Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом

Грищук, Юлия Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом"

На правах рукописи

ГРИЩУК Юлия Владимировна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ СТЕРОИД 21-ГИДРОКСИЛАЗЫ ЧЕЛОВЕКА У БОЛЬНЫХ С АДРЕНОГЕНИТАЛЬНЫМ

СИНДРОМОМ

03.00.03-молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук С.Н. Белжеларская Научный консультант:

доктор биологических наук, проф. П.М. Рубцов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф., чл.-корр. РАН С.Н. Кочетков

(Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, РАН)

кандидат биологических наук С.Б. Акопов

(Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, РАН)

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия», РАН

Защита состоится «21 » декабря 2006 г в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу 119991 г.Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан «3?» 2006г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Адреногенитальный синдром (АГС; врожденная дисфункция коры надпочечников, ВДКН) - группа наследственных заболеваний человека с аутосомно-рецессивным характером наследования, обусловленных нарушением биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников. Врожденным дефицитом стероид 21-гидроксилазы вызвано 9095% всех случаев адреногенитального синдрома.

Фермент стероид 21-гидроксилаза (21-гидроксилаза, CYP21A2) катализирует монооксигеназные реакции превращения 17-гидроксипрогестерона (17-ОН прогестерона, 17 ОНП) в дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон, участвуя в биосинтезе глюкокортикоидов и минералокортикоидов, соответственно, и относится к семейству цитохромов Р450. Белки этого семейства обнаружены у всех изученных эукариот и некоторых прокариот и широко участвуют в окислительном метаболизме эндогенных соединений (стероидогенезе, поддержании гомеостаза витамина Д), а также разнообразных ксенобиотиков (лекарств, химических канцерогенов, растительных метаболитов и пр.). Учитывая широкое распространение цитохромов Р450 и разнообразие катализируемых ими реакций, исследование белков этого семейства имеет большое значение для фармакологии (разработки новых лекарственных средств, определения индивидуальной переносимости лекарственных препаратов и т.д.), анализа экологических загрязнений, а также молекулярной генетики человека.

Недостаточность стероид 21-гидроксилазы является одним из наиболее распространенных генетических дефектов человека. Частота классических форм заболевания оценивается в среднем как 1:15000 новорожденных, тогда как неклассические случаи составляют 1% в общей популяции. Причина высокой частоты встречаемости дефицита 21-гидроксилазы объясняется особенностями организации области генома, в которой находится ген CYP21A2. Он расположен в коротком плече шестой хромосомы (6р21.3) в локусе генов главного комплекса гистосовместимости третьего класса (называемого также областью HLA - Human Leukocyte Antigen- III класса). Длина гена CYP21A2 составляет 3,4 т.п.н, он содержит 10 экзонов и 9 интронов. На расстоянии 30 т.п.н. от активного гена CYP21A2 между генами 4-го компонента комплемента С4А и С4В расположен псевдоген CYP21AIP. Степень гомологии гена и псевдогена составляет 98% в экзонах и 96% в интронах (Higashi, et al, 1986; White, et al, 1986; Rodrigues, et al, 1987). Рекомбинация между высокогомологичными CYP21A2 и CYP21A1P по механизму неравного кроссинговера или генной конверсии является основной причиной дефицита 21-гидроксилазы. Наряду с этим, по мере проведения молекулярно-генетического

скрининга мутаций в разных популяциях мира, накапливаются сведения о спонтанно возникающих мутациях, происхождение которых не связано с псевдогеном. Эти редкие или уникальные мутации характерны для отдельных семей или небольших по численности популяций. К настоящему моменту описано 60 таких мутаций.

Молекулярно-генетический анализ пациентов с адреногенитальным синдромом, проводимый в разных популяциях, выявляет хорошее соответствие между генотипом и клиническими проявлениями, которые в случае сочетанной гетерозиготности связаны с наименее поврежденным аллелем CYP21A2. Отмеченная корреляция генотипа и фенотипа позволяет классифицировать мутации в зависимости от степени инактивации 21-гидроксилазы, что крайне важно для прогнозирования тяжести заболевания в ходе пренатальной диагностики и своевременной пренатальной или ранней постнатальной терапии. Вовремя начатая пренатальная терапия помогает предупредить осложнения, связанные с нарушением стероидогенеза in utero, такие как повреждения репродуктивной функции, низкорослость, трансформация пола, а также водно-электролитный дисбаланс в случае наиболее тяжелой соль-теряющей формы заболевания.

При классификации редких и уникальных мутаций, когда статистический анализ клинических проявлений невозможен, наиболее надежным подходом является функциональная характеристика мутаций in vitro с последующим анализом модели пространственной структуры CYP21A2 и установление соответствия между эффектами, обнаруженными in vitro, и фенотипом пациента.

Для проведения функционального анализа мутаций CYP21A2 in vitro наиболее часто используемой системой экспрессии является система на основе клеток млекопитающих линии COS-1 и COS-7. Имеются также данные по экспрессии гена CYP21A2 в дрожжах, а также в клетках млекопитающих с использованием вируса осповакцины. Однако одним из наиболее перспективных подходов к получению высокого уровня экспрессии (в среднем 3-10% от общего количества белка клетки) функционально-активных белков эукариот, в большинстве случаев прошедших все стадии посттрансляционной модификации и созревания, для проведения функционального анализа и кристаллографии является бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых. Несколько цитохромов Р450 были успешно синтезированы в клетках насекомых, однако данных по экспрессии гена 21-гидроксилазы до настоящего времени не было.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является функциональная характеристика уникальных миссенс-мутаций C169R, G178R, W302R, R426C, выявленных при проведении молекулярно-

генетического тестирования российских пациентов в рамках совместного проекта Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Эндокринологического научного центра РАМН. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1 - введение миссенс-мутаций в кДНК гена 21-гидроксилазы человека для изучения свойств мутантных вариантов фермента in vitro;

2 - получение рекомбинантных векторов для экспрессии кДНК стероид 21 -гидроксилазы дикого типа и анализируемых мутантных вариантов в клетках млекопитающих линии COS-7 и клетках насекомых линий SJ9 и Hi5;

3 - определение влияния мутаций на биосинтез и ферментативную активность 21-гидроксилазы и ее свойства в клетках COS-7;

4 - получение функционально-активной стероид 21-гидроксилазы в клетках насекомых и изучение влияния одной из мутаций - C169R - на функциональную активность фермента в микросомных фракциях клеток насекомых;

5 - анализ модели пространственной структуры 21-гидроксилазы, определение структурно-функциональных последствий аминокислотных замен, определяемых изучаемыми мутациями.

Научная новизна и практическая ценность работы.

1 - Охарактеризованы четыре новых миссенс-мутации гена 21-гидроксилазы, выявленные у больных с классическими формами адреногенитального синдрома. Данные о влиянии этих мутаций на свойства 21-гидроксилазы, полученные in vitro, могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести заболевания в случае их выявления у детей при молекулярно-генетической диагностике в неонатальном периоде.

2 - С использованием рекомбинантных бакуловирусов в клетках насекомых впервые получена 21-гидроксилаза человека. Предложены условия эффективной продукции (28% от суммарного количества белка микросом) функционально-активной 21-гидроксилазы в линии клеток Hi5. Уровень синтеза рекомбинантной 21-гидроксилазы в клетках Hi5 значительно превышает показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей. Это делает возможным получение в достаточных количествах рекомбинантного белка для функционального анализа, а также его кристаллизации.

3 — Использована модель трехмерной структуры CYP21A2 для интерпретации результатов функционального анализа мутаций in vitro, что важно для установления структурно-функциональных взаимодействий 21-гидроксилазы, а также других стероидогенных цитохромов Р450.

Апробаиия работы. Результаты исследований представлены на VII Международной Энгельгардтовской конференции по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), XVII Зимней школе для молодых ученых (Москва, 2005), XI Международной конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), 30-том Конгрессе FEBS (Будапешт, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них статьи -3, тезисы конференций - 4.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах

машинописного текста, содержит рисунков, таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования.

В ходе молекулярно-генетического анализа 104 неродственных пациентов с классическими формами недостаточности 21-гидроксилазы, обследованных в Институте детской эндокринологии ЭНЦ РАМН, выявлены новые мутации в гене CYP21A2. Недостаточность 21-гидроксилазы диагностирована на основании общепринятых клинических и гормональных критериев (Joint LWPES/ESPE САН Working Group, 2002). Скрининг общераспространенных мутаций в гене CYP21A2 проводили по методике A.Wedell и H.Luthman (1993). Делеции и крупные перестройки гена CYP21A2 выявляли методом MLPA1 согласно протоколам производителя (MRC-Holland, The Netherlands). Идентификацию новых точечных мутаций осуществляли прямым секвенированием продуктов полимеразной цепной реакции после аллель-специфической амплификации гена CYP21A2. Мутации названы согласно рекомендациям Nomenclature Working Group (Antonarakis, 1998; den Dünnen & Antonarakis, 2000).

Пациент К (46, XX2). Диагностирована простая вирильная форма недостаточности 21-гидроксилазы со степенью вирилизации 2 по Прадеру в возрасте 2,5 месяца. Часто встречающихся мутаций при анализе методом аллель-специфической ПЦР обнаружено не было. Методом MLPA выявлена делеция с 1 по 6 зкзон в одной копии гена CYP21A2. Полное секвенирование гена CYP21A2 позволило обнаружить замену Т на С в положении 989 в экзоне 4 в гемизиготном состоянии у пациента и в гетерозиготном состоянии у отца.

1 multiplex ligation-dependcnt probe amplification, множественная лигаз-зависимая амплификация.

2 нормальный кариотип человека, XX - набор половых хромосом женского организма, XY- мужского организма.

А.

Р301_

12 С Л8&р 1172Ы

I I

У2811 0318Х с^ег I РЗОбп! Н35Ш

I I I II

д.989Т>С д.1016С>А С169Я С178Я

В. д.98ЭТ>С,С169Я

ни к

Ш-1-Э

1.1 I ■-,-( ■ 1.2

ИТ/СГ 69Я 1 ИТ /¡¡а!

сиж/ав!

С. д.10160А, С178Я

1.1

Ш-тЧ»

УЧ72Ы(?) X ЮТ/О

1.2

т/Ю2Ы(?) 1 ЮТ/078Я

11.1 р

Н72Ы/Ы7Ж

Э. д.1746Т>С, W302R

1.1

пи р

Ш-Т"© ■

1.2

УУТ/№302Я I ИТ /А>1

1У302Я/Л>/

Е. д.2497С>Т, 1*426С

1.1

1.2

№Т//1?2«С?; 1 №Т//?426С

11.1 V

Н72Ы/Я426С

д.1746Т>С W302R

д.2497С>Т (34260

1 СТСТСТС С Т САС С ХбСАбСЛГ С А

1.2

11.1 К

1.2

11.1 Р

СТСТСТС СТ САС С 1ВС А 6С АТ С А

1/ЛДлМЫ^мтЬ

С1СТ с т с сТс Асссгслесисл

АТСАТСТеНАССТСАССИ СЙ6А15А

А1СА»С1В11АС«САСС11 СКбАбА *

И.1 р

1.2

АСАСС С 1С тсссвав ссв ю о т

АСАСССТСТСС^бОСССвТват

У^УГ^Пг^У

татссств

стесав тассгвса та т ас с те

Рис. 1. Мутации в гене С7Р21А2. обнаруженные у пациентов с адреногенитальным синдромом. А,- схематическое изображение гена СУР21А2, сверху показаны наиболее распространенные мутации, вызывающие дефицит 21 -гидроксилазы, снизу- новые мутации, исследуемые в настоящей работе; В, С, Э, Е — анализ мутаций у пациентов К, Р, Р, V, соответственно, (описание в тексте).

Замена нуклетидов привела к замене цистеина на аргинин в положении 169 (C169R) в полипептидной цепи CYP21A2 (рис. 1 А). Мутация отсутствовала в гене CYP21A2 матери. Т.о. генотип пациента К можно представить как гемизиготу с делецией гена CYP21A2 в материнском аллеле и миссенс-мутацией C169R в отцовском.

Пациент F (46, XX). Диагностирована простая вирильная форма недостаточности 21-гидроксилазы в возрасте 6 лет. Методом MLPA крупных перестроек и делеций гена CYP21A2 обнаружено не было. Аллель-специфической ПЦР выявлена мутация I172N в экзоне 4 в гетерозиготном состоянии. Полное секвенирование гена CYP21A2 позволило обнаружить вторую гетерозиготную мутацию в экзоне 4 — замену G на А в положении 1016. В результате обнаруженной нуклеотидной замены глицин 178 замещается на аргинин (G178R) (рис. 1 С). Мутация унаследована от матери. ДНК отца недоступна для анализа. Генотип пациента F - I172N (отцовский aллeль)/G178R (материнский аллель).

Пациент Р (46, XY). Диагностирована соль-теряющая форма недостаточности 21-гидроксилазы на второй неделе жизни. Анализом MLPA выявлена делеция с 1 по 6 экзон в одной копии гена CYP21A2. При секвенировании обнаружена замена Т на С в позиции 1746 в экзоне 7, ведущая к замене триптофана 302 на аргинин (рис. 1 D). Мутация выявлена как гомизиготная у пациента и гетерозиготная у его отца. Генотип пациента Р -W302R (отцовский аллель)/с1е1 (материнский аллель).

Пациент V (46, XX). Диагностирована простая вирильная форма с вирилизацией по Прадеру 4 степени. При рождении был определен мужской пол. Недостаточность 21-гидроксилазы диагностирована в возрасте 6 лет. Методом MLPA крупных нарушений гена CYP21A2 выявлено не было. Аллель-специфической ПЦР обнаружена мутация I172N в гетерозиготном состоянии. При прямом секвенировании обнаружена замена С на Т в положении 2497 п.о в десятом экзоне, сопровождающаяся заменой аргинина 426 на цистеин (R426C) (рис. 1 Е). У матери мутация R426C выявлена как гетерозиготная, мутация I172N отсутствовала. ДНК отца для анализа недоступна. Генотип пациента был определен как I172N (отцовский аллель)/ R426C (материнский аллель).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Функциональный анализ CYP21A2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках COS-7.

Для определения функционального значения новых мутаций, выявленных у пациентов с классическими формами дефицита стероид 21-гидроксилазы, кДНК CYP21A2 дикого типа и исследуемых мутантных вариантов транзиентно экспрессировали в клетках COS-7. Каталитическую активность по отношению к двум субстратам CYP21A2 - 17-ОН

прогестерону (170НП) и прогестерону — определяли в интактных клетках. Результаты (табл.2) свидетельствуют о практически полной инактивации СУР21А2 в случае всех исследуемых мутаций и позволяют классифицировать их как тяжелые. Активность по отношению к 170НП и прогестерону была измерена и для мутантного варианта 1142611. Мутация 1142611 была ранее описана у больных с адреногенитальным синдромом (Ваипщаггпег-Раггег, Й а1, 2001; ВагЬаго, й а1,2006), и по нашим данным приводит к почти полной инактивации 21-гидроксилазной активности (табл. 2).

Форма CYP21A2 170НП Прогестерон

WT 100 ±6.0 100 ±8.5

C169R 0.1 ±0.2 0.0 ± 1.2

G178R 0.4 ± 0.5 0.0 ± 0.6

W302R 0.1 ±0.2 0.0 ±0.5

R426C 0.0 ±0.5 0.0 ± 0.6

R426H 0.4 ± 0.7 0.6 ±2.1

Таблица 2. Остаточная каталитическая активность мутантных вариантов CYP21A2. Активность мутантных вариантов выражена в процентах от активности CYP21A2 дикого типа. Показаны средние значения эффективности превращения 170НП в дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон при инкубации клеток в течение 90 мин в среде, содержащей 2 мкМ субстрата через 24 часа после трансфекции клеток; ± стандартное отклонение после 6 тансфекций.

Из результатов иммуноблотинга следует, что уровень экспрессии кДНК всех изученных мутантных вариантов CYP21A2 в клетках COS-7 примерно одинаков (рис. 2). Слабая полоса, мигрирующая в ПААГ-ДСН геле медленнее, вероятнее всего, представляет гликозилированную форму CYP21А2, что было отмечено в литературе ранее (Lajic, etal, 1999).

mock WT C169R G178R W302R R426C

» ' ' ; ; ;

1 2 3 4 * *5 6

Рис.2. Сравнение уровня экспрессии кДНК CYP21A2 с мутациями и дикого типа в клетках COS-7. В каждую дорожку ПААГ-ДСН геля вносили 2 мкг общего клеточного белка. Дорожка 1 — лизат клеток, трансфицированных исходным вектором pcDNA3.1(+); дорожки 2 - 6 - лизаты клеток, продуцирующих CYP21А2 дикого типа (WT) и мутантных вариантов.

Влияние мутаций на внутриклеточную локализацию CYP21A2 определяли методом иммунофлуоресцентного окрашивания. Результаты свидетельствуют о правильной локализации всех исследуемых мутантных форм CYP21A2 в гладком эндоплазматическом ретикулуме клеток (рис. 3). Таким образом, можно сделать вывод, что мутации C169R, G178R, W302R, R426C не влияют на трансляцию и внутриклеточную локализацию стероид 21 -гидроксилазы.

Рис.3. Влияние мутаций на локализацию CYP21A2 человека в клетках COS-7. Слева показано окрашивание клеток COS-7 вторичными антителами ALEXA Fluor 488 против иммуноглобулинов кролика после обработки поликлональными антителами кролика против CYP21А2 человека. В центре — окрашивание клеток вторичными антителами ALEXA Fluor 594 против иммуноглобулинов мыши после обработки первичными антителами мыши против KDEL, маркера гладкого эндоплазматического ретикулума. Справа — совмещение изображений.

Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы.

Для получения функционально-активной стероид 21-гидроксилазы, локализованной в мембране эндоплазматического ретикулума клеток насекомых, использовали бакуловирусный вектор pFastBacHTaA, модифицированный путем делеции последовательности, кодирующей 6 остатков гистидина, надстраивающихся к N-концу рекомбинантного белка. На основе вектора pFastBacHTaA получены бакуловирусы bv-CYP21A2 и bv-CYP21A2-C169R. Белки, выявленные с помощью вестерн-блотинга в лизатах и препаратах микросом инфицированных клеток насекомых, мигрировали при электрофорезе в 12%-ном денатурирующем ПААГ в виде одной полосы с молекулярной массой 55 кДа, что соответствует молекулярной массе CYP21A2 (рис. 4, 5, 6). Присутствие CYP21A2 дикого типа и CYP21A2-C169R во фракции микросом свидетельствует о встраивании рекомбинантных белков в мембраны эндоплазматической сети клеток насекомых.

Уровень синтеза CYP21A2 зависит от длительности инфекции (24 - 96 часов) и множественности заражения клеток вирусом (0.1 - 8 бляшкообразующих единиц на клетку (БОЕ/кл)). Оптимальные условия продукции CYP21A2 подбирали по результатам иммуноблотинга. Количество синтезирующейся в клетках насекомых стероид 21-гидроксилазы значительно увеличивается на третий день (72 часа) после заражения клеток вирусом, что связано с использованием промотора позднего бакуловирусного гена полиэдрина. В этот период клетки содержат максимальное количество спектрально- и функционально-активных форм практически всех полученных в бакуловирусной системе экспрессии цитохромов Р450 (Asseffa, et al, 1989; Lee, et al, 1995; Paine, et al, 1996; Chen, et a!, 1997). С помощью иммуноблотинга CYP21A2 удается выявить в лизате клеток при множественности заражения 1 БОЕ/кл. При повышении множественности заражения до 2 БОЕ/кл количество CYP21A2 существенно возрастает, а в дальнейшем повышении (3-8 БОЕ/кл) увеличивается незначительно (рис. 4). Известно, что в условиях высокой

1 2 3 4 5 6 7

Рис.4. Влияние множественности заражения клеток .5/9 рекомбинантным бакуловирусом на уровень продукции СУР21А2 Лу9: дорожки 1 - 6 - множественность инфекции вируса 0,1; 1; 2; 3; 4; 8 БОЕ/кл; дорожка 7 - лизат ложноинфицированных клеток.

множественности инфекции активность цитохромов Р450 может снижаться (Lee, et al, 1995; Wang, et al, 1996), поэтому в дальнейшем для получения рекомбинантной 21-гидроксилазы мы использовали множественность инфекции 2 БОЕ/кл.

Эффективность продукции гетерологичных белков в разных линиях клеток насекомых сильно различается. Показано, что в клеточных линиях T. ni выход рекомбинантных Р450 гораздо выше, чем в линиях клеток S. frugiperda (Lee, et al, 1995). Сходные результаты получены нами при экспрессии гена CYP21A2. По данным иммуноблотинга содержание CYP21A2 во фракции микросом клеток Hi5 в 4 раза превышает его содержание в микросомах клеток SJ9. Таким образом, для получения большого количества рекомбинантного белка CYP21A2 использование линии клеток Hi5 предпочтительно.

Рис. 5. Анализ продукции СУР21А2 в клетках 5)9 и Н15\ в среду культивирования добавляли 3 мкг/мл хлорида гемина.

Для получения микросомных фракций и определения активности 21-гидроксилазы синтез белков СУР21А2 и СУР21А2-С16911 проводили в инфицированных клетках насекомых линии ///.5 при множественности инфекции 2 БОЕ/кл. в течение 72 часов в среде 5£900-11, содержащей 20% сыворотки теленка и 3 мкг/мл хлорида гемина. Добавление гемина в среду культивирования клеток насекомых важно для получения гемопротеинов, в том числе цитохромов Р450, ввиду недостаточной эффективности эндогенной гем-синтезирующей системы клеток (Азвейа, е1 а1, 1989; Еее, й а1, 1995). Увеличение содержания сыворотки в среде позволяет избежать токсичного действия гемина на клетки. По нашим данным добавление гемина в концентрации 3 мкг/мл не снижало жизнеспособность клеток 5/9 и Н15 (97-98% жизнеспособных клеток).

Уровень синтеза СУР21А2 в клетках Ш5 составил примерно 28% от суммарного микросомного белка (5 нмоль/мг микросомного белка). Для сравнения можно привести опубликованные данные об уровне продукции спектрально-активного СУР21А2 в клетках дрожжей - 0.076 нмоль/мг микросомного белка ^ч, е1 а1, 1991). Учитывая, что в клетках насекомых в форме спектрально- и функционально-активного гемопротеина находится от 50 до 90% синтезированного рекомбинантного Р450 (АвэеГГа, е1 а1, 1989; Втеге, й а1, 1994), выход спектрально-активного СУР21А2 в полученной нами бакуловирусной

1 2

Sf9 H¡5

системе экспрессии превышает уровень продукции сходных белков в клетках дрожжей по меньшей мере в 33 раза.

Как следует из результатов иммуноблотинга (рис.6), СУР21А2-С169Я синтезировался столь же эффективно и так же встраивался в мембрану эндоплазматической сети, как и СУР21А2 дикого типа.

1 2

Рис. 6. Сравнение уровня продукции СУР21А2 и СУР21А2-С169Л в клетках Н15.

CYP21A2 C169R

Ферментативная активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Ш5.

Активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в клетках насекомых определяли по отношению к двум субстратам — 170НР и прогестерону. Известно, что содержание КАОРН-Р450-оксидоредуктазы (CYPOR) в клетках насекомых недостаточно для поддержания активности рекомбинантных цитохромов Р450. По нашим данным микросомы из клеток HiS с высоким уровнем экспрессии гена CYP21A2 дикого типа обладают эндогенной активностью CYPOR, способной частично поддерживать активность рекомбинантного фермента. Активность по отношению к 170НР составила 10.45 ± 0.8 пмоль/(мг микросомного белка х мин), тогда как активность по отношению к прогестерону была ниже в 7.3 раза и составила 1.43 ± 1.05 пмоль/(мг белка х мин). У мутантного варианта C169R активность по отношению к обоим субстратам полностью отсутствовала. Наблюдаемые нами расхождения в активности рекомбинантного CYP21А2 дикого типа на прогестероне и 170НР, по-видимому, связаны с особенностями биосинтеза минерало- и глюкокортикоидных гормонов in vivo. В норме уровень секреции в коре надпочечников альдостерона, предшественником которого является прогестерон, в 100 -1 ООО раз меньше по сравнению с уровнем секреции кортизола, в пути биосинтеза которого задействован 170НР (White, et al, 1992). Это согласуется и с ранее опубликованными результатами анализа кинетики реакций 21-гидроксш1ирования прогестерона и 170НР в клетках млекопитающих, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины (Tusie-Luna, et al, 1990). В этой системе каталитическая эффективность (Vmax/Km) рекомбинантной 21-гидроксилазы в реакции с прогестероном была в 5 раз ниже, чем в реакции с 170НР.

Для компенсации недостатка CYPOR используются три подхода: 1) добавление очищенной НАДФН-Р450-оксидоредуктазы в реакционную смесь при измерении каталитической активности, 2) коэкспрессия генов цитохрома Р450 и НАДФН-Р450-оксидоредуктазы с помощью одного рекомбинантного бакуловируса или 3) заражают клетки одновременно двумя рекомбинантными бакуловирусами, обеспечивающими продукцию цитохрома Р450 и НАДФН-Р450-оксидоредуктазы (Lee, et al, 1995; Chen, et al, 1997). В представленной работе недостаток НАДФН-Р450-оксидоредуктазы в микросомах клеток насекомых компенсировали добавлением очищенной CYPOR кролика в среду измерения. Добавление НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика к микросомным частицам из клеток Hi5, синтезирующих 21-гидроксилазу, в молярном соотношении CYP21A2: CYPOR = 1:1 приводило к увеличению эффективности превращения 17-ОНпрогестерона в 11-дезоксикортизол в 1.7 раза (рис. 7 а), тогда как превращение прогестерона в дезоксикортикостерон в этих условиях увеличивается в 5.3 раза (рис. 7 б).

Рис. 7. Ферментативная активность СУР21А2 в микросомах из клеток Ш5. Относительная активность

представлена как отношение радиоактивности продукта к суммарной радиоактивности

субстрата и продукта. Используемая концентрация субстратов 0.01 мкМ. Показаны средние значения ± стандартное отклонение, п — число экспериментов. Заштрихованные столбцы показывают значения активности в микросомных препаратах в отсутствие, а серые - в присутствии экзогенной НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика; а -относительная активность С УР21А2 по отношению к 170НП; б - по отношению к прогестерону.

Данные по измерению каталитической активности СУР21А2 и мутантного варианта CI69R в системе с добавлением НАДФН-Р450-оксидоредуктазы кролика приведены в таблице 3. Результаты свидетельствуют о практически полном отсутствии активности мутантного белка по отношению к двум субстратам СУР21А2 - прогестерону и 170НП.

Таким образом, данные по функциональной характеристике миссенс-мутации C169R 21-гидроксилазы в микросомкой фракции инфицированной клеточной линии насекомых Hi5 свидетельствуют о полной инактивации фермента и согласуются с данными, полученными на клетках COS-7. Полученные нами результаты позволяют считать экспрессию в бакуловирусной системе удобным способом синтеза CYP21A2 с большим выходом, что очень важно для функционального анализа мутаций.

Субстрат Удельная активность, пмоль/(мг микросомного белка х мин) Относительная активность, %

WT C169R WT C169R

17-ОНпрогестерон 17.0 ±2.1 (л=5) 0.1 ± 1.0 (п=6) 100 ± 12.4 (п=5) 0.44 ± 9.6 (п=6)

прогестерон 7.6 ±0.5 (п=4) 0.0 ± 0.4 («=4) 100 ±6.5 («=4) 0.0 ±4.6 (п=4)

Таблица 3. Ферментативная активность стероид 21-гидроксилазы дикого типа и мутантного варианта C169R в микросомной фракции из клеток Hi5. Относительная активность выражена в процентах от удельной активности фермента дикого типа. Приведены средние значения ± стандартное отклонение, (п - количество измерений).

Анализ модели трехмерной структуры.

Для анализа наблюдаемого инактивирующего эффекта миссенс-мутаций C169R, G178R, W302R и R426C на функцию стероид 21-гидроксилазы человека была создана модель трехмерной структуры (рис. 8) на основе расшифрованной методом рентгеновской дифракции структуры CYP2C5 кролика (Krone, et al, 2004).

За последние несколько лет успешно расшифрованы структуры нескольких эукариотических Р450: CYP2C5 (PDB код: 1DT6) (Wester, et al, 2003), CYP2C8 (PDB код: 1PQ2) (Schoch, et al, 2003), CYP2C9 (PDB код: 10G5) (Williams, et al, 2003), CYP2B4 (PDB код: 1P05) (Scott, et al, 2003) and CYP3A4 (PDB код: 1W0E and 1TQN) (Williams, et al, 2004; Yano, et al, 2004). Анализ полученных структур свидетельствует о консерватизме организации молекул белков, относящихся к семейству цитохромов Р450, что позволяет использовать расшифрованные структуры для создания моделей других цитохромов Р450, в том числе стероидогенных.

Выравнивание последовательностей CYP21A2 и CYP2C5, выполненное с учетом пространственной конфигурации CYP2C5, показало, что молекула CYP21A2 состоит из четырех р-слоев и шестнадцати а-спиралей. Высоким консерватизмом отличается участок молекулы в гидрофобном ядре, который координирует гем - спирали I и L, а также область цистеинового кармана. В последовательности CYP21A2 присутствуют высоко консервативные для всех расшифрованных структур Р450 аминокислотные остатки:

Суз428, пятый (аксиальный) лиганд железа гема, ТЬг295 и С1и294, расположенные по середине спирали I и участвующие в катализе, а также элементы «ЕЯЯ-триады» С1и351, Aгg354, расположенные в спирали К, и А^408, - в «меандре». В координации пропионатных групп гема у СУР21А2 участвуют консервативные аминокислотные остатки: Aтg426, расположенный в цистеиновом кармане перед спиралью Ь, ТгрПб и Ьуз120 на С-конце спирали С, а также 1Пз365 в составе р 1-4. К консервативным участкам относятся также спираль Д, р-лист 1, спираль С, Е, К, образующие внутреннюю часть молекулы. Присутствует спираль У, которая является характерным элементом в структуре цитохромов Р450 второго класса. Наиболее вариативные участки расположены на 14-конце молекулы. К ним относится отрезок, соединяющий спирали В и С, а также последовательность в области спиралей Б и О и петли, которая их соединяет, т.е элементы, ответственные за взаимодействие с субстратами.

С178,\У302,11426.

О роли цистеина 169 свидетельствует высокий консерватизм этого положения в аминокислотной последовательности СУР21А2 у разных видов млекопитающих - свиньи (ОепВапк Р15540), коровы (ОепВапк Р00191), крысы (СспВапк 064562), мыши (ОепВапк Р03940), собаки (ОепВапк (38\ТО\¥0) и гидрофобный характер этого положения в других стероидогенных цитохромах Р450 человека - СУР 17А1 (ОепВапк Р05093, треонин),

CYP11A1 (GenBank P05108, фенилаланин), CYP11B2 (GenBank NP_000489, изолейцин), CYP19A1 (GenBank PI 1511, валин), и P450 млекопитающих с установленной структурой (рис. 9). Цистеин в положении 169 расположен в спирали Е в гидрофобном ядре молекулы (рис. 8, 10). Замена цистеина на аминокислотный остаток аргинина с

а T T T ¥

CYP21 162 eefslltcsiicyltfgdkikd-d 184 295 TTANTLSWAWFLLH 309 419 LAFGCGARVC LGEFL 433

CYE2C5 16S FILGCAPCNVICSVIFHNRFDYKD 190 298 TTSTTLRYSLLLLLK 312 422 MPFSAGKRHCVGEGL 436

CYP2C8 168 FILGCAFCNVICSWFQKRFDYKD 190 301 TTSTTLRYGLLLLLK 315 426 MPFSAGKRICAGEGL 440

CYF2C9 168 FILGCAPCNVICSIIFHKRFDYKD 190 301 TTSTTLRYALLLLLK 315 42 6 KPFSAGKRICVGEAL 440

CYP2B4 170 LLFHSITSNIICSIVFCKRFDYKD 192 302 TTSTTLRYGFLLMLK 316 427 MPFS1£KRICL/3EGI 441

CYP3A4 б 175 DVFGAYSMDVITSTSFGVNXDSLN 197 309 TTSSVLSFIMYELAT 323 433 TPFG3GPRNCIGMBJT 447

и CYF21humaii 162 EEFSLLTCSIICYLTFGDKIKTirM 185 295 TTANTLSWAWFLUI 309 419 1AFGCGARVCLG3PL 433

CYP21pig 163 KEFSVLTCSIICCLTFGD—KEDT 184 294 TTANTLSWAWYLLH 308 418 LAFGCGARVCLG2PL 432

CYP21cov 163 KEFSliLTCSXICYLTFGN—KEDT 184 294 TTASTLSWAVAFLm 308 418 LAFGCGARVCLG23L 432

CYP21dog 162 KEFSlLTCAriCHLTFGD—KEDT 183 293 TTATTLSWAVAFLLEI 307 41' LAFGCGARVCLGlPL 431

CYP21rat 161 KEFS1LTCSIISCLTFGD-KQDST 183 293 TTAATLSWAVAFLUi 307 414 PTFGCGARVCLG3PL 428

crp21mouse D 13 9 lUbíüí'LTCSi.iyULTtGiJ-IS.-ÜST 180 290 TTATTLbWAVAt'Lm 304 41. pat'üCüARVL'uiJtL 425

D CYP21 162 EEFSLLTCSIICYLTFGDK—IKD 183 235 TTANTLSKAWFLLH 309 419 LAFGCGARVCLGEFL 433

CYP17 169 FPVFVAVTNVISLICFNTSYKNGD 192 206 T TT SWKWT LAF L Ш 320 433 LPFGAGPRSCIGEIL 447

CYF11A1 200 DDLFRFAFESITNVIFGERQGMLE 223 230 TTSMTLGWHLYEMAR 344 453 LGFGWGVRQC LGP-RI 467

CYF11B2 121 PS IF HYTIEASNLALFGE RLGLVG 144 248 TTAFPLLMTLFELAR 262 371 VPFGFGMRCC LGRRL 385

CYP19A1 IB 7 VLTLLRRVMLDTSNTLFLRIPLDE 210 210 TM3VSLFFMLFLIAK 324 427 QPFGFGPRGCAGKYI 441

Рис. 9. Множественные выравнивания аминокислотных последовательностей P450, образующих а-спирали Е и I и область цистеинового кармана. Слева показана область а-спирали Е, посередине - а-спирали I, справа — цистеинового кармана. Аминокислотные остатки в положениях, соответствующих С169, G178, W302, R426, выделены жирным шрифтом и отмечены на рисунке сверху; а- множественное выравнивание CYP21A2 человека и цитохромов Р450 млекопитающих с установленной пространственной структурой; б- множественное выравнивание стероидогенных P450 человека; в- множественное выравнивание CYP21A2 разных видов млекопитающих.

Рис. 10. Замена цистеина 169 на аргинин в составе а-спирали Е. Показано взаимодействие с тирозином 191, расположенным на а-спирали И, отмечены аминокислотные остатки У190 и 1194, расположенные по соседству.

длинной боковой цепью, несущей положительный заряд, способна сильно нарушить конформацию гидрофобного ядра. В частности, аргинин в положении 169 может нарушать правильное расположение тирозина 191 в спирали F (рис. 10), способствуя тем самым закрытию канала, образуемого между спиралями I и F, который служит для выхода образованной во время катализа молекулы воды (Wester, et al, 2003). Другой вероятный эффект аргинина 169 связан с изменением взаимного расположения спиралей Е и I, находящихся рядом и образующих остов гидрофобного ядра молекулы 21-гидроксилазы. Оба предположения указывают на то, что сильная инактивация CYP21A2 в результате замены C169R связана с нарушением конформации элементов белковой молекулы, важных для ее функционирования.

Глицин в положении 178 высоко консервативен в аминокислотной последовательности CYP21A2 млекопитающих, однако заменен другими аминокислотами в некоторых других Р450 (рис. 9). Тем не менее, показано, что замена глицина 178 на близкий по свойствам аланин снижает активность CYP21A2 до 20% от активности фермента дикого типа (Nunez, et al, 1999). G178 расположен на поверхности белковой молекулы, в петле, соединяющей спирали Е и F (рис. 8, 11). Появление аргинина в этом положении может нарушать конформацию аминокислотных остатков 1131, R132, D133, расположенных в петле между а-спиралями D и С, изменяя расположение а-спиралей D и С относительно остальной части молекулы. В связи с этим можно высказать два предположения. Поскольку, как известно, N-концевая часть а-спирали С цитохромов Р450 участвует в связывании гема (Hasemann, et al, 1995), изменение стерических взаимодействий в результате замены G178R может приводить к нарушению связывания и координации гема. Известно также, что участок последовательности между спиралями В-В'-С задействован в процессах связывания субстрата и высвобождения продукта (Wester,

Рис.11. Замена глицина 178 на аргинин. Аргинин в положении 178 нарушает конформацию аминокислотных остатков 1131, R132, D133, расположенных в петле между а-спиралями С и D. R254 расположен на N-конце а-спирали Н.

al, 2003). Помимо этого, взаимодействие аргинина в положении 178 с аргинином 254, расположенным на N-конце а-спирали Н, способно изменять конформацию спирали I, определенно связанной с координацией гема и катализом. Все обсуждаемые эффекты, вероятно, могут объяснять отсутствие ферментативной активности мутанта 0178R, наблюдаемые in vitro.

Триптофан в положении 302 локализован в а-спирали I (рис 8, 12). а-спираль I высококонсервативна, пронизывает всю молекулу и участвует в распознавании субстрата и координации гема. Гидрофобность положения 302 характерна для разнообразных представителей семейства Р450, а триптофан консервативен у CYP21A2 млекопитающих (рис. 9). Замена ароматической аминокислоты триптофана на полярный и заряженный аргинин непосредственно в ядре молекулы может сильно мешать правильному положению а-спирали I относительно простетической группы - гема. Поэтому можно предположить, что аргинин 302 может затруднять катализ CYP21A2 за счет нарушения координации гема. Отсутствие каталитической активности, обнаруженное при анализе мутации W302R in vitro, согласуется с ее фенотипическим проявлением — развитием соль-теряющей формы недостаточности 21 -гидроксилазы.

Аргинин 426 расположен в цистеиновом кармане, который отличается высоким консерватизмом среди цитохромов Р450 (рис 8, 13), и является одним из четырех аминокислотных остатков, участвующих в координации пропионатных групп гема (Haesmann, et al, 1995; Mornet & Gibrat, 2000). Аргинин в соответствующем положении присутствует в молекулах эукариотических Р450 (рис. 9), тогда как у некоторых прокариотических Р450 соответствующей аминокислотой является гистидин (P450terp (CYP108), P450eryf (CYP107A1), P450cam (CYP101), P450nor (CYP55A1)). Замена аргинина на цистеин сильно инактивирует CYP21A2, по всей видимости, за счет нарушения координации гема в активном центре молекулы. Ранее у пациентов с адреногенитальным синдромом была описана мутация R426H (Baumgartner-Parzer, et al, 2001; Barbaro, et al, 2006). Измерение активности мутанта R426H в условиях, когда нет насыщения системы по субстрату, выявило почти полное отсутствие ферментативной активности по отношению к двум субстратам (0.5% и 0.4% от активности дикого типа по отношению к 170НП и прогестерону, соответственно), что хорошо сочетается с данными, полученными нами (табл. 2) и подчеркивает важность аргинина в положении 426 CYP21A2 для осуществления катализа. Помимо этого, известно, что замена аргинина в соответствующем положении на цистеин или гистидин инактивирует и другие стероидогенные цитохромы Р450: CYP11В1 - замена R448H (White, et al, 1991; Cumow, et al, 1993) и R448C (Geley, et al, 1996), и CYP17A1- замена R440H (Fardella, et al, 1994).

Рис. 12. Расположение триптофана 302 в ядре молекулы. Введение полярного аргинина с длинной алифатической боковой цепью нарушает конформацию

молекулы СУР21А2.

Рис. 13. Расположение аргинина 426 и его взаимодействие с

пропионатными группами гема, нарушаемое при введении цистеина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

формой. Поскольку известно, что в подавляющем большинстве случаев фенотип при адреногенитальном синдроме определяется наименее поврежденным аллелем, клинические проявления пациентов F и V находятся в соответствии с установленным генотипом. Ожидаемое генотип-фенотипическое соответствие обнаружено и для пациента Р. Мутация W302R, по нашим данным полностью инактивирующая фермент, представлена в гемизиготном состоянии, и приводит к наиболее тяжелой соль-теряющей форме АГС у пациента. Мутация C169R обнаружена у пациента с простой вирильной формой дефицита 21-гидроксилазы совместно с делецией большого участка гена во втором аллеле. При этом наблюдаемые в большинстве случаев клинические проявления напрямую зависят от повреждающего эффекта мутации, обнаруживаемой в сохранившемся аллеле. Мутации, ассоциированные с простой вирильной формой заболевания, как правило, при измерении in vitro проявляют остаточную активность 1-5 % от активности 21-гидроксилазы дикого типа. Однако данные по измерению активности CYP21А2-С169R на целых клетках COS-7 свидетельствуют о полной утрате ферментативной активности мутантным ферментом по отношению к двум субстратам CYP21A2. Сходные результаты были получены и в более эффективной системе измерения - в микросомных препаратах из клеток насекомых 1П5. Таким образом, мутация C169R может быть классифицирована как тяжелая, а исследуемый случай, вероятно, можно отнести к одному из редких примеров несоответствия генотипа и проявляемого фенотипа при дефиците 21 -гидроксилазы.

Стероид 21-гидроксилаза человека получена нами в клетках насекомых с использованием рекомбинантных бакуловирусов. Высокий выход активного фермента позволяет рассматривать бакуловирусную систему экспрессии как перспективную для синтеза CYP21A2 в культивируемых клетках насекомых и функционального анализа мутаций.

выводы

Анализ каталитической активности мутантных вариантов стероид 21-гидроксилазы человека C169R, G178R W302R и R426C, проведенный в системе клеток млекопитающих COS-7, показал, что все они неактивны в отношении двух субстратов фермента — 170НП и прогестерона. Установлено, что инактивирующий эффект в случае всех исследуемых миссенс-мутаций не связан с нарушением биосинтеза, внутриклеточной локализации и общей укладки молекулы стероид 21-гидроксилазы в клетках COS-7.

Получена рекомбинантная функционально-активная стероид 21-гидроксилаза с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых SJ9 и Hi5 с использованием рекомбинантных бакуловирусов. Проведен анализ каталитической активности мутантного варианта C169R в микросомных препаратах из клеток Hi5. Результаты исследования совпадают с результатами, полученными на интактных клетках COS-7, и свидетельствуют о практически полном отсутствии активности в отношении двух субстратов фермента - 170НП и прогестерона, не связанном со снижением уровня синтеза мутантного белка или нарушением его внутриклеточной локализации.

В результате моделирования влияния миссенс-мутаций на трехмерную структуру молекулы стероид 21-гидроксилазы предложены возможные механизмы инактивации фермента, наблюдаемой in vitro.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

1. Королева Н.Н., Грищук Ю.В., Кочеткова С.В., Прасолов B.C., Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н. Оптимизация бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых и млекопитающих.// Молекулярная биология,- 2006.-Т.40.-№6.-С. 1074-1081.

2. Yu.Grischuk, P.Rubtsov, F.Riepe, J.Grotzinger, S.Beljelarskaya, V.Prassolov, N.Kalintchenko, T. Semitcheva, V.Peterkova, A.Tiulpakov, W. G. Sippell and N.Krone. Four novel missense mutations in the CYP21A2 gene in Russian patients suffering from the classical form of congenital adrenal hyperplasia (САН): identification, functional characterization and structural analysis// J Clin Endocrin & Metab.- 2006.-V.91 .-1.12.-P.4976-4980.

3. Грищук Ю.В, П.М. Рубцов и С.Н. Белжеларская. Экспрессия гена стероид 21-гидроксилазы человека и его мутантного варианта C169R в клетках насекомых и функциональный анализ продуктов экспрессии.// Молекулярная биология.- 2007.-Т.41.-

Тезисы конференций:

S. N. Beljelarskaya, Yu.V. Grischuk, N.N. Koroleva, S.N. Kochetkov and P.M. Rubtsov. Efficient gene transfer into insect and mammalian cells by baculovirus vectors for production of functional human steroid-21-hydroxilase and hepatitis С virus proteins in insect and mammalian cells. 7th Intemtional Engelhardt Conference on Molecular Biology, Susdal, 2004.

Белжеларская CH, Грищук ЮВ, Королева НИ, Кочетков СН и Рубцов ПМ. Оптимизация бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых и млекопитающих. XVII Зимняя школа для молодых ученых, Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, 2005, с. 56.

Грищук ЮВ, Белжеларская СН, Иванов ДС, Прасолов ВС, Рубцов ПМ. Изучение мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы с использованием систем экспрессии на основе клеток насекомых и млекопитающих. 9 международная конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 2005, с. 15.

Y.V.Grischuk, D.S. Ivanov, V.S. Prassolov, S.N. Beljelarskaya and P.M.Rubtsov. Two novel disease-causing mutations in the CYP21 gene in Russian patients with 21-hydroxylase deficiency: affect on functional enzyme activity. 30th FEBS Congress-9lh IUBMB Conference, Budapest, 2005.

Заказ №136/11/06 Подписано в печать 15.11.2006 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru ; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грищук, Юлия Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биосинтез стероидных гормонов.

1.1.1. Синтез стероидных гормонов в коре надпочечников человека -общие стадии.

1.1.2. Синтез минералокортикоидов.

1.1.3. Синтез глюкокортикоидов.

1.1.4. Синтез половых гормонов.

1.2. Наследственные нарушения биосинтеза стероидов.

1.2.1. Адреногенитальный синдром.

1.2.2. Формы недостаточности 21-гидроксилазы.

1.2.3. Частота недостаточности 21-гидроксилазы.

1.3. Особенности структуры и расположения гена CYP21A2.

1.3.1 Область генов комплекса гистосовместимости III класса.

1.3.2. Структура RCCX-модуля.

1.3.3 Структура гена CYP21A2 и псевдогена CYP21AIP.

1.4. Молекулярно-генетические механизмы возникновения и методы выявления мутаций в гене CYP21A2.

1.4.1. Крупные делеции гена по механизму неравного кроссинговера.

1.4.2. Небольшие генные конверсии.

1.4.3 Мутации, не связанные с псевдогеном.

1.4.4. Возникновение мутаций de novo.

1.4.5. Методы выявления мутаций в гене CYP21A2.

1.4.6. Молекулярно-генетический анализ гена CYP21A2 в российской популяции.

1.4.7. Корреляция между генотипом и клинической формой заболевания при дефиците 21-гидроксилазы.

1.5. Системы гетерологичной экспрессии генов, используемые для получения рекомбинантной стероид 21-гидроксилазы человека.

1.6. Стероид 21-гидроксилаза как представитель надсемейства цитохромов Р450.

1.6.1. Состав и функциональное значение надсемейства цитохромов Р450.

1.6.2. Механизм монооксигеназной реакции.

1.6.3. Пространственная организация молекул надсемейства цитохромов Р450.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Пациенты и молекулярно-генетический анализ мутаций.

2.2. Используемые клеточные линии и бактериальные штаммы.

2.3. Создание генно-инженерных конструкций и сайт-специфичный мутагенез.

2.4. Культивирование и трансфекция клеток COS-7.

2.5. Анализ каталитической активности в клетках COS-7.

2.6. Получение рекомбинантных бакуловирусных векторов.

2.7. Получение рекомбинантных бакмид.

2.8. Трансфекция клеток насекомых и получение рекомбинантных бакуловирусов.

2.9. Определение вирусного титра.

2.10. Экспрессия в клетках насекомых Sf9 и Я/5.

2.11. Получение микросомных фракций.

2.12. Анализ каталитической активности в микросомной фракции Я/5.

2.13. Измерение концентрации белка.

2.14. ДСН-ПААГ электрофорез.

2.15. Вестерн-блот-анализ.

2.16. Иммунофлуоресценция.

2.17. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.

2.18. Анализ клонов методом ПЦР.

2.19. Выделение плазмидной ДНК.

2.20. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.21. Фракционирование и очистка фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.22. Лигирование.

2.23. Моделирование трехмерной структуры.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Введение мутаций в заданные положения нуклеотидной последовательности кДНК гена CYP21A2.

3.2. Экспрессия и функциональный анализ CYP21A2 дикого типа и мутантных вариантов в клетках COS-7.

3.3. Влияние мутаций на локализацию CYP21A2 в клетках COS-7.

3.4. Экспрессия кДНК CYP21A2 и мутантного варианта C169R в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы.

3.5. Ферментативная активность CYP21A2 и CYP21A2-C169R в препаратах микросом из клеток Hi5.

3.6. Анализ модели трехмерной структуры.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом"

Адреногенитальный синдром (АТС; врожденная дисфункция коры надпочечников, ВДКН) - группа наследственных заболеваний человека с аутосомно-рецессивным характером наследования, обусловленных нарушением биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников. Врожденным дефицитом стероид 21-гидроксилазы вызвано 90-95% всех случаев адреногенитального синдрома.

Фермент стероид 21-гидроксилаза (21-гидроксилаза, CYP21A2) катализирует монооксигеназные реакции превращения 17-гидроксипрогестерона (17-ОН прогестерона, 17 0НП) в дезоксикортизол и прогестерона в дезоксикортикостерон, участвуя в биосинтезе глюкокортикоидов и минералокортикоидов, соответственно, и относится к семейству цитохромов Р450. Белки этого семейства обнаружены у всех изученных эукариот и некоторых прокариот и широко участвуют в окислительном метаболизме эндогенных соединений (стероидогенезе, поддержании гомеостаза витамина Д), а также разнообразных ксенобиотиков (лекарств, химических канцерогенов, растительных метаболитов и пр.). Учитывая широкое распространение цитохромов Р450 и разнообразие катализируемых ими реакций, исследование белков этого семейства имеет большое значение для фармакологии (разработки новых лекарственных средств, определения индивидуальной переносимости лекарственных препаратов и т.д.), анализа экологических загрязнений, а также молекулярной генетики человека.

CYP21A2. Он расположен в коротком плече шестой хромосомы (6р21.3) в локусе генов главного комплекса гистосовместимости третьего класса (называемого также областью HLA - Human Leukocyte Antigen- III класса). Длина гена CYP21A2 составляет 3,4 т.п.н, он содержит 10 экзонов и 9 интронов. На расстоянии 30 т.п.н. от активного гена CYP21A2 между генами 4-го компонента комплемента С4А и С4В расположен псевдоген CYP21A1P. Степень гомологии гена и псевдогена составляет 98% в экзонах и 96% в интронах (Higashi, et al, 1986; White, et al, 1986; Rodrigues, et al, 1987). Рекомбинация между высокогомологичными CYP21A2 и CYP21A1P по механизму неравного кроссинговера или генной конверсии является основной причиной дефицита 21-гидроксилазы. Наряду с этим, по мере проведения молекулярно-генетического скрининга мутаций в разных популяциях мира, накапливаются сведения о спонтанно возникающих мутациях, происхождение которых не связано с псевдогеном. Эти редкие или уникальные мутации характерны для отдельных семей или небольших по численности популяций. К настоящему моменту описано 60 таких мутаций.

Цель и задачи исследования.

Целью работы является функциональная характеристика уникальных миссенс-мутаций C169R, G178R, W302R, R426C, выявленных при проведении молекулярно-генетического тестирования российских пациентов в рамках совместного проекта Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Эндокринологического научного центра РАМН. Для этого было необходимо решить следующие задачи:

2-получение рекомбинантных векторов для экспрессии кДНК стероид 21-гидроксилазы дикого типа и анализируемых мутантных вариантов в клетках млекопитающих линии COS-7 и клетках насекомых линий Sf9 и Hi5;

5-анализ модели пространственной структуры 21-гидроксилазы, определение структурно-функциональных последствий аминокислотных замен, определяемых изучаемыми мутациями.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Грищук, Юлия Владимировна

выводы

1. Анализ каталитической активности мутантных вариантов стероид 21-гидроксилазы человека C169R, G178R W302R и R426C, проведенный в системе клеток млекопитающих COS-7, показал, что все они неактивны в отношении двух субстратов фермента - 170НП и прогестерона.

2. Установлено, что инактивирующий эффект в случае всех исследуемых миссенс-мутаций не связан с нарушением биосинтеза, внутриклеточной локализации и общей укладки молекулы стероид 21-гидроксилазы в клетках COS-7.

3. Получена рекомбинантная функционально-активная стероид 21-гидроксилаза с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и Hi5 с использованием рекомбинантных бакуловирусов.

4. Проведен анализ каталитической активности мутантного варианта C169R в микросомных препаратах из клеток Hi5. Результаты исследования совпадают с результатами, полученными на интактных клетках COS-7, и свидетельствуют о практически полном отсутствии активности в отношении двух субстратов фермента - 170НП и прогестерона, не связанном со снижением уровня синтеза мутантного белка или нарушением его внутриклеточной локализации.

5. В результате моделирования влияния миссенс-мутаций на трехмерную структуру молекулы стероид 21-гидроксилазы предложены возможные механизмы инактивации фермента, наблюдаемой in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведен функциональный анализ четырех новых, не описанных ранее мутаций C169R, G178R, W302R, R426C, обнаруженных у пациентов с классическими формами недостаточности 21-гидроксилазы. Показано, что все мутации приводят к потере активности фермента по отношению к двум субстратам - 170НП и прогестерону. При этом исследуемые замены аминокислот не влияют на биосинтез CYP21A2 и внутриклеточную локализацию в эндоплазматическом ретикулуме. Мутации G178R и R426C обнаружены в гетерозиготном состоянии у пациентов с простой вирильной формой дефицита 21-гидроксилазы совместно с хорошо охарактеризованной и часто встречающейся мутацией I172N в другом аллеле. Мутация I172N относится к группе мутаций средней тяжести и чаще всего ассоциирована с простой вирильной формой. Поскольку известно, что в подавляющем большинстве случаев фенотип при адреногенитальном синдроме определяется наименее поврежденным аллелем, клинические проявления пациентов F и V находятся в соответствии с установленным генотипом. Ожидаемое генотип-фенотипическое соответствие обнаружено и для пациента Р. Мутация W302R, по нашим данным полностью инактивирующая фермент, представлена в гемизиготном состоянии, и приводит к наиболее тяжелой соль-теряющей форме АГС у пациента. Мутация C169R обнаружена у пациента с простой вирильной формой дефицита 21-гидроксилазы совместно с делецией большого участка гена во втором аллеле. При этом в большинстве случаев наблюдаемые клинические проявления напрямую зависят от повреждающего эффекта мутации, обнаруживаемой в сохранившемся аллеле. Мутации, ассоциированные с простой вирильной формой заболевания, как правило, при измерении in vitro проявляют остаточную активность 1-5 % от активности 21-гидроксилазы дикого типа. Однако данные по измерению активности CYP21A2-C169R на целых клетках COS-7 свидетельствуют о полной утрате ферментативной активности мутантным ферментом по отношению к двум субстратам CYP21A2. Сходные результаты были получены и в более эффективной системе измерения - в микросомных препаратах из клеток насекомых Hi5. Таким образом, мутация C169R может быть классифицирована как тяжелая, а исследуемый случай, вероятно, можно отнести к одному из редких примеров несоответствия генотипа и проявляемого фенотипа при дефиците 21-гидроксилазы.

Стероид 21-гидроксилаза человека получена нами в клетках насекомых с использованием рекомбинантных бакуловирусов. Высокий выход активного фермента позволяет рассматривать бакуловирусную систему экспрессии как высокоэффективную для синтеза CYP21A2 в культивируемых клетках насекомых и функционального анализа мутаций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грищук, Юлия Владимировна, Москва

1. Белжеларская С.Н. Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых.//Молекуляр. биология. -2002,- Вып.36.-С.371-385.

2. Вартанян J1.C., Рашба Ю.Э., Наглер Л.Г. Мембраны субклеточных органелл как источник супероксидных радикалов при ишемии печени.// Бюл.эксперим.биологии и медицины.- 1990.-№6.-С.550-552.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование./ М.-Мир,-1984.- 480 с.

4. Осиновская Н.С., Иващенко Т.Э., Соболева Е.Л., Баранов B.C., Потин В.В., Плотников Е.В. Анализ спектра мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы у больных с адреногенитальным синдромом.// Генетика.-2000.-Вып.36.-№8.-С.1147-1149.

5. Al-Othman A.N., Docherty К., Makgoba N.W., Sheppard М.С., London D.R. DNA and RNA analysis of cytochrome P-450 21-hydroxylase: transcriptional activity in congenital adrenal hyperplasia.// J Mol Endocrinol.-1988.-V. 1 .-P. 157-164.

6. Antonarakis S.E. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group.// Hum Mutat.-1998.-V.11.-P.1-3.

7. Arnold G.E., Ornstein R.L. Molecular dynamics study of time-correlated protein domain motions and molecular flexibility: cytochrome P450BM-3.// Biophys J.-1997.-V.73.-T.3.-P.1147-1159.

8. Asseffa A., Smith S.J., Nagata K., Gillette J., Gelboin H.V., Gonzalez F.J. Novel exogenous heme-dependent expression of mammalian cytochrome P450 using baculovirus.// Arch Biochem Biophys.-1989.-V.274.-P.481-490.

9. Bachega T.A., Billerbeck A.E., Modureira G., Arnhold I.J., Medeiros M.A., Marcondes J.A., Lonqui C.A., Nicolau W., Bloise W., Mendonca

10. B.B. Low frequency of CYP21B deletions in Brazilian patients with Congenital Adrenal Hyperplasa due to 21-hydroxylase deficiency// Hum.Hered.-1999.-V.49.-P.9-14.

11. Bachega T.A., Billerbeck A.E., Madureira G., Marcondes J.A., Longui

12. C.A., Leite M.V., Arnhold I.J., Mendonca B.B. 21-Hydroxylase deficiency in Brazil.// Braz J Med Biol Res.-2000.- V.33.-I.10.-P.1211-1216.

13. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Instruction Manual. Life Technologies, Inc./ St.Louis.-1993.

14. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Instruction Manual. Life Technologies, Inc./ www.invitrogen.com.-2004.

15. Baculodirect Baculovirus Expression System. Instruction Manual. Life technologies, Inc./ www.invitrogen.com.-2006.

16. Baculovirus Expression Vector System Manual. Instruction Manual. Pharmingen. / www.pharmingen.com. -1999.

17. Barbaro M, Baldazzi L, Balsamo A, Lajic S, Robins T, Barp L, Pirazzoli P, Cacciari E, Cicognani A, Wedell A. 2006. Functional studies of two novel and two rare mutations in the 21-hydroxylase gene. J Mol Med. 84(6), 521-528.

18. Beale D., Feinstein A. Structure and function of the constant regions of immunoglobulins.// Q Rev Biophys.-1976.-T.9.-V.2.-P.135-180.

19. Bernhardt R., Pommerening K., Ruckpaul K. Modification of carboxyl groups on NADPH-cytochrome P-450 reductase involved in binding of cytochromes с and P-450 LM2.// Biochem Int.-1987.-V.14.-T.5.-P.823-832.

20. Beyenburg S., Watzka M., Clusmann H., Blumcke I., Bidlingmaier F., Elger C.E., Stoffel-Wagner B. Messenger RNA of steroid 21-hydroxylase (CYP21) is expressed in the human hippocampus//Neurosci Lett.-2001.-V.308-P.111-114.

21. Biagini C., Ceiler C. CDNA-directed expression of two allelic variants of cytochrome P450 2C11 using COS1 and SF21 insect cells// Arch Biochem Biophys.-1996.-T.326.-V.2.-P.298-305.

22. Black S.D., Martin S.T., Smith C.A. Membrane topology of liver microsomal cytochrome P450 2B4 determined via monoclonal antibodies directed to the halt-transfer signal.// Biochemistry.- 1994.-V.33.-P.6945-6951.

23. Bormann M, Kochhan L, Knorr D, Bidlingmaier F, Olek K. Clinical heterogeneity of 21-hydroxylase deficiency of sibs with identical 21-hydroxylase genes.// Acta Endocrinol.-1992.-V.126.-P.7-9.

24. Bridges A., Gruenke L., Chang Y.T., Vakser I.A., Loew G., Waskell L. Identification of the binding site on cytochrome P450 2B4 for cytochrome b5 and cytochrome P450 reductase.// J Biol Chem.-1998.-V.273.-T.27.-P.17036-17049.

25. Bryan G.T., Lewis A.M., Harkins J.B., Micheletti S.F., Boyd G.S. Cytochrome P450 and steroid 21-hydroxylation in microsomes from beef adrenal cortex// Steroids.-1974.-T.23.-V.2.-P.185-201.

26. Buters J.T.N., Korzekwa K.R., Kunze K.L., Omata Y., Hardwick J.P., Gonzalez F.J. cDNA-directed expression of human cytochrome P450 CYP3A4 using baculovirus.// Drug Methab Dispos Bio Fate Chem.-1994.-V.22.-P.688-692.

27. Carrera P, Bordone L, Azzani T, Brunelli V, Garancini MP, Chiumello G, Ferrari M. Point mutations in Italian patients with classic, non-classic, and cryptic forms of steroid 21-hydroxylase deficiency.// Hum Genet.-1996.-V.98.-I.6.-P.662-665.

28. Carrington M. Recombination within the human MHC// Immunol Rev.-1999.-V. 167.-P.245-256.

29. Casey M.L., Winkel C.A., MacDonald P.C. Conversion of progesterone to deoxycorticosterone in the human fetus: steroid 21-hydroxylase activity in fetal tissues// J Steroid Biochem.-1983.-V.18.-P.449-452.

30. Chen L., Buters J.T.M., Hardwick J.P., Tamura Sh., Penman B.W., Gonzalez F.J., Crespi Ch.L. Coexpression of cytochrome P4502A6 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in the baculovirus system.// Drug Methab Dispos.-1997.-V.25.-P.399-405.

31. Chen S., Zhou D. Functional domains of aromatase cytochrome P450 inferred from comparative analyses of amino acid sequences and substantiated by site-directed mutagenesis experiments.// J Biol Chem.-1992.-V.267.-T.31 .-P.225 87-22594.

32. Chin K.K., Chang S.F. The -104G nucleotide of the human CYP21 gene is important for CYP21 transcription activity and protein interaction.// Nucleic Acids Res.-1998.-V.26.-P.1959-1964.

33. Chiou S.H., Ни M.C., Chung B.C. AmissensemutationatIlel72Asnor Arg356Trp causes steroid 21-hydroxylase deficiency.// J Biol Chem.-1990.-T.265.-V.6.-P.3549-3552.

34. Coghlan V.M., Vickery L.E. Site-specific mutations in human ferredoxin that affect binding to ferredoxin reductase and cytochrome P450scc.// J Biol Chem. 1991.-V.266.-T.28.-P.18606-18612.

35. Collier S., Tassabehji M., Sinnott P.J., Strachan Т. A de novo pathological point mutation at the 21-hydroxylase locus: implications for gene conversion in the human genome.// Nat Genet.-1993.-V.3.-P.260-265; V.4.-P.101.

36. Cooper D.N., Youssoufian H. The CpG dinucleotide and human genetic disease.//Hum Genet.-1988.-V.78.-P.151-155.

37. Coon M.J., Vaz A.D., McGinnity D.F., Peng H.M. Multiple activated oxygen species in P450 catalysis: contributions to specificity in drug metabolism.// Drug Metab Dispos.-1998.-T.26.-V.12.-P.l 190-1193.

38. Cupp-Vicker J.R., Li H., Poulos T.L. Structure of cytochrome P450eryf involved in erythromycin biosynthesis.//Nature Struct Biol.-1995.-V.2.-P.144-153.

39. Curnow К., Slutsker L., Vitek J., Cole Т., Speiser P., New M., White P., Pascoe L. Mutations in the CYP11B1 Gene Causing Congenital Adrenal Hyperplasia and Hypertension Cluster in Exons 6, 7, and 8.// PNAS.-1993.-V.90.-P.4552-4556.

40. Day D.J., Speiser P.W., White P.C., Barany F. Detection of steroid 21 -hydroxylase alleles using gene-specific PCR and a multiplexed ligation detection reaction.// Genomics.-1995.-V.29.-P.152-162.

41. Dawkins R., Leelayuwat C., Gaudieri S., Hui J., Cattley S., Martinez P., Kulski J. Genomics of the major histocompatibility complex: haplotypes, duplication, retroviruses and disease.// Immunol Rev.-1999,-V. 167.-P.275-304.

42. Deiter H.H., Muller-Eberhard U., Johnson E.F. Identification of rabbit microsomal P-450 isozyme, form I, as a hepatic progesterone 21-hydroxylase.// Biochem Biophys Res Comm.-1982.-V.105.-P.515-520.

43. Endoh A., Natsume H., Igarashi Y. Dual regulation of 21 -hydroxylase activity by sex steroid hormones in rat hepatocytes.// J Steroid Biochem Mol Biol.-1995.-V.54.-P. 163-165.

44. Endoh A., Yang L., Hornsby P.J. CYP21 pseudogene transcripts are much less abundant than those from the active gene in normal humanadrenocortical cells under various condition in culture.// Mol Cell Endocrinol.-1998.-V. 137-P. 13-19.

45. Ezquieta В., Oliver A., Gracia R., Gancedo P.G. Analysis of steroid 21-hydroxylase gene mutations in the Spanish population.// Hum Genet.-1995.-V.96.-P. 198-204.

46. Ezquieta В., Varela J.M., Jariego C., Oliver A., Gracia R. Nonisotopic detection of point mutations in CYP21B gene in steroid 21-hydroxylase deficiency.// Clin Chem.-1996.-V.42.-P.l 108-1110.

47. Fardella C., Hum D., Homoki J., Miller W. Point mutation of Arg440 to His in cytochrome P450cl7 causes severe 17 alpha-hydroxylase deficiency.// J Clin Endocrinol Metab.-1994.-V.79.-P.160-164.

48. Gotoh 0. Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences.//J Biol Chem.-1992.-V.267.-P.83-90.

49. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling.// Electrophoresis.-1997.-V.18.-P.2714-23.

50. Hasemann C.A., Ravichandran K.G., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure and refinement of cytochrome P450terp at 2.3 A resolution.// J Mol Biol.-1994.-T.236.-V.4.-P. 1169-1185.

51. Hasia J.G. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays.// Nat Genet.-1999.-V.21 -P.42-47.

52. Hayashi Z., Orimo H., Araki Т., Shimada T. Prenatal diagnosis of steroid 21-hydroxylase deficiency by analysis of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) profiles.// Prenatal Diagn.-1997.-V. 17.-P.43 5-442.

53. Helmberg A., Tusie-Luna M.T., Tabarelli M., Kofler R., White P.C. R339H and P453S: CYP21 mutations associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency that are not apparent gene conversions.// Mol Endocrinol.-1992.-V.6-P. 1318-1322.

54. Higashi Y., Yoshioka H., Yamane M., Gotoh O., Fujii-Kuriyama Y. Complete nucleotide sequence of two steroid 21-hydroxylase genes tandemly arranged in human chromosome: a pseudogene and a genuine gene.// Proc Natl Acad Sci USA.-1986.-V.83.-P.2841-2845.

55. Higashi Y., Tanae A., Inoue H., Fujii-Kuriyama Y. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21) gene: implications for steroid 21-hydroxylase deficiency.// Am J Hum Genet.-1988.-V.42.-P.17-25.

56. Higashi Y., Fujii-Kuriyama Y. Functional analysis of mutant P450 (C21) genes in COS cell expression system.// Methods Enzymol.-1991.-V.206-P.166-173.

57. Hogstrand K., Bohme J. Gene conversion can create new MHC alleles.// Immunol Rev.-1999.-V. 167.-P.305-317.

58. Honig В., Nicholls A. Classical electrostatics in biology and chemistry.// Science.-1995.-V.268.-T.5214.-P.l 144-1149.

59. Hsu L.C., Ни M.C., Cheng H.C., Lu J.C., Chung B.C. The N-terminal hydrophobic domain of P450c21 is required for membrane insertion and enzyme stability.//J Biol Chem.-1993.-V.268.-14682-14686.

60. Ни M.C., Hsu L.C., Hsu N.C., Chung B.C. Function and membrane topology of wild-type and mutated cytochrome P-450c21.// Biochem J.-1996.-V.316.-P.325-329.

61. Ни M.C., Chung B.C. Expression of human 21-hydroxylase (P450c21) in bacterial and mammalian cells: a system to characterize normal and mutant enzymes.// Mol Endocrinol.-1990.-V.4.-P.893-898.

62. Ichikawa Y., Kroda M., Yamano T. Zonation of hemoprotein P-450 and cytochrome b5 in the adrenocortex of mammals.// J Cell Biol.-1984-V.45.-P.640-643.

63. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of E.coli with plasmids.// Gene.-1990.- V.6.-P.23-28.

64. Jeffreys A.J., Kauppi L., Neumann R. Intensely punctate meiotic recombination in the class II region of the major histocompatibility complex.// Nat Genet.-2001.-V.29.-P.217-222.

65. Johnson R.D., Jasin M. Sister chromatid gene conversion is a prominent double-strand break repair pathway in mammalian cells.// EMBO J.-2000.-V.19.-P.3398-3407.

66. Joint LWPES/ESPE САН Working Group. Consensus statement on 21 -hydroxylase deficiency from the Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society and the European Society for Paediatric Endocrinology.// J Clin Endocrinol Metab.-2002.-V.87.-P.4048-53.

67. Kassner RJ. A theoretical model for the effects of local nonpolar heme environments on the redox potentials in cytochromes.// J Am Chem Soc.-1973.-T.95.-V.8.-P.2674-2677.

68. Kayes-Wandover K.M., White P.C. Steroidogenic enzyme gene expression in the human heart//J Clin Endocrinol Metab.-2000.-V.85-P.2519-2525.

69. Killeen A.A., Sane K.S., Orr H.T. Molecular and endocrine characterization of a mutation involving a recombination between the steroid 21-hydroxilase functional gene and pseudogene.// J Steroid Biochem Mol Biol.-1991.-V.38.-P.677-686.

70. Kitamura M., Buczko E., Dufau M.L. Dissociation of hydroxylase and lyase activities by site-directed mutagenesis of the rat P45017 alpha.// Mol Endocrinol.-1991.-V.5.-T.10.-P. 1373-1380.

71. Koppens PF, Hoogenboezem T, Degenhart HJ. Duplication of the CYP21A2 gene complicates mutation analysis of steroid 21-hydroxylasedeficiency: characteristics of three unusual haplotypes.// Hum Genet.-2002.-V. 111 .-T.4,5.-P.405-410.

72. Kronbach Т., Larabee T.M., Johnson E.F. Hybrid cytochromes P-450 identify a substrate binding domain in P-450IIC5 and P-450IIC4.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1989.-V.86.-P.8262-8265.

73. Lajic S., Levo A., Nikoshkov A., Lundberg Y., Partanen J., Wedell A. A cluster of missense mutations at Arg356 of human steroid 21-hydroxylase may impair redox partner interaction.// Hum Genet.-1997.-T.99.-V.6.-P.704-709.

74. Lajic S., Nikoshkov A., Hoist M., Wedell A. Effects of missence mutations and deletions on membrane anchoring and enzyme function of human steroid 21-hydroxylase.// Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.257.-P.384-390.

75. Lajic S., Robins Т., Krone N., Schwarz H.P., Wedell A. CYP21 mutations in simple virilizing congenital adrenal hyperplasia.// J Mol Med.-2001.-V.79.-P.581-586.

76. Lajic S., Clauin S., Robins Т., Vexiau P., Blanche H., Bellanne-Chantelot C., Wedell A. Novel mutations in CYP21 detected in individuals with hyperandrogenism.// J Clin Endocrinol Met.-2002.-V.86.-T.6.-P.2824-2829.

77. Lee H.H., Chao H.T., Ng H.T., Choo K.B. Direct molecular diagnosis of CYP21 mutations in congenital adrenal hyperplasia.// J Med Genet.-1996.-V.33.-P.371-375.

78. Lee H.H., Chao H.T., Lee Y.J., Shu S.G., Chao M.C., Kuo J.M., Chung B.C. Identification of four novel mutations in the CYP21 gene in congenital adrenal hyperplasia in the Chinese.// Hum Genet.-1998.

79. V. 103 .-1.3 .-P.3 04-310.

80. Lee H.H., Kuo J.M., Chao H.T., Lee Y.T., Chang J.T., Tsai C.H., Chung B.C. Carrier analysis and prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia caused by 21-hydroxylase deficiency in Chinese.// J Clin Endocrinol Metab.-2000-V.85.-P.597-600.

81. Lee H.H. CYP21 mutations and congenital adrenal hyperplasia.// Clin Genet.-2001 .-V.59.-P.293-3 01.

82. Lee S.-J., Buhler D.R. Functional properties of a rainbow trout CYP3A27 expressed by recombinant baculovirus in insect cells.// Drug Metab Disp.-2002.-V.30.-P. 1406-1412.

83. Levo A., Partanen J. Novel mutations in the human CYP21 gene.// Prenatal Diagn.-2001 .-V.21 .-P.885-889.

84. Lindberg R.L., Negishi M. Alteration of mouse cytochrome P450coh substrate specificity by mutation of a single amino-acid residue.// Nature.-1989.- V.339.-T.6226.-P.632-634.

85. Luo Z., He Y.A., Halpert J.R. Role of residues 363 and 206 in conversion of cytochrome P450 2B1 from a steroid 16-hydroxylase to a 15 alpha-hydroxylase.// Arch Biochem Biophys.-1994.- V.309.-P.52-57.

86. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. A laboratory manual./ Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982.

87. Martinsohn J.T., Sousa A.B., Guethlein L.A., Howard J.C. The gene conversion hypothesis of MHC evolution: a review.// Immunogenetics.1999.-V.50.-P. 168-200.

88. Matthews F.S. The structure, function and evolution of cytochromes.// Prog Biophys Molec Biol.-1985.-V.85.-P. 1-56.

89. Mellon S.H., Miller W.L. Extraadrenal steroid 21-hydroxylation is not mediated by P450c21.// Clin Invest.-1989.-V.84-P.1497-1501.

90. Miller W.L. Molecular biology of steroid hormone synthesis.// Endocr Rev.-1988.-V.9.-P.295-318.

91. Milstone D.S., Shaw S.K., Parker K.L., Szyv M., Seidman J.G. An element regulating adrenal-spesific steroid 21-hydroxylase expression is located within the Sip gene.// J Biol Chem.-1992.-V.267.-P.21924-21927.

92. Miyazawa M., Sugie A., Shimada T. Roles of human CYP2A6and 2B6 and rat CYP2C11 and 2B1 in the 10-hydroxylation of (-)-verberone by liver microsomes.// Drug Metab Disp.-2003.-V.31.-P.l049-1053.

93. Modi S., SutcliffeM.J., Primrose W.U., LianL.Y., Roberts G.C. The catalytic mechanism of cytochrome P450 BM3 involves a 6 A movement of the bound substrate on reduction.// Nat Struct Biol.-1996.-V.3.-T.5.-P.414-417.

94. Monier S., Van Luc P., Kreibich G., Sabatini D.D., Adesnik M. Signals for the incorporation and orientation of cytochrome P450 in the endoplasmic reticulum membrane.// J Cell Biol.-1988.-V.107.-P.457-470.

95. Mornet E., Gibrat J.F. A 3D model of human P450c21: study of the putative effects of steroid 21-hydroxylase gene mutations.// Hum Genet.2000.-V.106.-P.330-339.

96. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P450 proteins.// J Biol Chem.-1988.-V.263.-P.6038-6050.

97. New M.I., White P.C., Pang S., Dupont В., Speiser P.W. The adrenal hyperplasias. In: Scriver Ch.R. et al., eds.: The metabolic basis of inherited disease./ New York-London.-McGraw-Hill.-1989.

98. New M.I. Prenatal treatment of congenital adrenal hyperplasia: the United States experience.// Endocrinol Metab Clin.-2001.-V.30.-P.l-13.

99. Nikoshkov A., Lajic S., Hoist M., Wedell A., Luthman H. Synergistic effect of partially inactivating mutations in steroid 21-hydroxylase deficiency.// J Clin Endocrinol Metab.-1997.-V.82.-P. 194-199.

100. Nunez B.S., Lobato M.N., White P.C., Meseguer A. Functional analysis of four CYP21 mutations from spanish patients with congenital adrenal hyperplasia.//Biochem Biophys Res Commun.-1999.-V.262.-P.635-637.

101. Ohlsson G., Schwartz M. Mutations in the gene encoding 21-hydroxylase detected by solid-phase minisequensing.// Hum Genet.-1997.-V.99.-P.98-102.

102. Ohlsson G., Muller J., Skakkebaek N.E., Schwartz M. Steroid 21-hydroxylase deficiency: mutational spectrum in Denmark, three novel mutations, and in vitro expression analysis.// Hum Mutat.-1999.-V.13.-I.6.-P.482-486.

103. Ohta D., Matsu-ura Y., Sato R. Expression and characterization of a rabbit liver cytochrome P450 belonging to P450IIB subfamily with the aid of the baculovirus expression vector system.// Biochem Biophys Res Commun-1991.- T.l 75.-V.2.-P.394-399.

104. Omura и Sato, The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification, and properties.// J Biol Chem.-1964.-V.39.-P.2379-2385.

105. Oriola J., Plensa I., Machuca I., Pavia C., Rivera-Fillat F. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene.// Clin Chem.-1997.-V.43.-P.557-561.

106. Owerbach D., Crawford Y.M., Draznin M.B. Direct analysis of CYP21B genes in 21-hydroxylase deficiency using polymerase chain reaction amplification.// Mol Endocrinol.-1990.-V.4.-P.125-131.

107. Owerbach D., Sherman L., Ballard A.L., Azziz R. Pro-453 to Ser mutation is associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency.// Mol Endocrinol.-1992.-V.6.-P. 1211-1215.

108. Paine M.J.I., Gilham D., Roberts G.C.K., Wolf R. Functional high level expression of cytochrome P450 CYP2D6 using baculoviral expression systems.// Arch Biochem Biophys.-1996.-V.328.-P.143-150.

109. Pang S., Murphey W., Levine L.S., Spence D., Leon A., La Franchi S., Surve A., New M.I. A pilot newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in Alaska.// J Clin Endocrinol Metab.-1982.-V.55.-P.413-420.

110. Patience C., Wilkinson D.A., Weiss R.A. Our retroviral heritage.// Trends Genet.-1997.-V. 13 .-P. 116-120.

111. Paulsen M.D., Ornstein R.L. Active-site mobility inhibits reductive dehalogenation of 1,1,1-trichloroethane by cytochrome P450cam.// J Comput Aided Mol Des.-1994.-V.8.-T.4.-P.389-404.

112. Peterson J.A., Graham S.E. A close family resemblance: the importance of structure in understanding cytochromes P450.// Structure.-1998.-V.6.1. P.l 079-1085.

113. Poulos T.L., Finzel B.C., Gunsalus I.C., Wagner G.C., Kraut J. The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450.// J Biol Chem.-1985.-T.260.-V.30.-P.16122-16130.

114. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam.// J Mol Biol.-1987.-V.195.-P.687-700.

115. Ravichandran K.G., Boddupalli S.S., Hasemann C.A., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure of hemoprotein domain of P450bm-3, a prototype for microsomal P450s.// Science.-1993.-V.261.-P.731-736.

116. Rice D.A., Kronenberg M.S., Mouw A. R., Aitken L.D., Franklin A., Schimmer B.P., Parker K.L. Multiple regulatory elements determine adrenocortical expression of steroid 21-hydroxylase.// J Biol Chem.-1990.-V.265.-P.8052-8058.

117. Rodrigues N.R., Dunham I., Yu C.Y., Carrot M.C., Porter R.R., Campbell R.D. Molecular characterization of the HLA-linked steroid 21-hydroxylase В gene from an individual with congenital adrenal hyperplasia.// EMBO J.-1987.-V.6.-P. 1653-1661.

118. Rogoff D., Gomez-Sanchez C.E., Foecking M.F., Wortsman J., Slominski A. Steroidogenesis in the human skin: 21-hydroxilation in cultured keratinocytes.// J Steroid Biochem Mol Biol.-2001.- V.78.-P.77-81.

119. Rowen L., Dankers C., Baskin D., Faust J., Loretz C., Ahearn M.E., Banta A., Schwartzell S., Smith T.M., Spies Т., Hood L. Sequence determination of 300 kilobases of the human class III MHC locus.// EMBL/GenBank/DDBJ accession number AFO19413.-1999.

120. Sakaguchi M., Mihara K., Sato R. A short amino-terminal segment of microsomal cytochrome P450 functions both as insertion signal and as a stop-transfer sequence.// EMBO J.-1987.-V.6.-P.2425-2431.

121. Schneider P.M., Witzel-Schlomp K., Rittner C., Zhang L. The endogenous retroviral insertion in the human complement C4 gene modulates the expression of homologous genes by antisense inhibition.// Immunogenetics.-2001 .-V.53 .-V. 1 -9.

122. Schoch G.A., Yano J.K., Wester M.R., Griffin K.J., Stout C.D., Johnson E.F. Structure of human microsomal cytochrome P450 2C8. Evidence for a peripheral fatty acid binding site.// J Biol Chem.-2004.-T.279.-V.10.-P.9497-9503.

123. Scott E.E., He Y.A., Wester M.R., White M.A., Chin C.C, Halpert J.R., Johnson E.F., Stout C.D. An open conformation of mammalian cytochrome P450 2B4 at 1.6-A resolution.// Proc Natl Acad Sci U S A.-2003 .-Т. 100.-V.23 .-P. 13196-13 201.

124. Sevrioukova I.F., Li H., Zhang H., Peterson J.A., Poulos T.L. Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1999.-V.96.-P.1863-1868.

125. Sigle R., Titus M., Harada N., Nelson S. Baculovirus mediated high level expression of human placental aromatase (CYP19A1).// Biochem Biophys Res Commun.-1994.-V.201.-P.694-700.

126. Sinnott P.J., Dyer P.A., Price D.A., Harris R., Strachan T. 21-hydroxylase deficiency families with HLA identical affected and unaffected sibs.// J Med Genet.-1989.-V.26.-P. 10-17.

127. Sinnott P.J., Collier S., Costigan C., Dyer P.A., Harris R., Strachan T. Genesis by meiotic unequal crossover of a de novo deletion that contributes to steroid 21-hydroxylase deficiency.// Proc Natl Acad Sci USA.-1990.-V.87.-P.2107-2111.

128. Szklarz G.D., He Y.A., Halpert J.R. Site-directed mutagenesis as a tool for molecular modeling of cytochrome P450 2B1.// Biochemistry.-1995.-V.34-P.14312-14322.

129. Slominski A., Ermak G., Mihm M. ACTG receptor, CYP11A1, CYP 17 and CYP21A2 genes are expressed in skin.// J Clin Endocrin Metab.-1996.-P.2746-2749.

130. Speiser P.W., Agdere L., Ueshiba H., White P.C., New M.I. Aldosterone synthesis in salt-wasting congenital adrenal hyperplasia with complete absence of adrenal 21-hydroxylase.//New Engl J Med.-1991.-V.324.-P.145-149.

131. Stayton P.S., Sligar S.G. The cytochrome P-450cam binding surface as defined by site-directed mutagenesis and electrostatic modeling.// Biochemistry.-1990.-V.29.-T.32.-P.73 81-73 86.

132. Szczesna-Skorupa E., Browne N., Mead D., Kemper B. Positive charges at the NH2 terminus convert the membrane-anchor signal peptide of cytochrome P450 to a secretory signal peptide.// Proc Natl Acad Sci U S A.-1988.-V.85.-P.738-742.

133. Thompson C.M., Kawashima H, Strobel H.W. Isolation of partially purified P450 2D18 and characterization of activity toward the tricyclic antidepressants imipramine and desipramine.// Arch Biochem Biophys.-1998.-T.359.-V.1.-P.115-121.

134. Tusie-Luna M.T., Traktman P., White P.C. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus.// J Biol Chem.-1990.-V.265.-P.20916-20922.

135. Tusie-Luna M.T., Speiser P.W., Dumic M., New M.I., White P.C. A mutation (Pro-30 to Leu) in CYP21 represents a potential nonclassic131steroid 21-hydroxylase deficiency allele.// Mol Endocrinol.-1991.-V.5.-P.685-692.

136. Tusie-Luna M.T., White P.C. Gene conversions and unequal crossovers between CYP21 (steroid 21-hydroxylase gene) and CYP21P involve different mechanisms.// Proc Natl Acad Sci USA.-1995.-V.92.-P. 1079610800.

137. Vriend G. WHAT IF: a molecular modeling and drug design program.// J Mol Graph.-1990.-V.8.-P.52-56,29.

138. Wada A., Waterman M.R. Identification by site-directed mutagenesis of two lysine residues in cholesterol side chain cleavage cytochrome P450 that are essential for adrenodoxin binding.// J Biol Chem.-1992.- V.267.-P.22877-22882.

139. Wang M., Roberts D.L., Paschke R., Shea T.M., Masters B.S., Kim J.J.P. Three-dimentional structure of NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase: prototype for FMN- and FAD-containing enzymes.// Proc Natl Acad Sci USA.-1997.-V.94.-P.8411-8416.

140. Wang S.-L., He X.-Y., Hong J.-Y. Human cytochrome P450 2S1: lack of activity in the metabolic activation of several cigarette smoke carcinogens and in the metabolism of nicotine.// Drug Methab Dispos.-2005.-V.33.-P.336-340.

141. Wedell A., Ritzen E.M., Haglund-Stengler В., Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: three additional mutated alleles and establishment of phenotype-genotype relationships of common mutations.// Proc Natl Acad Sci USA.-1992.-V.89.-P.7232-7236.

142. Wedell A., Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: two additional mutations in salt-wasting disease and rapid screening of disease-causing mutations.// Hum Mol Gen.l993.-V.2.-P.499-504.

143. White P.C., New M.I., Dupont B. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes.// Proc Natl Acad Sci USA.-1986.-V.83.-P.5111-5115.

144. White P.C., Dupont J., New M.I., Leiberman E., Hochberg Z., Rosier A. A mutation in CYP11B1 (Arg-448-His) associated with steroid 1 lb-hydroxylase deficiency in Jews of Moroccan oridgin.// J Clin Invest.-1991.-V.87.-1664-1667.

145. White P.C., New,M.I. Genetic basis of endocrine disease 2: congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.// J Clin Endocrinol Metab.-1992.-T.74.-V. 1 .-P. 6-11.

146. White P.C., Speiser P.W. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.// Endocr Rev.-2000.-V.21.-P.245-291.133

147. Wijesuriya S.Q., Zhang G., Dardis A., Miller WL. Transcriptional regulatory elements of the human gene for cytochrome P450c21 (steroid 21-hydroxylase) lie within intron 35 of the linked C4B gene// J Biol Chem.-1999.-V.274.-P.38097-38106.

148. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E.F., McRee D.E. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structure adaptations for membrane binding and functional diversity.// Molecular Cell.-2000.-V.5.-P.121-131.

149. Williams P.A., Cosme J., Ward A., Angove H.C., Vinkovic D.M., Jhoti H. Crystal structure of human cytochrome P450 2C9 with bound warfarin.// Nature.-2003.-V.424.-P.464-468.

150. Williams PA, Cosme J., Vinkovic D.M., Ward A., Angove H.C., Day P.J., Vonrhein C., Tickle I.J., Jhoti H. Crystal structures of human cytochrome P450 3A4 bound to metyrapone and progesterone.// Science.-2004.-V.305.-P.683-686.

151. Wilson Т.Е., Mouw A.R., Weaver C.A., Milbrandt J., Parker K.L. The orphan nuclear receptor NGFI-B regulates expression of the gene encoding steroid 21-hydroxylase.// Mol Cell Biol.-1993.-V.13.-P.861-868.

152. Wilson R.C., Mercado A.B., Cheng K.S., new M.I. Steroid 21-hydroxylase deficiency: genotype may not predict phenotype.// J Clin Endocrinol Metab.-1995.-V.80.-P.2322-2329.

153. Wu D.-A., Chung B. Mutations of P450c21 at Cys428, Val281, and Ser268 result in complete, partial, or no loss of enzymatic activity, respectively.//J Clin Invest.-1991.-V.88.-P.519-523.

154. Yano J.K., Wester M.R., Schoch G.A., Griffin K.J., Stout C.D., Johnson E.F. The structure of human microsomal cytochrome P450 3A4 determined by X-ray crystallography to 2.05-A resolution.// J Biol Chem.-2004.-T.279.-V.37.-P.38091-38094.

155. Yasui H., Hayashi S., Sakurai H. Possible involvement of singlet oxygen species as multiple oxidants in p450 catalytic reactions.// Drug Metab Pharmacokinet.-2005 .-V.20.-P. 1-13.

156. Yoshikawa K., Noguti Т., Tsutjimura M., Koga H., Yasukochi Т., Horiuchi Т., Go M. Hydrogen bond network of cytochrome P-450cam: a network connecting the heme group with helix К.// Biochim Biophys Acta.-1992.-V.l 122.-P.41-44.

157. Zhou Z., Agarwal V.R., Dixit N., White P.C., Speiser P.W. Steroid 21-hydroxylase expression and activity in human lymphocytes.// Mol Cell Endocrinol.-1997.-V. 127.-P. 11 -18.

158. БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую благодарность и признательность

159. Светлане Николаевне Белжеларской за чуткое руководство и терпение, за полученные знания, поддержку и помощь при проведении исследования и при написании диссертации;

160. Петру Михайловичу Рубцову за участие, помощь и советы в экспериментальной работе, обсуждении результатов, за прочтение рукописи и замечания;

161. Сотрудникам Эндокринологического научного центра А.Н. Тюльпакову, Т.В. Семичевой, В.А. Петерковой за предоставление необходимых клинических сведений;

162. Людям, чьи данные были использованы в работе;

163. Всем сотрудникам Лаборатории молеулярной эндокринологии ИМБ РАН за ежедневный совместный труд, участие и профессиональные советы.

Информация о работе

Грищук, Юлия Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Функциональный анализ мутаций в гене стероид 21-гидроксилазы человека у больных с адреногенитальным синдромом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы