Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфные маркеры ДНК для ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфные маркеры ДНК для ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна"

Российская академия медицинекии на_ук Медико-генетический научный центр

На правах рукописи ПОЛЯКОВ Александр Владимирович

УДК. 575.174.015.3:616.056.7

"ПОЛИМОРФНЫЕ МАРКЕРЫ ДНК ДЛЯ ДНК-ДИАГНОСТИКИ МИОДИСТРОФИИ ДЮШЕННА."

03.00.15 "Генетика"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1392

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики медико-генетического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

О.В Евграфов

Официальные оппоненты: кандидат медицинских наук,

В.Ф Ситников

доктор биологических наук В.Н. Калинин

Ведущая организация: гематологический научный центр РАМН, Москва.

Зашита диссертации состоится "_"_1332 г.

в_часов на заседании Специализированного совета Д 001

16. 01 по адресу: Москва, 115478, Москворечье, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН

Автореферат разослан "_"_1392 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета Л.Ф. Курило.

доктор биологических наук

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена изучению и поиску полиморфных л оку сов ДНК, пригодны:-! для проведения ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна.

Актуальность темы В настоящее время разработаны технологии, позволяющие использовать полиморфные локусы ДНК для проведения ДНК-диагностики ряда наследственных заболеваний человека. Актуальной задачей является исследование эффективности имеющийся и поиск дополнительных полиморфных маркеров, сцепленных с геном, ответственным за возникновение миодистрофии Дюшенна. Миодистрофия Дюшенна - наиболее частое К-сцепленное рецессивное заболевание (йа^аагс!, 1936), которое встречается приблизительно у одного из 2500-4000 новорожденны:-: мальчиков и приводит к летальному исходу в возрасте до 20 лет [Егпегу, 1387). Обнаружение новых полиморфных маркеров позволяет разработать более эффективные и точные методики Д НК-диагностики заболевания.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлись изучение и поиск полиморфных маркеров ДНК в районе гена, ответственного за возникновение миодистрофии Дюшенна. При этом ставились следующие основные задачи:

Провести анализ популяционных частот аллелей полиморфных маркеров, тесно сцепленных с локусом МДД.

Исследовать эффективность применения маркеров, тесно сцепленных с локусом МДД, при проведении ДНК-диагностики этого заболевания. На основе полученных данных выбрать наиболее ■«формативные маркеры и оптимизировать схему проведения косвенной ДНК-диагностики заболевания.

Разработать простой метод регистрация полиморфизма токуса рЕВТ87-1 /Муа I внутри гена дистрофина путем амплификации ; последующей рестрикцией.

Провести поиск полиморфизма длины рестрикцмонных фрагментов в 5" концевой области гена днстрофина.

Научная новизна. В ходе данной работы проведена оценка топуляционных частот эллелей ряда полиморфных маркеров, тесно

сцепленных с локусом МДД для контингента исследованных семей. Впервые определена первичная последовательность ДНК большей части зонда рЕЯТ87-1 и разработана методика проведения косвенной ДНК-диагностики МДД с использованием полиморфизма данного локуса на основе ПЦР.

Показано отличие в популяции нашей страны последовательности ДНК 5' концевой области гена дистрофина от последовательности клонированной кДНК (Коегид е1 а1, 1987) и ее соответствие, геномной версии (К1ати1 е1 а1,1989).

Практическая ценность работы. Данные, полученные в ходе работы позволяют оптимизировать проведение ДНК-диагностики МДД и увеличивают информативность метода ПЦР с последующей рестрикцией при проведении ДНК-диагностики этого заболевания. Сформулирована стратегия проведения косвенной диагностики МДД с использованием изученных полиморфных маркеров. Применение полученных результатов позволяет повысить эффективность косвенной ДНК-диагностики заболевания и снизить ее стоимость.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 1-ом и 2-ом Всесоюзных симпозиумах "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Москва, 1990; Самарканд 1991); II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата. -1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы и 17 рисунков. Список литературы включает 131 работу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения ДНК использовали венозную кровь пациентов и членов их семей. Работа была выполнена на образцах ДНК людей, являющихся пациентами Центра нервно-мышечных заболеваний г. Москвы и РНИЦПАиГ МЗ РСФСР.

Зонды для ДНК-диагностики методом ПДРШ были получены нами от зарубежных коллег: 754, Р20 (любезно предоставлены доктором Баккером). XJ1.1 (любезно предоставлен доктором Рэем), pERT87-15, pERT87-8 и pERT87-1 (любезно предоставлены доктором Кункелем).

ДНК из крови выделяли методом, предложенным Линдблумом иХолмундом (Lindblom and Holmlund. 1388). Выход ДНК составлял 25 - 50 мкг на 1 мл кроем.

При проведении блот-гибридизации 10 мкг ДНК человека рестрицировали в объеме 20-30 мкл с пятикратным избытком рестриктазы и проводили электрофорез в 0,7% агарозном геле, 1л ТВЕ. Для переноса ДНК из геля на фильтр Hybond N использовали метод вакуумного блоттинга.

Для мечения уникального зонда из генома человека использовали меченный по Р32 dCTP производства Anrtersham или отечественный с удельной активностью 3000 Кю/ммоль. Мечение проводили методом случайных затравок, при этом использовали набор Multiprime, производства Amersham и стандартные протоколы Фирмы. Для нерадиоактивного мечения уникального зонда из генома человека использовали стандартный набор фирмы Boehringer "DNA labelling and defection kit nonradioactive" и протоколы, рекомендованные фирмой. Гибридизацию с радиоактивно и нерадиоактивно меченными зондами проводили в пакете.

Полимеразную цепную реакцию проводили при помощи программируемого терм о ц и к л е р а РНС - 2 фирмы Teehne с использованием термофильной ДНК-полимеразы Tetmus termophilus производства института ядерной физики АН СССР г. Ленинграда или термофильной ДНК-полимеразы Termus aquaticus производства института прикладной энзимологии "ШерменТас" г. Вильнюса. ПЦР проводили по следующей схеме: 0.1 - 1 мкг геномной ДНК, 0.05 мкМ каждого олигопраймера. 200 мкМ каждого

дезоксинуклеозидтрифосфата в 50 мкл однократного буфера для ПЦР прогревали в течение 10 мин. при 95 С, добавляли 1 - 2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 40 - 60 мкл вазелинового масла и проводили 17 циклов с требуемыми для данной пары параметрами. Затем под вазелиновое масло в водную Фазу

добавляли 1-2 единицы термофильной ДНК-лолимерззы и праймеры до концентрации 0.5 мкМ каждого и проводили еще 15 циклов с теми же параметрами и финальную инкубацию при 68 С б течение 8 мин. В случае необходимости обнаружения ПДРФ внутри амплифицированного Фрагмента после проведения ПЦР отбирали 20 мкл реакционной смеси, доводили содержание солей до необходимых величин и обрабатывали 5 единицами требуемой рестриктазы в течение 2 часов или в течение ночи. Результаты эксперимента оценивали в 2 - 3 % агарозном геле или в 6 - 12 % ПААГ.

Результаты молекулярно-генетического анализа использовали для оценки генетического риска, которую проводили методом расчета правдоподобий, в ряде случаев использовали разработанную в лаборатории компьютерную программу "Генриск" (Евграфов, Лавренов, 1990).

При проведении клонирования ДНК в фагах М13гпр18 и М13тр19 необходимые фрагменты ДНК элюировали из 0.8 % легкоплавкого агарозного геля, содержащего бромистый этидий в концентрации 1 мкгЫл {Маниатис и др., 1984). Для анализа рекомбинантных Фаговых клонов использовали быстрый метод выделения репликативной формы ДНК фага М13 в малых количествах (ОгЯерр, 1389):

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Сравнительный анализ эффективности полиморфных маркеров при проведении ДНК-диагностики МДД.

Современные методы косвенной ДНК-диагностики наследственных заболеваний опираются на использование тесно сцепленных с локусом заболевания анонимных геномных полиморфных маркеров. Наиболее часто используются маркеры, выявляющие ПДРФ по той или иной рестриктазе. Они имеют различную эффективность при проведении ДНК-диагностики, которая определяется следующими критериями: методом регистрации аллелей маркера (блот-гибридизация или

амплификация); частотой рекомбинаций между маркерным л оку сом и повреждением в гене; частотами аллелей, выявляемых зондом.

Нами проанализирована эффективность 6 полиморфных маркеров, тесно сцепленных с геном дистрофина: 754, Р20, ХЛ.1, рЕР.Т87-15, рЕПТ87-8 и рЕЯТ37-1. Для анализа использовали образцы ДНК членов 51 семьи со случаями МДД из различных регионов Советского Союза. Ни для одного из используемых зондов не было обнаружено не описанных ранее аллелей. Полиморфизм наблюдался для всех маркеров.

Регистрацию аллелей маркеров проводили двумя методами: блот-гибридизацией или амплификацией. С зондами 754,ХЛ.1 и Р20 проводили блот-гибридизацию, а для обнаружения полиморфизма внутри локусов рЕПТ37-15, рЕЯТ87-8 и рЕЯТ87-1 проводили полимеразную цепную реакцию с последующей рестрикцией.

С использованием полиморфизма 754^1 I методом блот-гибридизации были проанализированы образцы ДНК 14 женщин, 5 из них были гетерозиготны по данному локусу, проведено 6 диагностик носительства МДД. С использованием полиморфизма ХЛ.1/Тао I ■ проанализированы образцы ДНК Э женщин, 4 были гетерозиготны по данному локусу, проведено 2 диагностики носительства заболевания.

Использованный в данном случае метод блот-гибридизации достаточно трудоемок и сложен, связан с поставками радиоактивно меченных аналогов предшественников ДНК, что налагает определенные технические ограничения на применимость метода для целей практической ДНК-диагностики.

Существующие коммерческие наборы позволяют регистрировать уникальные фрагменты ДНК в геноме человека при блот-гибридизации с использованием нерадиоактивно меченных геномных зондов. Этот вариант метода блот-гибридизации лишен недостатков, возникающие при работе с быстро распадающимся радиоактивным изотопом, но его чувствительность несколько ниже, и он не получил широкого применения при проведении ДНК-диагностики. Нами достигнута высокая воспроизводимость метода блот-гибридизации с использованием нерадиоактивно меченных зондов, позволяющая применять его для диагностических целей. На Г 5

Рис. 1 представлен результат ДНК-диагностики МДД, проведенной методом блот-гибридизации с использованием нерадиоактивно меченного зонда Р20, для которого наблюдается полиморфизм длины рестрикционных фрагментов рестриктазы Мер I. С использованием данного полиморфного маркера проанализированы образцы ДНК 11 женщин, 6 из них были информативны по данному локусу, проведено 2 диагностики носите л ьства МДД.

Метод полимеразной цепной реакции значительно проще и дешевле метода блот-гибридизации, требует меньшего количества материала и времени для проведения ДНК-диагностики. Результаты анализа регистрируются непосредственно в ПААГ или агарозном геле. Однако, он требует знания первичной последовательности ДНК около полиморфного сайта узнавания рестриктазы, что является наиболее важным ограничением, сдерживающим применение ПЦР при проведении ДНК-диагностики.

На Рис. 2 представлен результат пренатальной ДНК-диагностики МДД, проведенной методом амплификации с последующей рестрикцией с использованием полиморфизма рЕИТ87-15/Ват Н1. Этим методом проанализированы образцы ДНК 39 женщин, гетерозиготность выявлена у 13, проведено 6 пренатальных диагностик МДД и 9 диагностик носительства данного заболевания.

С методической точки зрения лучшим для проведения ДНК-диагностики является метод ПЦР с последующей рестрикцией {полиморфизмы рЕВТ87-1/Муа I, рЕИТ 87-8Л ад I, рЕВТ87-15/Вагп Н1.1. Он позволяет анализировать большое число образцов ДНК в короткие сроки.

Вторым критерием при выборе полиморфных маркеров для ДНК-диагностики является частота рекомбинаций между маркерным локусом и повреждением в гене. В случае МДД для большинства используемых зондов частота рекомбинаций (в том числе внутригенных) составляет около 5% и не может быть уменьшена из-за большой протяженности гена (Ми11еу е1 а1, 1988) и высокой частоты рекомбинационных событий в нем. Все используемые нами маркеры, кроме 754, являются внутригенными. Зонд 754 расположен в 5' концевой области гена дистрофина. 6

Рис.1

зО-

7® дЩ

ал| а1|

1<>гПз

5

01 ||п1

Ь-т-Об О

01II

иЗ

Рис.2

^□-т-О!

а2||а2

¿ь-П5

5 6(

□2||а1

Результат ДНК-диагностикн МДД. проведенной с использованием нерадиоактиЕно меченного зонда Р20. Аллели 6.8 и 3.5 т.п.н. Для дочери (3) консультируемой (А) установлено носнтельство заболевания.

9

и?

3|2| 8|

021 «2

10[ 021 011

!□-

216 ^ 166 ¡^

О 7

, "Г'

Результат пренаталъной ДНК-диагностики МДД, проведенной методом амплификации с последующей рестрикцией. Прогноз для плода (12)является благоприятным. Для постановки диагноза использован полиморфизм рЕЕТ87- 15/Ват Н1, аллели 216 п.н. и 166+50 п.н.

Нами были зарегистрированы две рекомбинации между маркерным локусом и повреждением в гене: одна при использовании зонда 754, а другая - при использовании полиморфизма pERT87-15/Ват HI. Один из случаев рекомбинации представлен на Рис. 2 - два больных сына консультируемой имеют различные аллели.

Зонды серии pERT87 являются внутригенными и позволяют проводить не только обычную косвенную диагностику заболевания, но и ргистрировать делеции в 4 - 10 % семей (Koenig et al, 1989, Chamberlain et al, 1988a, Малышева и др., 1992.). В этой группе семей, в ряде случаев, возможно проведение ДНК-диагностики МДД со 100% достоверностью. При использовании полиморфизма pERT87-15/Вагп HI нами были зарегистрированы делеции в 4 семьях, что позволило увеличить достоверность анализа в этих семьях.

Таким образом, в случае МДД лучшими с точки зрения расположения являются внутригенные маркеры.

Третим критерием при выборе полиморфных маркеров для ДНК-диагностики является их информативность. Она определяется частотами полиморфных аллелей маркера. Частоты полиморфных аллелей одного и того же маркера часто имеют популяционную специфичность, и следовательно, одни и те же зонды имеют разное практическое применение в различных популяциях (Summers, 1987, Papiha et al, 1989). Для оптимизации выбора маркеров при проведении ДНК-диагностики в конкретной популяции необходимо "знание частот аллелей зонда в этой популяции.

В таблице 1 представлены результаты оценки частот аллелей шести используемых нами маркеров в популяции нашей страны. В той же таблице приведены для сравнения данные по другим популяциям.

Из приведенной таблицы следует, что для всех используемых полиморфизмов частоты аллелей в изученном контингенте семей близки к частотам аллелей в европейской популяции и популяции США. Для полиморфизмов 754/Pst I и XJI.h'Taq I обнаружено отличие частот аллелей в изучаемой популяции от популяции Африки. Для зонда XJ1.1 наблюдается близость частот аллелей 8

между1 контингентом исследованных семей и индийской популяцией.

Таблица 1.

Полиморфизм Популяция Числс Частоты Р1С

хромо аллелей

сом 1 2

754/Р$11 СССР 35 0.49 0.51 0.50

а1 -12 т.п.н.. Англия 172 0.59 0.41 0.48

а2 - Э т.п.н. Индия 62 0.81 0.19 0.31

Африка 20 0.32 0.68 0.44

Европа 102 0.55 0.45 0.50

X} 1.1/Тая 1 СССР 23 0.35 0.65 0.46

Ы - 3.8 т.п.н.. Англия 139 0.25 0.75 0.38

Ь2 - 3.1 - т.п.н. Индия 53 0.34 0.66 0.45

Африка 28 0.86 0.14 0.24

Канада 130 0.28 0.72 0.40

РгО/Мгр I СССР 28 0.75 0.25 0.38

с!1 - 6.8 Т.П.Н., Европа 30 0.60 0.40 0.48

с!2 - 3.5 т.п.н.

рЕПТ87-15/ВатН1 СССР 89 0.24 0.76 0.36

с1 - 216 п.к. США >75 0.38 0.62 0.47

с2 -166+50 п.н. Европа 88 0.15 0.85 0.26

рЕтГ87-1 /ЕЫМ I СССР 54 0.52 0.48 0.50

е1 - 312 п.н.. США 105 0.65 0.35 0.46

е2 - 281+31 л.н.

рЕВТ87-8|'Тач 1 СССР . 59 0.20 0.80 0.32

(1 -144 п.н.. США 105 0.26 0.74 0.38

(2 - 74+70 п.н. Европа ? 0.26 0.74 0.38

На основе полученных данных можно сделать вывод, что в нашей стране наиболее информативны зонды 754 и рЕПТ87-1. Для регистрируемых ими полиморфизмов уровень гетерозиготности достигает 50%, что является максимально возможным при двуаллельном полиморфизме.

Учитывая рассмотренные критерии можно предложить следующую схему проведения косвенной ДНК-диагностики МДД:

Первоначально проводят поиск информативного маркера методом амплификации с последующей рестрикцией, при этом предпочтение следует отдавать наиболее информативным маркерам. Если информативный маркер не найден методом ПЦР, проводят блот-гибридизацию с зондами, имеющими наибольший PI С.

Наилучшим с точки зрения данной схемы является полиморфизм pERT 87-1/Mva I, так как он в популяции нашей страны обладает максимальной информативностью для двуаллельного полиморфизма (50%). Данный локус является внутригенным, что позволяет регистрировать делеции приблизительно в 102£ семей и проводить в этих семьях точную ДНК-диагностику заболевания. Метод регистрации полиморфизма данного локуса методом ПЦР с последующей рестрикцией Mva I был разработан во время выполнения данной работы (Рис. 4).

2. Регистрация полиморфизма pERT 87-1/Mva I внутри гена дистрофина методом ^амплификации с последующей рестрикцией.

Нами была разработана методика, позволяющая регистрировать аллели системы pERT87-1/Bst NI методом амплификации с последующей рестрикцией. Данная методика значительно увеличивает возможности применения данного полиморфизма при проведении ДНК-диагностики МДД.

Зонд pERT87-1 является внутригенным и выявляет по рестриктазе Bst N1 аллели 3.1 т.п.н. и 2.45+0.65 т.п.н., кроме того при проведении блот-гибридизации наблюдается постоянный фрагмент - 0.7 т.п.н (Kunkel et al, 1985). Полиморфный сайт узнавания рестриктазы расположен внутри зонда, так как сумма длин Фрагментов ДНК одного аллеля равна длине другого аллеля. Зонд pERT87-1 клонирован в плазмиде PUC18 и имеет длину 1.35 т.п.н. Схема возможного расположения сайтов узнавания рестриктазы Bst N1 внутри зонда pERT87-1 приведена на Рис. 3.

BsMj 3JM

B»1M

MSId

pftlymoipMe fds

1

Схема расположения сайтов узнавания рестриктазы 1Ы11 I и места отжига выбранных пар праймеров внутри зонда рЕВТ87-1.

Рис.3

I

Satni ваш

IM/iQ [MVtl]

Sail

i

i

В последовательности ДНК зонда полиморфный сайт присутствует, что было выяснено в результате расщепления ДНК зонда рестриктазой Муа I, изошизомером N1.

последовательность 355 нуклеотидов от сайта Kpr» I и 463 нуклеотидов от сайта Sal I. Сайт узнавания рестриктазы Mva I был обнаружен в 284 нуклеотидах от сайта Sail. Также был обнаружен сайт узнавания рестриктазы Xba I в 333 нуклеотидах от сайта Kpn I. После обработки ДНК зонда pERT87-1 этой рестриктазой подтверждено наличие найденного сайта и обнаружен еще один сайт узнавания рестриктазы Xba I внутри последовательности ДНК зонда. По этим сайтам было проведено переклонирование части зонда pERT87-1 в фаг М13тр18. Это позволило оределить первичную последовательность ДНК Xba I - Xba I фрагмента зонда pERT87-1 длиной 400 п.н. Внутри данного фрагмента был обнаружен второй сайт узнавания рестриктазы Mva I, лежащий в 360 нуклеотидах от сайта Kpn I. Таким образом, была определена последовательность 4S3 п.н. от сайта Sal I и 744 п.н. от сайта Kpn I внутри зонда pERT 87-1.

Далее в соответствии с разработанной нами стратегией (см параграф 3} были выбраны две пары праймеров, фланкирующие каждый из сайтов узнавания рестриктазы Mva I (Рис 3). В результате анализа ДНК 20 женщин было установлено, что полиморфный сайт узнавания рестриктазы Mva I фланкирован парой праймеров:

Методом Сенгера была определена первичная

Рис. 4

О

6 лг

а2Ца2 аЗ| а2|

■ОтО

312 281

Примеры диагностики носительства МДД с использованием полиморфизма рЕЕТ87-1'Муа I, проведенной методом амплификации с последующей рестрикцией. Аллели 312 и 281+31 п.н. Б обеих семьях установлено носителъство заболевания для дочерей консультируемы:-:.

12

5'-T G CAG T CAACG G AT CACAT AG A 5"-AG G ACT G G GAACAT T T T G AAG G

Для этой пары праймеров подобраны условия амплификации: 94° С - 45° сек., 50° С - 45 сек., 72 С - 75 сек. с содержанием MgCb в

буфере для Tth полимеразы равным 3.5 мМ. При проведения ПЦР амплифицировался Фрагмент ДНК длиной 312 п.н. После рестрикции M va I наблюдались аллели 312 п.н. и 281+31 п.н. Для данного полиморфизма нами был определен PIC в контингенте исследованных семей, он оказался равен 50% (см. табл. 1). Менделирование аллелей данного маркера было показано нами на 8 семьях со случаями МДД. С использованием данной пары праймеров нами было проведено 3 диагностики носительства поврежденного гена (Рис. 4), одна из которых была проведена пренатально.

Таким образом, была определена последовательность ДНК, вблизи полиморфного сайта узнавания рестриктазы Mva I внутри зонда pERT87-1, выбрана пара праймеров и подобраны условия проведения ПНР с ней. Это позволило проводить ДНК-диагностику МДД с использованием полиморфизма данного локуса методом амплификации с последующей рестрикцией.

Для целей практической ДНК диагностики данная полиморфная система является наилучшей из известных в настоящее время диаллельных систем, поскольку ее аллели выявляются методом ПЦР с последующей рестрикцией; в контингенте исследованных семей система обладает информативностью, максимальной для двуаллельного полиморфизма; полиморфный локус является внутригенным, что позволяет в некоторых семьях регистрировать делеции в гене дистрофина.

3. Выбор праймеров и стратегия подбора условий реакции при

проведении ПЦР.

Успешность проведения ПЦР определяется оптимальным выбором праймеров для реакции и подбором условий для данной

пары праймеров 1389, СеКапс), 1939). Выбор пар праймеров для

проведения ПЦР мы проводили на основе следующих критериев :

1. Длина амллифицируемого Фрагмента должна лежать в пределах 100 - 500 п.н.

2. Длины праймеров должны лежать в пределах 20 - 32 нуклеотида.

3. Температуры плавления праймеров не должны отличаться более чем на 1 ° С.

4. Праймеры не должны иметь внутренних инвертированных гомологичных участков, способных образовывать двуцепочечные структуры ДНК. с более чем В водородными связями.

5. Праймеры не должны иметь друг с другом 3' концевых инвертированных гомологичных участков.

6. На 3' концах обоих праймероБ должен быть либо цитозин, либо гуанозин.

Температуру плавления праймеров определяли методом интерполяции формул (1) и (2) в области 20 - 50 п.н.

(1) Тт=4(Б+С) + 2(А+Т) - 16.61одю^а+], где О, С, А, Т - числс

соответствующих оснований в цепи ДНК;

(2) Тт=81.5С - 16.61одю^а+] + 0.41(%В+С) - О.БЗ{%ЬгтатИе]

(600/М), гае N - длина цепи ДНК в нуклеотидах,. N > 50.

В области 20 - 50 п. н. кривые (1) и (2) аппроксимировал!, многочленом второго порядка (кривая 3, Рис. 5). На полученнук кривую налагали ограничение гладкости. Вычисления проводили с помощью разработанной в лаборатории компьютерной программы.

Рис.5

Схема определения температуры плавлена! праймеров, используемых для проведения ПЦР. I

ТВ!

На проведение ПЦР важную роль оказывает присутствие ионов Мд++, оптимум концентрации этих ионов для разных пар праймеров лежит в пределах 1-10 мМ, и не имеет выраженной корреляции со структурой олигонуклеотидов (Бак!, 1989). Поэтому нами был выбран путь двустадийного подбора условий проведения реакции амплификации для каждой пары праймеров. На первом этапе подбирали оптимальное содержание МдС12 в реакционном буфере, проводя ПЦР с различным содержанием МдС12 в буфере от 1.0 до 10 мМ с шагом в 1 мМ. Температуру отжига определяли с помощью описанной выше программы. На втором этапе проводили несколько ПЦР с выбранным содержанием МдС12 в буфере с различной

температурой отжига, повышая ее до 65° С с шагом в 5 С. Этот этап позволял увеличить специфичность проводимой реакции.

Используя описанную стратегию были подобраны условия проведения реакции для всех используемых пар праймеров, при этом выход амплифицированного фрагмента составлял больше одного микрограмма.

4. Исследование возможного полиморфизма 5" концевой области гена дистрофина.

Оптимальным для проведения ДНК-диагностики МДД является использование набора внутригенных высокополиморфных маркеров с анализом возможных рекомбинаций между ними в каждой семье, а также набора тесно сцепленных фланкирующих маркеров. Использование маркеров, непосредственно фланкирующих последовательность гена дистрофина в 5' и 3' областях позволяет уменьшить возможную ошибку диагноза практически до одного процента, что является общепринятой нормой в такого рода исследованиях.

Нами был проведен поиск возможного рестрикционного полиморфизма по рестриктазам ЗаиЗА I и Ни( I в 5' концевой области гена дистрофина. Последовательность ДНК данной области была определена независимо двумя группами авторов: геномная последовательность была определена группой Кламута |К1апиД еХ а1, 1389), последовательность кДНК была определена группой КеИига (Коегнд е(: а!, 1987). Между двумя этими

последовательностями в районе -5 -10 от начала гена существуют различия, которые могут быть обусловлены полиморфизмом данной области (Рис 6).

сОЫАйопв

Рис.6

Участок возможного полиморфизма и схема расположения праймеров в 5"

—-шотцриммикшчр I 11 ■¡ыж«.1си:гс| ...... и концевой области гена

1

СмЗЫ

дистрофина.

geiomtc aorte

Для проверки этого предположения была синтезирована пара праймеров, фланкирующих участок возможного полиморфизма: 5'-GGAAACCAACTTGAGAGAGAAGGCGGGT 5' ATAATTGCCTCCCAGATCTGAGTCCTGTAG Длина амплифицироеанного фрагмента ДНК должна была составить 168Л69 п.н. Для этой пары парймеров были подобраны условия проведения ПЦР: 94° С - 45 сек., 65° С - 45 сек, 72° С - 60 сек., 32 цикла в присутствии 3 мМ MgCl2 в реакционном буфере.

Отличия, наблюдаемые в последовательностях ДНК, предложенных двумя группами авторов, должны были приводить к различиям в наборе фрагментов рестрикции амплифицированного участка по рестриктазам S au ЗА I и Hinf I {Рис. 6]. В результате анализа образцов ДНК 24 неродственных мужчин из различных регионов нашей страны было установлено, что во всех случаях набор фрагментов рестрикции для обоих ферментов соответствовал геномной версии.

В результате полиморфизм в данной области по рестриктазам Hinf I и Sau ЗА I в исследованной популяции обнаружен не был. Это может быть объяснено наличием очень редкого Г1ДРФ по данным рестриктазам, который не может иметь применения в практической ДНК-диагностике. Кроме того, доктор Кениг с соавторами наблюдали последовательность, описанную группой Кламута, на нескольких геномных пробах (Кениг, личное сообщение]. 16

Следовательно., в слу чае последовательности., предложенной группой Кенигз, возможно наличие, ошибки клонирования кДНК.

ВЫВОДЫ.

1 В результате анализа генотипов 39 неродственных хромосом определены частоты аллелей для полиморфных маркеров рЕЯТ87-Ш4уа I.. рЕРТ87-0,'Тад 1, рЕРТ87-15/Вагг. Н1, 754,'Р^ I, ХЛЛЛГая I, Р20/М®р I, сцепленных с геном дистрофина. Показано, что для всех исследованных маркеров частоты аллелей в изученной популяции близки к таковым в европейской популяции. Наиболее информативными оказались полиморфные системы 754|'Ре1 I и рЕВТ87-1 /М\'а I.

2. На образцах ДНК членов 51 семьи со случаями МДД проведен сравнительный анализ эффективности применения шести полиморфных маркеров., тесно сцепленных с локусом дистрофина. На основе полученных данных предложена схема проведения косвенной ДНК-диагностики этого заболевания.

3. Разработана методика регистрации полиморфизма в локусе рЕРТ87-1 с помощью полимеразной цепной реакции с последующей обработкой эндонуклеазой Муа I. В популяции нашей страны данная полиморфная систем а является наилучшей из известных диаллельных систем: ее аллели выявляются методом ПЦР с последующей рестрикцией; система обладает информативностью., максимальной для двуаллельного полиморфизма; полиморфный локус является внутригенным, что позволяет в некоторых семьях проводить прямую ДНК-диагностику заболевания.

4. Разработана методика выбора пар олигопраймеров и подбора условий реакции для проведения ПЦР.

5. С помощью рестрикционного анализа изучена область предполагаемого полиморфизма в 5"-концевом фрагменте ДНК гена дистр0ф1ина на образцах ДНК 24 неродственных мужчин. Полиморфизм в данной области не обнаружен. Установлено отличие последовательности данного фрагмента ДНК от описанной в Генбзнке.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Для шесты полиморфных маркеров, тесно сцепленных с локусом МДД, частоты аллелей в изученной популяции близки к таковым в европейской популяции. Наиболее информативными являются полиморфные системы 754/Р$11 и рЕПТ87-1 /К-Ь/а !.

2. Разработана эффективная методика регистрации полиморфизма в локусе рЕВТ87-1 с помощью полимеразной цепной реакции с последующей обработкой эндонуклеазой М-/а I.

3. Сформулированны критерии, позволяющие эффективно проводить выбор пар олигопраймеров и подбор условий реакции для проведения ПЦР.

4. Доказано отсутствие в изученной популяции информативных полиморфизмов длины рестрикционных фрагментов для зндонуклеаз 'ЗаиЗА I и Нт* 1 в 5'-концевом фрагменте ДНК. гена дистрофина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Малыгина H.A., Евграфов О.В., Зайцева С.П., .Поляков A.B. Крылова Л.Н., Каменных Л.Н.. "Диагностика носительства гена миодистрофии Дюшенна с помощь» зондов ДНК." I! Тезисы докл. Всесоюз. науч.-практич. конф. по детской неврологии и психиатрии, Вмльюс. -1383. - С. 56-57.

2. Евграфов О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Малыгина H.A., Еадалян Л.0.;. Макаров В.Б. "ДНК-диагностика носительства гена миодистрофии Дюшенна'7/ Молек. генетика, микробиол. и вирусология.-1330.-1[2.- С. 1 5-17.

3. Евграфов О.В., Поляков A.B., Макаров В.Б. "Молекулярно-генетнческне методы диагностики наследственных заболеваний." II il Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата. - 1930. - тезисы докл. -С. 140.

4. Бадалян Л.О., Малыгина H.A., Евграфов О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Виноградов. C.B., Каменных Л.Н., Мнзитовз О.Н.. Заваденко H.H. "Генетическое консультирование семей с прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшенна с учетом данных 18

по ДНК-зондовой диагностике." If II Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата. • 1ЭЭ0. - тезисы докл. - С. 32.

5. Поляков A.B., Зайцева С.П., Евграфов О.В.. Мильман Ф.А., Виноградов C.B., Бахарев В.А., Макаров В.Б. "Пренатальная ДНК-диагностика миодиетрофии Дюшенна."// II Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата. -1930. - тезисы докл.- С. 359-360.

6. Евграфов О.В., Бадалян Л.О., Поляков A.B., Зайцева С.П., Малыгина H.A., Виноградов C.B., Бахарев В А, Мильман ФА, Лисова С.П., Зарецкая E.H., Мизитова G.H., Макаров В.Б. 'Установление носительства и пренатальная диагностика миодиетрофии Дюшенна на основе анализа ДНК."//Журнал невропатологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 1990. - 8. - С. 23-33

7. Евграфов О.В... Поляков A.B., Зайцева С.П., Виноградов C.B., Бахарев В.А., Мильман ФА, Лисова Л.П., Зарецкая Е.А., Малыгина H.A., Бадалян Л.О., Макаров В.Б. "Пренатальная диагностика миодиетрофии Дюшенна. "Л' M о лек. генетика, микробиол. и вирусология.- 1991.- N.2.- С. 15-16.

8. Поляков A.B., Зайцева С.П., Евграфов О.В. "Использование нерадиоактиво меченнных ДНК-зондов для ДНК-диагностики миодиетрофии Дюшенна. 'Vi Mo лек. генетика, микробиология и вирусология, -1991.- N5,- С. 21-23.

9. Евграфов О.В., Поляков A.B. "Способ амплификации Фрагмента ДНК неизвестной последовательности, расположнного на некотором расстоянии от Фрагмента известной последовательности."// Изобретение, per. N 4826213/13-054707, 15 мая 1990

10. Поляков А.Б., Стре.пьченко Л.В.. Пугачев В.В., Евграфов О.В. "Использование полиморфизма локуса pERT87-1 для ДНК-диагностики миодиетрофии Дюшенна."// 2-ой Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд. - 1331. - тезисы докл. - С. 156.

11. Макаров В.Б., Евграфов О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Малыгина H.A. "МДД локус: некоторые новые данные."// IV Всесоюзная научная конференция "Экологическая генетика растений, животных, человека", Кишинев. - 1391. - тезисы докл. - С. 510.

12. Евграфов О.В., Поляков А.В. '"Хромосомный минилрыжок" с использованием полимеразной цепной реакции.'V.' 14' Всесоюзная научная конференция "3 ко логическая генетика растений, животных, человека", Кишинев. -1991. - тезисы докл. - С. 507.

13. Поляков А.В., Евграфов О.В., Черников А.И.. Макаров В.Б. "Исследование 5' концевой последовательности гена дистрофина."1!1 IV Всесоюзная научная конференция "Экологическая генетика растений, животных, человека", Кишинев. - 1991. - тезисы докл. - С. 512.

14. Малышева О.В., Поляков А.В., Зайцева С.П., Малыгина НА, Горбунова В.Н.. Евграфов О.В., Макаров В.Б., Красильников В.В.. Баранов B.C., Бадапан ГШ. "Анализ делений в гене дистрофина методом мультиплексной амплификации у пациентов, страдающих миодистрофией Дюшенна."М Молек. генетика, микробиология и вирусология. -1992. - 5JL - С. 27-31.

15. Evgrafov O.V., Poiyakov A.V., Makarov У.В. "Chromosome "minijurnping" by means of polymerase chain reaction." H Human Gene Mapping 11. Abstracts. -1991. - P. 309-310.

16. Poiyakov A.V., Zaytseva S r.. Evgrafov O.V.. Maiygina NA. Makarov V.B. "DMD locus: some new data."II Human Gene Mapping 11. Abstracts.-1391.- P. 223.

17. Poiyakov A.V., Evgrafov O.V., Makarov V:6. "About the 5* end seguence of distrophin gene."W NucL Add Res. - 1 391 - 21

18. Poiyakov A V., Evgrafov П v. Streichenko L.V... Makarov V.B. "Detection of Mvai polymorphism within pERT87-1 region of dystrophin gene by restriction ot amplified DNA."/,' Nuci. Acid Res. -19Si. -21

19. Evgrafov O.V., Barsnov V.S., Poiyakov A.V., Malysheva O.V , Chuhrova A.L , Artem'eva O.V... Maiygina N.A., Gorbunova V.N., Makarov V.B. "Deletion screening of Duehenne muscular dystrophy patients in Russia: unusual high frequency of deletions of 1 7 or 1 9 exons.'V.' 4 Meeting of the Society of Human Genetics, Mains. Abstracts. -1992.

Подписано в печать 09.06.92. Заказ Ji 265. Тираж 100 экз.,

Отпечатано в типографии НИИ стандартизации и унификации. Москва, Сокольнический вал, 37/10.