Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование и изучение тонкой структуры некоторых генов человека и разработка на этой основе ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование и изучение тонкой структуры некоторых генов человека и разработка на этой основе ДНК-диагностики наследственных заболеваний."

Российская Академия медицинских наук

Меднко-гепетическнн научньш центр

На правах рукописи УДК 575.113.2 + 575.224.22: 616-056.7

ЕВГРАФОВ Олег Ваднмоиич

Картирование и изучение топкой

структуры некоторых генов человека и разработка на этой основе ДНК-диагностики наследственных заболеваний.

03.00.15. "Генетика" Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Института клинической генетики (директор - профессор Гннтер Е.К.). Медико-генетический научный центр РАМН (директор - чл.-корр. РАМН профессор Иванов В.И.).

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Калинин В.Н. доктор биологических наук Гайцхоки B.C. доктор химических наук Гринева Н.И. Ведущее учреждение:

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится XII 199& г. в /О часов на

заседании специализированного Совета Д-001.16.01 Медико-генетического центра РАМН по адресу: 115И78 Москва,.ул. Москворечье Д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН. Автореферат разослан " /<Р" XI J 992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета доктор медицинских наук, профессор

Л.Ф.Курило

/ 5т'?л I российская иип^т,^'

>сударственная -----

библиотек«

Актуальность проблемы. Успех^ в картировании генов человека и ' исследовании мутаций, приводящих к возникновению наследственных заболеваний, развитие чувствительных молекулярно-генетических методов регистрации полиморфных локусов ДНК и мутационных изменений являются предпосылками для создания эффективных ДНК-диагиостичсских процедур.

Хотя ДНК-диагностика основана на весьма сложных, трудоемких и дорогостоящих исследованиях, она имеет ряд важных преимуществ перед традиционными методами диагностики. Исследование проводится на ДНК, которая остается практически неизменной на протяжении всей жизни организма и одинакова во всех ядерных клетках. Это позволяет с помощью анализа ДНК решать задачи, которые часто не удается решить другими методами. Наиболее важно, что с помощью ДПК-диагностики можно обнаружить поврежденный ген в пресимптоматическом и в прснатальном периодах. Пренатальная ДНК-диагностика таких заболеваний как ммоднетрофня Дюшеппа, муковпецидоз, спинальная амиотрофия и др. в первом триместре беременности позволяют предотвращать рождение детей с тяжелыми наследственными патологиями. Г! случае недостатка 21-гидроксилазы (которая приводит к гиперплазии коры надпочечников) пренатальная ДНК-диагностика может позволить провести своевременное дородовое лечение, которое значительно снижает тяжесть заболевания после рождения. Для заболеваний с поздним дебютом важной является не только пренатальная, но и пресимптоматическая ДНК-диагностика, которая в ряде случаев позволяет провести профилактические мероприятия и лечение. Для таких заболеваний, при которых профилактическое лечение неэффективно (например, хорея Гентиштона), пресимптоматическая ДНК-диагиостика важна дли планирования семьи и имеет большое морально-психологическое значение.

ДНК-тестирование позволяет определить носительство поврежденного, гена для женщин, в случае Х-сцеплепных заболеваний, таких, например, как миодистрофии Дюшенна и Беккера. Для женщин-носительниц необходимо рекомендовать пренатальную

диагностику, в то время как женщины-неносителышцы не нуждаются в дальнейшем генетическом консультировании.

Методы ДНК-диагностики являются, как правило, более объективными и точными, чем традиционные методы диагностики. Эти преимущества определяют значительную роль ДНК-диагностики для генетического консультирования и актуальность задачи разработки процедур ДНК-диагностики.

Показателем актуальности исследований, направленных на разработку процедур ДНК-диагностики, является практически экспоненциальный рост публикаций, посвященных ДНК-диагностике наследственных заболеваний. К 31 декабря 1990 года в базу данных, посвященную исследованиям в области ДНК-диапюстики, было внесено 26К7 сообщений (примерно на 1000 больше, чем к началу 1990 года), касающихся диагностики более чем 300 генетических болезней или других наследуемых состояний (152 доминантных, 82 рецессивных, 70 Х-сцепленных).

Целью работы является разработка направления исследований, нацеленного на создание ДНК-диатостических процедур на основе картирования и изучения тонкой структуры генов человека.

Основными задачами работы являются:

1. Изучение возможностей и ограничений методов топкого генетического картирования генов на примере гена РИОЛ.

2. Исследование полиморфных локусов ДНК и опт. шзация методов косвенной ДНК-диагностики на примерах миодистрофии Дюшепна, хореи Гентинггона, спинальной амиотрофии, атаксии Фридрсйха и недостаточности 21-гидроксилазы.

3. Изучение мутаций в генах, приводящих к наследственным заболеваниям, и оптимизация прямых методов ДНК-диагностики на примерах миодистрофии Дюшепна и недостаточности 21-гидроксилазы.

Научная новизна и практическая значимости Обнаружены, картированы и исследованы 4 микросателлитных повтора из области предположительной локализации гена РЯЭА. С использованием этих и ранее известных полиморфных маркеров проводятся исследования по тонкому генетическому картированию и изучению разнообразия мутаций на основе анализа гаплотипов и неравновесного сцепления.

Разработаны методики ДНК-диарюстики и проведены две пресимптоматические диагностики.

В результате исследования мутаций в гене дистрофина, изучения некоторых фрагментов гена дистрофина и тесно сцепленных с геном дистрофина полиморфных локусов в популяции страны, усовершенствования методики оценки генетического риска и практической ДНК-диагностики предложена оптимизированная схема ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна с учетом появления возможных дополнительных данных о новых полиморфных локусах и мутациях.

На основе исследования частоты .мутаций в двух локусах гена 21-гидроксилазы В и использования методики регистрации полиморфизма в гене HLA DQA1 предложена методика ДНК-диагностики недостаточности 21-гидрокснлазы.

Сформулированы некоторые важные элементы создания ДНК-диагностических процедур на основе картнропания и изучения патологических генов, в частности, тесное сопряжение молекулярно-генетического проекта с медицинской частью проекта, преимущественное использование методик, основанных на амплификации и микросателитных повторов в качестве полиморфных маркеров (особенно на стадии картирования гена).

Тонкое генетическое картирование локуса FRDA.

Атаксия Фридрейха является аутосомно-рецессивным заболеванием, характеризующимся прогрессирующей дегенерацией центральной и периферической нервной системы. Частота встречаемости атаксии Фридрейха составляет около 1 - 4 случая на 100 тысяч человек. Биохимическая причина заболевания не идентифицирована.

Патологический ген картирован в районе 9ql2-ql3, на расстоянии не более 1 сМ от локусов D9S5 (26Р) и D9S15 (МСТ112). Для более точной локализации гена генетическими методами (тонкое генетическое картирование) используется либо изучение неравновесного сцепления полиморфных маркеров из области предположительной локализации гена с патологическим геном, либо анализ рекомбинаций в хромосомах с повреждением в данной области. Оба подхода

опираются на использование полиморфных локусов, расположенных в области предполагаемой локализации гена, поэтому поиск таких маркеров является перым этапом таких исследований.

Наибольший интерес как для ДНК-диагностики, так и для анализа неравновесного сцепления в области гена представляют микросателлитные СА и GA-повторы, которые часто обнаруживают многоаллельный полиморфизм по длине повтора и широко распространены в геноме человека. С целью обнаружения вмсокоинформативных маркеров нами был проведен поиск СА и GA повторов в области ДНК, заключенной между маркерами 26Р и МСТ 112. Данный район ДНК клонирован в- искусственных дрожжевых хромосомах, затем фрагмент геномной ДНК из одного YAC-клона (YAC4) был псрсклонирован в космидах в отделе генетики человека Института биологической химии, г.Страсбург. В этом наборе космид нами были зарегистрированы 4 различных (СА)П повтора методами

дот- и блот-гибридизации с синтетическим полиСА повтором, с помощью рестрикциониого картирования построена карта их взаимного расположения. Соответствующие рестрикционные фрагменты были элюированы из агарозного геля, псрсклопированы в ДНК фага N113, * и их нуклеотидная последовательность определена методом Сенгера. Независимо от наших исследований Г. Сируджо из группы доктора Кенига обнаружил повтор GS2, который оказался идентичным повтору CAI. Нуклеотидная последовательность ДНК вблизи повтора CAI совпадала с данными, полученными во Франции.

Для каждого микросателлитного повтора была выбрана пара праймеров и оптимизированы условия амплификации. Для микросателлитного повтора MS из МСТ112 были выбраны новые праймеры и для них также подобраны оптимальные условия амплификации.

СА4 оказался неполиморфным, три другие - полиморфными. Частоты аллелей полиморфного микросателлита MS из МСТ112 также были определены в русской популяции (см. Табл. 1).

По совокупным даным исследования неравновесного сцепления и рекомбинаций в ряде популяций область ДНК между МСТ112 и 26Р - наиболее вероятный район локализации локуса FRDA. Полиморфные

СА повторы, изученные нашей группой, расположены именно в этой области, и в связи с этим особенно привлекательны для тонкого генетического картирования Р[ША. Результаты изучения частот аллелей в поврежденных и "нормальных" хромосомах представлены в Табл. 1.

Таблица 1. Частоты аллелей л о кус он МСТП2 (МЯ), СА1, СА2 и САЗ II поирсждснных (К1ШЛ) н "нормальных" хромосомах.

'нормальные' поврежденные

локус аллель размер частота к-во хром. частота к-во хром.

1 293 0.128 0.063

2 2<)1 0.383 0.375 •

МСТ112 3 289 0 47 0.124 16

4 287 0.128 0.063

5 285 0.276 0.375

6 283 0.085 0

1 197 0.392 0.333

CAI 2 195 .0.176 51 0.167 18

3 193 0.392 0.389

4 191 0.04 0.111

1 111 0.019 0.048 •

2 109 0.077 0.095

СА2 3 107 0.712 52 0.666 21

4 105 0.057 0.048

5 103 0.135 0.143

1 124 0.02 0.048

САЗ 2 122 0.28 50 0.286 21

3 120 0.26 0.095

4 118 0.44 0.571

Не обнаружено неравновесного сцепления ни с одним из аллелей ни одного из анализируемого локуса в русской популяции. Мы также не обнаружили какого-либо специфического гаплотипа, сцепленного с геном Р1ША. Дальнейшие исследования могут выявить такое сцепление, но сильное неравновесное сцепление практически исключено. Хотя дальнейшие исследования .в этой рбдасти необходимы, по уже имеющимся данным можно полагать, что ■ русская популяция, так же как и английская, не имеют яркр выраженного эффекта основателя. Обнаруженные и описанные нами повторы могут, однако,

быть использованы для анализа неравновесного сцепления в популяциях, в которых эффект основателя уже установлен. Особенно эффективным может быть использование данных повторов для анализа гаплотипов.

В нашей популяции была обнаружена рекомбинация в семье с 2 больными. В данной семье изменена фаза сцепления у маркеров MCT1I2 и СЛ1 в одной из хромосом, несущих повреждение, маркеры СА2 и САЗ оказались неинформативны. Это первый случай, исключающий маркер CAI из области локализации матуции в гене FRDA, и, таким образом, район наиболее вероятной локализации гена может быть сужен до области CAI - 26Р- (при этом не исключено, что часть гена может выходить за пределы данной области).

Разработка ДНК-диагностики спииалыюй амнотрофин с помощью полиморфных маркеров из области 5ql2-ql4.

Спиналышя амиотрофия - одно из наиболее тяжелых и распространенных рецессивных наследственных заболевании, и разработка эффективной ДНК-диагностики этого заболевания является одной из наиболее актуальных задач молекулярной медицины. Для всех форм этого заболепани» патологический локус картируется в 5ql2-ql4. Примерно в 6% случаев, первоначально диагностированных как спиналышя амиотрофия, обнаруживается, что заболевание не наследуется с картированным локусом. Обычно это связано с ошибками диагностики, и для проведения ДНК-тстирования и дальнейших исследований необходима тщательная клиническая диагностика, отбор только ядерных, типичных случаев. Нами совместно с экспертами из РГМУ и научно-консультативного отдела МГНЦ РАМН были разработаны карты медицинского и генетического обследования больного спииалыюй амиотрофией, за основу которой приняты рекомендации международного семинара, посвященного этой проблеме, организован специализированный прием больных, верификация диагноза, заполнение клинической карты и сбор образцов крови. Проведен первичный сбор материала - образцов крови больных и их родителей из 42 семей. В качестве наиболее информативных и

перспективных для анализа | сцепления маркеров выбраны . микросателлитные повторы в локусах D5S39 и D5S125.

Для регистрации полиморфизма мы использовали два различных подхода: определение аллелей в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях, и определение аллелей в секвенирующем геле при использовании меченого праймера. В настоящее время удовлетворительные результаты получены при использовании обоих методов. Не обнаружено отличия в частотах аллелей по сравнению с французской и английской популяциями.

Отработана система медико-генетического консультирования этого заболевания с учетом возможностей • ДНК-диагностики и методика оценки генетического риска. Проведена пренатллытя диагностика СА.

Возможности пспользопання полиморфных маркеров ДНК для ДНК-диагиостики хореи Гентннгтона.

Хорея Гентингтона - тяжелое неврологическое заболевание с началом развития обычно в средние годы жизни (п среднем в 38 -40 лет). Заболевание характеризуется прогрессирующими нарушениями движения (хореотические симптомы), психиатрическими нарушениями и изменениями интеллекта. Заболевание картировано в теломерной области хромосомы 4, с наиболее вероятной локализацией между локусами D4S182 и D4S184. Известно большое количество полиморфных маркеров, расположенных на генетическом расстоянии примерно 1.5 - 4 сМ от патологического гена. Эти маркеры могут быть использованы для ДНК-диагностики данного заболевания косвенными "методами. Для регистрации аллелей в подавляющем большинстве случаев используется блот-гибридизация, л до недавнего времени имелась информация лишь о некоторых последовательностях ДНК в районе полиморфных сайтов, что дает возможность использовать амплификацию для ДНК-диагностики этого заболевания. Два таких фрагмента с известной последовательностью • ДНК, содержащих три полиморфные сайта, находятся в локусе D4S10 (G8).

Для регистрации аллелей двух полиморфных Hind III сайтов и полиморфного Sau96 I сайта из локуса G8 были выбраны две пары праймеров на основе известных последовательностей ДНК, и подобраны для них оптимальные условии амплификации. Мы

обнаружили неравновесное сцепление между полиморфными сайтами рестрикции Sau96 I (ранее не исследовался) и одним из Hind III, и для ДНК-диагностики обычно использовали два полиморфных Hind III сайта. Частота аллелей составила 0.77/0.23 для одного, и 0.82/0.18 для другого, PIC для обоих сайтов несколько ниже, чем в США.

Всего нами проанализировано 93 образца крови из 11 семей, включая 48 образцов из гигантской семьи из Азербайджана, Шамхорский район (184 человека, 30 больных). Для проведения ДНК-диагностики в 4 семьях пока недостает образцов ДНК от некоторых ключевых членов семьи. 5 семей и 3 ядерные семьи из азербайджанской родословной неинформативны по используемым в настоящее время полиморфных маркерам. В настоящее время проведено 8 прссимптоматимсских ДНК-тестов. Одна семья обратилась с просьбой о прснатальной диагностике.

Практика ДНК-тестирования показывает специфику молскулярно-генетического анализа для целей ДНК-диагностики. Во-первых, следует ожидать, что задачи ДНК-анализа могут измешпься в процессе тестирования. Во-вторых, из-за сложных родословных и недоступности некоторых ключевых членов семьи необходимо использовать высокоинформатнвные и тесно сцепленные с геном маркеры. В третьих, поиск возможных способов проведения ДНК-диагностики в случае доминантных заболеваний может быть весьма сложным, и требует от исследователя глубоких знаний и хорошего владения методами семейного анализа с использованием данных ДНК-тестирования. В-четвертых, оценка генетического риска может быть весьма сложной математической проблемой. Возникающие при ДНК-диагностике этические проблемы будут рассмотрены ниже.

Результаты примерно двухлетней работы в данной области показывают, что наиболее актуальной проблемой является недостаточность использования двух полиморфных Hind HI сайтов для проведения ДНК-тестирования. В последнее время появилась , информация о ряде высокоинформативных полиморфных локусов, тесно сцепленных с геном ХГ, определение аллелей которых возможно с помощью ПЦР. В настоящее время для ДНК-тестирования мы также используем микросателлитный повтор из гена альфа-идуранидазы и VNTR из локуса D4S125 (в последнем случае нами разработан метод

регистрации аллелей, основанный нр амплификации с последующей гибридизацией).

Исследование полиморфных локусов ДНК и оптимизация методов косвенной ДНК-диагностики миоднстрофнн Дюшенна

Миодистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее частым среди сцепленных с полом рецессивным генетическим заболеванием человека. МДД встречается приблизительно у одного из 2500-4000 новорожденных мальчиков, отличается тяжелым течением с постепенной деградацией мышечной ткани и приводит к летальному исходу, как правило, п возрасте до 20 лет.

Для МДД обнаружено и картировано большое число маркеров, тесно сцепленных с локусом заболевания. Ценность полиморфного маркера для ДНК-диагностики определяется в основном тремя факторами: 1) его информативностью, 2) генетическим расстоянием между маркером и повреждением в гене и 3) методом регистрации аллелей рассматриваемого маркера (предпочтение отдается более простым, дешевым и требующим меньше времени методам).

Информативность полиморфного маркера зависит от частот аллелей маркера в данной популяции. Для оптимизации выбора маркеров при проведении ДНК-диагностики и пашей популяции ' был проведен анализ частот аллелей ряда полиморфных локусов (Табл. 2, для сравнения приведены данные и по другим регионам). Ни для одного из используемых маркеров не было обнаружено ранее не описанных аллелей. Полиморфизм наблюдался для всех маркеров.

Из приведенной таблицы следует, что - для всех- используемых полиморфизмов частоты аллелей в популяции нашей страны близки к частотам аллелей в европейской популяции, наиболее информативными являются полиморфизмы рЕ1?Т87-1/Муа! и 754/Р$Н.

Проблемы, связанные с ДНК-диагностикой миодистрофии Дюшенна, связаны с гигантским генетическим размером гена дистрофииа (примерно 12 сМ). Это приводит к тому, что средняя частота рекомбинаций между внутригенным полиморфным маркеров и повреждением в гене составляет около 5%. Традиционным методом

Таблица 2. Полиморфизм используемых маркеров в русской и других

популяциях.

Полиморфизм Регион Число Частоты гетеро-

хромо аллелей зигот-

ность

сом 1 2

754/Рз1 I СНГ 35 0.49 0.51 0.50

а1 - 12 т.н.п., Англия 172 0.59 0.41 0.48

а2 - 9 т.н.п. Индия 62 0.81 0.19 0.31

Африка 20 0.32 0.68 0.44

Европа 102 0.55 0.45 0.50

X} 1.1/Тая I СНГ 23 0.35 0.65 0.46

: Ь1 - *3.8 т.н.п., Англия 139 0.25 0.75 0.38

>2 - 3.1 - т.н.п. Индия 53 0.34 0.66 0.45

Африка 28 0.86 0.14 0.24

Канада 130 0.23 0.72 0.40

' 20/М;;р I. СНГ 28 0.75 0.25 0.38

• - 6.8 т.н.п. Европа 30 0.60 0.40 0.48

< \ - 3.5 т.н.п.

р.' ГГ87-15/ВатН1 СНГ 89 0.24 0.76 0.36

с1 - 216 н.п., США »75 0.38 0.62 0.47

с2 106 + 50 н.п. Европа 88 0.15 0.85 0.26

рЬ •. Г87-1/В51Ы I СНГ 54 0.52 0.48 0.50

е1 • 312 н.п., США 105 0.65 0.35 0.46

е2 281+ 31 н.п.

рЕ1 ) 87-8/TaqI СНГ 97 0.28 0.72 0.40

П 144 н.п., США 105 0.26 0.74 0.38

12 74 + 70 н.п. Европа ? 0.26 0.74 0.38

рЕИ М7-8/Хшп1 СНГ 71 0.20 0.80 0.32

- 30 н.п.

g2 - Ю+ПОн.п.

сниж1 1 я вероятности такой ошибки является использование одиощ . <сшю нескольких полиморфных маркеров, расположенных внутри гена. При этом большинство рекомбинационных событий выявля) гея, а риск не обнаружить рекомбинацию значительно снижаете', Внегенные маркеры, к которым, в частности, относится маркер "< имеют большую частоту рекомбинаций с повреждением в

гене, и, следовательно, менее предг^очтительны для ДНК-диагностики (за исключением тех случаев, когда они используются в качестве одного из фланкирующих маркеров).

С методической точки зрения предпочтительнее использовать маркеры, позволяющие проводить анализ методом ПЦР, а не блот-гибридизации. Метод амплификации значительно проще, быстрее и дешевле, и после его применения возможно использование большого количества различных методов анализа амплифицированных фрагментов. С целью увеличения информативности метода амплификации при проведении ДНК-диагностики МДД нами была определена нуклеотидмая последовательность части "зонда pERT87-l, содержащая полиморфный сайт узнавания рестриктазы Bst N1 и ее изошпзомера Mva I, выбрана пара праймеров, фланкирующая этот сайт, подобраны условия амплификации. Для данного полиморфизма нами была определена гетерозиготность в популяции нашей страны, она оказалась равна 50%. Таким образом, данный маркер является наиболее эффективным диаллельным маркером для ДНК-диагностики МДД.

Для поиска наиболее тесно сцепленных с геном дистрофина фланкирующих маркеров нами была проанализирована промоторная область гена с помощью SSCP-анализа и рестрикционный анализ области сар-сайта, для которого известны два различных варианта последовательности ДНК. Для этого нами была выбрана пара праймеров для амплификации 518 н.п. промоторной области ДНК ( + 49 - -498). Затем проводили амплификацию с мечеными праймерами и анализировали полученные фрагменты ДНК после рестрикции EcoRI, разрезающей амплифицированный фрагмент в сайте -135, в денатурирующем полиакриламидном геле при температурах 6'С и 20'С. В 13 анализированных хромосомах не было обнаружено полиморфизма.

Для проверки возможного полиморфизма в районе сар-сайта гена дистрофина нами была синтезирована пара праймеров, фланкирующих этот участок, и , подобраны условия проведения ПЦР. Отличия, наблюдаемые в последовательностях ДНК в районе сар-сайта гена дистрофина, предложенных двумя группами авторов, должны были приводить к различиям в наборе фрагментов рестрикции амплифицированного участка по рестриктазам Sau ЗА I и Hinf I. В

24 независимых хромосомах набор фрагментов рестрикции для обоих ферментов соответствовал геномной версии. Это может быть объяснено наличием очень редкого ПДРФ по данным рестриктазам, который не может иметь применения в практической ДНК-диагностике в популяции нашей страны, или ошибкой клонирования кДНК.

Анализ дслсций в гене дистрофина.

В случае миодистрофии Дюшенна/Беккера основным типом мутаций, приводящих к возникновению заболевания, являются крупные делеции. Для поиска и анализа таких делеций используется несколько различных методов; один из наиболее эффективных . - метод мультиплексной амплификации, который состоит в одновременной амплификации фрагментов нескольких окзонон гена. Во-первых, этот метод, как и псе методы, основанные на амплификации, является быстрым, простым и воспроизводимым. Во-вторых, он требует минимального количества материала, что может быть весьма важным для лренатальиой диагностики. В-трстьих, он является точным, так как направлен непосредственно на регистрацию повреждения ДНК, приводящего к возникновению заболевания. В-четвертых, он устойчив к различным методическим ошибкам. Данный метод мы используем для пренаталыюй диагностики МДД и для подтверждения диагноза заболевания.

Всего нами проанализированы на делеции в гене дистр^Фина по экзонам 6, 8, 17, 19, 42, 45, 47, 48, 50, 52 образцы ДНК 88 пациентов с диагнозами миодистрофия Дюшенна и миодистрофия Беккера. Все обнаруженные делеции представлены на рис. 1. В целом спектр обнаруженных делеций сходен с таковым для популяций Западной Европы. Характерными чертами делециониого спектра являются наличие двух "горячих" районов образования делеций. Один из них приходится на 6 - 8 экзоны (5'-. район), другой - на 45 -48 экзоны (3'- район), причем на 3'- район приходится наибольшая доля делеций. Более тонкое сравнение делеционных спектров позволило выявить ' некоторые небольшие, но достоверные различия между полученными нами результатами и наблюдениями, проведенными в большинстве стран Западной Европы. Эти изменения касаются нескольких связанных между собой параметров делеционного спектра,

в частности, частоты делений экзонов 17 и 19, которая у наших пациентов выше, чем в большинстве популяций стран Западной Европы. На рис. 2 приведено сравнение спектра делеций проанализированных нами пациентов с аналогичными данными, полученными в Уэльсе. Различия в частоте делеций экзонов 17 - 19 достоверны (р«0.01). Мы также провели анализ объединенных данных, полученных в нашей лаборатории, и лаборатория пренатальной диагностики, Институт акушерства и гинекологии, Санкт-Петербург, зав. проф. Баранов B.C. В Санкт-Петербурге было проанализировано 76 пациентов, и обнаружено 37 делеций. Сравнение спектра делеций, обнаруженных в России, с суммарным спектром делеций в популяциях Уэльса, Англии, Нидерландов и Италии также выявили значимое различие в частоте делеций экзонов 17 и 19 (р«0.01). По крайней мере в двух исследованиях (Финляндия, Северная Америка, штат Техас) получены сходные с нашими частоты экзонов 17 и 19. Мы рассмотрели 4 различные гипотезы, способные объяснить наблюдаемой нами явление: (1) методические ошибки, (2) полиморфизм последовательностей ДНК в районе отжига праймеров (NAFNAP - Non Amplification from Non-Annealing of a Primer), (3) различия мутагенных факторов, (4) различия в последовательностях ДНК, приводящее в изменению вероятности возникновения делеций в определенных районах. Экспериментальные данные не вполне согласуются с гипотезами 1, 2 и 4, и они представляются нам маловероятными. ' Различия в мутагенных факторах могут быть причиной в различия спектра делеций. По некоторым данным, часть делеций образуется за счет СХО. Для того, чтобы сравнить индукцию СХО разными индуцированными воздействиями, мы разработали систему, позволяющую определить вклад в индукцию двух различных типов первичных повреждений - моноаддуктов и межннтевых сшивок ДНК. Межнитсвая сшивка препятствует репликации ДНК и не может быть репариропана за счет безошибочных путей репарации, поскольку повреждены обе нити в одном локусе. Таким образом, можно предположить, что эти типы первичных повреждений играют принципиально различную роль в индукции СХО. Нами была разработана экспериментальная система, позволяющая не только разделить эффект этих двух типов первичных повреждений, но и

1 Т 1

-ГЗ

1

— —

вг

=

|

—

|—' нслслстиронашшй зкзон псисслслопанная область делегированный экзом

—

-

-1 - :_ — — - — __ — "_ —

Е~

--

—

—

; — —

; ; .1

: ' : — Е: — Е

- .Е Е —

— — — — —

—

■7 -. I .. — 1 "Е Е = Е~

— — - — —

—

;Е — г-'г4— ■ III Е _

— —

— -4-

Рис. 1. Делении в гене дистрофипа у больных МДД (г. Москва)

/о

25" 20" 15" 10 5

0

%

25 20" 15 10 5 " 0"

Москва

¿/зо

15/87

3/52 8/85 7/85 2/37 2/29

3/81 Г™1 3/83

•

| | 1.......1 1 0/37

1 6 1 в 1 " 1 4' 4 4 5 4 7 5 0 1 л?.1

Уэльс

28/164

32/164

11\164

.а/16*, 6/164

¿¿¿¿¿ 2/164 1/164 I 1 "— ■ ' I ' ■ ■1 1

В II Г~7~|| 1 9 || 4 г ||~~4 4 || 45~]| 4 7 11 5 0 11 52

27/164

11/164

Рис.2. Спектр делеций экзонов гена дистрофипа у пациентов в Москве и Уэльсе 16

&

оценить их вклад в индукцию СХО количественно. В качестве . идуктора первичных повреждений использовали 8-метоксипсорален (8-МОП), способный под воздействием УФ-света ковалентно присоединяться к ДНК с образованием как моноаддуктов, так и мсжнитевых сшивок. В качестве источника облучения использовали УФ лазер с длительностью импульса 10 нсек (меньше времени жизни возбужденного состояния молекулы 8-МОП), что позволяло получить после облучения одним импульсом только моноаддукты. Количество моноаддуктов в модельных экспериментах определяли с помощью меченого 8-МОП. Затем несвязанный с ДНК 8-МОП отмывали и проводили повторное облучение для определение параметров второго этапа реакции с образованием мсжнитевых сшивок. Количество межнитевых сшивок ДНК определяли электронномикроскопически в денатурирующих условиях. Определение параметров реакции позволило провести аналогичные количественные эксперименты на культурах клеток китайского хомячка и лимфоцитах человека. Исследования, проведенные нами, показали, . что спонтанные СХО и СХО, индуцированные моноаддуктами и межнитевыми сшипкамн, распределены вдоль 1 хромосомы клеток китайского хомячка различным образом. Более того, эффективность межнитевых сшивок в индукции СХО очень высока (3-8 сшивок на 1 СХО в отсутствии насыщения для клеток китайского хомячка). Из этого, например, следует, что незначительное повышение в среде мутагенного фактора, индуцирующего в ДНК межнитевые сшивки, может приводить к значительному изменению распределения СХО вдоль хромосомы и, таким образом, к изменению спектра делеций в гене дистрофина. Однако прямых подтверждений роли мутагенных факторов в изменении спектра делеций пока не получено.

Некоторые особенности оценки генетического риска при использовании методов ДНК-диагностики.

При ДНК-диагностике миодистрофии Дюшенна и оценке генетического риска необходимо учитывать некоторые особенности структуры гена и специфику мутагенеза. Разнообразие мутаций и значительный размер гена дистрофина осложняет проведение прямой

ДНК-диагностики. Эффективность прямых методов (понимаемая как доля пациентов, у которых может быть зарегистрирована мутация) составляет 30 - 60% в зависимости от финансовых возможностей лаборатории.

Главным фактором, осложняющим использование косвенных методов ДНК-диагностики МДД, является большой генетический размер гена (около 12 сМ). Это означает, что даже для внутригениых маркеров существует значительная вероятность рекомбинации с сайтом повреждения, оцениваемая для наиболее известных маркеров в 0.05. Метод фланкирующих маркеров по оценке Abbs et al. (1991) снижает вероятность нарушения сцепления сразу с парой маркеров до величины, несколько меньшей 0.015. При этом авторы не учитывают вероятность того, что две рекомбинации между маркерами могут не фланкировать сайт повреждения. Проведенные нами уточненные расчеты (без учета интерференции) показали, что вероятность ошибки не должна превосходить 0.5%. Дальнейшее снижение этой величины может быть достигнуто за счет использования трех маркеров - дну" фланкирующих и одного внутреннего, предложенное нами еще в 1986 году, а затем выдвинутое английскими исследователями. Однако более" оптимальной представляется следующая схема. Определяется набор высокоинформативных маркеров, расположенных в разных районах гена дистрофина, и все они испытываются для каждой семьи. Если информативных маркеров оказывается несколько, то рекомбинации во внутренней по отношению к ним части гена маловероятны, и, следовательно, определенность диагностики повышается.

Расчеты показывают, что использование двух внутригениых маркеров (например, pERT87 и Р20) вместо одного снижает риск ошибки примерно впятеро, причем основной вклад в эту величину вносят вероятности рекомбинаций между маркерами и концами гена. Использование большего количества маркеров более оптимально распределенных по гену позволит уменьшить эту величину. Как показывают расчеты, для оптимально расположенных внутригениых маркеров генетические расстояния между маркерами должны быть примерно равны, удвоенные расстояния от крайних маркеров до края гена - примерно равно одной трети квадрата расстояния между соседними маркерами. Разумным компромиссом между стоимостью

исследования и уровнем определенности ДНК-диагностики в настоящее время можно считать использование трех маркеров. Учитывая возможную неинформативность, необходимо одновременно использовать 5-6 маркеров. Но даже использование идеального набора полиморфных маркеров не может помочь примерно в 11 - 12% случаях, когда в гене дистрофина обнаруживается рекомбинация.

Таким образом, и прямые, и косвенные методы имеют принципиальные ограничения. Учитывая значимость различных целей ДНК-диагностики, эффективность, длительность и стоимость различных процедур, оптимальной представляется следующая общая схема ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна:

На первом этапе у больного проводится поиск делений мультиплексной амплификацией с использованием примерно 10 пар праймеров. При положительном результате этот подход используется для пренатальной диагностики. В случае, если, кроме того, необходимо определение носительстпл, или при отрицательном результате поиска делений, проводится поиск информативных инутрш'спних маркеров. Набор используемых для этой цели маркеров должен по возможности удовлетворять требованиям, описанным выше, и, кроме того, методика определения аллелей полиморфного маркера, должна быть основана на использовании ПЦР и быть достаточно простой.

Оценка генетического риска не ограничивается описанными проблемами. Так, традиционные методы оценки генетического риска с учетом дачных ДНК-диагностики не учитывают явления гонадного мозаицизма. Строгай учет этого явления в настоящее время невозможен, поскольку пока неизвестны некоторые параметры процесса образования мутаций . в гене дистрофина в гонадных клетках, однако при генетическом консультировании в некоторых семьях следует учитывать это явление. Проведенные нами оценки возможного влияния гонадного мозаицизма на изменение оценки генетического риска дают меньшее отклонение, чем наблюдается реально. Наблюдаемые случаи гонадного мозаицизма могут быть удовлетворительно объяснены, если предположить, что вероятность мутаций на протяжении первых делений оплодотворенной яйцеклетки значительно выше, чем на последующих.

Другая проблема, с которой приходится сталкиваться при ДНК-диапЮ6П'ке МДД, состоит в том, что существующие методики оценхи

генетического риска с учетом данных ДНК-диагностики (в том числе и разработанная нами модификация) слишком сложны для практического использования врачами-генетиками. Существующие компьютерные программы (в том числе и разработанная нами) недостаточно общие, а разработка более совершенных требует существенных затрат.

Изучение мутации в гене 21-гидроксилазы и разработка методов ДНК-диагностики недостаточности 21-гидроксилазы.

Ген, ответственный за синтез этого фермента, 21-гидроксилаза В (CYP21B) и псевдоген 21-гидроксилаза А (CYP21A) организованы в тандемные повторы с высокой гомологией вместе с генами комплементов С4В и С4А соответственно на 6 хромосоме между локусами HLA-B и IILA-PR. Из-за высокой степени гомологии между повторами гомологичная рекомбинация и генная конверсия

обуславливают большинство мутаций данного локуса. Неравная рекомбинация может приводить к различному количеству тандсмиых повторов, а также к образованию химерных генов в том случае, если рекомбинациоиное событие произошло внутри гена. Генная конверсия может привести к потенциально неактивному химерному гену CYP2IB-CYP2IA. При таком специфическом типе мукиинсза большинство потенциальных мутаций присутствуют в геноме как нормальные последовательности псевдогена, и методы, направленные непосредственно на регистрацию мутантных последовательностей, оказываются неэффективными.

Для настоящего исследования мы выбрали подход, основанный на количественной амплификации фрагментов ДНК, включающих часть 3 и 8 экзонов. Последовательность праймеров, выбранных нами для амплификации, общая как для гена, так и для псевдогена, но в амплифицированных фрагментах существуют различия. Фрагмент ДНК, амплифицированный с матрицы псевдогена, содержащий фрагмент экзона 8, имеет сайт Pst I, который отсутствует в гене. Таким образом, электрофорез фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции рестриктазой Pst I позволяет регистрировать не только делеции всего гена, но и результаты гомологичной рекомбинации в

анализируемой части гена (см. рис. 3), причем более простым, надежным и быстрым способом, чем блот-гибридизация.

СУР21А

СУР21В

СУР21А

СУР21В

150

158

РгП

244С43 148

96

Н М Н М

а б

Рис. 3. Схема регистрации мутаций (типа генной конверсии или делении) в 3 и 8 экзопах гена 21-гндроксилазы 11 Н - нормальная последовательность гена. М - мутантная последовательность гена в гомозиготном состоянии.

Один из вариантов нуклеотидной последовательности гена позволял предполагать наличие в том же амплнфнцироканном фрагменте сайта рестрикции Пат Ш, который отсутствует в псевдогене. Использование двух рестриктаз для того, чтобы различить последовательности гена и псепдогена, позволило бы увеличить надежность метода, но в нашей популяции из 12 проанализированных хромосом не было обнаружено ни одного гена, содержащего сайт рестрикции Ваш Ш.

При амплификации части 3 зкзона генов СУР21А и СУР21В образуются два фрагмента ДНК различной длины, поскольку в последовательности псевдогена имеется делеция протяженностью 8 нуклеотидов. Если ген отсутствует, или в нем произошла мутация в

исследуемом районе, после амплификации обнаруживается лишь один фрагмент, соответствующий последовательности псевдогена (рис. 3).

Особое внимание было уделено контролю результатов количественной амплификации. Для этого:

1. Все эксперименты повторяли по крайней мере дважды для проверки воспроизводимости результатов.

2. Количественное определение результатов амплификации проводили с помощью анализатора изображений (определяли интегрированную оптическую плотность полос на негативе, соответствующих полосам в геле).

3. В каждом случае подтверждали менделсвское наследование делеций/дупликаций при анализе родителей, а при наличии сибсов, кроме того, проверялось мсидслевскос наследование делении с помощью анализа наследования аллелей локусов 11 LA А, В, С, DQA1.

Соотношение ген/псевдоген может быть различным (1:3 в случае генной конверсии, 1:2 в случае делеции, и ряд сходных отношений, например, в , случае дополнительной дупликации гена или псевдогена), и эти различия не разрешались достоверно с помощью используемого нами метода. Поэтому соотношения ген/исевдоген фиксировали либо как полную делецию гена или псевдогена (0/+ или +/0), либо как большее (»), меньшее («) или равное (1:1). Количественный ПЦР-анализ позволяет регистрировать мутации в гетерозиготном состоянии и повышает эффективность данного метода.

Анализ мутаций в гене 21-гидроксилазы в 3 и 8 экзонах был проведен для 31 пациента с недостаточностью 21-гидроксилазы из 29 семей, их родителей и (по возможности) сибсов (Табл. 4). Для каждого обследованного сотрудниками РНИЦПАиГ были определены аллели генов HLA А и В иммунологическими методами. Кроме того, для большинства больных мы определили аллели гена HLA DQA1 с помощью амплификации/рестрикции. Для разделения аллелей гена II LA DQA1 мы предложили использовать модификацию метода, основанного на амплификации с последующей рестрикцией. Данный метод позволяет без использования дополнительных олигонуклеотидных зондов, процедуры мечения и гибридизации определять 5 аллельных состояний гена.

Количественный ПЦР-анализ 3 1 экзона и анализ с помощью амплификации/рестрикции 8 экзона в нашей популяции оказались достаточно эффективны для регистрации мутаций в гене СУР21В у пациентов с недостаточностью 21-гидрокснлазы. Мы обнаружили мутации в 22 хромосомах из 59 обследованных (примерно 37%).

Таблица 4. Мутации в 3 и 8 экзонлх в хромосомах больных с недостаточностью 21-гндрокснлазы и ганлотнпы этих хромосом по локусам НЬА А, В, 0(}А1.

N КЛШ1ИЧ. форма этпнч. происхо- ША А.В Н1А одА1 ген/пссвлогсн

ждение :>► зон 3 экэон 8

1 ЯШ Гус. ЛЗ/Л9.П12/П47 N1' 1/1 ыт

21-" 1о Рус. . Л2Х.И14/Л19.1П4 (1.1.1.21/(4.1.4.2) » */*

2 ЯШ Гус. Л2.Ч.1И4/Л19.1114 (1.1.1.21/(1.1.1.2) 0/4

3 я* Гус. А9.Ш4/7.1П4 (1.1.1.21/(1.1.1.2) 0/* +/+

4 Пол. АЗ.Н40/А9.В40 (2.4.31/(4.1.4.21 0/4 0/+

5 я* Поч. ЛЧ,|1.Я5/ЛИ.П5 3/3 1/1 ♦А

6 я* Пол. Л.1.11.1Л/Л.1.1Ш (4.1.4.21/(4.1.4.2) 1/1 «А

7 ЯШ II 0,1. А3,?/Л40,? (2.4.31/3 */*

Я ЯШ Рус. Л1.1Ш/ЛЗ.И12 (1.1,1.21/1.3 1/1 +А

9 ЗУ Рус. N Г (2.4.31/1.3 1/1 */*

10 ЯШ Рус. ЛЗ.П40/Л10.В7 (2,4.3)/(1.1.1.2) 1/1 ♦А

11 ЯШ Рус. Л2.П5/Л2.П40 3/(1.1,1 2) V* +А

12 ЯН' Гус. Л.1.1147/7.117 (2.4 .11/(1.1,1.21 « •А

14.1 Я*' ¡'ус. Л1.П40/А\\1Ш (2.4..11/3 1/1 ♦ А

14.2 ЯШ Рус. А1.В40/А7.1Ш (2,4.31/(1.1,1.2) 1/1 */*

15 5У Рус. Л.1.1Ш/ЛЗ.Н40 (1.1.1.21/(4.1,4.2) 1/1 */*

16 Зш Рус. А.1.И47/А9.1116 (2.4.31/3 1/1 + А

18 3*' Рус. ЛЗ.Н40/Л 1 1.1114 (1.1.1.21/(2,4.3) 0/+ */>■

19 ЗШ Р)С. Л1.П14/Л.Ч2.т4 (1.1,1.2 >/<1.1.1.21 0/+

20 ЗУ Рус. Л2.Ш5/ЛЗ.И7 (1.1,1.21/(2.4 31 » +А

21 ЗШ Рус. ЛЗ.В7/Л.1.В40 (4.1,4?>/<|.1,|.21 ♦А

22 5Ш Рус. А23.Ы 4 /7,1144 (1.1.1.21/(4.1.4.2) • ♦А

23 ЯШ Рус. А3.1147/л;б.1И6 12.4 Л/3 1/1 ♦А

24 Рус. Л1.115/Л2Я.1Ш (1.1.1.21/(4.1,4.2) 1/1 ♦А

26 ЯШ Рус. Л1.П47/Л32.В35 (1.1,1.21/(2,4.3) « */*

27 ЯШ Рус. А10.В40/Л19.В14 (1.1,1.21/(1.1,1.21 «

28 ЯШ Рус. АЗ.В47/А?.В14 (2.4.3)/(1.1,1.2) 0А

29 1о Рус. . Л2/А7.П13/В14 (1.1,1.2)/(2.4.3) » «

30 ЯШ Рус. А2.В5/А19.В35 (1.1.1.21/3 « 0/+

31 БШ Рус. АЗ.В7/АЗ.В47 <4.1,4.2>/(2/4.3> 1/1 1/1

.33 Л» Рус. ЛТ 1.3/(2.4.3) 0/+ N7

Данный подход позволил также выявить мажорную мутацию в нашей популяции, которая ответственна за тяжелую форму заболевания. Эта мутация сцеплена с аллелем В14 и 0<ЗА1*0101 или 0102 (в наших экспериментах мы не различали эти аллели), но не сцеплена с определенным аллелем гена А. Это может быть связано с достаточно большим возрастом мутации (наличие нескольких независимых однотипных мутаций, сцепленных с одним и тем же гаплотипом является практически невероятным событием). Мутация характеризуется, в частности, делецией 8 нуклеотидных пар в 3 экзоне, характерной для последовательности псевдогена. Вероятно, данная мутация представляет собой событие типа конверсии гена, которое включает по крайней мерс часть 3 экзона, но не включает 8 экзон. Частота этой мутации среди русских весьма велика (23% хромосом пациентов с сольтеряющей формой АГС в наших исследованиях). Достаточно неожиданным является тот факт, что данная мутация крайне редка, если вообще- обнаружена, в западноевропейских "популяциях.

Сравнимая по частоте мутация (0.1 - 0.15 среди классических случаев недостаточности 21-гидроксилазы), приводящая к тяжелой форме АГС, в Западной Европе сцеплена с гаплотипом 01?7 АЗ В47 и является делецией всего гена 21-гидроксилазы В. Сцепление с определенным аллелем гена IIЬА А свидетельствует о более молодом возрасте западноевропейской мутации. Данная мутация также встречается в нашей популяции (характерный гаплотип АЗ В47 и отсутствие нормальной последовательности 3 экзона).

Методические аспекты разработки ДНК-диагностических процедур.

Методические аспекты чрезвычайно важны как для практической ДНК-диагностики, так и для научных исследований, направленных на создание или оптимизацию процедур ДНК-диагностики. С точки зрения ДНК-диагностики следует в значительной степени опираться на использование ПЦР вместо блот-гибридизации, и использовать по возможности методы, исключающие радиоактивное мечение. Поэтому одним из принципов нашей политики в области использования определенных методов является использование и разработка

амплификационных методов ДНК-диагностики. Этот принцип был нами реализован при разработке методов амплификацнонной регистрации аллелей локуса рЕЯТ87-1 (с помощью секвенирования участков ДНК, фланкирующих полиморфный локус) для ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна, трех полиморфных маркеров в районе локуса С8 (на основе известной последовательности ДНК) для диагностики хореи Гсптингтона.

Другим принципом является ориентация на микросателлитные полиморфные маркеры как в исследованиях, так и в диагностике. Во-первых, такие повторы имеют в среднем более высокую информативность по сравнению с традиционными диаллельными локусами (обычно информативность составляет 0.5 - 0.8), они часто расположены в геноме (только микросателлит СЛ встречается в среднем каждые 30 т.н.п.), их легко обнаружить в геноме (например, с помощью гибридизации с синтетическими олиго- или полинуклеотидными последовательностями, различными приемами, использующими амплификацию), и, кроме того, такие повторы рекомендованы в качестве маркерных локусов при картировании генома человека. Исследования по картированию локуса РЙПА были основаны на использовании только микросателлитных локусов, вновь организованная ДНК-дилшостикл спинлльпой амиотрофин также основана только на использовании микросателлитных повторов.

Существуют, однако, методические сложности при регистрации аллелей такого полиморфного локуса. Аллели дннуклеотидных микросателлитных повторов различаются по длине на 2 нуклеотида, и для надежной регистрации различия между аллелями используют наиболее высокоразрешающий денатурирующий полиакриламидный гель, в котором выявляют радиоактивно меченые однонитевые фрагменты ДНК. При таком подходе часто наблюдаются дополнительные полосы сходной интенсивности, обычно соответствующие фрагментам ДНК на 2-4 нуклеотида более коротким, чем истинные аллели, что значительно затрудняет анализ гентипов. Нерадиоактивное определение аллелей используется редко из-за того, что __ для получения удовлетворительных результатов необходимо тщательно подбирать условия, и не для каждой пары праймеров такие условия удается подобрать. Наконец, существуют определенные ограничения на

разделение близкорасположенных аллелей (для микросателлитов СА они различаются на 2 нуклеотида) в неденатурирующем полиакриламидном геле.

С помощью используемых нами приемов нам удалось улучшить почти все оригинальные методики амплификации микросателлитных повторов, в том числе разработать нерадиоактивные методы регистрации большинства из них, а также разработать достаточно эффективные методы регистрации обнаруженных нами микросателлитных повторов.

Определение дозы определенного фрагмента ДНК является важной задачей для регистрации делеции в гетерозиготном состоянии. Как гибридизация, так и амплификация, не могут быть отнесены к точным количественным методам, поскольку на конечный сигнал влияет большое количество фактором, часть из которых плохо изучена или не поддается эффективному контролю и, кроме того, точность измерения самого конечного сигнала невелика.

В случае амплификации предполагалось, что отношение количества амплифицированных фрагментов к исходному количеству матриц должно сохраняться только в фазе экспоненциального роста. При разработке методики количественной амплификации фрагмента гена 21-гидроксилазы оказалось, что соотношение интенсивности полос в определенных пределах слабо зависело от количества циклов, в том числе и в той области, когда экспоненциальная фаза роста к тичества фрагментов, очевидно, закончилась. Мы полагаем, что насыщение без изменения соотношения количества амплифицируемых фрагментов будет также происходить в случае, если исчерпывается общий для обоих реакций ресурс: ДНК-полимераза или дезоксинуклсотидтрифосфаты, при этом соотношение концентраций праймеров и синтезированной матрицы будет по-прежнему велико. Дальнейшее изучение количественной амплификации в этом направлении может привести к разработке нового класса количественных амплификационных методик.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований по картированию патологических генов человека с одной стороны, и совершенствования молекулярно-

генетических методов - с другой, в < развитых странах сформировалось, а в нашей стране формируется направление исследований, направленное на создание ДНК-диагностических процедур на основе картирования и изучения тонкой молекулярной структуры генов человека.

Организация типичного исследования в рамках данного направления предполагает создание медико-генетического проекта с общим финансированием, создание нового или модификацию существующего генетического регистра, стандартизацию диагностических критериев в соответствии с нормами, сложившимися при картировании интересующего гена, организацию системы получения образцов ДНК больных и членов их семей, организацию либо помощь в организации генетического консультирования, практическую ДНК-диагностику.

Собственно научные проекты могут включать любые работы по тонкому генетическому картированию патологического гена, непосредственно исследования по поиску гена, изучение мутаций, создание новых или оптимизация известных методов ДНК-диагностики изучаемого заболевания.

Важнейшей особенностью этого направления является обязательное сочетание научного и практического направлений. С одной стороны, практическая ДНК-диагностика поставляет необходимый ценный, а подчас и уникальный генетический материал для научных исследований, с другой - проводимые научные исследования позволяют постоянно совершенствовать методы ДНК-дна:иостики. Такой характер исследований предопределяет необходимость тесного сотрудничества врачей и генетиков в рамках одной темы и (много, целенаправленного финансирования.

Кроме того, в развитых странах больше? внимание уделяется этическим и юридическим аспектам разработки 1 использования ДНК-диагностических процедур, и на пути исследования этих проблем получены значительные результаты, которые I значительной мере могут служить прообразом решения аналогичнгх проблем в нашей стране. Однако, во-первых, решение этических и юридических проблем нельзя слепо переносить из одного общества в доугое, тем более с очевидными различиями как в этике, так и в инс мтуте права, и во-вторых, в нашей стране отсутствует инфраструкура, с помощью

которой можно было бы реализовать рекомендации, выработанные в процессе специальных исследований в других странах.

В настоящее время в нашей стране отсутствуют законы или рекомендации, регламентирующие проведение ДНК-диагностики. Другим важным негативным фактором является отсутствие системы психологической помощи, врачебного наблюдения, необходимого при получении информации, имеющей решающее значение для прогноза будущего здоровья, особенно в тех случаях, когда речь идет о прогнозе неврологических заболеваний, повышающих вероятность суицидальных попыток. В данных условиях возрастает роль людей, непосредственно принимающих участие в процессе медико-генетического консультирования. К ним относятся: врач, наблюдающий семыо, врач-генетик, врач-эксперт и, возможно, специалист, проводящий ДНК-диагностику.

Очевидна необходимость проведения соответствующего исследования. Пока нет квалифицированно выбранной стратегии в данной области, мы считаем необходимым ознакомить врачей-генетиков с методами консультирования при ДНК-тестировании, применяющихся в развитых странах, и рекомендовать в основном руководствоваться ими.

Исследования по тонкому генетическому картированию и изучению тонкой молекулярной структуры генов имеют не только очевидный практический смысл, но и большое знач«. <с для фундаментальной науки. Благодаря исследованиям гена дистрофика и мутаций в нем обнаружены такие необычные явления, как повышенная частота рекомбинаций, "горячие" области делений, привлечено внимание к проблеме гонадного мозаицизма, получены важные данные о структуре этого гена. Изучение мутаций в гене 21-гидроксилазы В обнаружило необычный характер мутагенеза этого гена. Картирование гена, ответственного за хорею Гентингтона выявило область повышенной рекомбинации. Картирование генов и изучение мутаций, ответственных за возникновение синдрома Мартина-Белла и миотонической дистрофии позволило обнаружить принципиально новый тип патологических мутаций.

Следовательно, как научная дисциплина, тонкое генетическое картирование и изучение молекулярной структуры генов является исключительно продуктивной.

Таким образом, тонкое генетическое картирование и изучение тонкой молекулярной структуры генов представляет собой новое сложившееся направление генетики со своей целью, задачами, методами исследования, объектами исследования, значимыми результатами и перспективными направлениями дальнейших исследований.

Представленные в настоящей работе научные исследования отражают разные этапы тонкого генетического картированию и изучения молекулярной структуры генов рахтичных локусов с использованием разных методических подходов. Исследования локуса спинальной амиотрофии соответствуют наиболее раннему этапу, когда генетическое картирование патологического гена еще недостаточно точное для анализа неравновесного сцепления. В данном случае налажен сбор генетического материала, определяются частоты аллелей тесно сцепленных полиморфных локусов, организована работа по ДНК-диагностике. Для локуса Р1?Г>Л, кроме подобной работы, проведен поиск полиморфных микрослтеллитных маркеров в области предположительной локализации гена, определены частоты аллелей нескольких полиморфных маркеров, проводится работа по тонкому генетическому картированию локуса с помощью картирования рекомбинационных событий в этой области и анализа неравновесного сцепления. Для совершенствования ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна определены частоты аллелей часто использующихся полиморфных локусов, разработана методика определения аллелей локуса рПЯТ87-1 на основе ПЦР (путем секвенирования области, содержащей полиморфный сайт, подбора праймеров и условий амплификации), проведен поиск дополнительных полиморфных маркеров, проанализирован спектр делеций у пациентов с МДД. Для гена 21-гидроксилазы разработана методика регистрации некоторых мутаций в гене, выявлена мажорная мутация в нашей популяции, не зарегистрированная в западноевропейских и североамериканской популяциях, предложена методика косвенной ДНК-диагностики на основе определения аллелей гена Н1А Б<ЗА1 с помощью

амплификации/рестрикции. Таким образом, представленная работа достаточно полно представляет данное направление исследований с точки зрения набора используемых методов, разных локусов, этапов исследования и научных задач.

ВЫВОДЫ.

1. IIa основе модификации известных и разработки новых методов разработаны и внедрены в практику методы ДНК-диагностики спиналыюй пмиотрофии, атаксии Фридрсйха, хореи Гептингтона, миодистрофий Дюшснна и Беккера, недостаточности 21-гидроксилазы.

2. На основе новых методических подходов разработаны методы инализа мутации в гене 21-гидроксилазы и косвенной ДНК-диагностики недостаточности 21-гидроксилазы. Обнаружена мажорная для популяции страны мутация, инактивирующая ген за счет делении

8 нуклеотидов в 3 экзоие и . сцепленная с аллелями. В14 и , DQAl'0101/0102. Предположительно данная' мутация является результатом генной конверсии. Данная мутация, сцепленная с аллслсм В14, практически не встречается в других популяциях. •

3. Обнаружены, картированы и изучены 3 новых ' микросателлитных полиморфных маркера в районе предположительной локализации гена FRDA, показана их эффективность для проведения тонкого генетического картирования и ДНК-диагностики атаксии Фридрсйха. Показано отсутствие доминирующей мутации в локусе

Г К IM Ii популяции страны.

4. Показана эффективность нерадиоактипной регистрации аллелей микросателлитных полиморфных локусоп для картирования генов и ДНК-диагностики.

5. Сформулированы некоторые важные элементы создания ДНК-диагностических процедур- на основе картирования и изучения патологических генов: (1) тесное сопряжение молекулярно-генстического проекта с медицинской частью проекта, (2) необходимость организации научно-исследовательской программы исследования структуры патологического гена (если он известен), характера мутаций и особенностей мутационного процесса, популяционной специфичности мутаций, факторов, влияющих на оценку генетического риска (фенокопии, ошибки диагноза, импринтинг,

неполное доминирование), (3) преимущественное использование методик, основанных на амплификации и (4) микросателитных повторов в качестве полиморфных маркеров (особенно на стадии картирования гена).

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.А.Бомко и др. "Структурно-функциональная организация, мутации и потенциальные изменения."// Отчет ВНТИЦ за 1976-1980 гг. инв. N Б982124, per.N 76063504, M. 1981.

2. Евграфов О.В., Македонов Г.П., Федотов А.Р., Тиняков В.Г. "Способ определения моноаддуктов и диаддуктов ДПК."// Авторское свидетельство N 1028719, 1983, бюлл. 26.

3. Македонов Г.П., Евграфов О.В. "Молекулярные механизмы образования сестринских хроматидных обменов и структурных мутаций хромосом."// В кн. "Мутагенез и репарация в системе вирус-клетка", М., с.38-73, 1983.

4. Evgrafov О.V., Bautista M.R.L. "Efficiency of SCE induction by 8-methoxypsoraIen momoadducts and crosslinks in the first and subsequent cell cycles."// XIV Annual meeting of the European Environmental Mut. Soc., Abstracts p.151-152, 1984, M.

5. Евграфов O.B., Сафронов В.В., Евграфова И.II., Македонов Г.П. "Распределение спонтанных и индуцированных 8-метоксипсораленом сестринских хроматидных обмнов по длине первой хромосомы клеток китайского хомячка."// Генетика, т.21, 4, с.586-590.

6. Евграфов О.В., Г.П.Македонов "Молекулярные механизмы индукции сестринских хроматидных обменов."// в кн. "Рекомбнногенез и его значение в эволюции и селекции", Кишинев, "Штииица", с.68-72, 1986.

7. Евграфов О.В., Макаров В.Б. "Диагностика миодистрофии Дюшенна с помощью зондов ДНК."// Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова, 1987,- S1-- С. 1732 - 1736.

8. Евгафов О.В., Поляков.. A.B., Зайцева С.П.,_ Малыгина H.A., Бадалан Л.О., Макаров В.Б. "ДНК-диагпостика носительства гена

миоднстрофии Дюшенна."// Молек. генетика, микробиол. и вирусология.- 1990.- 12- С. 15-17.

9. Евграфов О.В., Лавренов A.A., Маругина Г.Г. "Интегрированная система ГенРиск для оценки генетического риска X-сцепленных наследственных заболеваний."// Тезисы докл. Совещания специалистов стран-членов СЭВ "Персональные ЭВМ в задачах премирования и поддержки решей" с.19, М., 1989

10. Малыгина H.A., Евграфов О.В., С.П.Зайцева, А.В.Поляков, Л.Н.Крылова, Л.Н.Каменных "Диагностика носительства гена миодистрофии Дюшенна с помощью зондов ДНК."// Тезисы докл. Всесоюз. науч.-практич. конф. по детской неврологии и психиатрии, Вильюс, 1989, с.56-57.

П.Евграфов О.В., А.В.Поляков, В.Б.Макаров "Молекулярно-генетические методы диапюстики наследственных заболеваний."// II Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата, 1990, тезисы докл., с.140.

12. Н.И.Воронцова, Евграфов О.В., В.Б.Макаров "Высоко:к|>фсктивная трансформация клеток млекопитающих"// II Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата, 1990, тезисы докл., с.83-84.

13. Бадалян Л.О., Малыгина H.A., Евграфов О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Виноградов C.B., Каменных Л.Н., Мизитова О.Н., Заваденко H.H. "Генетическое консультирование семей с прогрессирующей мышечной дистрофией Дюшенна с учетом данных по ДНК-зондовой диагностике."// II Всесоюз. съезд мед. : четиков, Алма-Ата, 1990, тезисы докл., с.32.

14. Евграфов О.В., Лавренов A.A. "Оценка генетического риска в семьях со случаями миоднстрофии Дюшенна."// II Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата, 1990, тезисы докл., с.242-243.

15. Поляков A.B., Зайцева С.П., Евграфов О.В., Мильман Ф.А., Виноградов C.B., Бахарев В.А., Макаров В.Б. "Пренатальная ДНК-диагностика миодистрофии Дюшенна."// II Всесоюз. съезд мед. генетиков, Алма-Ата. - 1990. - тезисы докл.- С. 359-360.

16. Евграфов О.В., Бадалян Л.О., Поляков A.B., Зайцева С.П., Малыгина H.A., Виноградов C.B., Бахарев В.А., Мильман Ф.А., Лисова С.П., Зарецкая E.H., Мизитова О.Н., Макаров В.Б. "Установление носительства и пренатальная диагностика миодистрофии Дюшенна на основе анализа ДНК.""Установление носительства и пренатальная

диагностика миодистрофии Дюшеина| на основе анализа ДНК."// Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова.- 1990.- 8.-С. 29-33.

17. Евграфов О.В., Л.В.Поляков "Способ амплификации фрагмента ДНК неизвестной последовательности, расположнного на некотором расстоянии от фрагмента известной последовательности."// Изобретение, per. N 4826213/13-054707, 15 мая 1990.

18. Evgrafov О.V., Polyakov A.V., Makarov V.B. "Chromosome "minijumping" by means of polymerase chain reaction."// Human gene mapping 11.- 1991.- P. 309-310.

19. Polyakov A.V., Zaytseva S.P., Evgrafov O.V., Malygina N.A., Makarov V.B. "DMD locus: some new data."// Human gene mapping 11. Abstracts.- 1991,- P.223.

20. A.H.I 1олико», C.I1.Зайцева, Евграфов ' O.B. "Использование нерадиоактивно меченых ДНК-зондов для ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна."// Молек. генетика, мнкробиол. и вирусология.- 1991.- 5.- С. 21-23.

21. Евграфов О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Виноградов C.B., Бахарев В.А., Мильман Ф.А., Лисова Т.А., Зарецкая Е.А., Малыгина H.A., Бадалян Л.О., Макаров В.Б. "Пренатальная диагностика модистрофин Дюшенна."// Молек. генетика, мнкробиол. н ' . вирусология,- 1991.- 2.- С. 15-16.

22. Поляков A.B., Стрельченко Л.В., Пугачев В.В., Евграфов О.В. "Использование полиморфизма локуса pP.RT87-l для ДНК-диагностики миодистрофии Дюшенна."// 2-ой Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологин", Самарканд. - 1991. - тезисы докл. - С.156. -

23. Евграфов О.В., Поляков A.B., Пугачев В.В., Стрельченко Л.В. "Обнаружение полиморфного маркера в области гена, ответственного за возникновение атаксии Фридрейха."// 2-ой Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биолопш", Самарканд. - 1991. - тезисы докл. - С. 68.

24. Макаров В.Б., Евграфов О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Малыгина H.A. "МДД локус: некоторые новые данные."// IV Всесоюзная научная конференция "Экологическая генетика растений, животных, человека", Кишинев. - 1991. - тезисы докл. - С. 510.

25. Евграфов О.В., Поляков A.B. ""Хромосомный минипрыжок" с использованием полимеразной цепной реакции."// IV Всесоюзная научная конференция "Экологическая генетика растений, животных, человека", Кишинев. - 1991. - тезисы докл. - С. 507.

26. Поляков A.B., Евграфов О.В., Черников А.И., Макаров В.Б. "Исследование 5' концевой последовательности гена дистрофина."// IV Всесоюзная научная конференция "Экологическая генетика растений, животных, человека", Кишинев. - 1991. - тезисы докл. - С. 512.

27. Малышева О.В., Поляков A.B., Зайцева С.П., Малыгина H.A., Горбунова В.Н., Евграфов О.В., Макаров В.Б., Красильников В.В., Баранов B.C., Бадалян Л.О. "Анализ делеций в гене • дистрофина методом мультиплексной амплификации у пациентов, страдающих миодистрофисй Дюшенна."// Молск. генетика, микробиол. и вирусология.- 1991.- 5-6. - С. 27-31.

28. Евграфов О.В., Гроппа С.А., Проскурина Л.А., Тагнев Э.Ш. "Использование метода полимеразной цепной реакции в пресимнтоматической диагностике хореи Гентинпона."// В кн. "Наследственные болезни и медико-гепетич. консультирование" М., МОНИКИ.- 1991.- С.75-78.

29. Бадалян Л.О., Гроппа С.А., Проскурина Л.А. Малыгина H.A., Макаров В.Б. "Прссимптоматичсская ДНК-диагностика хореи Гентингтона."// Журнал невропатологии психиатрии им. С.С.Корсакова, т.91, 4, 1990, с.103-105.

30. Гинтср Е.К., Рогасп Е.И., Евфафов О.В. "Анализ сцепления генов наследственных заболеваний у человека."// 2 Всесоюз. конф. "Геном человека - 91", М., 1991 с. 104-105.

31. Евграфов О.В., Макаров В.Б. "ДНК-диагностика наследственных заболеваний."// Итоги науки и техники, серия "Генетка человека" т.9, М.,1991, с.53-126.

32. Евграфов О.В., Гроппа С.А.. "ДНК-диагностика наследственных заболсваий." Методические рекомендации.// Кишинев,1992.

33. A.V.Polyakov, I.G.Dzenis, V.A.Baharev "PCR-based detection of mutations causing 21-hydroxylase deficiency."// 24 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstr. P. 127.

34. Pugachev V.V., Polynkov A.V., Evgrafov O.V. "MicrosnlelHtes from region of possible localization of FRDA locus."// 24 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstr. P. 128.

35. Evgrafov O.V., Baranov V.S., Polyakov A.V., Malysheva O.V., Chuhrova A.L., Artem'eva O.V., Malygina N.A., Gorbunova V.N. "Deletion screening of Duchenne muscular dystrophy patients in Russia: Unusual high frequency of deletions of 17 - 19 exons."// 24 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstr.- 1992.- P.69.

36. Evgrafov O.V., Groppa S.A., Proskurina L.A., Nikulina O.L., Badalyan L.O., Ivanova-Smolenskaya I.A. "DNA diagnosis of Huntington's disease in Russia."// 24 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstr.- 1992,- P.69-70.

37. Evgrafov O.V., Groppa S.A., Proskurina I,.A., Nikulina O.L., Badalyan L.O., lvanova-Smolenskaya I.A. "Predictive DNA testing for Huntington's disease in Russia."// Proceedings Int. Conf. on improving birth quality and .child upgrading, Beijing, eds W.Jieping, Y.Unying.-1992,- P.328.

38. Evgrafov O.V., A.V.PoIyakov, l.G.Dzenis, V.A.Baharev "Detection of mutations causing 21-hydroxylase deficiency."// Proceedings Int. Conf. on improving birth quality and child upgrading, Beijing, eds W.Jieping, Y.Rnying, 1992, p.330.'

39. Pugachev V.V., Polyakov A.V., Sitnikov V.F. Malygina N.A., Dadali E.L., Ivanova-Smolenskaya I.A. "Russian programs of DNA diagnosis of spinal muscular atrophies and Friedreich ataxia."// Proceedings Int. Conf. on improving birth quality and child upgrading, Beijing, eds WJieping, Y.Rnying.- 1992,- P.329.

40. O.V.Evgrafov, A.V.PoIyakov, S.P.Zaytseva, N.A.Malvgina, A.L.Chuhrova, L.O. Badalyan "DNA diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in Moscow."// Proceedings Int. Conf. on improving birth quality and child upgrading, Beijing, eds WJieping, Y.Rnying.- 1992.- P.

41. Evgrafov O.V., Baranov V.S., Polyakov A.V., Malysheva O.V., ' Chuhrova A.L., Artem'eva O.V., Malygina N.A., Gorbunova V.N., Makarov V.B. "Deletion screening of Duchenne muscular dystrophy patients In Russia: unusual high frequency of deletions of 17 or 19 exons."// 4 Meeting of the Society of Human Genetics, Mains. Abstracts. - 1992.-P. 280.

331.

Jaxai N»4343. THpa* 100 okj. ®HpMi "3KcnocrpoflMam".

35