Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ сцепления высокополимерных локусов генома с наследственными заболеваниями человека: врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ сцепления высокополимерных локусов генома с наследственными заболеваниями человека: врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом"

российская академия медицинских наук

медико-гкнетический НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

Но правах рукописи УДК 575.599

Коровайцева Галина Ивановна

Ч.___

анализ сцепления высокополиморфнш локусов генома с наследственными заболеваниям! человека; врожденной катарактой И ладонно-подошвенным гипкркератозш.

03.00.15 - генетика

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики ыозга Научного Центра Психического Здоровья РАМН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук РОГАЕВ Е.И.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук МАЛЫГИНА H.A.

доктор биология.наук, профессор СПШДЫН В.А.

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет им. М.Б. Ломоносова .

Защита состоится "_"_1996 г. в __час._мин.

на заседании Диссертационного совета Д.001.1^.01 при Медико-Генетическоы Научном Центре РАМН (МГНЦ РАМН) по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

-1-

общая характеристика работы.

Актуальность пробремы. Метод генетического анализа основан на использовании генетических маркеров. В качестве таких маркеров могут выступать особенности организма, обладающие рядом определенных свойств. Они должны устойчиво наследоваться и сохраняться в ряду поколений, а также поддаваться количественной или качественной регистрации. Кроме того, при молекулярно-генетических исследованиях выбранные маркеры должны служить индивидуальными характеристиками конкретных участков генома (в том числе и отдельных генетических локусов).

Выделение в геноме нестабильных, гипервариабельных локусов и развитие методов их идентификации привели к созданию маркерных систем и их использованию при популяционных и генеалогических исследованиях (Bell et al., 1982, Chakraborty, 1991, Cooper et al,, 19S5, Orita et al., 1990). Наследование полиморфных вариантов геномных локусов как простых менделевских кодоминантных признаков и их возможное сцепление с дефектными генами при различных наследственных заболеваниях предоставили широкие возможности для картирования генов различных заболеваний (Davies et al., 19,33,' Eiberg et al., 1988).

Относительная простота выявления структурного полиморфизма гомологичных локусов генома позволяет проводить анализ большого числа индивидов одновременно. Это значительно облегчает изучение обширных родословных и позволяет получить статистически значимые результаты анализа сцепления маркерного локуса и гена заболевания.

Картирование генов наследственных заболеваний человека, благодаря использованию универсального принципа генетического маркирования, проводится в настоящее время довольно эффективно. Исследования подобного рода весьма актуальны как в аспекте решения проблем медицинской генетики, так и в аспекте построения полной карты генома человека (Международная научная программа Human Geno me Organization [hugo]). Картирование гена наследственного заболевания является первым этапом на пути выявления первичного биохимического дефекта, приводящего к развитию наследственного заболевания. Поэтому результаты этих исследований часто пс~воляют разработать способы профилактики, лечения и диагностики данного заболевания. Согласно hugo, приоритет в изучении тонкой структуры генома человека отдается тем участкам хромосом, где уже картированы гены, мутации которых приводят к тяжелым наследственным дефектам.

Катаракта является одной из наиболее распространенных врож

денных патологий органа зрения. От 13 до 45® случаев слепоты и 11% ш:ех случаев уменьшения остроты зрения объясняются этим наследственным заболеванием (Хватова, 1971). Учитывая высокий уровень генетической гетерогенности врожденны! катаракт, любые новые сведения о какой-либо из форм заболевания являются важными.

Типичная картина поражения при кератозах представляет собой в норную очерздь косметический дефект. Однако при генерализованных формах патологический процесс распространнен почти по всему телу или нахватывает большие участки кожного покрова. Кроме того» помимо основных клинических проявлений кератозы могут сопровождаться дополнительными неприятными или болезненными эффектами: появлением глубоких трещин по складкам кош, делушением кожи, отечностью и покрасившем кожи на суставных поверхностях и т.д. Поэтому„ хотя данное заболевание и не носит угрожающего характера для жизни человека, оно является достаточно серьезным.

Исходя из псего выше изложенного проблема локализации генов данных наследственных заболеваний представляется нам заслуживающей внимания.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось проведение анализа сцепления генов врожденной катаракты и ладонно-подошвешого гиперкератоза с высокополиморфными локусами геномао

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи;

1. Проверка истинности биологического отцовства и материнства для всех членов полных ядерных семей родословных, отягощенных врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом с помощью полиморфных локусспецифичных "НК-маркеров.

2. Выявление возможной генетической гетерогенности морфологически сходных форм врожденных катаракт.

3. \нализ сцепления генов изучаемой формы врокденной катаракты и ладонно-подошвенного гиперкератоза с высокополиморфными тетя- и микросателлитными маркерами: 1) из областей картирования генов„ первичный биохимический дефект которых может привести возникновению изучаемых наследственных заболеваний; 2) со случайной локализацией в геноме.

4. Определение потенциальной области хромосомной локализации г -нов ладонно-подошвенного гиперкератоза и врожденной катаракты в случае обнаружения сцепления мевду исследуемыми генами и маркерными локусами.

5. Генотиаирование индивидов обеих родословных.

Научная новизна. Нами впервые проведен анализ сцепления врокденной полиморфной катаракты в туркменском изоляте "Нохурли".

-э-

Вровденныв аутосомно-доминантные катаракта обладают высоким уровнем генетической гетерогенности дефектов, лежащих в основе заболевания. В каталоге наследственных заболеваний Мокиа1ок а.у. представленно более десяти различных клинических форм доминантно наследуемых катаракт (Мския1ок„ 1990). Однако неясно, есть ли строгое соответствие числа клиничегааях форм числу генов, вызывающих. катаракту. В нашей работе предсгааяеш результаты, демонстрирующие наличие генетической гетерогенности клинически сходных зонулярных форм катаракт в различных популяциях.

В результате проведенных иссдадопатгй нами впервые были полу чены данные, исключающие локализ'пщго г®ца изучаемой формы врожденной катаракты в ряде геномных локусов*

Несмотря на появившиеся в литературе данные о локализации генов ряда дерматозов, до последнего врэмени ни один из генов тилоза картирован не был. При изучении семей, отягощенных ладонно- подошвенным гиперкератозом (ЛПГ), или тилозом, нами впервые было установлено сцепление гена данного заболевания с маркером 17-ой хромосомы и определена область потенциальной хромосомной локализации ЛПГ-гена: 17411.2-412.

Научно-практическое значение. Выявление сцепления гена тилоза с маркером из области длинного плеча 17-ой хромосомы облегчает дальнейшую работу по определению точной локализации ЛПГ-гена, ограничивая тем самым круг возможных генов-кандидатов данного за 5о -левания.

Дальнейшее изучение генетического дефекта, лежащего в основе врожденной полиморфной катаракты, также может быть ускорено благодаря исключению ряда локусов генома. Кроме того, на основании полученных данных оказалось возможным расширить представления ■ генетической гетерогенности доминантно наследуемых катаракт.Это может иметь важное значение при разработке методов лечения и диагностики данного наследственного заболевания.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Ген ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза) сцеплен с маркером 17-ой хромосомы (значение 1оа=4,65 при 8=0,05).

2. Установлена область потенциальной локализации гена ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза): 17411.2-412.

3. Исключена локализация гена врождённой полиморфной катаракты из популяции "Нохурли" в локусах ряда хромосом.

4. Выявлена генетическая гетерогенность врожденных аутосомных доминантных зонулярных форм катаракт, характеризующихся сходством морфологических проявлений, в различных популяциях.

-45. Мутации в гипервариабельных районах ДНК могут быть выявлены с помощью локусспецифичных ДНК-маркеров, имеющих высокий уровень популяционного полиморфизма (степень гетерозиготности - более

9055).

6. Локусспецифичные марке; . ДНК с уровнем гетерозиготности более 80% могут быть использованы для реконструкции семей в родослов-шх (исключения случайных индивидов, включение в анализ сцепления которых может привести к ошибкам).

Апробация.

Результаты исследования были представлены на Первой международной конференции по ДНК-фингерпринтингу (Берн, 1990 г.), на 3-ей конференции "Геном человека" в 1993 году в г.Черноголовка, на меи-лабораторном семинаре Института клинической Психиатрии НЦПЗ РАМН (1996 г.)

Структура и объем работы.

Работа изложена на 136 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы,экспериментальной части и обсуаде-ния, выводов и списка цитированной литературы (156 работ). В тексте диссертации - 10 рисунков и II таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Ллазмидную дНК выделяли щелочным методом, высокомолекулярную ДНК человека - методом фенольной экстракции (Маниатис и др. 1986),

Все манипуляции с ДНК (электрофорез, гидролиз рестриктазами, олотинг-гибридизация и т.д.) проводились в соответствии с-протоколами, приведенным в руководстве Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1986), иногда с незначительными модификациями.

При подготовке фильтров для блотинг-гибридизации использс ;али вакуумный перенос ДНК на фильтр (Зайцев, Яковлев, 1983) или перенос по Саузерну (Маниатис и др.. 1986).

Радиоактивное мечение ДНК фосфором проводили методом случайного праймирования по методике фирмы АтегяЬат.

илнгонуклеотиднш праймеры дпя полнмеразной цепной реакции ШЦ1'> сшш.-зкрор.а.та, используя опубликованные последовательности.

Уеловия 1ЩР варьировали для кавдого набора праймеров в зависимости от их состава.

Родословные с врожденной катарактой и кератозом были обнаружены в сотрудниками Медико-Генетического Научного Центра РАМН под руководством Е.К. Гинтера во время медико-генетического обследования населения районов Туркмении и Узбекистана соответственно.

Исследуемая наш шестипоколенная туркменская родословная представляла собой генетический изолят и объединяла 20 семей, что в общей сложности составило 105 индивидов. Изучаемая врожденная катаракта была классифицирована как атипичная форма зонулярной катаракты и названа Врожденной Полиморфной Катарактой (ВПК), вследствие полиморфизма как расположения, так и форм помутнений хрусталика.

Гиперкератоз, наблюдавшийся в узбекской популяции, морфологически более всего соответствовал т.н. тилозу., или ладонно-подошвенному гиперкератозу (ЛПГ). В ходе исследований проанализировано 7 ядерных семей, объединявших 37 индивидов (пятипоколенная родословная).

В обеих родословных имели место браки мевду двоюродными -родственниками: три кровнородственных брака в родословной с ВПК и один - в родословной с ЛПГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБОТДЕНИЕ.

Генетический анализ родословных с ВПК и ЛПГ мы проводили поэтапно.

I. Чтобы избежать ошибок при анализе сцепления и получить достоверный результат, нами была проверена истинность отцовства и материнства во всех ядерных семьях, входящих в обе родословные.

II. Стратегия картирования гена врожденной полиморфной катаракты включала в себя три этапа:

1. Анализ сцеплений гена ВПК с маркерами 1-ой хромосомы, в том числе с пробой muoin, локализованной в области, тесно сцепленной с локусом FY, ответственным за развитие одной из зонулярных форм врожденных катаракт - Coppock-катаракты.

2. Попытка аналогизировать ген ВПК с уже картированными аутосомны-ми доминантными генами врожденых катаракт.

3. Анализ сцепления гена ВПК с ДНК-маркерами, имеющими различную локализацию в геноме.

III. Локализацию ЛПГ-гена устанавливали, проводя анализ сцепления

с ДНК--маркерами:

1. взятыми из областей картирования генов, мутации в которых могли привести к возникновению, данного наследственного заболевания, или из близких к ним районов;

2. имеющими случайную лок&„лзацшо в геноме.

Исключение из анализа сцепления случайных индивидов.

Во время генетических исследований,. проведенных в ходе данной работы, было проверено отцовство и материнство для всех членов полных ядерных семей в обеих родословных.'

Тестирование родословной, отягощенной ЛИГ, проводили с использованием Ю vnvr- и минросателлитных маркеров, применяя технологию гибридизации по Саузерау или полимеразной цепной реакции соответственно (табл.1). Анализируя гибридизационные картины и профили ДНК после "ЦР, мы обнаружили семью, в которой один из пораженных индивидов, судя по всему, не являлся членом этой семьи. ДНК-профиль указанного потомка не имел аллельных вариантов рес-трикционных фрагментов материнского генотипа ни для одного маркера. (На рис.1 Б показан результат реконструкции семьи с использованием одной пробы, остальные данные не представлены). Как выяснилось, забор крови у данного индивида был сделан в отсутствие сотрудников Медико-генетического Научного Центра. Не исключено, что ребенок не принадлежал к изучаемой родословной и кровь у него взяли по ошибке или образцы были перепуганы на пункте взятия крови. Данный индивид был исключен из родосло: лой и при проведении анализа сцепления в расчет не принимался.

Подобный ан'таз структуры семей проводили и в родословной с врох.денной полиморфной катарактой. В процессе исследований была обнаружена семья, в которой ставилась под сомнение истинность биологического отцовства из-за отсутствия маркерных аллелей отца в генотипе потомков. Во всех случаях, кроме одного, при использовании 9 микросателлитных (далее в тексте) и 6 информативных VNTR-маркеров (муциновую пробу в анализе данной семьи не использовали) (табл.2), наблюдалось несоответствие отцовских аллельных вариантов тем, которые ожидались бы, будь он истинным отцом. На рис.1 Л представлены ДНК-профили членов этой семьи, выявляемые в результате гибридизации 'laql-гидролизата тотальной ДНК индивидов с локусспецифичным ViiTK- маркером СШ101 (данные для остальных ги-нерпариабельных проб по показаны).

Данный индивид также•был.исключен из анализа сцепления.

1 2 3:456

Рис.1 Реконструкция семей с ВПК Ia) и ЛПГ (Б). ДНК-профили членов семей получены в результате гибридизации Taqi-гидролизатов тотальной ДНК индивидов с VNTR-пробами - СЫМЮ1 и mucin соответственно.

А: Выявлено ложное биологическое отцовство.

Б: Один из потомков (дорожка 2) не является членом данной

семьи: в своем генотипе не имеет материнских аллелей

ООнаруженные нами в хода работы несоответствия в структуре семей ясно продемонстрировали возмскность использования высокополиморфных маркеров ДНК для реконстругадай семей в родословных,, для которых опрос не всегда бывает верен. Кроме того, методика,, предполагающая использование тг их проб ДНК, позволяет избежать ошибок при анализе сцепления, связанных с включением в анализ случайных-индивидов.

Выявление мутаций в гишрвнриабвльшх районах ДНК.

Сравнивая электрофорвгическко профили ДНК детей и их родителей, мы обнаружили одну семью, в которой у ребенка отмечалось наличие полосы, отсутствующих у обоих родителей. Этот феномен нами рассматривался как результат мэйотической мутации, произошедшей при созревании гамет (рис.2).

* Семья принадлежала к родословной с вроздэнной полиморфной катарактой. Мутация выявлялась на таСридизацконном профиле, полученном с помощью g3 ДНК-пробы, локализованной на 7 хромосоме (7q36-qter). У обследованных в родословной 45 потомков и их родителей проанализировано распределение 85 аллельных наеш-^рагментов. Во всех случаях, кроме одного, наблюдалось четкое соответствие генотипов потомков генотипам их родителей. В описываемой семье один из двух детей имел нормальное распределение аллелей (один от отца, другой от матери), а у второго присутствовал только отцовский аллель (рис.2). Очевидно, что наблюдаемая наш мутация a© novo произошла в материнской гамете.

Из 16 информативных VJKIR- и микросателлитных маркеров, с'помощью которых т исследовали эту семью, только один выявил такой необччный фрагмент. Остальные полиморфные маркеры подтверждали кровное родство этого потомка с остальными членами семьи.

Теоретичски, пробы ДНК, определяющие уникальные локусы генома, должны обладать уровнем гетерозиготности близким к юс~ чтобы иметь возможности детектировать мутации в гипервариабельных районах генома. В нашем случае средняя гетерозиготность маркера g3 для обследованной выборки составила 93,8%«

Выявление генетической гетерогенности клинически сходных зонулярных форм врожденных катаракт.

В родословной, отягощенной врожденной полиморфной катарактой (ЬПК), определенной как атшшчпая популярная, среди пораженных ин-

12 3 4

Рис.2 Выявление мутации de novo в гглервариаСэльном районе ДНК. Представленные ДНЕС-профиж индивидов получены в резул1 7ате гибридизации по Саузерну Haelll-гидролизатов тотальной ДНК индивидов из родословной с ВПК с пробой gi лосле электрофо-ретического разделения рестрикцшнныз фрагментов в 0,75% агарозном геле. Один из потомков (дорожа 3) несет отцовский аллель и мутацию de novo (указана стрелкой). Гетерози-готность пробы, детектирующей мутацию равна 93,8Ж.

дивидов имелись больные со случаями катаракты, морфологически сходной с клинической формой, описанной Renwiok J.H и Lanier s.d. (1963 г.). Описанная авторами как аутосомно-доминантная эонулярная порошковидная (или Оорроок) тсатаракта, данная форма обнаруживала сцепление с локусом группы крови Дафн dq2i-q25) (табл.1) (McKusiok, 1990). Обе формы катаракт проявляли некоторые сходные черты фенотипов: в частности, зонулярную локализацию помутнений у некоторых индивидов. Это дало нам основание предположить, что генетический дефект, ответственный за врожденную катаракту, обнаруженную в туркменской популяции "Нохурли", может быть локализован на 1-ой хромосоме.

Для проверки сделанного предположения проводили анализ сцепления с использованием двух'теломерных VNTR-проб ДНК, картированных на обоих плечах 1-ой хромосомы (М532, 1q42-q43 и MS1, 1рЗЗ-р35)^ и муциновой пробой (iq2i-q23), тесно сцепленной с локусом группы крови Дафи (Iq23-q25). При гибридизации с MS32 и MS1 пробами использовали Haelll-гидролизаты тотальной ДНК индивидов. Для муциновой пробы - Taql-гидролиз а ты.

Ранее маркер HS32 был описан как минисателлитная локусспеци-фичная ДНК-проба (локус D1S8). В нашей работе ..ы обнаружили,, что., гибридизационше профили ДНК каждого индивида нохурской популяции содержат целый набор полиморфных и константных фрагментов ДНК, не характерных для локусспецифичной пробы. Возникновение такого ДНК-фингерпринта явилось, очевидно, результатом регулярного расположения НаеШ-сайтов в МБЗг-минисателлитных повторах. Таким образом, выявляемый MS32 пробой НаеШ-полиморфизм представлял собой муль-тилокусный полиморфизм и не мог быть использован для анализа сцепления D1S8 локуса о геном катаракты.

MS1 и муциновая пробы выявили характерную для локусспецифич-ных ДНК-зондов модель полиморфизма. Анализ сцепления, проведенный с данными маркерами, продемонстрировал отсутствие сцеплеш',я гена заболевания с маркерными' локусами. Полученные максимальные значения lod были отрицательными или слабо положительными при достаточно высоких величинах рекомбинационных фракций <msi: 1ой=-0.0Э9 тя 0=0,45; mucin: iod=o,432 при 6=0,35). Негативный результат сцепле-1шя с пробой mucin позволил нам утверждать, что лежащий в основе ВПК генетический дефект отличается от дефекта гена, картированного С локусо ' 1q21-q25.

Tükhm образом, в,результате проведенного анализа, было пока-":>но ji.'VHSMiif гетерогенности наследственных форм катаракт, морфоло-vivioi'.vr. схс.'Л!з!jх с "'ч.'улнр.чбй порошковидной катарактой, в различных

гопуляциях.

Попытка аналогизировать ген нохурской вровденной полиморфной катаракты с уже известными аутосомными доминантными генами других форм врожденных катаракт.

Исключив сцепление ВПК-гена с локусами 1-ой хромосомы, мы попытались аналогизировать ген изучаемой наш формы катаракты с уже известными аутосомно-доминантныш генами других форм врож. катаракт. Несмотря на отсутствие сходства кшшич. проявлений, мы не могли исключить вероятность того, что ген ВПК может являться аналогом уже известных генов (табл.1).

Локализация Символ Форма катаракты Номер по каталогу McKusiok, 1988 г.

10.21-4.25 gae Катаракга зонулярная порошковидная, или Сорроск-катаракта 116200

2р25 или 14^24 САР1 Катаракта передняя полярная 1 11*5650

Зр2б.2 ИЛИ 4р15 САР2 Катаракта передняя полярнаяя 2 115650

1бч22.1 CCDN Катаракта задняя полярная 116700

гсаз-35 GCL Сорроок-подобная катаракта 123660

16(3.22.1 стм Катаракта зонулярная, или Ыагаег-катаракта 116806

Табл.1 Локализация генов доминантных врожденных катаракт в геноме человека.

На данном этапе картирования гена ВПК мы использовали маркеры ДНК, картированные вблизи локусов указанных генов.

Учитывая области локализации генов передней полярной и Сорроск-подобной катаракт, мы включили в анализ 2 маркера 2-ой хромосомы - УШ24, АРОВ - И 5 Маркеров 14-ой хромосомы - РАИ101,

EPZ18.2, СШ66, НС0012, СШ101 (табЛ.2)

Результаты анализа дали строгие доказательства отсутствия сцепления мевду маркерами 2-ой хромосомы и ВПК-геном. Полученные максимальные значения lod были ненамного выше нуля. ШШ24: lod=0,00 при 6=0,455 АРОВ:1=00062 при 0=0,45)

Можно было с уверенностью утверждать, что ген В1Ж не является аналогом гена сар.

Однако возможность гомологии исследуемого нами гена с ссь-геном не отвергалась окончательно. Для маркера данного плеча 2-ой хромосомы (YNH24) нам была известна только довольно обширная область локализации: 2ql4-q2l - 2q3S-q3'/. То есть, возмовзо, он не'является на самом деле тесно сцепленным с локусом сорроок-по-добной катаракты. И в этом случае отсутствие сцепления мэвду маркерным локусом'и геном заболевания не может слушть доказательством неидентичности генов ось и ВПК.

из 5 vntr а»чркеров 14-ой хрояюсож только один оказался информативным - 0ШЮ1 (014S13). Для него максимальное значение lod превышало 1 (1,291 при 8=0,3)) Это позволяло с остороиностьзо предположить возможное сцепление между локусеми.

Лабораторией Е.К.Гинтера нам были любезно предоставлена результаты исследования этого же семейного материала с маркером белковой природа «¡оку с а PI {ген ай-антитрипсш)£ lod=1„089 при 6=0,20. Как и маркер СШЮ1, маркер локуса PI картирован на длинном плече 14-ой хромосомы, в котором локализован один из генов передней полярной катаракты.

Наш был проведен анализ сцешг чия между локусами PI и D14S13. Полученные данные (iod=2,24, 8=о.05) с высокой вероятностью позволяли предположить, что эти два локуса достаточно тесно сцеьлены между собой.

Взаимное расположение гена заболевания и маркерных локусов на 14-ой хромосоме можно представить следующим образом:

свп-- ВПК —о.госМ— PI —о.ойсм— D14S13

(14q32.1) (14q32.1 -

14q32.32)

--о.зо-

Можно было ожидать, что если ВПК-ген локализован на хромосоме 14, то перспективной областью для его поиска является область 14ч, расположенная проксимальное PI. Поэтому мы включили в анализ 4 ми-кр.ч'пт'.ччлитаих маркера из• этой области (M4S4Ö, D14S50, D14S53,

D14S77). Однако ни с одним из дополнительно привлеченных маркеров не было показано сцепления гена катаракты. Поэтому 14-ая хромосома была :сключена наш как хромосома, на которой может быть картирован ген ВПК.

Исключение локализации гена нохурской врожденной полиморфной катаракты в локусах других хромосом.

Кроме попыток аналогизировать ген ВПК с уже картированными аутосомными доминантными генами вровдешшх катаракт» мы исследовали его сцепление с доступными для нас генетическими полиморфными системами, имеющими различную локализацию (как микросателлитными, так и VMTR-ыаркераш).

Часть проб была отобрана случайным образом. В ряде случаев выбор ДНК-маркеров для проведения анализа сцепления основывался на их локализации в геноме вблизи областей картирования генов, кодирующих структурные белки-кристаллшш, дефекты которых могли бы привести к развитию заболевания (области I7q и 22q).

Среди использованных STR-маркеров (гетерозиготность которых составляла по крайней мере 70%) быт маркеры на следующие локусы: D6S105 (бр), D17S250 (17q11.2-q12), GABRB3 (15q11.2), F8VWF (12р1 з)» CRYB2-A (22q)<. Для всех изученных семей указанные ДНК-пробы являлись информативными. При исследовании сцепления гена ВПК с микросателлитными маркерами ни для одного из них не был получен 'положительный lod. Это указывало на отсутствие сцепления меиду маркерными локусаш и ВПК-геном. .

Наряду с маркерами, имеющая мшросагеллитную прир. ду, в анализ включили ряд минисателлитов, "выявляющих полиморфизм длины рес-трикционных фрагментово

В таблице 2 приведены данные о локализации всех ПДРФ-маркеров, используемых в анализе, и указаны рестриктазы, по которым получали специфические ДНК-профили» выявляющие VNTR-полимор-физм после гибридизации с пробами ДНК. Кроме проб, детектирующих рестрикционный полиморфизм в результате блот-гибридизации по Сау-зериу, в таблице представлен один маркер (аров), выявляющий полиморфизм в локусе после ПЦР. Однако аллельные вариации и в да'шгч случае были оиусловлены изменением числа тандемно организованных повторяющихся единиц в амилифицируемом фрагменте ДНК.

Для всех информативных проб в таблице указаны значения 1'ГС и гстерозиготноети. Следует отметить, что, анализиронэлись сомьи, относящиеся к одной родословной, внутри которой и»'...! место крон-

Маркер Локус Хро- Положе- Величина Использу- Значе- Информа-

мо- ние на . гетеро- емая рес- ние PIG тивность

сома карте зиготно- триктаза

сти (%)

MS32 di sa 1 1q42-q43 На еШ неинформ.

ins INS 11 11р15.5 НаеШ нэинформ.

Ha-ras HRAS1 11 11р15.5 неинформ.

YNZ22 D17S5 17 17р13-3 TaqI неинформ.

ТНН59 D17S4 17 17q23- НаеШ неинформ.

q25.3

СМЫ66 DI4S22 14 14q ЕооЫ неинформ.

PAW101 D14S1 14 1 4q32.1 - ЕооЫ неинформ.

q32.2

BPZ182 D14S17 14 14q32- неинформ.

<133

МС0С12 D14S20 14 14q32- « неинформ.

q33

СМЫ101 D14S13 14 14q32 97,6 0,92 информат.

или (14(132.1

MLJ14 -14q32.32

MS1 D1S7 1 1РЗЗ-РЭ5 80,0 НаеШ 0,89 информат.

muoin MUC1 1 1q21-q23 82,2 0,76 информат.

YNH24 D2S44 2 2q 87,4 • НаеШ 0,91 информат.

(2q14-q2-

-2q36-q37)

S3 OTS22 7 7q36- 93.8 ; НаеШ 0,88 информат.

qter

a-glo D16S85 16 16p13.3 82,6 НаеШ 0,83 информат.

bin

АРОВ 2 ¡2p24-p23 т., ; 0,81 информат.

Табл.^ шгн-маркеры, используемые при проведении анализа сцепле- . ния гена вроаденной по шорфной катаракты из популяции "Нохурли" с различными локусами генома.

нородственные браки. Поэтому не наблюдалось прямого соответствия между значениями Pic и гетерозиготности для отдельных локусов, установленных на данной выборке семей, и значениями, установленными для популяции. Так, например, в литературе для маркеров muoin, YNH24 и MS1 приводят значения гетерозйготностей, установленные для европейской популяции, равные 90-98% в (зависимости от используемых рестриктаз) (Human Gene Mapping 11, 1991),

Из 6 дополнительно вовлеченных в анализ VNTR-маркеров (помимо описанных ранее десяти ДНК-проб), только 2 ок-зались информативными для обследуемых семей: g3 и а-глобин. Остальные маркеры были непригодны для проведения анализа, так как обнаруживали муль-тилокусность или проявляли слабый полиморфизм. Полученные максимальные значения lod (a-globin: lod=0.04, 9=0,40; g3: lod=0,140, 6=0,4) исключали возможность сцепления между геном заболевания и маркерными локусами.

Таким образом, проведенный наш анализ исключил локализацию

гена ВПК в локусах ряда хромосом: 1,2,6,7,12,14,15,16,17,22.

•

Анализ сцепления в семьях родословной, отягощенных ладонно-подошвенным гиперкератозом.

Чтобы определить хромосомную.локализацию ЛПГ-гена, мы изучали сегрегацию в родословной, отягощенной этим наследственным заболеванием, ряда VNTR и STR-маркеров. При выборе маркеров учитывали области картирования генов, де^кты которых могли бы привести к развитию заболевания.

Фенотипические проявления тилоза позволяют предположить, что лежащий в основе заболевания генетический дефект может затрагивать один из нескольких генов, важных для дифференциации эпидермальшх клеток или целостности цитоскелета кератиноцитов.

В этом отношении интерес вызывают гены кератинов, инволюкри-на, профилаггрина, трансглютаминазы I. Кластеры кератиновых генов локализованы в 17q, 17p и 12p (Rosenberg et al, 1988, Compton et al-., 1992).Ген инволюкрина картирован на' длинном плече 1-ой хромосомы в области 1q2i-q22 (Richard et ai.,1986); ген профилаггрт.^ (.предшественника филаггрина)' - в области iq2i (Gan et al., 1990); ген трацсглютпмйиазы l - в районе I4qii.2-qi3 на 14-ой хромосоме (Kim et ra., 1992). Поэтому мы включили в анализ родословной, отягощенной JIIIl', ДНК нрос;ц, локплизонашше в укаппнннх или нрилеж.-эдих к ним оолпстях.

Кроме того мы использовали ДНК-маркеры со случайной локализацией в геноме из имещейся в натем распоряжении коллекции (таблица 3)

U: 'ПКер JДокуС Хр^.иосома J Положение на карте Рестриктаза

VNTR-маркеры

Kuc in JMUC-1 1 j 1q21-q23 Taql

YNZ22 pi7S5 17 17Р13.3 S?aql

ТНН'. 3 JD17S4 17 17q23-q25.3 TaqX

СШ101 JD14S13 14 I 14q32 üaql

микросателлитше маркеры

jNEPb 8 I 8p21

pavwp 12 12p13

|D14S4a 14 I 14q11-q24

I DI4S50 14 | 14q11-q24

J СНУВ2-A 22 I 224

|D17S250 .17 I 17q11.2-q12 C'

Табл.3 VNTR- и микросателлитные маркеры, сегрегация которых изучалась в родословной, отягощенной ЛПГ. Для Умшн-маркеров указана рестриктаза, используемая при получении гидролиза-тов геномной ДНК индивидов.

Результаты знализа сцепления ЛПГ-гена с маркерными полиморфными локусами представлены в приведенной ниже таблице 4. Из полученных' данных следует, что отсутствует сцепление между геном тилоза и 5 микросателлиташми локусами: МРЬ, ?avw„ B14S48, D14S50, CRYB2-A. Во всех случаях значения логарифмов шансов оказались отрицательными или слабо положительными при малых значениях частот рекомбинаций. С тремя из четырех УЫТН-маркеров (Muoin, YNZ22 СШ 101) т?"-же не било обнаружено сцепления (табл.4).

Однако, при исследовании сцепления между ЛПГ-геном и локус^м D17S4 d7q23-q25.3) в анализе 7 ядерных семей с общим числом сиб-сов равным 23, было получено ши „штельное значение loci. При частоте рекомбинации 0,2 оно оказалось равным 0,729. Несмотря на небольшую абсолютную величину полученного значения, мы посчитали не-

Маркер локус Положение I на 1 карте | А | 21 | А в

Анализ сцепления шга-маркеров

с ЛПГ-геном.

Мио1п дас-1 11421-423 | 0,000 0,50

таггг Ш7Б5 117Р13.3 0,350 0,20

ТКН59 Ш7Б4 Я17ч23-<125.э| 0,729 0,20

СШ101 014313|14432 | О.ООС 0,50

Лнализ сцепления микросателлитных маркеров с ЛПГ-геном.

|ИЕРЬ 8р21 0,000 0,50

12р13 0,490 0,20

1)14348 14411 -424 0,460 0,20

Ю14350 14411 -424 0,000 0,50

СЙУВ2-А 224 0,120 0,30

0178250 17411 .2-Ч12 4,650 0,05

Табл.4 Результаты анализа сцепления ЛПГ-гена с таш- и зтк-мар-керами. 6 - значение частоты рекомбинации, при которой наблюдается максимальное значение 1ой (2^).

обходимым проверить гипотезу о озмокном расположении г ча тилоза в длинном плече 17-ой хромосомы. Для этого было необходимо ввести в анализ сцепления дополнительные маркеры из области 17ч.

Использование микросателлитного маркера 0173250, картированного в 17411.2-412,, позволило получить значение 1ой не только положительное, но и превышающее 3 (г,=4.65 при е=о,05) (табл.4). Исходя из принятой величины порога вероятности сцепления, двух ло-кусов, это можно было рассматривать как доказательство наличия сцепления между маркерным локусом и геном ЛИГ.

На рисунке 3 показан полиморфизм локуса С173250, выявляемы, полимеразиой цепной реакцией. Отмечается совместная сегрегация ал-леля 7 маркерного локуса и гена тилоза.

На основании полпенних дгшпы'х о величине рекомбинационнчх фракций, ссотпетстпушщих наолюлл^шм макгимнлышм положительным значениям Ю11 при -иплипе л;-кул»п пптм и иг/й^п, >:з-о рзсполо-

Ноцерл индивидов в родословной

14 л С1 * с< г-

Генотипы инда- _ . _ _

10 О ЮГ- Г;

видов в .локусе ВкЗпНВ^гС^ГН^й'К« о' с К п п л

73255

4 К 1 й Л * *

Рис.3 Полиморфизм локуса 1)173250 в семьях с ЛПГ, выявляемый по-лимеразной цепной реакцией. (Приведен фрагмент родословной). Указаны порядковые номера индивидов, под которып они фигурируют в родословной. Показаны генотипы индивидох. в маркерном локусе: 7-ой аллель косегрегирует с ЛПГ-гежл Звездочкой помечены индивида, ДНК которых не исследовали в шштзе сцепления.

жить исследуемый и маркерные локусы на 17q следующим образом:

сеп

(ЛПГ)-о,05сМ- D17S250 -o.osctt- (ЛПГ) (17q11.2-q12)

-62сМ—

- D17S4

(17q23-q25.3)

Генетическое расстояние мэзду D17S250 и D17S4 и порядок расположения локусов взяты из литературных источников (Weissenbach et al., 1992). Незначительный положительный lod, получ^.шый при анализе сцепления локусов ЛПГ и D17S4 (6=0,2) демонстрирует возможность лишь очень слабого сцепления между изучаемы!® локусами. Это не позволяет достаточно точно установить расположение ЛПГ-локуса относительно двух маркерных локусов. Можно только утверждать, что ген, ответственный за развитие ладонно-подошвенного гиперкератоза, картирован где-то в"области локализации D17S250 (17qll.2-q12).

Для более точного картирования гена патологии следовало бы провести анализ сцепления с целым рядом маркеров, перекрывающих длинное плечо 17-ой хромосомы. В нашем- распоряжении, однако, не имелось таких ДНК-проб. Поэтому в данной работе было установлено сцепление ЛПГ-гена с локусом D17S250 и определена область поиска маркеров для точной локализации гена заболевания.

Область локализации марк ра, сцепленного с геном .ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза), интересна тем, что содержит ряд генов, первичный биохимический дефект которых может привести к данному заболеванию.

Во-первых, в длинном плече '17-ой хромосомы, в локусе I7qli-q2i картирован один из кластеров генов кислых кератинов (кга) (Rosenberg et al., 1988). Накопление нератинов в клетках внешних слоев эпидермиса может вызывать утолщение рогового слоя эпидермиса. Так как ЛПГ характеризуется наличием именно такого признака, то вполне допустимо, что гени Кератинов I типа могут являться генами, ответст.' нншми ?*i возникновение данной патологии.

Обсуждая возможность вовлечения кератиновых генов в этиологию дерматозов, связанных с нарушениями рогового слоя эпидермиса, ряд авторов обращает особое внимание на KRT9. Выло показано, что данный ген экспрессируется преимущественно в эпидерм ;ышх' клетклх ладоней и подошв, присутствуя только в окончательно днфферешшро

Возможные гены-кандидаты ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза).

-го-

яашшх клетках шиповатого и рогового слоев. В большинстве других ¡нидормисов кератин 9 не обнаружен (по Reis et al., 1992). При гзучешш эпидермолитической ладонно-подошвенной кератодермии ген KRT9 рассматривался авторами как естественный ген-кандидат заболевания uieis et al., 1992). Ген KRT9 еще не был клонирован. Но .рансляционный анализ in vitro показал, что кератиновый белок КЗ не является продуктом протеолиза или альтернативного сплайсинга других кератиновых генов и кодируется дискретной мРНК.

Кроме того, кератины всегда функционируют как гетеродамерьг. Поэтому изменение именно этих структурных белков могло бы объяснить „оминантный фенотип ряда наследственных дерматозов, связанных с изменением процесса кератшшзации. Доминантность мутаций керати-ноеых белков обуславливается тем, что изменение только одного члена димера повлияет на весь димер в целом.

В период, когда результаты о локализации гена ладонно-нодошвенного гиперкератоза,' входящие в данную работу, готовились к печати, в литературе появились публикации о картировании генов, ответственных за возникновение ряда наследственных дерматозов. Так, генетические дефекты, приводящие к эпидермолитическому гиперкератозу, простому генерализованному буллезному эпидермолизу и простому локальному буллезному эпидермолизу, были локализованы в I2qii-qi3 и ассоциированы с мутациями в гене КНГ1 (coropton et al., 1992, Rothnagel J.A. et al., 1992). Гены простого буллезНОГО ЭПИ-дермолиза типа Bowling—Meara и буллезного эпидермолиза типа Weber-cockayne были картированы в том же районе, но их дефекты ассоциированы с мутациями гена KRT5 (Boniías et al., 1991). Для ряда форм эпидермолитического гиперкератоза и простого буллезного эпидермолиза типа Dowling-Meara были обнаружены мутации в кератинах KRT10 (17q2.-q.22) И KRT14 (17q12-q21 ) соответственно Coulombe et al., 1992, Rothnagel J.A. et al., 1992).

Эти дерматозы характеризуются поражением в первую очередь эпидермиса. Однако проявление этих мутаций различно. При эпидермо-литическом гиперкератозе цитолиз происходит в .супрабазальном слое эпидермиса, а при простом буллезном эпидермолизе - в базальном слое. Тем не менее, при обоих заболеваниях первично страдает одгт из кератинов. Как известно, кератиновым белкам придается большое значение в поддержании целостности эпидермиса за счет образован?" i сети кератиновых филаментов в клетках.

Фенотипические проявления отличаются от характерных фено-тшшческих признаков, эпидермолитического гиперкератоза и простого оулло?ного эпидермолиза. Но, несмотря на это, можно предположить.

что при ЛПГ мутация локализуется также в одном из кератиповых генов. Недавнее картирование гена эпидермолитической ладонно-подс-венной кератодермии в районе I7qi2-q21 подтверждает эту возможность (Reis et al., 1992). (Так как данное заболевание является эпидермолитической формой локальных гиперкератозов, к которой относится и ЛПГ.)

Другим возможным геном-кандидатом ЛПГ может быть ген рецептора ретиноевой кислоты (RARA-ген), который локализован в том же районе 17-ой хромосомы, что и кластер кэратиновых генов I типа. Ретиноиды играют важную роль в процессе роста л дифференциации эпидермалышх' клеток. Экспрессируясь в клетках кожи, рецепторы ретиноевой кислоты могут, в свою очередь, регулировать экспрессию кератиновых генов (Noji et al., 1989).

Таким образом, число генов-кандидатов ЛПГ является весьма значительным. Предполагаемая область локализации гена тилоза на длинном плече 17-ой хромосомы включает целый кластер генов кис».-кератинов (KRT10, 12, 13, 14, 15. 16, 17, 19) и ген RARA. Учитывая это, идентификация гена ладоино-подошвенного гиперкератоза бчдет представлять сложную задачу.

ВЫВОДЫ

1. Установлено сцепление гена ладонно-подотвенного гиперкора-тозо (тилоза) с маркером 17-ой хромосомы - D17S250 (значение lod-4,65 при 8=0,05).

2. Определена потенциальная область локализации гена ладонно-подошвенного гиперкератоза нь длинном плече 17-ой хромосомы:

17q11.2-q12.

3. Установлена генетическая гетерогенность врожденных ауто-сомно-доминантных форм катаракт, морфологически сходных с зонуляр-ной порошковидной катарактой (Сорроок-катарактой).

4. Исключена локализация гена врожденной полиморфной "нохур-ской" катаракты в следующих хромосомных локусах: 1р33-р35, 1q21-q23, 2р24-р23, 6р, 7q36-qter, 12р13, 14q11-q24, 14q32.1, 15q11.2, 1бр13.3, 17q11.2-q12, 22q. .

5 Продемонстрирована возможность использования локусспецифи" -ных маркеров Д'ЕК с уровнем гетерозиготности более 8UX для исключения из генетического анализа случайных индивидов, что позволяот избежать ошибок при проведении анализа сцеплония и получить достоверный результат. Из 15 использованных нами информативных vntr- и str-маркероп для анализа одной из семей, только од;.л но выявил

ломгое биологическое отцовство.

6. Показана возможность заявления мутаций в гипервариабельных районах ДНК при помощи псшшорЗвнх маркеров, детектирующих, уникальные локусы генома и ииещих уровень гетерозиготности более

г

ПРИМЕЧАНИЕ.

Картирование гена врожденной полиморфной катаракты из туркменского генетического изолята "Нохурли" недавно было завершено К.И. .огаевым, научным руководителем раиной диссертационной работы. Обнаружено тесное сцепление БПК-гека о локусом длинного плеча 2-ой хромосомы (Рогаев Е.И. с соавт., в печати).

В ходе совместных исследование между лабораторией молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья РАШ и Университетом города Торонто, им же была установлена точная локализация гена ладонно-подошвешого гиперкератоза на длинном плечо '7-ой хромосомы вблизи кластера кератиновых генов (Rogaev Е. et al Na re Genetics, 1993, v.5: 158-162).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Rogaev E.I., Korovaitseva G.I.« Trubnikov V.I Application ol VNTR-markers for linkage analysis of sohizofrenia and cataract. Abstracts of First International Conference on DMA fingerprinting, 1990, p.47

a. Rogaev E.I.. Korovaitseva G.I., Barisheva E, Ginter E.K. DNA--genotyping of. cataract enriched. Meddle Asia familial isolate. Amer. J. Лит• Genet., 1991, v.49 (supplement), p.347 3. Rogaev B.I., Korovaitseva G.I.. Barisheva E, Ginter E.K. Data for geterogenety of zonular form oataraot. Exolusion of ethnic cataract locus for 1q21-q23 and other chromosome "candidates" loci. Ceil Gt^el , IQ9 I , u. S 8 , f>.

4 Rogaev E.I;, Rogaeva E.A., Ginter E.K., Korovaitseva G.I., Far-re r L.A., Shlensky А.В., Prittov A.N., liordovtsev V.N., P. Gt\ org-Hyslop. Identification ol the genetic locus for Keratosis Pa'^naris et Plantaris on chromosome 17 near the RARA and Ker; • tin type I genes. Nature Genetics, 1993, v.5: 158-162 Korovaitseva 0.1., Rogaev , Shlensky A.B., Ginter E.K. Application oi hypervariable ША-markers for detection individual-specific patterns and linkage analysis. Abstracts of 25th

Annual Meeting of the European Society of Human Genetics, 8»?-selona, 1993» p.84 (N 227)

6. T лтер S.K.в Рогаэв Е.И. „ Коровайцева Г.И.» Тураева Ш.М„, Печ рин А.Н.u Спицын В.А.о Тарлычева Л.В» Дальнейший анализ хот лизацин гена аутосомной доминантной зровденно.® нохурскоЯ катаракты. Генетика» 1993, т.29, N4;670-673

7. Рогаев ¡S.U., Гинтер S.K., Рогаева Е.А., Коровайцева Г.И», Прыт ков А.Н,. Исследование локализации гена доминантного ладенно-подошвенного гиперкэратоза у человека« Генетика, 1993, т-29, N7:1180-1185

8. Рогаев Е.И., Рогаева Е.А., Гинтер Е„Н.0 Коровайцева Г»И»е Оар-рер Л., ШленскиЯ А.Б.0 Прнтков А.Н», Дкордн-Хнслоп Р.» Мордовцев В.Н. Картирование гэка ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза) на 17 хромосоме в районе I7qi2-q24. Генетика, 1994, т.30„ N3:326-329

9. Рогаев E.H., Рогаева Е.А., Гинтэр Е.К.„ Корозвйцева Г.И., Фар . pep Л.0 Шлвнский'A.B.» Прытков А.Н., Дкордк-З&слоп ?. Асс-о

циирован ли ген ладонно-подошвенного гкпэркэрвтозв с одни : из локусов кератина типа I? Генетика, 1994, т.ЗОо N5:600-303

10.Гинтер Е.К., Рогаев Е.И., Коровайцева Г.Ио Картирование генов наследственных болезней человека- Тезисы 4-ой конференции "Геном чвловека-94", г.Черноголовка, 19940 с.25