Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ сцепления высокополиморфных локусов генома с наследственными заболеваниями: врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ сцепления высокополиморфных локусов генома с наследственными заболеваниями: врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом"

российская академия медицшсот наук

?щжо-гкнетическш наэтнш, центр

Р г Б ОД

м па правах рукописи

УДК 575.599

Корозайцеаа Галина Ивановна

АНАЛИЗ СЦЕПЛЕНИЯ шсокопошюрфныя локусов ГЗНСЙл с 1ШЗДСТВЕННЫШ заболеваниями ЧЕЛОВЕКА? ВРОЖДЕННОЙ катарактой и ЛАДОШО-ПОДОШВЕШШ ГИЕРКЕРАТОЗОМ.

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических неук.

Москва 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья РАМН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук РОГАЕВ Е.й.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук МАЛЫГИНА H.A.

доктор биологич.наук, профессор

сгошда в.а.

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет иы. М.В. Ломоносова.

Защита состоится "_и_ 1996 г. в __час._юга.

на заседании Диссертационного совета Д.001.1^.01 при Медико-Генетическом Научном Центре РАМН (МГНЦ РАМН) по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "__ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

-1-

ОбЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАбОТЫ.

Актуальность пробремы. Метод генетического анализа основан на использовании генетических маркеров. В качестве таких маркеров могут выступать особенности организма, обладающие рядом определенных свойств. Они должны устойчиво наследоваться и сохраняться в ряду поколений, а также поддаваться количественной шти качественной регистрации. Кроме того, при молекулярно-генетических исследованиях выбранные маркеры должны служить индивидуальными характеристиками конкретных участков генома (в том числе и отдельных генетических локусов).

Выделение в геноме нестабильных, гипорвариабельных локусов и развитие методов их идентификации привели к созданию маркерных систем и их использованию при популяционных и генеалогических исследованиях (Bell et al., 1982, Chakraborty, 1991, Cooper et al., 1985, Orita et al., 1990). Наследование полиморфных вариантов геномных локусов как простых менделевских кодоминантных признаков и их возможное сцепление с дефектными генами при различных наследственных заболеваниях предоставили широкие возможности для картирования генов различных заболеваний (Davies et al., 1983, Eiberg et al., 1988).

Относительная простота выявления структурного полиморфизма гомологичных локусов генома позволяет проводить анализ большого числа индивидов одновременно. Это значительно облегчает изучение обширных родословных и позволяет получить статистически значимые результаты анализа сцепления маркерного локуса и гена заболевания.

Картирование генов наследственных заболеваний человека, благодаря использованию универсального принципа генетического маркирования, проводится в настоящее время довольно эффективно. Исследования подобного рода весьма актуальны как в аспекте решения проблем медицинской генетики, так и в аспекте построения полной карты генома человека (Международная научная программа Human Geno me Organization [HUGO]). Картирование гена наследственного заболевания является первым этапом на пути выявления первичного биохимического дефекта, приводящего к развитию наследственного заболевания. Поэтому результаты этих исследований часто позволяют разработать способы профилактики, лечения и диагностики данного заболевания. Согласно HUGO, приоритет в изучении тонкой структуры генома человека отдается тем участкам хромосом, где уже картированы гены, мутации которых приводят к тяжелым наследственным дефектам.

Катаракта является одной из наиболее распространенных врок

денных патологий органа зрения- От 13 до 45% случаев слепоты и 11% лсех случаев уменьшения остроты зрения объясняются этим наследственным заболеванием (Хватова, 1971). Учитывая высокий уровень генетической гетерогенности врожденных катаракт, любые новые сведения о какой-либо из форм заболевания являются важными.

Типичная картина поражения при кератозах представляет собой в норную очерэдь косметический дефект- Однако при генерализованных формах патологический процесс распространен почти по всему телу шш захватывает большие участки кожного покрова. Кроме того0 помимо основных клинических проявлений кератозы могут сопровождаться дополнительными неприятными или болезненными эффектами: появлением глубоких трещин по складкам кожи, шелушением кожи, отечностью и покраснением кожи на суставных поверхностях и т.д. Поэтому,, хотя данное заболевание и не носит угрожающего характера для кизни человека, оно является достаточно серьезным.

Исходя из чсего выше изложенного проблема локализации генов данных наследственных заболеваний представляется нам заслуживающей внимания.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось проведение анализа сцепления генов врожденной катаракты и ладонно-подошвенного гиперкератоза с .высокополиморфными локусами генома„

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи %

1. Проверка истинности биологического отцовства и материнства для всех членов полных ядерных семей родословных, отягощенных врожденной катарактой и ладонно-подошвенным гиперкератозом с помощью полиморфных локусспецифичных "Ш-маркеров.

2. Выявление возможной генетической гетерогенности морфологически сходных форм врожденных катаракт.

3. гнализ сцепления генов изучаемой формы врожденной катаракты и ладонно-подошвенного гиперкератоза с высокополиморфными тети- и микросателлитными маркерами: 1) из областей картирования генов, первичный биохимический дефект которых может привести возникновению изучаемых наследственных заболеваний; 2) со случайной локализацией в геноме.

4. Определение потенциальной области хромосомной локализации г >нов ладонно-подошвенного ■ гиперкератоза и врожденной катаракты в случае обнаружена сцепления между исследуемыми генвми и маркерными локусами.

5. Генотипирование индивидов обеих родословных.

Научная новизна. Нами впервые проведен анализ сцепления врожденной полиморфной катаракты в туркменском изоляте "Нохурли".

-э-

Врожденные аутосомно-доминантные катаракты обладают высоким

уровнем генетической гетерогенности дефектов, лежащих в основе за болевания. В каталоге наследственных заболеваний МскиМск а.у. ггредставленно более десяти различных клинических форм доминантно наследуемых катаракт (Ыскиз1окс 1990). Однако неясно, есть ли строгое соответствие числа клинических форм числу генов, вызывающих катаракту. 3 нашей работе представлены результаты, демонстрирующие наличие генетической гетерогенности клинически сходных зонулярных форм катаракт в различных популяциях.

В результате проведенных исследований нами впервые были полу чеки ионные, нсклачагдпс .»окелиэ'ацию гена изучаемой формы врожденной катаракты в ряде геномных локусов.

Несмотря на появившиеся в литературе данные о локализации генов ряда дерматозов, до последнего времени ни один из генов тилоза картирован не был. При изучении семей, отягощенных ладонно- подошвенным гиперкератозом (ЛПГ), или тилозом, наш впервые было установлено сцепление гена данного заболевания с маркером 17-ой хромосомы и определена область потенциальной хромосомной локализации ЛИГ-гена: 17д1*

Научно-практическое значение. Выявление сцепления гена тилоза с маркером из области длинного плеча 17-ой хромосомы облегчает дальнейшую работу по определению точной локализации ЛПГ-гена, ограничивая тем самым круг возможных генов-кандидатов данного зг. ^о-левания.

Дальнейшее изучение генетического дефекта, лежащего в основе врожденной полиморфной катаракты, также может быть ускорено благодаря исключению ряда локусов генома. Кроме того, на основании полученных данных оказалось возможным расширить представления ■ генетической гетерогенности доминантно наследуемых катаракт.Это может иметь важное значение при разработке методов лечения и диагностики данного наследственного заболевания.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Ген ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза) сцеплен с маркером 17-ой хромосомы (значение 1ой=4,65 при 6=0,05).

2. Установлена область потенциальной локализации гена ладонно-ло-дошвенного гиперкератоза (тилоза): 17411.2-412.

3. Исключена локализация гена врождённой полиморфной катаракты из популяции "Нохурли" в локусах ряда хромосом.

4. Выявлена генетическая гетерогенность врожденных аутосомных доминантных зонулярных форм катаракт, характеризующихся сходством морфологических проявлений, в различных популяциях.

-45. Мутации в гипервариабельных районах ДНК иогут быть выявлены с помощью локусспецифичных ДНК-ыаркеров, имеющих высокий уровень популяционного полиморфизма (степень гетерозиготности - более 90%).

6. Локусспецифичше марке; . ДНК с уровнем гетерозиготности более 80% могут Сыть использованы для реконструкции семей в родословных (исключения случайных индивидов, включение в анализ сцепления которых может привести к ошибкам).

Апробация.

Результаты исследования были представлены на Первой меядуна-родной конференции по ДНН-фингерпринтингу (Берн, 1990 г.), на 3-ей конференции "Геном человека" в 1993 году в г.Черноголовка, на мея-ладорагорнои семинаре Института клинической Психиатрии НЦПЗ РАМН (1996 г.)

Структура и объем работы.

Работа изложена на 136 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы,экспериментальной части и обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (156 работ). В тексте диссертации - 10 рисунков и II таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Плазмидную дНК выделяли щелочным методом, высокомолекулярную ДНК человека - методом фенольной экстракции (Маниатис и др. 1986),

Все манипуляции с ДНК (электрофорез, гидролиз рестриктазаыи, олотинг-гибридизация и т.д.) проводились в соответствии с-протоколами, приведенном в руководстве Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1986), иногда с незначительными модификациями.

При подготовке фильтров для блотинг-гибридизации испольэг ¡али вакуумный перенос ДНК на фильтр (Зайцев, Яковлев, 1983) или перенос по Сауэерну (Маниатис и др., 1986).

Радиоактивное меченые ДНК фосфором проводили методом случайного праймирования по методике фирмы ДтегкИал!.

илигонуклеотидаше пряймерн для полимеразной цепной реакции (1Щ1') синтезировали, используя опубликованные последовательности.

Услоеия iilXP варьировали для каждого набора праймерор в зависимости от их состава.

Родословные с врожденной катарактой и кератозом были обнаружены в сотрудниками Медико-Генетического Научного .Центра РАМН под руководством Е.К. Гинтсра во время медико-генетического обследования населения районов Туркмении и Узбекистана соответственно.

Исследуемая наш шестилоколенная туркменская родословная представляла собой' генетический изолят и объединяла 20 семей, что в оощей сложности составило 105 индивидов. Изучаемая врожденная катаракта была классифицирована как атипичная форма зонулярной катаракта и названа Врозденпой Полиморфной Катарактой (ВПК), вследствие полиморфизма как расположения, так и форм помутнений хрусталика.

Гиперкератоз, наблюдавшийся в узбекской популяции, морфологически более всего соответствовал т.н. тилозу., или ладонно-подошвенному гиперкератозу (ЛПГ). В ходе исследований проанализировано 7 ядерных семей, объединявших 37 индивидов (пятипоколенная родословная).

В обеих родословных тлели место браки между двоюродными • родственниками: три кровнородственных брака в родословной с ВПК и один - в родословной с ЛПГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Генетический анализ родословных с ШК и ЛПГ ад проводили поэтапно.

I. Чтобы избежать ошибок при анализе сцепления и получить достоверный результат, нами была проверена истинность отцовства и материнства во всех ядерных семьях, входящих в обе родословные.

II. Стратегия картирования гена врожденной полиморфной катаракты включала в себя три этапа:

1. Анализ сцеплений гена ВПК с маркерами 1-ой хромосомы, в том числе с пробой mucin, локализованной в обл&сти, тесно сцепленной с локусом FY, ответственным за развитие одной из зонулярных форм врожденных катаракт - Goppock-катаракты.

2. Попытка аналогизировать ген ВПК с уже картированными аутосошш-ми доминантными генами врожденых катаракт.

3. Анализ сцепления гена ВПК с ДНК-маркерами, имеющими различную локализацию в геноме.

ill. Локализацию ЛГТГ-гена устанавливали, проводя анализ сцепления

с ДНК-маркерами:

1. взятыми из областей картирования генов, мутации в которых могли привести к возникновению, данного наследственного заболевания, или .из близких к ним районов;

2. имеющими случайную лок&^лзацию в геноме.

Исключение из анализа сцепления случайных индивидов.

Во время генетических исследований,.проведенных в ходе данной работы, было проверено отцовство и материнство для всех членов полных ядерных семей в обеих родословных.'

Тестирование родословной, отягощенной ЛПГ, проводили с использованием Ю унта- и микросателлитных маркеров, применяя технологию гибридизации по Саузерну или полимеразной цепной реакции соответственно (табл.1). Анализируя гибридизационные картины и профили ДНК после "ЦР, мы обнаружили семью, в которой один из пораженных индивидов, судя по всему, не являлся членом этой семьи. ДНК-профиль указанного потомка не имел аллельных вариантов рес-трикционных фрагментов материнского генотипа ни для одного маркера. (На рис.1 Б показан результат реконструкции семьи с использованием одной пробы, остальные данные не представлены). Как выяснилось, забор крови у данного индивида был сделан в отсутствие сотрудников Медико-генетического Научного Центра. Не исключено, что ребенок не принадлежал к изучаемой родословной и кровь у него взяли по ошибке или образцы были перепутаны на пункте взятия крови. Данный индивид был исключен из родосло: лой и при проведении анализа сцепления в расчет не принимался.

Подобный ан'тиз структуры семей проводили и в родословной с врожденной полиморфной катарактой. В процессе исследований была обнаружена семья, в которой ставилась под сомнение истинность биологического отцовства из-за отсутствия маркерных аллелей отца в генотипе потомков. Во всех случаях, кроме одного, при использовании 9 микросателлитных (далее в тексте) и 6 информативных У№№-маркеров (муциновую пробу в анализе данной семьи не использовали) (табл.2), наблюдалось несоответствие отцовских аллельных вариантов тем, которые ожидались бы, будь он истинным отцом. На рис.1 А представлены ДНК-профили членов этой семьи, выявляемые в результате гибридизации таах-гидролизата тотальной ДНК индивидов с локусспецифичным УНТК- маркером СММ101 (данные для остальных гипервариабельных проб не показаны).

Данный индивид также- был исключен из анализа сцепления.

-О

йо52з

<99

«8» '

1 2 3 4 5 6 7

Ь» 9 ~ -'

1. ;

1 2 3 4 5 6

Рис.1 Реконструкция семей с ВПК (А) и ЛПГ (Б). ДНК-профили членов семей получены в результате гиблидизации Taql-гидролизатов тотальной ДНК .индивидов с YUTR-пробами - СШ101 и mucin соответственно.

А: Выявлено ложное биологическое отцовство.

Б: Один из потомков (дорожка 2) не является членом даьиой

семьи: в своем генотипе не имеет материнских аллелей

Обнаруженные наш в хода работы несоответствия в структуре семей ясно продемонстрировали возможность использования высокого-лиморфных маркеров ДНИ для реконструкции семей в родословных» для .которых опрос не всегда бывает верен. Кроме того, методика, предполагающая использование тг :их проб ДНК, позволяет избежать ошибок при анализе сцепления, связанных с включением в анализ случайных индивидов.

Выявление мутаций в гипервариабельных районах ДНК.

Сравнивая электрофоретичвские профили ДНК детей и их родителей, мы обнаружили одну семью, в которой у ребенка отмечалось наличие полосы, отсутствующих у обоих родителей. Этот феномен наш рассматривался как результат. мейотической мутации, произошедшей при созревании гамет (рис.2).

■* Семья принадлежала к родословной с врожденной полиморфной катарактой. Мутация выявлялась на гибридазационном профиле, полученном с помощью g3 ДНК-пробы, локализованной на 7 хромосоме (7q36-qter). У обследованных в родословной 45 потомков и их родителей проанализировано распределение 85 аллельных Haelll-фрагментов. Во всех случаях, кроме одного» наблюдалось четкое соответствие генотипов потомков генотипам их родителей. В описываемой семье один из двух детей имел нормальное распределение аллелей (один от отца, другой от матери), а у второго црисутствовал только отцовский аллель (рис.2). Очевидно, что наблюдаемая нами мутация d© novo произошла в материнской гамете.

Из 16 информативных vmtr- и микросателлитных маркеров,, с'помощью которых мы исследовали эту семью, только один выявил такой необччный фрагмент. Остальные полиморфные маркеры подтверждали кровное родство этого потомка с остальными членами семьи.

Теоретичски, пробы ДНК, определяющие уникальные локусы генома, должны обладать уровнем гетерозиготности близким к юс~ чтобы иметь возможности детектировать мутации в гипервариабельных районах генома. В нашем случае средняя гетерозиготность маркера g3 для обследованной выборки составила 93,ей.

Выявление генетической гетерогенности клинически сходных зонулярных форм врожденных катаракт«

В родословной, отягощенной врожденной полиморфной катарактой iВПК), определенной как атипичная популярная, среди пораженных ин-

о ~т~т

k л

66

t-

со

I

г? _ •

Ь^Щ

12 3 4

Рис.2 Выявление мутации de novo з гоервариабэльном районе ДНК. Представленные ДНК-профили индивидов получены в резул! ^ате гибридизации по Саузерну Наещ-гидролизатов тотальной ДНК индашидов из родословной с ВПК с пробой gs досле электрофо-ретического разделения рестрикционных фрагментов в 0,75% агарозном геле. Один из потомков (дорожка 3) несет отцовский аллель и мутацию de novo (указана стрелкой). Гетерози-готность пробы, детектирующей мутацию равна 93,8%.

дивидов имелись больные со случаями катаракты, морфологически сходной с клинической формой, описанной Renwiok J.H и Lawler S.D. (1963 г.). Описанная авторами как аутосомно-доминантная зонулярная порошковидная (или Сорроск) катаракта, данная форма обнаруживала сцепление с локусом группы крови Дафи Oq2i-q25) (табл.1) (McKusick, 1990). Обе формы катаракт проявляли некоторые сходные черты фенотипов: в частности, зонулярную локализацию помутнений у некоторых индивидов. Это дало нам основание предположить, что генетический дефект, ответственный за врожденную катаракту, обнаруженную в туркменской популяции "Нохурли", Может быть локализован на 1-ой хромосоме.

Для проверки сделанного предположения проводили анализ сцепления с использованием двух'теломерных WR-проб ДНК, картированных на обоих плечах 1-ой хромосомы (MS32, Iq42~q43 и MS1, 1рЗЗ-рЭ5)( и муциновой пробой (iq2i-q23), тесно сцепленной с локусом группы крови Дафи (Iq23-q25). При гибридизации с MS32 и Ы31 пробами использовали Haein-гидролизаты тотальной ДНК индивидов. Для муциновой пробы - laql-гйдролизаты.

Ранее маркер MS32 был описан как минисателлитная локусспеци-фичная ДНК-проба (локус D1S8). В нашей работе .ш обнаружили, что, гибридизационные профили ДНК каждого индивида нохурской популяции содержат целый набор полиморфных и константных фрагментов ДНК, не характерных для локусспецифичной пробы. Возникновение такого ДНК-фингерпринта явилось, очевидно, результатом регулярного расположения НаеШ-сайтов в мвзг-минисателлитных повторах. Таким образом, выявляемый MS32 пробой НаеШ-полиморфизм представлял собой муль-тилокусный полиморфизм и не мог быть использован для анализа сцепления D1S8 локуса о геном катаракты.

Ы31 и муциновая пробы выявили характерную для локусспецифич-ных ДНК-зондов модель полиморфизма. Анализ сцепления, проведенный с данными маркерами, продемонстрировал отсутствие сцеплеш'я гена заболевания с маркерными локусами. Полученные максимальные значения lod были отрицателышми или слабо положительными при достаточно высоких величинах рекомбинационных фракций (MS1: l0d=-0.039 гпэи 6=0,45; muain: lod=o,432 при 0=0,35). Негативный результат сцепле-1шя с пробой mucin позволил нам утверждать, что лежащш. в основе ВПК генетический дефект отличается от дефекта гена, картированного В. локусс ' 1q21-q2i>.

Таким образом,-п.результате проведенного анализа, было пока-нг^чичио гетерогенности наследственных форм катаракт, морфоло-сходны:', с ;';ч!у.чпрн0Й порошковидной катарактой, в различных

популяциях.

Попытка аналогизировать ген нохурской врожденной полиморфной катаракты с уже известными аутосомными доминантными генами других форм врожденных катаракт.

Исключив сцепление ВПК-гена с локусами 1-ой хромосомы, мы попытались аналогизировать ген изучаемой нами формы катаракты с уже известными аутосомно-доминантнывд генами других форм врож. катаракт. Несмотря на отсутствие сходства клинич. проявлений, мы не могли исключить вероятность того, что ген ВПК может являться аналогом уже известных генов (табл.1).

Локализация Символ Форма катаракты Номер по каталогу МоКив1ок, 1988 г.

CAE Катаракга зонулярная порошковидная, или Сорроск-катаракта 116200

2р25 ИЛИ 14424 САР1 Катаракта передняя полярная 1 1113650

Зр26.2 ИЛИ 4р15 САР2 Катаракта передняя полярнаяя 2 115650

^22.1 CCDN Катаракта задняя полярная 116700

2ЧЭЭ-35 CCL Сорроск-подобная катаракта 123660

1бч22.1 СТМ Катаракта зонулярная, или Магпег-катаракта 116806

Табл.1 Локализация генов доминантных врожденных катаракт в геноме человека.

На данном этапе картирования гена ВПК мы использовали маркеры ДНК, картированные вблизи локусов указанных генов.

Учитывая области локализации генов передней полярной и Сорроок-подобной катаракт, мы включили в анализ 2 маркера 2-ой хромосомы - уш24, аров - и 5 маркеров 14-ой хромосомы - рап01,

-12-

EFZ18.2, ОШ66, ЫС0С12, СШ101 (Т86Л.2)

Результаты анализа дали строгие доказательства отсутствия сцепления мевду маркерами 2-ой хромосомы и ВПК-геном. Полученные максимальные значения lod были ненамного выше нуля. (YNH24: iod=o,oo при е=о,45г аров: 1^.1=0,062 при е=о,45)

Можно было с уверенностью утвервдать, что ген ВПК не является аналогом гена САР.

Однако возможность гомологии исследуемого наш гена с ссь-геном не отвергалась окончательно. Для маркера длинного плэча 2-ой хромосомы (YNH24) нам была известна только довольно обширная область локализации: 2q14-q2l - 2q36-q31. То есть, возможно, он не 'является на самом деле тесно сцепленным с локусом Coppook-но-добной катаракты. И в этом случае отсутствие сцешшшя мевду маркерным локусом'и геном заболевания не мокет служить доказательством неидентичности генов ОСЬ и ВПК.

' Из б таги i/чркеров 1 4-оё хромосомы только один оказался информативным - СЫМЮ1 (D14S13). Для него макскмальноэ значэниэ lod превышало 1 (1,291 при 6=0,3)) Это позволяло с осторонностьи предположить возможное сцепление мезду локусамк.

Лабораторией Е.К.Гинтера нам были любезно предоставлены результаты исследования этого же семейного материала с маркером белковой природы локуса PI (ген а^-антитрипсин); iod=1„089 при 6=0,20. Как и маркер СЫМ101, маркер локуса pi картирован на длинном плече 14-ой хромосомы, в котором локализован один из генов передней полярной катаракты.

Наш был проведен анализ сцелл чия между локусами Pi и D14S13. Полученные данные (lod=2,24, 6=0.05) с высокой вероятностью позволяли предположить, что эти два локуса достаточно тесно сцеьлены между собой.

Взаимное расположение гена заболевания и маркерных локусов на 14-ой хромосоме можно представить следующим образом:

сеп -ВПК —о.госм— PI —o.oscM— BKS13

(14q32.1) (14q32.1 -

14q32.32)

--0.30-

Можно было ожидать, что если ВПК-ген локализован на хромосоме и, та перспективной областью для его поиска является область i4q, расположенная проксимальное pi. Поэтому, мы включили в анализ 4 ми-кр.>с\'!т!?ллитных маркера из-этой области <1)14S40, D14S50, D14S53,

-13014377). Однако ни с одним из дополнительно привлеченных маркеров не было показано сцепления гена катаракты. Поэтому 14-ая хромосома была :склзочена наш как хромосома, на которой может быть картирован ген ВПК.

Исключение локализации гена нохурской врожденной полиморфной катаракты в локусах других хромосом.

Кроме попыток аналогизировать ген ВПК с уже картированными аутосомными доминантными генами вроаденных катаракт„ мы исследоза-га зге сцепление с доезугяая «ля яяо генетическими полиморфными системами, имеющими различную локел^заци» (как ;,31:фоса7сл?ти^"мми. так и тати-маркерами).

Часть проб была отобрана случайным образом. 3 ряде случаев выбор ДНК-маркеров для проведения анализа сцепления основывался на их локализаций в геноме вблизи областей картирования генов,, кодирующих структурные белки-кристалланы, дефекты которых могли бы привести к развитию заболевания (области 17ч и 22ч).

Среда использованных зтн-маркеров (гетерозиготность которых составляла по крайней мере 70%) были маркеры на следующие локусы: ПбЗЮ5 (6р), 0173250 (17ч11.2-д12), ОАВНВЗ (15411.2),. ?8УУ/Р (12р13)о СЯУВ2-А (22о), Для всех изученных семой указгшшв ДНК-пробы являлись информативными. При исследовании сцепления гена ВПК с микросателлитными маркерами ни для одного из них не был получен 'положительный 1ой. Зто указывало на отсутствие сцепления мевду маркерными локусами и ВПК-геном.

Наряду с маркерами, имеющими микросателлитную прир ду; в анализ включили ряд минисателлитов, "выявляющих полиморфизм длины рес-трикционных фрагментов«

В таблице г приведены данные о локализации всех 1ШРФ-маркеров, используемых в анализе, и указаны рестриктазы, по которым получали специфические ДНК-профили, выявляющие У№Гй-полимор-физм после гибридизации с'пробами ДНК» Кроме проб, детектирующих рестрикционный полиморфизм в результате блот-гибридизации по Слу-зерну, в таблице представлен один маркер (аров), выявляющий полиморфизм в локусе после ПЦР. Однако аллелыше вариации и в дашгч случае были ооусловлены изменением числа тандемно организованных повторяющихся единиц в амплифицируемом фрагменте ДНК.

Для всех информативных проб в таблице указаны значения НС и гсторозиготности. -Следует отметить, что, анализировались семьи, относящиеся к одной родословной, внутри которой им»1..моего крон-

Маркер Локус Хро- Положе- Величина Использу- ¡Значе- Информа-

мо- ние на. гетеро- емая рес- ние PIO тивность

сома карте зиготно- триктаза

сти (i)

MS32 D1S8 1 1q42-q43 НаеШ неинформ.

INS INS 11 11р15.5 НаеШ неинформ.

Ha-ras HRAS1 11 11P15.5 TaqI неинформ.

YNZ22 D17S5 17 17Р13.Э TaqI неинформ.

ТНН59 D17S4 17 17q23- НаеШ неинформ.

q25.3

СШ66 D14S22 14 14q EooRI неинформ.

PAW101 D14S1 14 14q32.1- EooRI неинформ.

q32.2

EFZ182 D14S17 14 14q32- TaqI неинформ.

q33

МС0С12 D14S20 14 14q32- TaqI » неинформ.

q33

СММ101 D14S13 14 14q32 97,6 TaqI 0,92 информвт.

или (14q32.1

MLJ14 -14432.32

MS1 D1S7 1 1p33-p35j 80,0 НаеШ 0,89 информат.

mucin MUC1 1 1q21-q23j 82,2 TaqI 0,76 информат.

YNH24 D2S44 2 2q 87,4 • Haelll 0,91 информат.

(2q14-q2"

-2q36-q37)

g3 D7S22 7 7q36- 93,8 Haelll 0,88 информат.

qter

a-glo D16S85 16 1бр13.3 82,6 Haelll 0,83 информат.

bin

АРОВ 2 2p24-p23 87,9 0,81 информат.

Табл.^ Уотя-маркеры, используемые при проведении анализа сцепле- . ния гена врожденной по шорфной катаракты из популяции "Нохурли" с различными локусами генома.

нородственные браки. Поэтому не наблюдалось прямого соответствия между значениями pic и гетерозиготности для отдельных локусов, установленных на данной выборке семей, и значениями, установленными для популяции. Так, например, в литературе для маркеров muoin, YNH24 и MS1 приводят значешя гетерозиготностей, установленные для европейской популяции, равные 90-98% в (зависимости от используемых рвстриктаз) (Human Gene Mapping 11, 1991).

Из 6 дополнительно вовлеченных в анализ штн-маркеров (помимо описаншх ранее десяти ДНК-проб), только 2 окупались шгформа-тивными для обследуемых семей: g3 и а-глобпн. Остальные маркеры Сил: г непригодны для проведения анализа, так как обнаруживали муль-тилокусность или проявлял* слабый колшорфиэм. Нолучеишо мзкси-мальные значения lod (a-globin: lod=0.04, 0=0,40; g3: iod=0,l40, 6=0,4) исключали возможность сцепления между геном заболевания и маркерными локусами.

Таким образом, проведенный нами анализ исключил локализацию гена ВПК в локусах ряда хромосом: 1,2,6,7,12,14,15,16,17,22.

Анализ сцепления в семьях родословной, отягощенных ладонно-подошвенным гиперкератозом.

Чтобы определить хромосомную локализацию ЛПГ-гвна, мы изучали сегрегацию в родословной, отягощенной этим наследственным заболеванием, ряда VNTR и STR-маркеров. При выборе маркеров учитывали области картирования генов, де^кты которых могли Ou привести к развитию заболевания.

Фепотипические проявления тилоза позволяют предположить, что лежащий в основе заболевания генетический дефект может затрагивать один из нескольких генов, важных для дифференциации эпидермалышх клеток или целостности цитоскелета кератиноцитов.

В этом отношении интерес вызывают гены кератинов, инволюкри-на, профилаггрина, трансглютаминазы I. Кластеры карагановых генов локализованы В 17q, 17р И 12р (Rosenberg et al, 1983, Compton et al., 1992).Ген инволюкрина картирован на длинном плече 1-ой хромосомы В области 1 q21 --q22 (Richard et ai. ,1986); ген профилаггрш.и (Предшественника филаггрина) - в области iq2i (uan et ai., 1990); ген трансглютаминазы l - в районе I4qïi.2-qi3 на 14-ой хромосоме (Kim et al., 1992). Поэтому мы включили в анализ родословной, отя-гещшшсй JIÍIL', ДНК пробы, локплизовшпше. в указанных или приложлщих к ним областях. -

Кроме того ш использовали ДНК-маркеры со случайной локализацией в геноме из имеющейся в нашем распоряжении коллекции (таблица 3)

м-'пкер локус Хромосома Положение на карте [ Рестряктаза

умгй-маркеры

Кио1п ШС-1 1 . | 1421-423 I Тач!

Ж22 Б1735 17 17Р1Э.Э

1'НН:^ Ш7Б4 17 I 17ч23-425.3 Тач!

0503101 4Б13 14 - | 14ч32 1 Шаа!

микросателлитные маркеры

ШРЬ з | 8р21

12 I 12р1Э

Б14848 14 14^11-424

014350 14 | 14411-424

СЮГВ2-А 22 | 22ч

Б173250 .17 I 17411.2-412 р

Табл.з таги- и микросателлитные маркеры, сегрегация которых изучалась в родословной, отягощенной ЛПГ. Для тети-маркеров указана рестриктаза0 используемая при получении гидролиза-тов геномной ДНК индивидов.

Результаты анализа сцепления ЛПГ-гена с маркерными полиморфными локусами представлены в приведенной ниже таблице 4. Из полученных данных следует, что отсутствует сцепление между геном тилоза и 5 микросатедлитшми локусами: нуь, ратарс 014343, и14350, скув2-а. Во всех случаях значения логарифмов шансов оказались отрицательными или слабо положительными при малых значениях частот рекомбинаций. С тремя из четырех УИТН-маркеров (Ыио1л, УМ222 смм 101) тг;-же не было обнаружено сцепления (табл.4).

Однако, при исследовании сцепления между ЛПГ-геном и локус^м 1)1734 117423-425.3) в анализе 7 ядерных семей с общим числом сиб-сов раЕним 23, было получено по.ижительное значение 1ой. При частоте рекомбинации 0,2 оно оказалось равным 0,729. Несмотря на не-оольиую абсолютную величину полученного значения, мы посчитали не-

Маркер

Л оку с

Положение на

карте

г\

Анализ сцепления ште-маркеров с ЛПГ-геном.

МиоЛп ГОС-1 1421-423 0,000 0,50

тъгг Б1735 17Р13.3 0,350 0,20

ТНН59 Ш734 17423-425.3 0,729 0,20

сш101 ш4313 14432 0,000 0,50

Анализ сцепления микросателлитных маркеров с ЛПГ-геном.

ЦНЕРЬ РВУТО 014348 4350

8р21 12р13 14411-424 14411-424

СКУВ2-А!22<1 0173250 170,11.

Табл.4 Результаты анализа сцепления ЛПГ-гена с умти- и зтл-мар-керами. 8 - значение частоты рекомбинации, при которой наблюдается максимальное значение 1о<1 ).

обходимым Проверить гипотезу о озможном расположении г ча тилоза в длинном плече 17-ой хромосомы. Для этого было необходимо ввести в анализ сцепления дополнительные маркеры из области 174.

Использование микросателлитного маркера В17Б250, картированного в 17411.2-412, позволило получить значение юй не только положительное, но и превышающее 3 (гх=4,65 при 8=0,05) (табл.4). Исходя из принятой величины порога вероятности сцепления» двух ло-кусов, это можно было рассматривать как доказательство наличия сцепления между маркерным локусом и геном ЛИГ.

На рисунке 3 показан полиморфизм локуса 0173250, выявляемы полимеразной цепной реакцией. Отмечается совместная сегрегация ал-леля 7 маркерного локуса и гена тилоза.

На основании полученных данных о величине рекомбнншшонных 'фракций, ссотпптстпукицих ..нлолюдпомым. максимальным положительным • знячмгаям 1<>а при -шачизе л-лкулч» ШУУ4 и 1)173Пьо, V -з!о рзеноло-

Ноиерл индивидов в родословной

ndlInlll^^■)>>•lt^лDHiaf<^llllиn

и *

Р) * Г» ^

Генотипы индивида б в,локусе б173255

811 ч О » Ш В ш г- с, в,

И ■ I 1-, |>. > О' (V к О о Л" 1

4 1 1

Й Л Л т(

Рис.3 Полиморфизм локуса 1)178250 в семьях с ЛПГ, выявляемый по-лимеразной цепной реакцией. (Приведен фрагмент родословной). Указаны порядковые номера индивидов, под которыгч они фигурируют в родословной. Показаны генотипы индивидоь в маркерном локусе: 7-ой аллель косегрегирует с ЛЙГ-геж» Звездочкой помечены индивида, ДНК которых не исследовали в анализе сцепления.

кить исследуемый и маркерные локусы на I7q следующим образом:

ceil - (ЛПГ)-0.05сМ- D17S250 -o.oscM- (ЛПГ) -D17S4

(17q11-2-q12) (1?q23-q25.3)

-62сМ-

Генетическое расстояние между D17S250 и D17S4 и порядок расположения локусов взяты из литературных источников (Weissenbach et al., 1992). Незначительный положительный lod, получ.-шый при анализе сцепления локусов ЛПГ и D17S4 (6=0,2) демонстрирует возможность лишь очень слабого сцеияэлпя между изучаемыми локусами. Это не позволяет достаточно точно установить расположение ЛПГ-локуеа относительно двух маркерных локусов. Можно только утверждать, что ген, ответственный за развитие ладонно-подошвенного гиперкератоза, картирован где-то в области локализации D17S250 07qii.2-ql2).

Для более точного картирования гена патологии следовало бы провести анализ сцепления с целым рядом маркеров, перекрывающих длинное плечо 17-ой хромосомы. В нашем- распоряжении, однако, не имелось таких ДНК-проб. Поэтому в данной работе было установлено сцепление ЛПГ-гена с локусом D17S250 и определена область поиска маркеров для точной локализации гена заболевания.

Возможные гены-кандидаты ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза).

Область локализации марк ¿а, сцепленного с генгч ладонно-подошвенного гиперкератоза (тилоза), интересна тем, что содержит ряд генов, первичный биохимический дефект которых может привести к данному заболеванию.

Во-первых, в длинном плече 17-ой хромосомы, в ло^усе i7qii-q2i картирован один из кластеров генов кислых кератинов (KRT) (Rosenberg et al., 1988). Накопление кератинов в клетках внешних слоев эпидермиса может вызывать утолщение рогового слоя эпидермиса. Так как ЛПГ характеризуется наличием именно такого признака, то вполне допустимо, что гены Иератшов I типа могут являться генами, ответст' энными pi возникновение данной патологии.

Обсуждая возможное^1 вовлечения кератиновых генов в этиологию дерматозов, связанных с нарушениями рогового слоя эпидермиса, ряд авторов обращает особое внимание на KRT9. Было показано, что данный геи экспрессируется преимущественно в эпидерк ;ышх •клетках ладоней и .подошв', присутствуя только в окончательно дкф$яренииро

иашшх клетках шиповатого и рогового слоев. В большинстве других .атдермисов кератин 9 не обнаружен (по Reis et al., 1992). IIpjj гзучепии эпидермолитической ладонно-подощвенной кератодермии гея KRT9 рассматривался авторащ как естественный ген-кандидат заболевания (Heis et al., 1992). Ген KRT9 еще не был клонирован. Но .рансляционный анализ in vitro показал, что кератиновый белок К9 не является продуктом протеолиза или альтернативного сплайсинга других кератиновых генов и кодируется дискретной мРНК.

Кроме того, кератины всегда функционируют как гетеродимеры. Поэтому изменение именно этих структурных белков могло бы объяснить „оминантный фенотип ряда наследственных дерматозов, связанных с изменением процесса кератинизации. Доминантность мутаций кератиновых белков обуславливается тем, что изменение только одного члена димера повлияет на весь димер в целом.

В период, когда результаты о локализации гена ладонно-иодошвенного гиперкератоза,' входящие в данную работу, готовились к печати, в литературе появились публикации о картировании генов, ответственных за возникновение ряда наследственных дерматозов. Так, генетические дефекты, приводящие к эпидермолитическому гиперкератозу, простому генерализованному буллезному эпидермолизу и простому локальному буллезному эпидермолизу, были локализованы в I2qli-qi3 и ассоциированы с мутациями в гене кгеп (Compton et al., 1992, Rothnagei J.A. et al., 1992). Гены простого буллезного эпи-дермолиза типа Dowling—Меага и буллезного эпидермолиза типа Weber-cockayne были картированы в том же районе, но их дефекты ассоциированы с мутациями гена KRT5 (Bonifas et al., 1991). Для ряда форм эпидермолитического гиперкератоза и простого буллезного эпидермолиза типа Dowling-Meara были .обнаружены мутации в кератина?: KRT10 (17q2 -q22) И KRT14 (17q12-q21) соответственно Coulombe et al., 1992, Rothnagei J.A. et al., 1992).

Эти дерматозы характеризуются поражением в первую очередь эпидермиса. Однако проявление этих мутаций различно. При эпидермо-литическом гиперкератозе цитолиз происходит в супрабазальном слое эпидермиса, а при простом булдезном эпидермолизе - в базальном слое. Тем не менее, при обоих заболеваниях первично страдает одгт из кератинов. Как известно, кератиновым белкам придается большое значете в поддержании целостности эпидермиса за счет образован?-1 сети кератиновых филаментов в клетках.

Фенотипические проявления Л^ отличаются от характерных фено-тшшческих признаков, эпидермолитического гиперкератоза и простого оулл??кого эпидермолиза. Но, несмотря на это, мокно предположить,

что при ЛПГ мутация локализуется также в одном из карагановых генов. Недавнее картирование гена эпидермолитической ладонно-подо-венной кератодермии в районе I7qi2-q2l подтверждает эту возможность (Reis et al., 1992). (Так как данное заболевание является эпидермолитической формой локальных гиперкератозов, к которой относится и ЛПГ.)

Другим возможным геном-кандидатом ЛПГ может быть ген рецептора ретиноевой кислоты (RARA-ген), который локализован в том же районе 17-ой хромосомы, что и кластер кератиновых генов I типа. Ретиноиды играют важную роль в процессе роста л дифференциации эпидормальшх'клеток. Экспрессируясь в клетках кожи, рецепторы ретиноевой кислоты могут, в свою очередь, регулировать экспро сто кератиновых генов (Noji et al., 1989).

Таким образом, число генов-кандидатов ЛПГ является весьма значительным. Предполагаемая область локализации гена тилоза на длинном плече 17-ой хромосомы включает целый кластер генов кис">. • кератинов (кнтю, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19) и ген rara. Учитывая это, идентификация гена ладонно-подошвенного гиперкератоза будет представлять сложную задачу.

ВЫВОДЫ

1. Установлено сцепление гена ладонно-подошвенного гиперкора-тоза (тилоза) с маркером 17-ой хромосомы - D17S250 (значение lod-4,65 при 6=0,05).

2. Определена потенциальная область локализации гена ладонно-подошвенного гиперкератоза яь длинном плече 17-ой хромосомы: 17q11.2-q12.

3. Установлена генетическая гетерогенность врожденных ауто-сомно-доминаатшх форм катаракт, морфологически сходных с зонуляр-ной порошковидной катарактой (Coppock-катарактой).

4.'Исключена локализация гена врожденной полиморфной "нохур-сной" катаракты в следующих хромосомных локусах: 1р33-р35, 1q21-q23, 2р24-р2Э, 6р, 7q36-qter, 12р13, 14q11-q24, 14q32.1, 15q11.2, 1бр13.3, 17q11.2-q12, 22q.

b Продемонстрирована возможность использования локусспецифи1' -ных маркеров Д."К с уровнем гетерозиготности более 8и% для исключе-1шя из генетического анализа случайных индивидов, что позволяет избежать ошибок при проведении анализа сцепления и получить достоверный результат. Из 15 использованных нами информативных vntr- и STR-маркеров для анализа одной из семей, только од..л т выявил

ложное биологическое отцовство.

ь. Показана возможность выявления мутаций в гиперзариабельных районах ДНК при помощи полиморфных маркеров, детектирующих уникальные локусы генома и имеющих уровень гетерозиготности более

.'Uii.

г

ПРИМЕЧАНИЕ.

Картирование гена врожденной полиморфной катаракты из туркменского генетического изолята "Нохурли" недавно было завершено Е.И. .огаевым, научным руководителем данной диссертационной работы. Обнаружено тесное сцепление ВПК-гена с локусом длинного плеча 2-ой хромосомы (Рогаев Е.И. с соавт., в печати).

В ходе совместных исследований мевду лабораторией молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья РАМН и Университетом города Торонто, им же была установлена точная локализация гена ладонно-подошвешюго гиперкератоза на длинном плече '"-ой хромосомы вблизи кластера кератиновых генов (Rogaev Е. et al Na r-e Genetics, 1993, v.5: 158-162).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Rogaev E.I., Korovaitseva G.I., Trubnikov V.I Application of VNTR-markers for linkage analysis of schizofrenia and cataraot. Abstracts of First International Conference on ША fingerprinting, 1990, p.47

2. Rogaev E.I., Korovaitseva G.I., Barisheva E, Ginter E.K. ША--genotyping of. cataract enriched. Meddle Asia familial isolate, Amer. J. Jum. Genet., 1991, v.49 (supplement), p.347

3. Rogaev E.I., Korovaitseva G.I., Barisheva E, Ginter E.K. Data for geterogenety of zonular form cataraot. Exclusion of ethnic cataraot locus for 1q21-q23 and other chromosome "candidates" loci.

4 Rogaev E.I., Rogaeva E.A., Ginter E.K., Korovaitseva G.I., Far-rer L.A., Shlensky А.В., Pritkov A.N., Mordovtsev V.N., P. Gc\ org-Hyslop. Identification of the genetic locus for Keratosis Pa'-naris et Plantaris on chromosome 17 near the RARA and Ker; -tin type I genes. Nature Genetics, 1993, v.5: 158-162

5 Korovaitseva 0.1., Rogaev E.^., Shlensky A.B., Ginter E.K. Application of hype-rvariable DNA-markers for detection indivi-dual-speoific patterns and linkage analysis. Abstracts of 25th

Aimual Meeting oi the European Society of Human Genetics, Bar seIona9 1993» p.84 (N 227)

6. Г лтер 2.K.„"Рогаев Е.И.5 Коровайцааа Г.И.» Тураева Ш.М„, Печ-рин А.Н. „ Спицан В.Л. 0 Тарлычеза Л.В< Дальнейший аяажз яокч-лизации гена аутосомной доминантной эровденкой нохурской чег» ранты. Генетика, 1993, ?=29, N4:670-673

7. Рогаев 2.И., Гинтер Е.К., Рогаева S.A., Коровайцева Г.И., Прыт ков А.Н„ исследование локализаций гена доминантного лэдонно-подошвенного гиперкэратоза у человека, Генетика, 1993, т. 29, N7:1180-1185

8. Рогаев 2.11.ь Рогаева Е.Д.„ Гютер Е„К.0 Коровайцева Г.И.» öap-рер Л. о Шленский А.Б.0 Прытков A.H«, Джордк-Хислоп Р,, Мордоа цев В.Н. Картирование гена яадонно-подошвенного пшеркератоза (тилоза) на 17 хромосоме в район® I7qi2-q24. Генетика, 1994, Т.ЗОо N3:326-329

9. Рогаев Е.И., Рогаева Е.А., Гинтер Е.К., Коровайцева Г„И„» Фар pep Л., Шленский' A.B., Прытков А.Н., Дяорда-Яислоп Р. Ассоциирован ли ген ладонно-подоивенного гипвркэратоза с однх ! из локусов кератина типа I? Генетика, 1994, f=300 N5:600-303

10.Гинтер Е.К., Рогаев Е.И., Коровайцева Г.И. Картирование генов наследственных болезней человека. Тезиск 4-ой конференции 'Те-ном человека-94", г.Черноголовка, 1994, с.25