic relationships in Lactuca sp // Theor. Appl. Genet. 1996. - V. 93. - P. 12021210.

107. Imazio S., Labra M., Grassi F., Winfield M., Bardini M. and Scienza A. Molecular tools for clone identification: the case of the grapevine cultivar Traminer // Plant Breeding. 2002. - V. 121. - P. 531-535.

108. Kalendar R., Grab T., Regina M., Suoniemi A. and Schulman A.H. IRAP and REMAP: Two new retrotransposonbased DMA fingerprinting techniques // Theor Appl Genet. 1999. - V. 98. - P. 704-711.

109. Kang H.W., Cho Y.G., Yoon U.H. and Eun M.Y. A rapid DNA extraction method for RFLP and PCR analysis from a single dry seed // Plant. Mol. Biol. 1998. -V. 16.-P. 90.

110. Karp A., Ingram. D.S. and Isaac P. Molecular Tools for Screening Biodiversity // Chapman and Hall. 1998. - P. 195-201.

111. Kurata N., Umehara Y., Tanoue H. and Sasaki T. Physical mapping of the rice genome with YAC clones // Plant. Mol. Biol. 1997. - V. 35. - P. 101-113

112. Lahogue F., This P. and Bouquet A. Identification of a codominant SCAR marker linked to seedlessness character in grapevine // Theor. Appl. Genet. 1998. -V. 97, № 5-6. - p. 950-959.

113. Lagercrantz U., Ellengren H. and Andersson L. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plant and vertebrates // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21, № 5. - P. 1111-1115.

114. Lamboy W.F. and Alpha C.G. Using simple sequence repeats (SSRs) for DNA fingerprinting germplasm accessions of grape (Vitis L.) species // J. Am. Soc. Hort. Sci. 1998. - V. 123. - P. 182-188.

115. Lefort F. and Roubelakis-Angelakis К.A. Genetic Comparison of Greek Cultivars of Vitis vinifera L. by Nuclear Microsatellite Profiling // Am. J. Enol. Vitic. -2001.- V. 52, № 2. P. 101-108.

116. Lefort F., Anzidei M., Roubelakis-Angelakis K.A. and Vendramin G.G. Characterization of grapevine with universal chloroplast microsatellite markers, 6th Intern. Symposium on Grapevine Physiology and Biotechnology // Book of abstracts. 2000. - P. 200.

117. Liao X.R., Zhu X.C. and He P.C. Application of seed protein components in cluster analysis of Chinese Vitis plants // J. Hort. Sci. 1997. - V. 72. - P. 109-115.

118. Litt M. and Luty J.A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene // Am.J.Hum.Genet. 1989. - V. 44. - P. 388-396.

119. Lopes M.S., Sefc K.M., Eiras D.E., Steinkellner H., Laimer da Camara Machado M. and A. da Camara Machado. The use of microsatellites for germplasm management in a Portuguese grapevine collection // Theor. Appl. Genet. 1999. - V. 99. - P. 733-799.

120. Ma Z.Q., Roder M. and Sorrells M.E. Frequencies and sequence characteristics of dinucleotide, trinucleotide, and tetra-nucleotide microsatellites in wheat // Genome. 1996. - V. 39. - P. 123-130.

121. Maletic E., Sefc K.M., Steinkellner H., Kontic J.K. and Pejic I. Genetic characterization of Croatian grapevine cultivars and detection of synonymous cultivars in neighboring region // Vitis. 1999. - V. 38. - P. 79-83.

122. Manninen O., Kalendar R., Robinson J. and Schulman A.H. Application of BARE -1 retrotransposon markers to the mapping of a major resistance gene for net blotch in barley // Mol. Gen. Genet. 2000. - V. 264. - P. 325-334.

123. Martinez-Zapater J.M., Cabezas J.A. and Cervera M.T. AFLPs in genetic identification and genome analysis of grapevines // Acta Hort. 2000. - V. 528, № 1. -P. 105-111.

124. Meredith C.P., Bowers J.E., Riaz S., Handley V., Bandman E.B. and Dangl G.S. The identity and parentage of the variety known in California as 'Petite Sirah' // Amer. J. Enol. Vitic. 1999. - V. 50. - P. 236-242.

125. Mohan M., Nair S., Bhagwat A., Krishna T.G., Yano M., Bhatia C.R. and Sasaki T. Genome mapping, molecular marker and marker-assisted selection in crop plants // Molecular Breeding. 1997. - V. 3. - P. 87-103.

126. Moreno S., Martin J.P. and Ortiz J.M. Inter-simple sequence repeats PCR for characterization of closely related grapevine germplasm // Euphytica. 1998. - V. 101.-P. 117-125.

127. Morgante M. and Olivieri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics // The Plant J. 1993. - V. 3. - P. 175-182.

128. Muhammad A.L., Reisch I.B. and Norman F. Weeden. Genetic linkage maps of Vitis and QLT detection by interval mapping // Plant Genome II Conference. 1994.-NY. 14456.

129. Muhammad A.L., Guang-Ning Ye, Norman F. W. and Reisch I.B. A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species // Plant Molecular Biology Reporter. 1994. - V. 12, № 1. - P. 6-13.

130. Murray M.G. and Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA //Nucleic Acids Research. 1980. - V. 10. - P. 4321-4325.

131. Parfitt D.E. and Arulsekar S. Inheritance and isoenzyme diversity for GPI and PGM among grape cultivars // J. Am. Sci. Hort. Sci. 1989. - V. 114. - P. 486491.

132. Patrick P. and Jean B. Molecular genetic diversity of the French-American grapevine hybrids cultivated in North America // Genome/Genome. 2003. - V. 46, №6.-P. 1037-1048.

133. Perret M., Arnold C., Gobat J.-M. and Kupfer P. Cultivated grapevanes (Vitis vinifera L.) in central Europe based on microsatellite markers // In: Proceedings of VII International symposium on Grapevine Genetics and Breeding.-2001.-V. 531.-P. 155-159.

134. Reich B.I. Molecular markers: The foundation for grapevine genetic mapping, DNA fingerprinting and genomics. Proc. 7th Intern. Symp. Grapevine Genetics and Breeding. // Book of abstracts. 1998. - P. 56.

135. Regner F., Sefc K., Stadlbauer A. and Steinkellner H. Genetic markers for the identification of varieties and clones as a guarantee of quality // Acta Hortic. -1998.-V. 473.-P. 49-61.

136. Regner F., Stadlbauer A. and Eisenheld C. Molecular markers for genotyping grapevine and for identifying clones of traditional varieties // ISHS Acta Horticulture. 2000. - I.N.546

137. Rossetto M., Mcnally J. and Henry R.J. Evaluating the potential of SSR flanking regions for examining taxonomic relationships in the Vitaceae // Theor. Appl. Genet. 2002. - V. 104. - P. 61-66.

138. Rychlik W., Spencer W.J. and Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18, № 21.-P. 6409-6412.

139. Saji S., Umehara Y., Baltazar A.A., Yamane H. and Tanoue H. A physical map with yeast artificial chromosome (YAC) clones covering 63 % of the 12 rice chromosomes // Genome. 2001. - V. 44. - P. 32-37.

140. Sanchez-Escribano E.M., Martin J.P., Carreno J. and Cenis J.L. Use of sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars // Genome. 1999. - V. 42. - P. 87-93.

141. Sasaki T. The progress in rice genomics // Euphytica. 2001. - V. 118.-P. 103-111.

142. Scott K.D., Abblet E.M., Lee L.S. and Henry R.J. AFLP markers distinguishing an early mutant of Flame Seedless grape // Euphytica. 2000. - V. 113. - P.245-249.

143. Scott K.D., Eggler P., Seaton G. and Rossetto M. Analysis of SSRs derived from grape ESTs // Theor. Appl. Genet. 2000. - V. 100. - P. 723-726.

144. Schaeffer H. Enzympolymorphismus in Rebenblaettern // Phytochemistry. -1971.-V. 10.-P. 2601-2607.

145. Schlotterer C. and Soller M. Polymorphism and locus-specific effects on polymorphism at microsatellite loci in natural Drosophila melanogaster populations // Genetics. 1997. - V. 146. - P. 309-320.

146. Sefc K.M., Lefort F., Grando M.S., Scott K.D., Steinkellner H. and Thomas M.R. Microsatellite markers for grapevine: a state of the art // Molecular Biology and Biotechnology of Grapevine. 2001. - P. 433-463.

147. Sefc K.M., Regner F., Tureschek E., Glossl J. and Steinkellner. H. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their application for genotyping of different Vitis species // Genome. 1999. - V. 42. - P. 367-373.

148. Sefc K.M., Regner F., Tureschek E., Glossl J. and Steinkellner. H. Genotyping of grapevine and rootstock cultivars using microsatellite markers // Vitis.- 1998.-V. 37.-P. 15-20.

149. Sefc K.M., Steinkellner H., Wagner H.W., Glossl J. and Regner. F. Application of microsatellite markers for parentage studies in grapevine // Vitis. -1997.-V. 36.-P. 179-183.

150. Sensi E., Vignani R., Rohde W. and Biricotti S. Characterization of genetic biodiversity with Vitis vinifera L. Sangiovese and Colorino genotypes by AFLP and ISTR DNA marker technology // Vitis. 1996. - V. 35. - P. 183-188.

151. Sneath P.H.A. and Sokal R.R. Numeral Taxonomy // The Principles and Practice of Numerical Classification. 1973. - V. 1. - P. 573.

152. Stavrakakis M.N. and Biniari K. Genetic study of grape cultivars belonging to the Muscat family by random amplified polymorphic DNA markers // Vitis. 1998.-V. 37.-P. 119-122.

153. Stavrakakis M.N. and Loukas. M. The between -and within- grape-cultivars genetic variation // Sci. Hort. 1983. - V. 19. - P. 321-334.

154. Striem M.J., Spiegel-Roy P., Ben-Hayyim G., Beckmann J. and Gidoni D. Genomic DNA fingerprinting of Vitis vinifera by the use of multi-loci probes // Vitis.- 1990.-V. 29.-P. 223-227.

155. Tautz D. Notes on the definition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences. In: DNA fingerprinting, State of the art, S.DJ. Pena S.D.J., Chakraborty R., Epplen J.T., and Jeffreys A.J., (Eds) // Birkhauser Verlag, Basel. -1993.-P. 21-28.

156. Tautz D., Trick M. and Dover G. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation // Nature. 1986. - V. 322. - P. 652-653.

157. This P., Cuisset C. and Boursiquot J.M. Development of stable RAPD markers for the identification of grapevine rootstocks and the analysis of genetic relationships // Am. 6J. Enol. Vitic. 1997. - V. 48. - P. 492-501.

158. This P., Lahogue F., Adam-Blondon A.F., Doligez A. and Bouquet A. Towards marker-assisted selection for seedlessness in grapevine // Acta Hort. 2000. -V. 528, № l.-P. 221-229.

159. Thomas M.R., Matsumoto S., Cain P. and Scott N.S. Repetitive DNA of grapevine: classes present and sequences suitable for cultivar identification // Theor. Appl. Genet. 1993. - V. 86. - P. 173-180.

160. Thomas M.R. and Scott N.S. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence-tagged sites (STSs) // Theor. Appl. Genet. 1993. - V. 86. - P. 985-990.

161. Thomas M.R., Scott N.S., Botta R. and Kijas J.M.H. Sequence-tagged site markers in grapevine and citrus // Journal of the Japanese Society for Horticultural. -1998.-V. 67.-P. 1189-1192.

162. Tschammer J. and Zyprian E. Molecular characterization of grapevine cultivars of Riesling-type and of closely related Burgundies // Vitis. 1994. - V. 33. -P. 249-250.

163. Vignani R., Scali M., Masi E. and Cresti M. Genomic variability in Vitis vinifera L. „Sangiovese" assessed by microsatellite and nonradioactive AFLP test // Electr. J. Biotechnol. 2002. - V. 5. - P. 1-11.

164. Vos P.R. and Hogers J. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting // Nucl. Acids Res. 1995. - V. 23. - P. 4407-4414.

165. Umehara Y., Inagaki A., Tanoue H., Yasukochi Y. and Nagamura Y. Construction and characterization of a rice YAC library for physical mapping // Molecular Breeding. 1995. - V. 1. - P. 79-89.

166. Walter T.W., Posluszny U. and Kevan P.G. Isoenzyme analysis of the grape (Vitis) //1. A practical solution. Can. J. Bot. 1989. - V. 67. - P. 2894-2899.

167. Wang Z., Weber J.L., Zhong G. and Tanksley S.D. Survey of plant short tandem repeats // Theor.Appl. Genet. 1994. - V. 88. - P. 1-6.

168. Weber J.L. Human DNA polymorphism and methods of analysis // Curr. Opin. Biotechnology. 1990. - V. 1. - P. 166-171.

169. Xu H. and Bakalinsky A.T. Identification of grape (Vitis) rootstocks using sequence characterized amplified region DNA markers // Hort. Science. 1996. - V. 32. - P. 267-268.

170. Ye G.N., Soylemezoglu G., Weeden N.F., Lamboy W.F., Pool R.M. and Reisch B.I. Analysis of the relationship between grapevine cultivars, sports and clones via DNA fingerprinting // Vitis. 1998. - V. 37. - P. 33-38.

171. Zhang Q., Liu K.D., Yang G.P. and Saghai M.M.A. Molekularmarker diversity and hybrid sterility in indica-japonica rice crosses // Theor. Appl. Genet. -1997.-V. 95.-P. 112-118.

172. Zietkiewicz E., Rafalski A. and Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. - V. 20. - P. 176-183.

Информация о работе

Звягин, Андрей Сергеевич
кандидата биологических наук
Краснодар, 2006
ВАК 06.01.07

Диссертация

Изучение полиморфизма черноягодных популяций винограда - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы