Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленной недостаточностью 21-гидроксилазы

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленной недостаточностью 21-гидроксилазы"

На правах рукописи

РАХИМКУЛОВА АИГУЛЬ АИРАТОВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВРОЖДЕННОЙ ДИСФУНКЦИИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ 21-ГИДРОКСИЛАЗЫ

03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

005542165

Уфа-2013

005542165

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН)

Научный руководитель: Хуснутдинова Эльза Камилевна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Зинченко Рена Абульфазовна

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией генетической эпидемиологии ФГБУ «МГНЦ» РАМН

Корытина Гульназ Фаритовна

доктор биологических наук, старший паучный сотрудник лаборатории физиологической генетики ИБГ УНЦ РАН

ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «/¿?>н % т.*«/? » часов

на заседании диссертационного совета Д 00i.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71; с электронной версией автореферата - на сайтах ВАК РФ и ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru.

Автореферат разослан » М<Л(?C^éh013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н

С.М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - группа аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных нарушением секреции кортикостероидов вследствие врожденного дефекта ферментов, ответственных за их биосинтез (Katsumata et al, 2010; Wedell, 2011; Mnif, 2013). В 95% случаев ВДКН обусловлена недостаточностью фермента 21-гидроксилаза вследствие мутаций в кодирующем его гене CYP21A2 (White et al, 2000). Недостаточность 21-гидроксилазы классифицируется на 2 основные формы: «классическая» (сольтеряющая (СТФ) и простая вирильная (ПФ)), основными признаками которой являются внутриутробная вирилизация и нарушение солевого обмена, и «неклассическая», проявляющаяся в постнатальном периоде. Частота ВДКН варьирует от 1:27 до 1:42000 в зависимости от формы и рассматриваемой популяции (Ambroziak, 2010; Li-Ping Tsai, 2011).

Из-за высокой распространенности и тяжести клинических проявлений ВДКН включили в программу неонатального скрининга новорожденных более чем в 30 странах мира, в том числе с 2006 года и в России. Введение массового обследования новорожденных позволяет диагностировать ВДКН в неонатальный период, что с помощью своевременного и адекватного лечения дает возможность предотвратить развитие таких серьезных осложнений, как сольтеряющий криз и связанные с ним летальные исходы и длительная госпитализация, преждевременное половое развитие и бесплодие.

Ввиду сложности диагностики ВДКН и се неточности при использовании биохимических методов во всем мире активно ведется исследование молекулярной природы данного заболевания. Идентификация мутаций гена 21-гидроксилазы и последующая оценка индивидуального генетического риска па их основе имеют большое значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению ВДКН, а также внедрения в практику медико-генетической службы. Использование высокополиморфных маркеров, локализованных в HLA-локусе рядом с геном 21-гидроксилазы и сцепленных с ним, позволяет более эффективно проводить пренатальпую молекулярно-генетическую диагностику ВДКН и выявлять гетерозиготных носителей в семьях высокого риска с целью профилактики данного

заболевания, что, в свою очередь, значительно улучшает медико-генетическое консультирование семей с ВДКН.

Цель работы: изучение генетической природы врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленной недостаточностью 21-гидроксилазы, и разработка подходов ее ДНК-диагностики.

Задачи исследования:

1. Провести скрининг наиболее распространенных «классических» мутаций гена 21-гидроксилазы у больных с ВДКН из Республики Башкортостан.

2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене 21-гидроксилазы у больных с ВДКН из Республики Башкортостан.

3. Определить молекулярпо-генетические особенности классических форм ВДКН вследствие дефицита 21-гидроксилазы у больных в Республике Башкортостан.

4. Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и гаплотипов внегенных ЗТЛ-локусов (0682670, 068273) на нормальных и мутантных хромосомах в семьях больных с ВДКН и здоровых семьях.

5. Проанализировать неравновесие по сцеплению между мутациями гена 21-гидроксилазы и аллелями и гаплотипами изученных ЭТИ-локусов; оценить их значимость и возможность использования для косвенной ДНК-диагностики ВДКН.

6. Разработать оптимальный алгоритм молекулярной диагностики ВДКН в Республике Башкортостан.

Научная новизна. Впервые в Республике Башкортостан проведено молекулярно-генетическое исследование всей кодирующей последовательности и экзон-интронных соединений гена 21-гидроксилазы методом БвСР анализа с последующим секвенированием. Впервые обнаружена мутация с.1151_1153йе1АСТ (р.11е384с1еГ) гена СУР21А2. Получены данные о спектре и частоте мутаций в гене 21-гидроксилазы у больных ВДКН из Республики Башкортостан. Для каждой классической формы ВДКН показан свой спектр диагностически значимых мутаций гена 21-гидроксилазы. Впервые проведен анализ распределения частот аллелей и гаплотипов высокополиморфных локусов 0682670 и 068273, локализованных рядом с геном СУР21А2, в семьях больных ВДКН и здоровых семьях и определена их значимость для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы. Впервые проведена

оценка информативности семей с ВДКН из Республики Башкортостан, основанная на комплексном исследовании мутаций в гене CYP21A2,

Научно-практическая значимость. В результате молекулярно-генетического анализа гена 21-гидроксилазы определена информативность изученных семей с ВДКН из Республики Башкортостан для пренатальной молекулярно-генетической диагностики и выявлены гетерозиготные носители. Полученные данные о частоте и спектре мутаций и полиморфных вариантов в гене CYP21A2 внесли определенный вклад в познание генетической природы недостаточности 21-гидроксилазы и позволили разработать поэтапную схему молекулярно-генетического обследования семей с ВДКН, которая дает возможность повысить эффективность медико-генетического консультирования и профилактики данного заболевания в Республике Башкортостан. В 7 семьях с ВДКН определен тип мутационных повреждений и проведена пренатальная диагностика дефицита 21-гидроксилазы.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II и III школе-конференции по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011; 2012); международной конференции Human Genome Meeting (Dubai, 2011); European Human Genetics Conference (Nürnberg, 2012; Paris, 2013); V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012); V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); Всероссийской молодежной научно-практической конференции (Уфа, 2013); 8th IS ABS Conference (Zagreb, 2013); конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 - статьи в журналах из Перечня ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 140 источников, в том числе 5

отечественных и 135 зарубежных. Иллюстративный материал содержит 47 рисунков и 15 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 был проведен у 108-и больных разной этнической принадлежности с клиническим диагнозом «врожденная дисфункция коры надпочечников», состоящих на учете в отделении эндокринологии Республиканской детской клинической больницы г. Уфы, а также у 176 членов их семей (родителей, сибсов), проживающих на территории Республики Башкортостан (РБ). В исследуемую группу вошли 64 больных с сольтеряющей формой (59.2%), 26 больных с простой вирильной (24.1%) и 18 - с неклассической формой (НФ) ВДКН (16.7%).

В качестве контрольной выборки были использованы 47 семей и 73 здоровых неродственных индивида, соответствующих выборке больных по полу, возрасту и этнической принадлежности.

Геномную ДНК обследуемых индивидов выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984). Для анализа 11 наиболее распространенных «классических» мутаций гена CYP21A2, обусловленных генными рекомбинациями между активным геном и псевдогеном локуса CYP21, применены различные виды ПЦР на амплификаторах «Eppendorf» (Германия) и «BioRad» (США) и, если это было необходимо, с последующим рестрикционным анализом. Поиск приводящих к развитию ВДКН мутаций в гене CYP21A2 проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) амплификата активного гена с последующим секвенированием образцов с измененной подвижностью на автоматическом секвенаторе ABI Prism модель ABI Prizm 3130x1 (Applied Biosystems). Для «прочтения» последовательности нуклеотидов использовали приложение Chromas LITE (Version 2, technelysium.com.au), а для анализа полученных сиквенсов -программу DNAStar Inc (1993-2002). Для подтверждения мутаций и полиморфных локусов гена CYP21A2, являющихся однонуклеотидными заменами, в выборке ВДКН и в группе здоровых индивидов использовали метод рестрикционного анализа. Для анализа внегенных высокополиморфных локусов D6S2670 и D6S273 применяли геномную ДНК и соответствующие праймеры. Статистическую обработку

полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ программного обеспечения MS Excel 2007 (Microsoft) и компьютерной программы RxC (Rows х Columns) (Roff D., Bentzen, 1989). Для сравнения распределения частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов применяли критерий /2 для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Иейтса на непрерывность (Epstein and Satten 2003; http://www.biometrica.tomsk.ru). Оценку неравновесия по сцеплению выявленных однонуклеотидных замен, определение частот гаплотипов и анализ распределения частот гаплотипов в группах больных и контроля проводили с помощью программы Haploview 4.2. (Barret et al., 2005). Степень ассоциации аллелей и гаплотипов изученных полиморфных локусов с мутациями гена CYP21A2 оценивали по коэффициенту стандартного неравновесия Ast (Krawczak et al, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ частоты встречаемости ВДКН в Республике Башкортостан

Частота врожденной дисфункции коры надпочечников в РБ составляет 1:8974 (Рамова, 2010). Наиболее высокая частота данного заболевания в нашем регионе наблюдалась у русских (35.78%), татарских (27.52%) и метисных (23.85%) семей. В метисных семьях основными носителями мутаций гена CYP21A2 оказались хромосомы русской, татарской и башкирской этнической принадлежности.

Скрининг «классических» мутаций гена 21-гидроксилазы

На первом этапе работы был проведен скрининг наиболее распространенных «классических» мутаций, обусловленных генными рекомбинациями между активным геном CYP2IA2 и псевдогеном CYP21A1 вследствие высокой гомологии их нуклеотидной последовательности.

Протяженные делеции и крупные генные конверсии delA2orLGC гена CYP21A2, приводящие к образованию нефункциональных химерных конструкций «ген-псевдоген» и встречающиеся во многих популяциях у больных с классической формой заболевания (Chang, 1995; White, 2000; Lee, 2005) определены с наибольшей частотой 33.26%, в том числе у 38 больных с СТФ (42.96%), из них у 17-ти в гомозиготном состоянии, у 11-ти с ПФ (20.37%) и у 5-ти больных с неклассической формой ВДКН (15.3%) в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями (таблица 1, 2). По литературным данным, у больных из европейских популяций частота делеции/конверсии delA2orLGC выше 20%, варьируя от 22.22% до 45.00%

(Stikkelbroeck et al., 2003; Bas et al., 2008; Chan et al., 2011), за исключением Испании (5.64%) и Франции (19.00%) (Stikkelbroeck et al., 2003; Loidi et al., 2006). У больных из Индонезии и Бразилии данные мутации не идентифицированы (Campos et al., 2009; Goossens et al., 2009).

Таблица 1

Распределение частот генотипов с мутациями гена СУР21А2 у больных с различными формами ВДКН из Республики Башкортостан

Гепотипы В общей выборке СТФ ПФ НФ

n Частота, % n Частота, % n Частота, % n Частота, %

delA2orLGCIdelA2orLGC 17 15.74 17 26.56 0 0.00 0 0.00

delA2oxLGOp.Ilel 72Asn 7 6.48 0 0.00 7 26.92 0 0.00

delA2orLGC/I2splice 10 9.26 9 14.06 1 3.85 0 0.00

delA2orLGCIp.Arg356Trp 5 4.63 4 6.25 1 3.85 0 0.00

ch'lA2orLGC/p. GlnSlHX 4 3.70 4 6.25 0 0.00 0 0.00

delA2oiLGC/p.Arg356Trp + p.Gln318X 1 0.93 1 1.56 0 0.00 0 0.00

delA2ovLGCIp. Va!28ILeu 5 4.62 0 0.00 0 0.00 5 27.77

delA2orLGCIp.Leu307fs 1 0.93 1 1.56 0 0.00 0 0.00

delA2orLGC/p.Ile384del 1 0.93 1 1.56 0 0.00 0 0.00

delA2orLGC/X 3 2.78 1 1.56 2 7.69 0 0.00

I2splice/I2splice 6 5.50 6 9.23 0 0.00 0 0.00

I2spIice/p.Arg356Trp 5 4.63 4 6.25 1 3.85 0 0.00

l2splice/p.Gln318X 2 1.85 2 3.13 0 0.00 0 0.00

12splice/p.Ilel 72Asti 2 1.85 0 0.00 2 7.69 0 0.00

I2splice/p.Arg426Cys 1 0.93 1 1.56 0 0.00 0 0.00

12splice/X 2 1.85 2 3.13 0 0.00 0 0.00

p.Arg356Trp /p.Arg356Trp 5 4.63 4 6.25 1 3.85 0 0.00

p.Arg356Trp/p.Arg356Trp+p.Gln3l8X 5 4.63 4 6.25 1 3.85 0 0.00

p.Arg356Trp/p.Ilel 72Asn 1 0.93 0 0.00 1 3.85 0 0.00

p.Arg356Trp/p.Ile 172Asn + p.Gln3I8X 1 0.93 1 1.56 0 0.00 0 0.00

p.Arg356Trp/X 2 1.85 0 0.00 1 3.85 1 5.56

p.Ilel 72Asn/p.I!el 72Am 2 1.85 0 0.00 2 7.69 0 0.00

p.Ilel 72Asn /I2splice+ p.Pro453Ser 1 0.93 0 0.00 1 3.85 0 0.00

p.Ilel 72Asn /delA2oiLGC+ p. Val281Le„ 1 0.93 0 0.00 0 0.00 1 5.56

p.Ilel 72Asn/X 1 0.93 0 0.00 1 3.85 0 0.00

p.Gln318XJX 3 2.78 1 1.56 0 0.00 2 11.11

p. Val28ILeu /X 2 1.85 0 0.00 0 0.00 2 11.11

p.Pro30LeuJp.Pro30Leu 1 0.93 0 0.00 0 0.00 1 5.56

p.ProSOLeuJX 1 0.93 0 0.00 0 0.00 1 5.56

XJX 10 9.26 1 1.56 4 15.38 5 27.78

Всего 108 64 26 18

Примечание здесь и далее: п - абсолютное количество больных, СТФ - сольтерякнцая форма, ПФ - простая вирильная форма, НФ — неклассическая форма

Таблица 2

Распределение частот мутаций гена СУР21А2 у больных с различными формами ВДКН из Республики Башкортостан

Мутации В общей выборке СТФ ПФ НФ

Частота, % Частота, % Частота, % Частота, У»

de!A2otLGC 33.26 42.96 20.37 15.3

I2splice 16.05 23.44 8.65 0.00

p.Arg356Trp 14.88 18.36 14.42 2.78

p.Gln318X 5.81 7.81 0.96 5.56

p.Hel72Asn 8.14 0.4 30.77 2.78

p. Val281Leu 3.49 0,00 0.00 20.83

p.Pio30Leu 1.39 0.00 0.00 8.33

p.Pro453Ser 0.23 0.00 0.96 0.00

p.l.eu307fs 0.46 0.78 0.00 0.00

p.Arg426Cys 0.46 0.78 0.00 0.00

p.Iíe384del 0.46 0.78 0.00 0.00

X 15.35 4.69 23.08 44.44

Мутация сплайсинга 12splice (c.293-13A/OG) гена CYP21A2, приводящая как к тяжелым формам заболевания вследствие преждевременного сплайсинга интрона и сдвига трансляционной рамки считывания, так и к более легким в результате возможного синтеза некоторого количества функционально активного белка за счет альтернативного сплайсинга (Higashi et al., 1988), в пашем исследовании идентифицирована у 24-х больных с СТФ ВДКН (23.44%) и у 4-х больных с ПФ заболевания (8.65%), общая частота составила 16.05% (таблица 1, 2). В других популяциях мира частота данной мутации, в основном, превышает 20%-й порог, за исключением некоторых стран (Krone et al., 2000; Stikkelbroeck et al., 2003; Dolzan et al., 2005).

Мутация p.Arg356Trp (с.1066С>Т) гена CYP21A2 полностью инактивирует фермент 21-гидроксилаза и в гомозиготном состоянии ассоциирована, в основном, с СТФ ВДКН (Miller, 1989; Higashi, 1991; Speiser, 1992; Wedell, 1995). В нашем исследовании данная мутация обнаружена на 14.88% мутантных хромосом, у 17-ти больных с СТФ ВДКН (18.36%), у 6-ти больных с простой вирилыгой формой (14.42%) и у 1-го больного с НФ заболевания (2.78%) (таблица 1, 2). Выявленная частота мутации p.Arg356Trp гена CYP21A2 в общей выборке больных из РБ практически в 2 раза выше, чем в других популяциях мира и сопоставима с таковой в Японии (17.65%) и Бразилии (14.30%) (Campos et al., 2009; Chang et al., 2011).

Частота мутации p.Gln3l8X (с.952С>Т) гена CYP21A2, приводящей к синтезу нефункционального белка 21-гидроксилаза, в популяциях мира не превышает 10% уровень, за исключением Бразилии, где она обнаружена на 25.70% мутантных хромосом (Campos et al., 2009). У больных ВДКН из РБ данная мутация выявлена с частотой выше среднеевропейской (5.81%), в том числе у 7-и больных с СТФ ВДКН (7.81%), 2-х больных с НФ ВДКН (5.56%) и у 1-го больного с ПФ (0.96%) заболевания в компаунд-гетерозиготном состоянии и кластере с другими мутациями (таблица 1,2).

Мутация p.Ilel72Asn (с.515Т>А) гена CYP21A2 приводит к вирилизации наружных половых органов без нарушения электролитного баланса и ассоциирована, главным образом, с ПФ ВДКН и лишь в единичных случаях встречается у больных с СТФ (Lobato, 1999). В РБ данная мутация идентифицирована на 8.14% хромосом, в том числе у 14-ти больных с ПФ ВДКН с частотой 30.77%, у 1-го больного с НФ заболевания (2.78%) и 1-го больного с СТФ (0.40%) в кластере с мутациями, полностью инактивирующими фермент 21-гидроксилаза (таблица 1, 2). В целом, частота встречаемости мутации p.Ilel72Asn в РБ оказалась ниже средней частоты популяций мира (12.54%), где она варьирует от 1.02% в Италии до 29.40% в Финляндии (Stikkelbroeck et al., 2003; Dolzan et al., 2005; Finkielstain et al., 2011).

При мутации р. Val281Leu (c.841G>T) гена CYP21A2 активность 21-гидроксилазы сохраняется на 20-50% и развивается неклассическая форма ВДКН (Tusie-Luna et al., 1990; Tajima et al, 1997; Wilson et al., 2006). В нашей выборке данная мутация обнаружена только у 7-и больных с НФ ВДКН, что составило 3.49% от общего числа больных (таблица 1, 2). Частота мутации p.Val281Leu гена CYP21A2 в популяциях мира колеблется в широких пределах: от 0% до 63.47%, достигая своего максимального значения у больных из Испании (Loidi et al., 2006).

Мутация р.РгоЗОЬеи (с.890Т) гена CYP21A2, сохраняющая 30-60% ферментативной активности 21-гидроксилазы, приводит к развитию НФ ВДКН (Barbat et al., 1995). В РБ данная мутация выявлена только у 2-х больных с НФ заболевания с частотой 1.39%, причем, у одного больного в гомозиготном состоянии (таблица 1, 2). Согласно литературным данным, в различных популяциях мира частота мутации р.РгоЗОЬеи незначительна, за исключением Италии и Австрии, где процент встречаемости данной мутации достиг более 9.00%.

Поиск изменений нуклеотиднои последовательности гена CYP21A2 У больных ВДКН с неидентифицированными на первом этапе мутациями продолжен поиск новых мутационных изменений с помощью SSCP-анализа промоторного региона, 1-10 экзонов и экзон-интронных соединений гена CYP21A2 с последующим секвенированием, в результате которого выявлено 4 мутации: p.Leu307fs (c..923_924insT), ранее неописанная делеция p.Ile384del, p.Pro453Ser и p.Arg426Cys.

При секвенировании 7 экзона гена 21-гидроксилазы обнаружена «классическая» мутация p.Leu307fs (c.923_924insT), приводящая к сдвигу рамки считывания и, как следствие, к прекращению синтеза нормального белка 21-гидроксилаза (Higashi et al., 1988; White et al., 1994). Частота данной мутации в различных популяциях мира незначительная - от 0.00% до 3.98% в Венгрии, и выявлена она, в основном, у больных с СТФ недостаточности 21-гидроксилазы (Stikkelbroeck et al., 2003; Dolzan et al., 2005). В нашем исследовании мутация p.Leu307fs гена CYP21A2 обнаружена у одного больного с СТФ заболевания в компаунд-гетерозиготном состоянии с delA2orLGC с частотой 0.46% (таблица 1, 2; рисунок 1).

А) Последовательность с мутацией F307* lut Б) Нормальная последовательность 305 ЗОв 307 308 305 300 307 308

Val Plie Plie Ala Val Plie Leo Leu

OTT ТГГ IKK OCT T GTT rrr ПО СТГ

ш* а Шшшш

Рисунок 1. Фрагмент сиквенса 7 экзона гена СУР21А2 А) Образец ДНК больного ВДКН с мутацией р.ЬеиЗО7/э гена СУР21А2;

Б) Образец ДНК пациента с нормальной последовательностью

При проведении ЗБСР-анализа 10 экзона гена СУР21А2 обнаружено 2 типа изменения подвижности однонитевых фрагментов ДНК. Последующее секвенирование образца с первым типом изменения позволило идентифицировать мутацию р.Рго4535ег (с.1357С>Т), выявленную у 1-го больного с ПФ в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией р.11е1172А$п и в кластере с мутацией _Щг?//се с частотой 0.23%, что согласуется с данными по другим популяциям мира, где ее частота не превышает 2% (таблица 1, 2; рисунок 2) (8Шске1Ьгоеск е1 а1., 2003; Оо1гап е! а!., 2005).

Рисунок 2. А) Результаты ЗвСР-анализа, Б) секвенирования и В) электрофореграмма рестрикционного анализа мутации р.Рго4535ег гена СУР21А2

В результате секвенирования образца со вторым типом изменения подвижности однонитевых фрагментов ДНК идентифицирована мутацияp.ArgR426Cys (с.1278С>Т) гена СУР21А2, изменяющая ориентацию гемма в белке 21-гидроксилазы, что приводит к нарушению переноса электронов и, как следствие, к потере функциональной активности (рисунок 3). Данная мутация выявлена в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией сплайсинга 12врИсе (с.293-1ЗА/С>й) у одного больного с СТФ ВДКН с частотой 0.46% , что совпадает с литературными данными (ОпсЬик е1 а!., 2006).

р.Лг<^426Су^

Рисунок 3. А) Результаты БЗСР-анализа, Б) секвенирования и В) электрофореграмма рестрикционного анализа мутацииp.Arg426Cys гена

СУР21А2

При секвенировании 9 экзона гена СУР21А2 у 1-го больного с СТФ ВДКН в компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией с1е1А2ог1,ОС и частотой 0.46% идентифицирована ранее неописанная мутация - делеция трех нуклеотидов АТС в 1151 нуклеотидной последовательности, приводящая к делеции изолейцина в 384 положении аминокислотной последовательности - р.11е384йе1 (с.1151_1153с1е1АТС) (таблица 1, 2; рисунок 4). Данная делеция, возможно, ведет к появлению дополнительного акцепторного сайта сплайсинга и синтезу неполноценного

укороченного белка с частичной или полной потерей своих функций (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).

Рисунок 4. Результаты секвенирования и электрофореграмма анализа мутации р.Пе384с1е1. Дорожки 1,2 — образцы ДНК пациента без мутации р.1\е384с1е1\ 3— образец ДНК больного ВДКН с мутацией р.11е384с1е1

В результате проведенного сравнительного анализа распределения частот мутаций гена СУР21А2 между тремя группами пациентов с разными формами ВДКН обнаружены статистически значимые различия (таблица 3) и показано, что для сольтеряющей, простой вирильной и неклассической форм недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой спектр диагностически значимых мутаций.

Таблица 3

Распределение частот мутаций в гене СУР21А2 в группе больных с разными формами

ВДКН

Форма заболевания Частоты мутаций, %

аеШогЬвС 12хрЧсе р.А1а356Тгр р.СЫМНХ р.11е172Аэп

Сольтеряющая форма 42.96 23.44 18.36 7.81 0.40

Простая вирильная форма 20.37 8.65 14.42 0.96 30.77

Х-6-99 р=0.009 Х2=5.15 р=0.023 Х2=0.41 р=0.52 Х:=3.81 р=0.5 Х2=38.9 р=0

Сольтеряющая форма 42.96 23.44 18.36 7.81 0.4

Неклассическая форма 15.3 0.00 2.78 5.56 2.78

Х-7.38 р=0.007 Х2=39.03 р«0.000 Х*=6.08 р=0.014 Х2=0.67 р=0.41 Г=2.83 р=0.09

Простая вирильная форма 20.37 8.65 14.42 0.96 30.77

Неклассическая форма 15.3 0.00 2.78 5.56 2.78

Г=0.29 р-0.59 Х2=76.51 р«0.000 Х-3.94 р=0.047 Г=1 р-0.32 Х2=4.3 р=0.04

Кластеры мутаций гена СУР21Л2

У 9-ти больных ВДКН обнаружено присутствие двух мутаций на одной хромосоме: р.Аф56Тгр+р.С1п318Х (2.8%, 6/216), р.Пе172Аьп+р.С1п318Х (0.46%, 1/216), 12эрИсе+р.Рго4538ег (0.46%, 1/216), сМА2ог1СС+р. УаШИеи (0.46%, 1/216).

Все больные с кластерами мутаций на одной хромосоме были компаунд-гетерозиготами с другими мутациями. Кластеризация мутаций на одной хромосоме внутри нуклеотидной последовательности гена характерна для гена CYP21A2. Одним из ярких примеров сцепления мутаций в этом гене является кластер из 3-х миссенс-мутацийp.Ile235Asn (c.\ZZST>A)+Val236Glu (с.1385Т>А)+Met238Lys fc.l391T>Aj в б экзоне, известный как «классическая» мутация Eöcluster. Согласно литературным данным, у больных ВДКН из разных стран мира идентифицированы различные кластеры мутаций, специфичные для каждого региона. В нашем регионе наиболее распространенным оказался кластер из двух миссенс-мутаций в экзоне 8 p.Gln318X+p.Arg356Trp, который является наиболее частым и в других популяциях мира (Wilson et al, 1995; Lobato et al, 1999; Bachega et al., 2000; Koppens et al, 2000; Stikkelbroeck et al., 2003; Dolzan et al, 2005; Finkielstain et al., 2011). Кластеры p.Ilel72Asn+p.Gln3¡8Xи I2splice+p.Pro453Ser оказались специфичными для больных из РБ.

Проведенное молекулярно-генетическое обследование 108 семей с ВДКН, проживающих в РБ, показало, что 77.78% изученных ВДКН семей оказались полностью информативными, 12.96% - частично информативными и 9.26% -абсолютно неинформативными для ДНК-диагностики прямым методом. Общая информативность изученных ВДКН семей для прямого метода ДНК-диагностики составила 84.26%. Во всех семьях при использовании прямого метода молекулярной диагностики были определены носители мутантных хромосом.

Анализ полиморфных вариантов гена CYP21A2y больных ВДКН и в группе

контроля из РБ

Помимо мутаций, приводящих к развитию тех или иных форм ВДКН, в результате проведенного анализа в гене CYP21A2 выявлено 15 различных однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP), несущих нейтральный характер и фенотипически не проявляющихся: в 1 экзоне — с.117С>Т (p.Leu39Leu, rs6468), с.137С>А (p.Pro45Pro, is6464); во втором интроне - с.289+9С>Т (rs6462\ c.289+48G>A (rs20755641), С.289+670Т(rs6449), c.289+33A>C (rs6463); в 3 интроне и экзоне - c.307G>A (p.Argl02Lys, rs6474), c.315G>C (p.ProlOSPro, rs6455), C.3430T {p.Leul 14Leu); в 4 интроне - c.549-15C>A (rsl040312); в 6 экзоне и интроне -с.702Т>С (p.Asp234Asp), с.735+12А>С (rs6458); в 7 экзоне и интроне - c.746C>G

{п6477), с.805С>С (рЯег268Тгр, гхб472); в 9 экзоне - с.1123С>Т (р.5ег374$ег), из которых полиморфные варианты р.Ьеи114Ьеи р.8ег3748ег ранее в литературе не описаны. При проведении анализа распределения частот аллелей, генотипов и гаплотипов полиморфных вариантов тб449, кб462, пч6474 и р.8ег3748ег гена СУР21А2 в выборках больных ВДКН и здоровых индивидов обнаружены статистически значимые различия (р<0.05) по частотам генотипов всех изученных локусов, за исключением синонимичной замены р.8ег3748ег. С помощью программы Нар1оУ1еш 4.1. выявлен гаплотип ТС (/^6462^6449), ассоциированный с мутантными аллелями гена СУР21А2 (х2=3.901, р=0.048), но не показавший сцепления с ними (ДяКОЛОО).

Таким образом, в результате анализа гена СУР21А2 у 108-и больных ВДКН на 84.65% хромосом, в том числе на 95.31% хромосом у больных с СТФ, на 78.43% хромосом - с ПФ и 55.56% - с НФ, выявлено 11 различных мутаций и 15 полиморфных вариантов (рисунок 5). С наибольшей частотой 33.26% обнаружена делеция/конверсия гена с!е1А2огЬСС гена СУР21А2. Второй по частоте была мутация сплайсинга во втором интроне гена СУР21А2 - 12эрНсе (16.05%). Мутации р.Аф56Тгр, р.Пе172Азп, р.С1п318Х. р. Га 128Ней, р.РгоЗОЬеи, р.ЬеиЗЩх, р.А^426Су$ р.Рго4535ег гена СУР21А2 выявлены с частотами от 14.88% до 0.23%. Обнаружена новая ранее неописанная делеция р.11е384с1е1 гена СУР21А2. На 15.74% хромосом с ВДКН мутации не идентифицированы, в том числе у 10-ти больных с разными формами заболевания не обнаружена ни одна мутация. У 9-ти больных ВДКН определено 4 кластера из двух различных мутаций гена СУР21А2, из которых наиболее распространенным оказался кластер из двух миссенс-мутаций 8 экзона -р.вЫЗ 18Х+р.Аг^356Тгр (2.Ж/о).

Рисунок 5. Идентификация мутаций и полиморфных вариантов гена СУР21А2 у больных ВДКН из РБ

Анализ корреляции генотип-фенотип

Для того, чтобы определить особенности фенотипических проявлений идентифицированных в данном исследовании мутаций, больные с недостаточностью 21-гидроксилазы, у которых обнаружены обе мутации, были разделены на несколько групп в соответствии с известными данными о влиянии различных мутаций гена CYP21A2 на ферментативную активность 21-гидроксилазы. В первую группу вошли пациенты с генотипами из мутаций, приводящих к нулевой активности белка 21-гидроксилаза. Во вторую группу - генотипы с мутацией I2splice, приводящей как к тяжелым формам заболевания, так и к более легким, в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии с мутацией, обусловливающей тяжелое течение заболевания. Третья группа - генотипы, содержащие мутацию p.Ilel72Asn в гомозиготном состоянии или в компаунде с мутациями, ведущими к тяжелым формам заболевания. Четвертая группа - генотипы из мутаций p.Pro30Leu, p.Val281Leu и p.Pro453Ser, частично снижающих активность фермента и приводящих к более мягкому течению ВДКН, в гомозиготном или в компаунд-гетерозиготном состоянии с другими мутациями разного действия.

На основании частоты встречаемости мутаций у пациентов с разными формами ВДКН нами установлено, что в 1 и 3 группах предсказательная ценность идентифицированных мутаций (соответствие фенотипа генотипу) составляет 92.68%, во второй группе - 91.66%, в четвертой - 100%, что свидетельствует о том, что наиболее полное соответствие фенотипа генотипу установлено в группах с мутациями, ведущими к более легкому течению заболевания, и согласуется с литературными данными (Lee et al., 2000; Pmterova et al., 2000; White et al., 2000; Lee, 2001 ;Осиновская, 2006).

Анализ внегенных STR-локусов D6S2670 и D6S273 в семьях больных ВДКН и здоровых семьях

С целью выбора полиморфных локусов для их использования в косвенной ДНК-диагностике было проведено изучение высокополиморфных STR-локусов D6S2670 и D6S273, расположенных в непосредственной близости от гена CYP21A2, в 108 семьях с ВДКН и 47 здоровых семьях, соответствующих выборке семей с ВДКН по полу, возрасту и этнической принадлежности.

В результате исследования вТЯ-локуса 0682670 (М68222) выявлено 39 аллелей, частота каждого из которых не превышала 10%, за исключением аллеля 0682670*206, обнаруженного с частотой 13.87% на мутантных хромосомах и аллелей 0682670*216 и 0682670*220, определенных на 11.64% и 10.26% нормальных хромосом, соответственно (рисунок 6).

Рисунок 6. Распределение частот аллелей полиморфного локуса D6S2670 на нормальных и мутантных хромосомах в семьях с ВДКН и здоровых семьях из РБ

Различия в распределении частот аллелей D6S2670 между нормальными и мутантными хромосомами оказались статистически значимыми (^2=84.77, р=0.000). Для определения степени ассоциации аллелей локуса D6S2670 с мутациями гена CYP21A2 был вычислен стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению - Ast. Самые высокие его значения обнаружены для аллелей D6S2670*208 (0.112), D6S2670*205 и D6S2670*215 (0.106). Однако, такие значения стандартного коэффициента неравновесия по сцеплению говорят о невысокой степени сцепления аллелей локуса D6S2670 с геном CYP21A2, несмотря на его близкое расположение. Возможно, данный факт обусловлен большим количеством аллелей в данном локусе, что, в свою очередь, может быть связано с высокой скоростью рекомбинации в этой области.

При анализе распределения частот D6S2670 аллелей на мутантных хромосомах различного этнического происхождения обнаружены статистически достоверные различия между хромосомами башкирского и русского, башкирского и татарского происхождения (х2=34.67, р=0.035 и %2=34.26, р=0.004, соответственно). Кроме того, аллель D6S2670*205 показал незначительное сцепление с мутацией delA2orLGC (Ast=0.232), а аллель D6S2670*206 - с мутацией сплайсинга I2splice (Ast=0.228).

В результате исследования полиморфного локуса D6S273 выявлено 9 аллелей, распределение частот которых между мутантными и нормальными хромосомами показало статистически достоверные различия (х2=18.71, р=0.012) (рисунок 7).

1 " Я 1ЩНЭ1 3 N 1 _ ..... ■ 138 ■ 136 134 - _ 1J2 13t»

Ц N | 2 -------— OL ПДКН U=r' ■ 126

1 а= ПЛК11 ""

<» 1<> 2 О 3« II >

Рисунок 7. Распределение частот аллелей полиморфного локуса D6S273 на нормальных и мутантных хромосомах в семьях с ВДКН и здоровых семьях из РБ

На мутантных хромосомах с наиболее высокой частотой встречался аллель D6S273*134 (30.00%), тогда как на нормальных - D6S273*132 (31.78%). С учетом этнической принадлежности статистически достоверные различия обнаружены только между мутантными и нормальными хромосомами русского происхождения (х2=13.69, р=0.041). Кроме того, выявлены статистически значимые различия в распределении частот D6S273 аллелей между мутантными хромосомами русской и татарской этнической принадлежности (х2=15.15, р=0.021).

Стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению Ast был выше для аллеля D6S273*130 - 0.141, а для мутантных хромосом русской этнической принадлежности - 0.267. Достаточно высокую степень сцепления показал данный аллель и с мутаций delA2orLGC гена CYP21A2 - 0.333. Возможно, что степень сцепления аллеля D6S273*130 с мутациями гена 21-гидроксилазы связана именно с высокой степенью неравновесного сцепления этого аллеля с данной мутацией.

По выявленным аллелям локусов D6S2670 и D6S273 было составлено 127 различных гаплотипов, частоты которых не превышали 5%. Анализ распределения частот гаплотипов на нормальных и мутантных хромосомах не обнаружил статистически достоверных различий (%2=136.14, р=0.067).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о невысокой степени сцепления аллелей и гаплотипов STR-локусов D6S2670 и D6S273 с мутациями гена CYP21A2 и нецелесообразности их использования для проведения косвенной ДНК-диагностики ВДКН и определения носительства мутантного аллеля в РБ.

Практическое применение полученных результатов молекулярно-генетического изучения недостаточности 21-гидроксилазы

На основании данных проведенного исследования гена CYP2IA2 разработан алгоритм молекулярной диагностики ВДКН в семьях высокого риска (рисунок 8),

который позволяет обозначить стратегию поиска мутаций, приводящих к недостаточности 21-гидроксилазы у больных, в том числе, и у вновь выявленных во время массового неонатального скрининга, определить гетерозитное носительство мутаций гена СУР21А2 и проводить пренатальную диагностику для предотвращения рождения больных детей в отягощенных ВДКН семьях.

Рисунок 8. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики ВДКН в Республике

Башкортостан

В соответствии с данным алгоритмом была проведена пренатальная диагностика ВДКН прямым методом в 7-ми семьях, в которых один один плод оказался здоровым, два плода являлись компаунд-гетерозиготами выявленной мутации и нормы, у четырех плодов обнаружены обе мутации, идентифицированные у пробанда и родителей.

Таким образом, в случае идентификации обеих мутаций в гене СУР21А2 с помощью системы наиболее распространенных и легко детектируемых мутаций семья является информативной для прямой ДНК-диагностики и для этой семьи возможно проведение пренатальной диагностики и определение гетерозиготных носителей с использованием разработанного нами алгоритма молекулярной диагностики ВДКН в РБ.

ВЫВОДЫ

1. У больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников из Республики Башкортостан идентифицировано 11 мутаций гена СУР21А2 с различной частотой: делеция/конверсия гена (1с1Л2огШС - 33.26%, с.293-!ЗА/С>С (Г2$рИсе) - 16.05%, с.1066С>Т (р.А^356Тгр) - 14.88%. с.515Т>А (р.Пе172Ахп) - 8.14%, с.952С>Т (р.С1п318Х) - 5.81%, с.84Ш>Т (р.УаШИеи) - 3.49% с.89С>Т(р.РгоЗОЬеи) - 1.39%, с.920 921шТ (р.Ьеи307/я), с.1278С>Т (р.Аг%426Су5) и ранее неописанная делеция р.Пе384с!е1 (<с.1151_1153с/е!АТС) - 0.46%, С.13570Т (р.Рго4533ег) - 0.23%. Из 15 идентифицированных полиморфных вариантов гена СУР21А2 два описаны впервые -с.343С>Т (р.Ьеи114Ьеи) и с.11230Т(р.Бег3748ег).

2. У 9-ти больных с ВДКН из Республики Башкортостан идентифицированы кластеры из двух мутаций: наиболее распространенный в европейский популяциях р.Аг%356Тгр+р. С1п318Х с частотой 2.8%, и специфичные для нашего региона -р.Пе172Аэп+р.&п318Х, 12эрИсе+р.Рго4538ег, ¿еШогЮС+рУаШгЬеи, каждый с частотой 0.46%.

3. Общая информативность изученных семей с ВДКН из Республики Башкортостан для прямого метода ДНК-диагностики составила 84.26%.

4. Установлено, что у больных с ВДКН из Республики Башкортостан при мутациях, полностью инактивирующих фермент 21-гидроксилазу, и мутации р.11е172Айп гена СУР21А2 соответствие фенотипа генотипу составляет 92.68%, при мутациях, ведущих к незначительному снижению активности - 100% и в группе с мутацией сплайсинга 12$рНсе - 91.66%.

5. Показано, что аллели и гаплотипы внегенных 8ТЯ-локусов И682670 и 068273 имеют низкую степень сцепления с мутациями гена СУР21А2 у больных ВДКН из Республики Башкортостан и неинформативны для проведения молекулярной диагностики ВДКН в нашем регионе.

6. На основании данных проведенного исследования разработан алгоритм молекулярной диагностики ВДКН в Республике Башкортостан, оптимизирующий подходы медико-генстической консультации в семьях высокого риска.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хидиятова, И.М. Популяционное исследование структурных особенностей генов моногенных заболеваний в Республике Башкортостан / И.М. Хидиятова, В.Л. Ахметова, Р.И. Хусаинова, A.C. Карунас, Л.У. Джемилева, И.А. Скачкова, Д.Д. Надыршина, A.A. Рахимкулова, А.К. Мардапова, С.Ш. Мурзабаева, Р.В. Магжанов, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика - 2011. - Т. 10(6). - С. 13-24.

2. Рахимкулова A.A. Врожденная дисфункция коры надпочечников: современные клинико-генетические аспекты / A.A. Рахимкулова, В.Л. Ахметова, O.A. Малиевский, Э.К. Хуснутдинова // Медицинская генетика - 2013. - Т.12(6). - С.3-14.

3. Рахимкулова, A.A. Изучение врожденной дисфункции коры надпочечников в Республике Башкортостан / A.A. Рахимкулова, В.Л. Ахметова, O.A. Малиевский, Э.К. Хуснутдинова // Известия Уфимского научного центра Российской академии наук. -2013. -№4.-С. 59-63.

4. Рахимкулова, A.A., Ахметова В.Л., Малиевский O.A., Хуснутдинова Э.К. Молекулярно-генетическое изучение врожденной дисфункции коры надпочечников в Республике Башкортостан /A.A. Рахимкулова, В.Л. Ахметова, O.A. Малиевский, Э.К. Хуснутдинова // Материалы Ii Всероссийской школы-конференции «Биомика - наука XXI века». - Уфа. - 2011. - С. 106-108.

5. Rakhimkulova, Aigul. The molecular-genetic study of congenital adrenal hyperplasia in Bashkortostan Republic (Russia) / Aigul Rakhimkulova, Vita Akhmetova, Irina Gilyazova, Zumrad Ramova, Oleg Malievsky, Elza Khusnutdinova //Abstracts of Human Genome Meeting. - Dubai. - 2011. - P. 235.

6. Rakhimkulova, A. Analysis of CYP21A2 gene in Congenital Adrenal Hyperplasia patients from Bashkortostan Republic of Russia / A. Rakhimkulova, V. Akhmetova, I. Gilyazova, O. Malievsky, E. Khusnutdinova // Abstracts of European Human Genetics Conference / -Nürnberg. - 2012. -P.146.

7. Рахимкулова A.A. Анализ гена CYP21A2 у больных врожденной дисфункцией коры надпочечников в Республике Башкортостан / A.A. Рахимкулова, В.Л. Ахметова, O.A. Малиевский, Э.К. Хуснутдинова // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием /Под ред. чл.-корр. РАМН B.C. Баранова. - Новосибирск: «НСК Регион», 2012. - С.96.

8. Рахимкулова, A.A. Анализ гена CYP21A2 у больных врожденной дисфункцией коры надпочечииков в Республике Башкортостан / A.A. Рахимкулова, В.Л. Ахметова,

О.А. Малиевский, Э.К. Хуснутдинова //Материалы Всероссийской школы-конференции молодых ученых. / Уфа: РИЦ БашГУ, 2012. - С. 140.

9. Рахимкулова, АА Спектр мутаций в гене CYP21A2 у больных врожденной дисфункцией коры надпочечников в Республике Башкортостан / АА Рахимкулова, BJI Ахмегова, OA Малиевский, 3JC Хуснуцпинова // Материалы Ш Всероссийской шюлы-конференции молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Вопго-Уральсного региона по физико-химической биологии и биотехнологии. /Уфа, 2012.-С.84.

Ю.Рахимкуяова, АА Поиск мутаций в гене CYP21A2 у больных врсмдаиой дисфункцией коры надпочечников в Республике Башкортостан / АА Рахимкулова, BJI Ахмегова, Э1С Хуспугдшюва // V Международная школа молодых ученых по молекулярной гевяике «Непостоянство генома». Тезисы докладов.-М: Мегакатадаг, 2012 -С55.

11.Рахимкуяова, АА Мопекулярно-генетичссюэс исследование вражде! мой дисфункции коры надпочечников в Республике Башкортостан / АА Рахимкулова, BJ1 Ахмегова, ЭХ Хушугдннова // Тезисы Всероссийской молодежной научно-пракпмеской конференции / отв. ред. BJO. Гуськов. -Уфа: РИЦ БашГУ, 2013.-С. 214.

12. Rakhimkulova, A. Molecular-genetic study of congenital adrenal hyperplasia in Bashkortostan Republic (Russia) / A Rakhimkulova, V. Akhmetova, L Gilyazova, E Kiraiutdinova // Abstracts of8th ISABS Conference in Forensic, Anthropologic and Medical Genetics and Majo Clinic Lectures m Translated Medicine. - Split -2013.-P.255.

13. Rakhimkulova, A. A. CYP21A2 gene analysis in Congenital Adrenal Hyperplasia patients from Bashkortostan Republic of Russia / A. A. Rakhimkulova, V. L. Akhmetova, I. R. Gilyazova, O. A. Malievsky, E. K. Khusnutdinova // Abstracts of European Human Genetics Conference / - Paris. -2013. - P. 591-592.

14. Ахметова, BJI. Молекулярно-генетическое изучение фенилкетонурии и врожденной дисфункции коры надпочечников в Республике Башкортостан / В.Л. Ахметова, А.А. Рахимкулова, Е.А. Пудова, О.А. Малиевский, Э.К. Хуснутдинова // Материалы конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» / Новосибирск. -2013.-С.13.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечников

НФ - неклассическая форма

ПФ - простая вирильная форма

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РБ - Республика Башкортостан

СТФ - сольтеряющая форма

СУР21А2 - ген 21-гидроксилазы

ЭБСР - анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК

Подписано в печать 14.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60X84/16. Гарнитура Times. Усл.печ. л. 1,40. Тираж 100 экз. Заказ 747.

Типография ИИЯЛ УНЦ РАН г.Уфа, пр. Октября, 71. тел. (347)235-60-50

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рахимкулова, Айгуль Айратовна, Уфа

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201453430 На правах рукописи

Рахимкулова Айгуль Айратовна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВРОЖДЕННОЙ ДИСФУНКЦИИ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ 21-ГИДРОКСИЛАЗЫ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Э.К. Хуснутдинова

Уфа- 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ __5

1.1. Врожденная дисфункция коры надпочечников. Общие представления____ 12

1.2. Биосинтез кортикостероидов_14

1.3. Классификация форм врожденной дисфункции коры надпочечников__ 17

1.3.1. ВДКНпри недостаточности 81АЯ-протеина_17

1.3.2. ВДКНпри дефиците 20,22-десмолазы (Р450зсс)_17

1.3.3. ВДКН при недостаточности 3-/3-гидроксистероиддегидрогеназы (ЗртИ)_18

1.3.4. ВДКНпри дефиците 17-а-гидроксилазы (Р450с17)_18

1.3.5. ВДКН при дефиците 11 ¡З-гидроксилазы (Р450с 11(3) и алъдостеронсинтазы (Р450с11АБ)_19

1.3.6. ВДКНпри недостаточности Р450-оксидредуктазы (РОЯ)_20

1.4. ВДКН, обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы (Р450с21)_21

1.4.1. Клинические формы 21-гидроксилазной недостаточности _21

1.4.2. Распространенность ВДКН при дефиците 21-гидроксилазы_23

1.4.3. Белок 21 -гидроксилаза: строение, функции. Участие в развитии ВДКН_24

26 26 28 30

35

36 39 42

45

45

45 47 52

1.4.4. Молекулярно-генетические основы 21-гидроксилазной недостаточности_

1.4.4.1. Структура, локализация генов СУР21А2 и СУР21Р1

1.4.4.2. Мутации в гене СУР21А2 _

1.4.4.2.1. Точечные мутации гена СУР21А2_

1.4.4.2.2. Делеции, конверсии и химерные конструкции _

1.4.5. Генофенотипическая корреляция_

1.4.6. Диагностика недостаточности 21-гидроксилазы __

1.4.7. Неонаталъный скрининг новорожденных на ВДКН_

2.1. Материал для исследования_

2.2. Методы исследования_

2.2.1. Выделение геномной ДНК_

2.2.2. Полимеразная цепная реакция_

2.2.3. Рестрикционный анализ_

2.2.4. SSCP-анализ_52

2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности_53

2.2.6. Анализ внегенных STR-локусов_54

2.2.7. Методы статистической обработки_54

3.1. Анализ частоты встречаемости ВДКН в Республике Башкортостан _56

3.2. Анализ гена CYP21A2 у больных ВДКН из РБ_56

3.2.1. Скрининг «классических» мутаций гена 21-гидроксшазы_57

3.2.2. Поиск изменений нуклеотидной последовательности гена CYP21A2

_67

3.2.3 Кластеры мутаций гена CYP21A2 _73

3.2.4. Анализ полиморфных вариантов гена CYP21A2 у больных ВДКН и в группе контроля из РБ_75

3.3. Анализ корреляции генотип-фенотип_90

3.4. Анализ внегенных STR-локусов D6S2670 и D6S273 в семьях больных ВДКН и здоровых семьях_97

3.4. Практическое применение полученных результатов молекулярно-генетического изучения недостаточности 21-гидроксилазы_109

ЗАКЛЮЧЕНИЕ_113

ВЫВОДЫ_118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГС - адреногенитальный синдром АКТГ - адренокортикотропный гормон ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечников НФ - неклассическая форма

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПФ - простая вирильная форма

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РБ - Республика Башкортостан

СТФ - сольтеряющая форма

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

CYP21A2 - ген 21-гидроксилазы

DHEA - дегидроэпиандростерон

DOC - дезоксикортикостерон

PBR - бензодиазепиновый рецептор

RAAS - ренин-ангиотензин-алдостероновая система

StAR - направленный белок-регулятор стероидогенеза

STR - short tandem repeats

ВВЕДЕНИЕ

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) - одно из наиболее распространенных наследственных заболеваний,

характеризующееся сложной патобиохимией и высокой вариабельностью клинической картины. ВДКН относят как к заболеваниям хронической первичной надпочечниковой недостаточности, так и к патологиям полового развития и половой дифференцировки. Кроме того, ВДКН является частой причиной нарушений репродуктивных функций, приводящих к бесплодию и невынашиванию беременности.

В зависимости от дефекта фермента ВДКН подразделяют на 6 форм, из которых наиболее распространенная (90-95% всех случаев) обусловлена дефицитом фермента 21-гидроксилаза (цитохром Р450с21) вследствие мутаций в кодирующем ее гене CYP21А2, локализованном в области 6р21.3 рядом с высокогомологичным неактивным псевдогеном CYP21A1P (Donohoue, 1989). Недостаточность 21-гидроксилазы разнообразна по клиническим проявлениям и степени тяжести и классифицируется на 2 основные формы: «классическая» (сольтеряющая и простая вирильная) с выраженной недостаточностью фермента, основными признаками которой являются внутриутробная вирилизация и нарушение солевого обмена, и «неклассическая» с умеренно выраженным ферментативным дефектом, проявляющаяся в постнатальном периоде. Частота 21-гидроксилазной недостаточности составляет от 1:27 до 1:42000 новорожденных в зависимости от клинической формы и рассматриваемой популяции (Lucky et al., 1986; Consolino et al., 2010; Ambroziak, 2010; Tsai et al., 2011). В России «классическая» форма ВДКН встречается со средней частотой 1:8662 новорожденных (Новиков, 2008), в Республике Башкортостан - 1:8974 (Рамова, 2010).

Из-за высокой распространенности и тяжести клинических проявлений ВДКН включили в программу неонатального скрининга новорожденных

более чем в 30 странах мира, в том числе в России с 2006 года. Введение массового обследования новорожденных позволяет диагностировать ВДКН в неонатальный период, что дает возможность предотвратить с помощью своевременного и адекватного лечения развитие таких серьезных осложнений, как сольтеряющий криз и связанные с ним летальные исходы и длительная госпитализация, преждевременное половое развитие при вирильной форме и бесплодие.

В виду сложности диагностики ВДКН и ее неточности при использовании биохимических методов во всем мире активно ведется исследование молекулярной природы данного заболевания с применением всех современных методов и подходов, которое расширяет представление о молекулярно-генетических механизмах развития такого гетерогенного заболевания как ВДКН. Идентификация мутаций гена 21 -гидроксилазы и последующая оценка индивидуального генетического риска на их основе имеют большое значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению ВДКН, а также внедрения в практику медико-генетической службы. Использование высокополиморфных маркеров, локализованных в НЬА-локусе рядом с геном 21-гидроксилазы и сцепленных с ним, позволяет более эффективно проводить пренатальную молекулярно-генетическую диагностику ВДКН и выявлять гетерозиготных носителей в семьях высокого риска с целью профилактики данного заболевания, что в свою очередь значительно улучшает медико-генетическое консультирование семей с ВДКН.

В связи с вышеизложенным целью исследования является изучение генетической природы врожденной дисфункции коры надпочечников, обусловленной недостаточностью 21-гидроксилазы, и разработка подходов ее ДНК-диагностики.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг наиболее распространенных мутаций гена 21-гидроксилазы у больных с ВДКН из Республики Башкортостан.

2. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене 21-гидроксилазы у больных с ВДКН из Республики Башкортостан.

3. Определить молекулярно-генетические особенности классических форм ВДКН вследствие дефицита 21-гидроксилазы в Республике Башкортостан.

4. Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и гаплотипов внегенных высокополиморфных БТЯ-локусов (Б682670, 068273) на нормальных и мутантных хромосомах в семьях больных с ВДКН и здоровых семьях.

5. Проанализировать неравновесие по сцеплению между мутациями гена 21-гидроксилазы и аллелями и гаплотипами изученных высокополиморфных БТЯ-локусов; оценить их значимость и возможность использования для косвенной ДНК-диагностики ВДКН.

6. Разработать оптимальный алгоритм молекулярной диагностики ВДКН в Республике Башкортостан.

Научная новизна: Впервые в Республике Башкортостан проведено молекулярно-генетическое исследование всей кодирующей последовательности и экзон-интронных соединений гена 21-гидроксилазы методом ББСР анализа с последующим секвенированием. Впервые обнаружена мутация р.Пе384с1е1 гена СУР21А2. Получены данные о спектре и частоте мутаций в гене 21-гидроксилазы у больных ВДКН из Республики Башкортостан. Для каждой классической формы ВДКН показан свой спектр диагностически значимых мутаций гена 21-гидроксилазы. Впервые проведен анализ распределения частот аллелей и гаплотипов высокополиморфных локусов 0682670 и Б68273, локализованных рядом с геном СУР21А2, в

семьях больных ВДКН и здоровых семьях и определена их значимость для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы. Впервые проведена оценка информативности семей с ВДКН, основанная на комплексном исследовании мутаций в гене СУР21А2.

Научно-практическая значимость: В результате молекулярно-генетического анализа гена 21-гидроксилазы определена информативность изученных семей с ВДКН для пренатальной диагностики и выявлены гетерозиготные носители. Полученные данные о частоте и спектре мутаций и полиморфных вариантов в гене СУР21А2 внесли определенный вклад в познание молекулярно-генетической природы недостаточности 21-гидроксилазы и позволили разработать поэтапную схему молекулярно-генетического обследования семей с ВДКН, которая дает возможность повысить эффективность медико-генетического консультирования и профилактики данного заболевания в Республике Башкортостан. В 7 семьях с ВДКН определен тип мутационных повреждений и проведена пренатальная диагностика недостаточности 21-гидроксилазы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Анализ гена 21-гидроксилазы у больных с врожденной дисфункцией коры надпочечников из Республики Башкортостан позволил выявить И различных мутаций, в том числе ранее неописанную делецию р.1\е384<Ле\

с.1151_1153с1е1АТС), и 15 фенотипически не проявляющихся однонуклеотидных полиморфных вариантов (БЫР), из которых с.343С>Т (р.Ьеи114Ьеи) и с.1123С>Т {р.8ег3748ег) описаны впервые.

2. Идентифицировано 4 различных кластера из двух мутаций у 9-ти больных с ВДКН из Республики Башкортостан: распространенный в европейских популяциях р.А^356Тгр+р,ап318Х (2.8%) и специфичные для нашего региона - рМе172АБп+р.01п318Х (0.46%), ШрИсе+р.Рго4538ег (0.46%), с1е!А2огШС+р. Уа128Иеи (0.46%).

3.84.26% семей с ВДКН из Республики Башкортостан оказались информативными для прямого метода ДНК-диагностики.

4. У больных с ВДКН из Республики Башкортостан 100% соответствие фенотипа генотипу показано для мутаций, незначительно снижающих активность фермента 21-гидроксилаза, 92.68% - для мутаций, полностью инактивирующих фермент, и мутации p.Ilel72Asn гена CYP21A2, 91.66% -для мутации сплайсинга I2splice.

5. Низкая степень сцепления аллелей и гаплотипов внегенных STR-локусов D6S2670 и D6S273 с мутантными аллелями гена CYP21A2 у больных с ВДКН из Республики Башкортостан свидетельствует о нецелесообразности их использования для проведения молекулярной диагностики заболевания в данном регионе.

6. Основанный на молекулярно-генетическом анализе наиболее распространенных мутаций гена CYP21A2 алгоритм молекулярной диагностики ВДКН в Республике Башкортостан позволит оптимизировать подходы медико-генетической консультации в семьях высокого риска.

Публикации и апробация работы: по теме диссертации опубликовано 15 работ, из которых 2 статьи в журналах, рекомендованных для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 1 статья принята в печать в журнал, рекомендованный для опубликования работ при защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, 12 публикаций - в виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций.

Результаты исследования были представлены на международных и российских конференциях: II и III школе-конференции по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа, 2011; 2012); международной конференции Human Genome Meeting (Dubai, 2011); European Human Genetics Conference (Nürnberg, 2012; Paris, 2013); V Всероссийской конференции с

международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики человека, животных растений и микроорганизмов» (Уфа, 2012); V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012); Всероссийской молодежной научно-практической конференции (Уфа, 2013); 8th IS ABS Conference (Zagreb, 2013); конференции ВОГиС «Проблемы генетики и селекции» (Новосибирск, 2013).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 47 рисунков. Список литературы включает 140 источников.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики человека Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН в соответствии с научным направлением Института по бюджетным темам «Геногеография наследственной и многофакторной патологии и филогеографии народов Евразии» (№ Госрегистрации 012.0 801230) и «Структура генофонда, молекулярные основы формирования наследственных и многофакторных заболеваний в популяции народов Центральной Евразии» (№ Госрегистрации 012.0 1151168), а также в рамках грантов РФФИ № 12-04-97046-р_поволжье_а «Анализ гена 21-гидроксилазы у больных врожденной дисфункцией коры надпочечников из Республики Башкортостан» и Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. госконтракт № П601 от 18.05.2010 г.,

«Геногенография и ДНК-диагностика наследственной и многофакторной патологии».

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Врожденная дисфункция коры надпочечников. Общие

представления

Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) или адреногенитальный синдром (АГС) - группа аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных недостаточностью одного из ферментов биосинтеза стероидных гормонов, вырабатываемых в коре надпочечников (Katsumata, 2010; Wedell, 2011; Mnif, 2013).

Все надпочечниковые стероидные гормоны являются продуктом холестерина, модификация молекулы которого идет по трем путям, приводящим к образованию альдостерона, кортизола и половых стероидов, в синтезе которых основное участие принимают 6 энзимов: холестерингидроксилаза/20,22-десмолаза (P450scc, CYP11A1), 17-а-гидроксилаза (Р450с17, CYP17), 21-гидроксилаза (Р450с21, CYP21), 11(3-гидроксилаза (Р450с11 (3, CYP11B1), альдостеронсинтаза (Р450с18, CYP11B2), ЗР-дегидрогеназа (3J3HSD) и 17[3-гидроксилстероиддегидрогеназа (17(3HSD), в зависимости от дефектов которых выделяют 6 форм ВДКН, различающихся по клиническим проявлениям, степени тяжести и продолжительности жизни больного (Greger et al, 1987; Demirci et al, 2008; Concolino, 2010). Помимо указанных выше, в биосинтезе стероидных гормонов участвуют и другие ферменты, выполняющие вспомогательные функции, например, Р450 оксидоредуктаза (POR), которая переносит электроны, необходимые для стероидогенных процессов, от NADPH эндоплазматической сети до трех ферментов стероидогенеза Р450с17, Р450с21 и ароматазы P450aro (CYP19) (Lee, 2013).

Основным результатом ферментативного нарушения стероидогенеза является снижение выработки кортизола и, по механизму обратной связи, увеличение секреции гипофизом адрено-кортикотропного гормона (АКТГ), ведущее к двусторонней гиперплазии коры надпочечников и активизации

синтеза гормонов, главным образом, андрогенов, избыточная продукция которых приводит к клинической картине ложного преждевременного полового развития у мальчиков и вирилизации у девочек, степень которой зависит от уровня секреции андрогенов и времени начала патологии (Rosier, 1977; Waterman et al., 1997; Itoi et al, 1998; Осиновская, 2006; Goncalves et al, 2007; Trakakis et al, 2009; Al-Agha et al, 2011). Более тяжелым последствием ВДКН является нарушение солевого обмена, часто приводящего к смерти в раннем возрасте. Кроме того, ВДКН является одной из частых причин бесплодия. Внешне адреногенитальный синдром легче выявить у новорожденных девочек, если заболевание проявляется вирилизацией (формированием наружных половых органов по мужскому типу), которая в некоторых случаях настолько выражена, что девочку при рождении ошибочно регистрируют как мальчика (White et al, 2000; Demirci et al, 2008; Shaw, 2010). У мальчиков с ВДКН наружные половые органы соответствуют полу, поэтому до введения в 2006 г. обязательного скрининга заболевание часто оставалось незамеченным и приводило к ранней гибели больных. Так как указанные выше ферменты участвуют и в синтезе гормонов половых желез, то при ВДКН также наблюдает�