Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ недостаточности 21-гидроксилазы при врождённой гиперплазии коры надпочечников

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ недостаточности 21-гидроксилазы при врождённой гиперплазии коры надпочечников"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Осииовская Наталья Сергеевна

Молекулярно-генетический анализ недостаточности 21- гидроксилазы при врождённой гиперплазии коры надпочечников.

Специальность: 03 00Л 5 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт- Петербург -2007-

003066255

Работа выполнена в Лаборашрии пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им Д О Отта РАМН

Научные руководители доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Татьяна Эдуардовна Иващенко

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Виктория Николаевна Горбунова

доктор биологических наук профессор Поляков Александр Владимирович

Ведущее учреждение НИИ молекулярной медицины ММА им И.М.

Сеченова

Защита состоится У/

2007 г в 'V часов на заседании Диссертационного

совета Д 212 232 12 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном университете по адресу 199034 Санкт-Петербург Университетская наб 7/9 СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и сетекции, аудитория 1

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан

/^ 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л А Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Одной из актуальных проблем молекулярной генетики человека является создание национального банка данных о характере мутационных повреждений определённых генетических детерминант при наиболее распространённых наследственных патологиях

Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) — распространённое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное в 95% случаев дефицитом фермента 21-шдроксилаза. В Европейской популяции частота встречаемости ВГКН достаточно высока и составляет 1 2,5 000-10000 новорожденных (Fitness J. 1999)

Недостаточность 21-гидроксилазы характеризуется выраженным генетическим и клиническим полиморфизмом Наиболее тяжёлые клинические проявления наблюдаются у детей с сольтеряющей формой (СТФ) заболевания Дети рождаются с выраженными расстройствами обмена веществ, вызванными нарушениями синтеза глюкокоргакоидов и минералкортикоидов в коре надпочечников У девочек, кроме того, имеется нарушение формирования наружных половых органов При отсутствии своевременного и правильного лечения дети погибают на первых неделях жизни от надпочечниковой недостаточности В связи с нерешенностью проблем ранней диагностики недостаточности 21-гидроксилазы большое медицинское и социальное значение имеет профилактика заболевания, ставшая возможной только с появлением молекулярно-генетических методов Необходимость знания молекулярной природы мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы при данном заболевании связана с тем, что биохимический метод диагностики (определение уровня 17-ОН прогестерона) не всегда точно отражает клиническую картину заболевания, и применение его в пренатадьной диагностике недостаточности 21-гидроксилазы может привести к ошибочному диагнозу

В настоящее время известно более 100 мутаций в гене CYP21A2, кодирующем белок 21-гидроксилазу Проводившиеся последние годы во всем мире исследования локуса 6р21 3. в котором картирован ген CYP21A2, выявили гетерогенность недостаточности 21-гидроксилазы на молекулярном уровне и определили целый спектр ВГКН-обуславливающих мутаций После открытия неравновесия по сцеплению между ВГКН и HLA-локусом, внутри которого картирован ген CYP2IA2 появилась возможность использовать HLA-типироваяие для пренаталыюй диагностики данного заболевания

Для каждой отдельной популяции существует свой специфический спектр мутаций, знание когорого, а так же знание особенностей полиморфизма генов входящих в HLA-локус, таких как HLA-DQA1 и MICA являются необходимыми для проведения мероприятий по медико-генетическому консультированию пациентов и планированию семьи, а также для проведения скрининговых программ с целью выявления гетерозиготных носителей мутаций в гене CYP21A2 Цель и задачи исследования.

Разработать алгоритм молекулярной диагностики недостаточности 21-пздроксилазы на основе анализа гена CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQAI и MICA В соответсгвии с целью исследования были поставлены следующие задачи.

1 Проанализировать частоты мутаций в гене CYP21A2 у больных с недостаточностью 21-гидроксилазы при различных клинических формах заболевания

2. Проанализировать полиморфизм генов HLA-DQA/ и MICA в группах больных с сольтеряющей, простой вирильной (ПФ) и неклассической формами (НФ) заболевания

3 Проанализировать неравновесие по сцеплению между мутациями гена CYP2IA2 и аллелями гено» HLA-DQA 1 и MICA

4 Определить значимость полиморфизмов генов HLA-DQA! и MICA для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы

5 Разработать на основе полученных данных оптимальную схему молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы

Научная новизна работы. В резульгате проведённого исследования впервые определен спектр мутационных повреждений гена CYP21A2 у больных с недостаточностью 21-

гидроксилазы Северо-западного региона России Разработан метод идентификации мутации P453S на основе рестрикционного анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции Rsal Описан новый «химерный» ген, включающий в себя 5' -участок гена CYP21A2 и 3' -участок псевдогена CYP21A1P (тип 2) и разработана методика его выявления Выявлена ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа 1 и типа 2 У больных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы выявлены «химерные» конструкции ген/псевдоген (тип 2) Проведен анализ частот аллелей и генотипов по гену MICA у больных с различными формами недостаточности 21-гидроксилазы Определена информативность GCT-повторов гена MICA для молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы Выявлено неравновесие по сцеплению между мутациями в гене CYP21A2 и аллелями гена MICA Выявлены достоверные отличия в распределении генотипов по гену MICA между группой больных с НФ недостаточности 21-гидроксилазы и популяционной выборкой и между группой больных с ПФ и популяционной выборкой Впервые проведена оценка информативности семей с высоким риском рождения ребенка с недостаточностью 21-гидроксилазы основанная на комплексном исследовании мутаций в гене CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA Разработан алгоритм молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы Практическая значимость

В результате исследования спектра мутаций в гене CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA разработана оптимальная схема молекулярного обследования семей, попадающих в группу риска по рождению ребенка с ВГКН Определен тип мутационных повреждений и проведена пренатальная диагностика недостаточности 21 -гидроксилазы в 35 семьях, имеющих детей с ВГКН Полученные результаты явились материалом для подготовки методических рекомендаций по пренатальной диагностике ВГКН Основные положения, выносимые на защиту

1 Показано что для каждой клинической формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой специфический спектр мутаций в гене CYP21A2

2 Показано что клиническое проявление недостаточности 21-гидроксилазы зависит от «тяжести» молекулярного дефекта в гене CYP21A2 Так, при «тяжелых» мутациях соответствие фенотипа генотипу равно 94%, при «легких» - 100% и в группах с мутациями «средней тяжести» - 87,5%

3 Описана новая «химерная» конструкция (тип 2), состоящая из последовательности гена и псевдогена Выявлена ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа 1 и типа 2 У бопъных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы «химерные» конструкции ген/псевдоген (тип 2) выявлены с частотой в 2,5 большей, чем в популяционной выборке

4 Выявлены достоверные отличия в распределении частот аллелей гена HLA-DQA1 между группой больных с СТФ недостаточности 21-гидроксилазы и популяционной выборкой

5 Выявлены статистически значимые различия между группой больных с СТФ и популяционной выборкой по частотам аллелей гена MICA

6. Показано, что-комплексный анализ полиморфизмов в генах HLA-DQA1 и MICA позволяет повысить информативность-семей для лренатаяьной диагностики до 98% Апробация работы. Результаты работы представлены на 9-м международном семинаре по клинической г.ене.тике (Кипр, 1998), на Международной конференции по реабилитации детей-ияваяидов с редкими генетическими заболеваниями ''Врачи мира-пациентам" (С -Пб,

1998), на Конференции по прогрессу в профилактике наследственных болезней (Прага,

1999), на Европейском конгрессе .по тенатике человека (Вена, 2001), на 4-м Всероссийском конгрессе эндокринологов (С -Пб, 2001), на конференции «Врачи мира пациентам» (С-Пб , 2003), на Европейском конгрессе по генетике человека (Мюнхен, 2004) и (Прага, 2005), на конф «Современное состояние и новые подходы в дородовой профилактике наследственных болезней и врожденных пороков развития» (С -Пб, 2005), на конф «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2006), на конф

«Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний возможности и перспективы» (Москва,2006), на конф «Молекулярная медицина и биобезопасность» ( Москва, 2006)

Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней ГУ НИИАГ им Д О Отта

Публикации По материалам диссертации опубликовано 16 работ

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описание результатов и их обсуждения выводов и списка цитируемой литературы, включающего 146 ссылок Диссертация иллюстрирована 20 Таблицами и 15 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови и пятен крови на фильтровальной бумаге

Проведено исследование 143 пациентов с недостаточностью 21-гидроксилазы, проходящих лечение в СПбГПМА (С Петербург) и в отделении эндокринологии НИИАГ им Д О Отта (С Петербург) и 21 пациента с «идиопатической» андрогенизацией, проходящих лечение в отделении эндокринологии НИИАГ им Д О Отта (С Петербург) В исследуемую группу с недостаточностью 21-гидроксилазы вошли 47 больных с СТФ, 25 больных с ПФ и 71 больная с подозрением на НФ Выделение соответствующих клинико-патогенетических вариантов недостаточности 21-гидроксилазы и «идиопатической» андрогенизашгаи (гирсутизм, угревая сыпь себорея) проводились специалистами перечисленных выше центров на основании клинической картины заболевания и данных лабораторного обсчедования Из группы пациентов с подозрением на НФ выделена подгруппа, в которую вошли 26 ботьных с положительным результатом по тесту на пробу с АКТГ и соответствующей клинической картиной НФ ВГКН

В качестве контрочьной группы использовали популяционную выборку, которую составили 100 здоровых доноров проживающих на территории Северо-западного региона России

Выделение ДНК из ядер лимфоцитов проводилось в соответствии с методикой, привденной в руководстве Самбрук и др (Sambrook et al, 1989) Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме при помощи протраммируемого термоциклера МС-2 с использованием термофильной полимеразы и специфических олигопраймеров

Амплификацию необходимых фрагментов гена CYP21A2 и псевдогена CYP21A1P проводили в два этапа (Lee et al, 1996, Bobba et al, 1997) Чтобы идентифицировать мутацию delA2 (делеция гена) использовали олигопраймеры для амплификации фрагмента, включающего участки 2-го интрона- 3-го экзона как гена, так и псевдогена (Evgrafov et al, 1995) После окрашивания полиакриламидного геля сравнивалась интенсивность свечения при УФ обоих фрагментов, соответствующих послдовательностям гена и псевдогена

В данной работе метод ПЦР использовали в сочетании с методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) Большинство полиморфизмов и мутаций являлись однонуклеотидными заменами, которые определялись по наличию или отсутствию сайта рестрикции для специфичной эндонуклеазы (Табл 1)

Определение аллелей гена HLA-DQA1 (HLAII класс) и гена MICA (HLAI класс) проводили с помощью ПЦР с последующим ферментативным гидролизом (для гена HLA-DQA1) Данная система позволяет выделить аллели и группы аллелей в локусе HLA-DQA1 *0102 ичи *0Ю1, *0103, *0201или*0б01, *0301, *0401 или *0501, в локусе MICA A4, А5~ А5 1, А6, А9 (Lee et al, 2000)

В процессе работы была разработана новая методика для идентификации мутации P453S в экзоне 10 гена CYP21A2 Для удобного тестирования мутации P453S создан новый модифицированный праймер 10R (в последовательность праймера 10R введена одна точечная замена), с помощью которого создается искусственный сайт рестрикции для эндонуклеазы Rsa I GT4-AC (CAÎTG)

Для определения алчелей гена MICA использован гетеродуплексный анализ Продукты амплификации и ферментативного гидролиза разделяли в 5-7,5% неденатурируюшем полиакриламидном геле (ПААГ) Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК регистрировали в проходящем ультрафиолетовом свете

Таблица 1 Детекция мутаций в гене CYP21A2

Мутация Экзон/ интрон Наличие сайта рестрикции Эндонуклеаза рестрикции

Норма Мутация

P30L 1 экзон - 195п о 4- 166+29 Pstl

I2sphce 2 интрон - 114п о + 85+29 SacI

Del8bp 3 экзон - ЮВп о + 81+27 Rsal

I172N 4 экзон - 168п о + 139+29 Tru9I

V236E 6 экзон - 143п о + 115+28 Tagl

V281L 7 экзон + 111+110 - 211по ApaLI

Q318X 8 экзон + 146+50 - 196п о Pstl

R356W 8 экзон - 196п о + 164+32 Mscl

P453S 10 экзон - 290по ! - 270-1-20 Rsal

Для определения значимости различий частот алчелей и генотипов использовали точный двусторонний критерий Фишера для парных сравнений по стандартной формуле, критерий X2 по стандартной форм\че с учетом поправки Йетса дня парных сравнений (Гланц, 1999, Реброва, 2003) пакеты программ STATISTIC А 5 5 (США)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для определения спектра мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы у больных с нед on атомностью 21-гидроксилазы бычи проанализированы частоты мутаций, наиболее распространенных у пациентов Европейских популяций и проведена оценка перспективности испотьзования их анализа для молекулярной диагностики заболевания Были опредечены частоты встречаемости 12 мутаций (P30L, i2splice, del8bp, I172N I235N, V237E, М239К V281L Q318X R356W, P453S deIA2), являющихся диагностически значимыми для популяции Европы

Проведенный нзми аначиз мутаций в гене CYP21A2 позволил определить молекулярный дефект, приводящий к развитию недостаточности 21-гидроксилазы в 84% мутантных хромосом при СТФ и в 70% мутантных хромосом при ПФ заболевания (Рис 1) Распределение мутаций в гене CYP21A2 статистически значимо отличается в двух группах пациентов с классическими формами заболевания (р=0,0001, х2=31.46, df 8) Сравнительный анализ выявил достоверные различия в частотах таких мутаций, как delA2 и I172N В группе с сольтеряющей формой деления гена встречается с частотой статистически достоверно более высокой, чем у больных с простой формой недостаточности 21-гидроксилазы (48% и 14% соответственно р=0,0001), тогда как мутация в экзоне 4 более характерна для пациентов с ПФ ВГКН (18%), чем для больных с СТФ недостаточности 21-гидроксилазы (1%)(р=0,0001) Данные мутации распространены у больных из других популяций с разчичной частотой Так, делеция гена у больных с классическими формами ВГКН встречается с частотой от 7% в аргентинской популяции до 31% в Австрии и 36% - в Дании В Англии зарегистрирована ее наибольшая частота - 45% (Ezquietta et al, 1995, Ohlsson et al, 1999, Krone et al, 2000, Baumgartoer-Parzer et al, 2001) Мутация I172N в экзоне 4 имеет меньшую долю от общего числа мутантных хромосом по сравнению с делецией гена от 2% -в Испании до 29% - в Финляндии и 28% - в Китае Другая распространенная мутация при классических формах недостаточности 21-гидроксилазы - мутация сплайсинга в интроне 2 гена CYP21A2 По нашим данным как у больных с СТФ, так и у больных с ПФ мутация встречается практически с одинаковой частотой (24% и 28% соответственно) Частота встречаемости i2splice широко варьирует от 12% в Финляндии до 23% в Австрии, 34% - в Дании и 15,8-60% в популяциях Латинской

Америки. Любопытно, т частота делении гена СУР21А2 снижена в южных популяциях и возрастает в северных Смлаисинговая же мутация в нитроне 2 имеет обратную текдеишю: её минимальная частота зарегистрирована в Финляндия (12%). а максимальная -в южной Италии (56%), Вероятно, распространение этих мутаций шло в противоположных дру! Другу направлениях

АсШ 48%

Ненденгифи цнрованные мушш 30%

Конверсии

15

M72N 18%

12splice 24%

Ненлгнтифн ИнроЕ&кные

МуТаШП lfi%

de!A2

14%

Î2sp1icc

28%

Конверсии 3% R356W 1 Q3I SX 6%

Put. 1. Спектр нутации при СТФ н ПФ педастар)чнсети 21-гидрокеллазы.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том. что ДЛЯ сольтеряющей и для Простой внрилглюп фк'^.гы недостаточности 21-гидроксилазы караьчерен свой спектр дна«ностически значимы \ мутаций. Согласно полученным данным при сольтеряющей форме недостаточности 21-гидрОкеилазы наиболее частыми мутациями являются деления гена и .путаним сплайсинга во втором ннгронс. Тогда как при простой вирильной форме ведущими являются мутация сплайсинга и мутация в интронс 4 - [172N. Деления гена но своей распространенности у Больных с ПФ занимает третье место. В целом, при СТФ и ПФ заболевании диагностически значимыми являются четыре из двенадцати мутаций. Это -деления гена, мутация сплайсинга в интроне 2, мутация в зкзопе 4 - I172N и мутация Qjl8Х в эк ю не 8.

97% НЕТ 76%

Без АКТ Г С АКТГ

PiK'.2. Час юты мут :ц<лй в геие CYP21A2 у больных с подозрением на НФ недостаточности 21-гид рО к сил азы

Нами проанализированы частоты встречаемости 12 мутаций (P3QL., i2spliee. de 1Sbр. I172N. I235K. V237E. M23УК. V2S1L, 031 SX. R356W. P453S, delA2) y пациентов с подозрением на неклассическую форму тоолсванпя Данные пациенты были подразделены на две группы, У

бэкзон 4%

V2S1L 6%

delA2

щ

1172N

2%

s

пациентов первой группы пробу с АКТГ не проводили. Во вторую вошли те больные, \ кого после геста на проб} с АКТГ уровень 17-гидроксиирагестерэна превысил значение 25 ямольй» Из полученных данных следует, что частота мутаций у больных с подозрением на НФ Недостаточности 21-чидроксилазы без пробы с АКТГ очень низкая И составляет только 3% от всех мутактнш хромосом. Она повышается до 24% при исследовании ДНК пациентов с положительным тестом на пробу с АКТГ (Рис .2'). Можно предположить, что низкая частота выявленных мутаций у пациентов с подозрением на НФ недостаточности 21-гвдрюKW.naatí 'связана с^ сложностями клинической диагностики данной формы заболевания (схожесть клинической картины при дефектах других ферментов, участвующих в биосинтезе глюкокортикоидои н Ыикерапкортикоидов), либо с наличием в российской популяции других, пока неизвестных мажорных мутаций, характерных для НФ при дефиците 21-гидроксилазы.

При анализе образцов ДНК пациенток с подозрением на НФ недостаточности 21-гидроксилазы нами были идентифицированы «химерные» конструкции двух типов .

Конструкция первого типа (псевдоген-ген 1-го типа) образуется в результате крупной делеции размером 30 ' .т.о.. которая захватывает 3'- участок псевдогена CYP21A1P и 5'-участок гена CYP21A2. дрп этом возникает «химерный» ген, состояний из 5'-участка псевдогена и 3'-> 'laciiiíi ела с точкой разрыва после 3-го экзона (Lee et al.. 2000). Памп выявлена ((химерная» конструкция 2-го типа, не описанная ранее в литературе, которая включает 5'- последовагельностъ гена CYP2IA2 и 3'- последовательность псевдогена CrPZlAjPtpwg).

А - «химерный» ген 1- го типа

В - «химерный» ген 2-го типа

SSSíXSS Поалело ил тельность псевдогена ШШ^Ш [ [ос.тедоьатедыюсть тени

Рпс.З. Типы выявляемых генных конструкции в локуее 6р21.3

Для идентификации «химерных» конструкций нами предложен метод с использованием различных сочетаний ген специфичных и гтеевдоген о специфичных праймеров (рис.4). При выявлении «химерной» конструкции типа ! в 1-й ПЦР-реакшш использовали один праймер гомологичный 5'-участку псевлогена СУР21А1Р и другой праймер З'-участку гена СУР21А2. Для анализа «.химерной» конструкции типа 2 в 1-й реакции были использованы праймеры гомологичные 5'-участку гена СУР2/А2 и 3"- участку псевдогена СУР21А!Р.

ПНР-реакция проходила только при наличии определенной «химерной» конструкции, тогда как при отсутствии ((химерных» конструкций ПЦР реакция не проходила, поскольку расстояние межд; используемыми и реакции прайм ерами составляет более 30т, и.о..

Нормальный ген

•• ■».. «Химерный») ген 1-го

«Химернь:к» Г«« 2-го

псевдпгенс пен ценный ] свдпецнфиччый п дай мер

^ - Констр> кипя, ожидаемая при данном есчгг.шии прайм еров

..........................^ Констр(укцШ невозможная при дашюм сочетании праймерои

Рис.4 Схема появлении "■.шмеряих" конструкций к локусе Ьр2] .3

Так Как при кашчна «химсрн&фзя гена размер амплнфипщювшшого фрагмента составляет более 3 тысяч нар оснований, для визуализации результатов проводили второй раунд ПЦР с аес!1ецйфичньща одигаиуклеотндными праймерами. расположенными в экзоне 8 (Рйе.5),

«е—— — — Рис,5 Лмилнфвкяция>чистка жзона

8 о исспеШфиищаш прайм срамя (2-й 12) 123 1 з л раунд ПЦР):

1-3 дорожки: ГЕН (1-пробанд, 2-мать, 3-отец)

■ , "" ' ■■ . м ^ ** им м* — лсрмвки: «химерный» тек тана !

.■-.■■ ■ % ■ " (1-пробанд,2-мать, 3-отец)

■-га:, "■ ■■> ■ ; - - - -

15-17 дорожки; «химерный» ген типа 2 (]-пробанд, 2-мать, 3-отец)

Существование «хичернкх» генав 2-го типа было подтверждено метолом ПДРФ анализа З'-участка выявленной конструкции. Чтобы проанализировать3'—участок «химерного» гена мы разработали схему рестрикции данной последовательности «химерной» конструкции двумя ферментами: 5та 1 и А1и1.

В первом опыте после 1-го раунда ПЦР с ген специфичными И цсевдоШЯоспсцифичными □рай мерами был пропелен 2-й раунд, при котором использовали прайм еры на 10 экзон. Полученный После амплификации фрагмен1 длиной 163 п.о, подвергался гидролизу эидонуклензой 5та 1 (С С С/ООО), Нели анализируемая последовательность соответствует последовательности гена, после рестрикции визуализируются фрагменты 100 п.о. и 63 п.о. Если анализируемая последовательность соответствует последовательности псевдогена, после рестрикции идентифицируются фрагменты 100 и.о., 41 п.о. и 22 п.о. (рис.6). Согласно результатам анализа «химерная» конструкция содержит последовательность псевдогена.

'Viw - '

f' ■'! ' •if-'-W ■

! 2 3 4

1'nc.fi Анализ последовательности гсня и псевлогени с помощью эпдонуклеаз рестрикции Snml и Alul,

1 Оорожка - рестрикция Smal ампдифицировяшю га фрагмента экзона 10 (после первого раунда ПЦР с гене лени фичными ирай мерами} нормальный ген

2 дорожка - рестрикция Smal амп лиф и цированного фрагмента экзона 10 (после первого раунда ПЦР с прямым ген специфичным и обратным псевдогенспецифичным нргймерамн) - «химерный» i ch типа 2

3 борожка - рестрикция Alul ам п л я фи ци рова н н ого фрагмента 3'-декодируемой части гена (после первого раунда ПЦР с гсяспецифичными прайм с рами) -нормальный ген

-¡оорожка— маркер A/Psll

Во втором опыте после 1-го раунда ПЦР был проведен 2-й раунд, при котором использовали следующие прйЙмеры прямой праймер, соответствующий праймеру ИЗ первого опыта и обратный. соответствующий праймеру из первого раунда ПЦР (псеьдогенспецпфичпый), Полученный после амплификации фрагмент длиной 600 п.о. подвергался гидролиз} фермента Alul (AG/CT), Если анализируемая последовательность соответствует последовательности гена, после рестрикции визуализируются следующие фрагменты 384 п.о.. 83 п.о,. 52 и.о.. 42 п.о. и 3] п.о. Если анализируемая последовательность соответствует последовательности псевдогена, после рестрикции идентифицируются фрагменты 384 п.о.. 114 п.о., 52 п.о. и 42 п.о. (рис.7). Согласно результатам анализа «химерная"!) конструкция и данной области содержит последовательность псевдогеиа.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том. что «химерный», ген типа 2 включает послед ователыюсь гена и последовательность ттсе в логе на. От про моторного участка до колола 318 включительно идентифицирована последовательность гена, тогда как в области кодонов 490-491 и далее ■■ последовательность псевлогена. Результаты ПДРФ-аналнза подтверждены результатами с с квитирования.

Рис.7, Анализ кос ледов атсльн о сти гена и ticcBjoi сня с помощью эвдонуклеазы рестрикций Alul.

1 дорожка - рестрикция Alul амплифиц про ванного фрагмента 3'»Декодируемой части гена (после первого раунда ПЦР с ген специфичны ми лраймерами) -нормальный геи 2. 4, 6 дорожки - рестрикция Alul амплифниироваиного фрагмента 3 '-декодируемой части гена {после первого раунда ПЦР с прямым ге к специфичным и обратным

псевдогенспецифнчным праймерами) «химерный» ген типа 2 7 дорожка - маркер У Pst 1

384 п.о-

52 и.о. 41 п.о.

tr

I 2

Среди проанализированных 52 мутантных хромосом у больных с НФ недостаточности 21-гидроксилазы «химерные» гены обоих типов были найдены В 25% (13 из 52) хромосом, тогда как в популяционной выборке данные конструкции встречаются с частотой 7% (7 нз 94)

(рЮ.ООЗ) [Табл.2),

Таблица 2 Част оты «химерных» генов в локусе 6р21.3 у больных с НФ недостаточности 21-гидрокеилазы, у женщин с «идиопатической» андрогенизацией и в популяционной выборке.

Мутации в гене СУР21А2 «Идиопатическая» андрогенизация Неклассическая форма Популяционная выборка

п % п % п %

Химерный ген 1 -го типа 4 9,5 (р=0,015) 5 9,5 <Р=0,01) 1 1

Химерный геи 2-го типа 12 28,5 (р=0,0003) 8 15,4 6 6

Всего 42 100 52 100 94 100

п - число хромосом

Сравнительный анализ частот «химерных» генов в локусе 6р21 3 между группой больных с НФ и поп> тяционной выборкой выявил статистически значимые различия между изученными группами ( X2 = 9,982 Р = 0 0068, с1£2)

Кроме «химерных» генных конструкций 1-го типа (5'- участок соответствует псевдогену, 3'- участок - гену) были выявлены «химерные» генные конструкции 2-го типа (5'- участок соответствует гелу, а 3 - участок - псевдогену) Частота конструкций 1-го типа в данной группе составит 9,5% (5 из 52), тогда как в популяции только 1% (р=0,01, = 2) Конструкции 2-го типа бьии идентифицированы в 15,4% (8 из 52) мутантных хромосом у пациентов с НФ и в попу тяции в 6% (6 из 94) хромосом (р=0,07, с1£ = 2)

«Химерные» 1ены типа 1 по результатам действия на уровне белкового продукта равнозначны дс ¡едии юна Ести учесть иастоту идентифицированных мутаций в группе больных с НФ педос гаточности 21-гидроксичазы то суммарная частота выявленных нарушений (вк почая «химерные» конструкции) составляет 41% (21 из 52) Наши результаты свидетельству е; о высокой значимости комплексного анализа, включающего идентификацию частых мутаций, выявление «химерных» генных конструкций, характеристик) клинической картины заболевания и проведение пробы с АКТГ в диагностике нектассической формы врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН)

Истинные причины «идиопатической» андрогенизации обычно установить очень сложно Считается, что «идиопагический» гирсутизм связан или с повышенной концентрацией дегидротестостерона или со слишком большой чувствительностью рецепторов клеток волосяных луковиц к воздействию андрогенов (Долян, 1981) Клиническая картина при «идиопатическои» андрогенизации является весьма схожей с таковой при НФ недостаточности 21-гидроксилазы, исключая значительное повышение уровня 17-гидроксипрогестсрона после теста на пробу с АКТГ у больных с НФ Мы предположили, что наличие «химерных» генов в локусе 6р21 3 может входить в ряд причин, вызывающих «идиопатическ\ ю» андрогенизацию

Сравнительны» анализ частот «химерных» генов в локусе 6р21 3 между группой женщин с «идиопатической» андрогенизацией и популяционной выборкой выявил статистически значимые различия между изученными группами (X2 = 19,731, Р = 0,0004, ёГ = 2) У женщин с «идиопатической» андрогенизацией «химерные» гены были выявлены в 38% мутантных хромосом (16 из 42) Частоты «химерных» генных конструкций типа 1 и типа 2 составили 9,5% (4 из 42) и 28,5% (12 из 42) в группе женщин с «идиопатической» андрогенизацией и 1% (1 из 94) и 6% (6 из 94), соответственно в популяционной выборке

Можно предполагать что выявленные нами «химерные» конструкции 2-го типа, кодируют фермент 21-гицроксилазу с незначительными нарушениями функциональной активности По-видимому, именно по этой причине эти мутации могут быть чаще идентифицированы у больных с более мягкими симптомами недостаточности 21-гидроксилазы, и у женщин с «идиопатическои» андрогенизациеи

Наличие «химерных» генов 1-го и 2-го типов более чем у потовины больных с "идиопатической" андрогенизацией может указывать на наличие у них латентной формы недостаточное ш 21 -гидроксилазы

Существует прямая связь между тяжестью заболевания и остаточной энзиматической активностью, как результата проявления отдельных мутаций Мутации, которые полностью дезактивируют бе^ок, приводят к тяжелым формам недостаточности 21-гидроксилазы, тогда как мутации, приводящие к частичной дезактивации белкового продукта, наблюдаются при мягких формах заболевания

Резучьтаты проведенного нами анализа фенотипических особенностей проявления различных м\таций у больных с недостаточностью 21-гидроксилазы, вполне согласовываются с исследованиями отдельных зарубежных авторов (Krone et al, 2000)

Мы показа ш что при «тяжелых» нарушениях (группа «0») ожидаемый фенотип (СТФ) выявляется в 94% случаев, при «легких» (НФ) - в 100% (группа «С») и в группе с мутациями «средней гяжес гп» (группа «В»)(ПФ) - в 87,5% случаев (Табл 3)

Таблица 3 Соотвествие фенотипа генотипу

Генотипы Группа Абс /п % Форма

delA2/de!A2 «0» Ю'17 59 СТФ

delA2/Q318X «0» 3/17 17 СТФ

Q318X /Q318X «0» 1/17 6 СТФ

delA2/R356W «0» ГТ/! 7 6 ПФ

delA2/kohb «0» 1/17 6 СТФ

Q318X/kohb «0» 1/17 6 СТФ

delA2/I2sphce «А» 14/26 54 СТФ

I2sphce/I2sphce «А» 3/26 И СТФ

«А» 5/26 19 ПФ

«А» 1/26 4 НФ

I2splice/ V237I «А» Ь26 4 ПФ

I2sphce/Q318X «А» 1/26 4 ПФ

I2sphce/R356W «А» 1/26 4 СТФ

delA2/I172N «В» 1/8 12,5 СТФ

«В>/ 5/8 62 5 ПФ

I2splice/I172N «В» 1/8 12,5 ПФ

I172N/I172N «В» 1/8 12,5 ПФ

V281L/delA2 «С» 2/3 66 НФ

V281L/ V237E «С» 1/3 34 НФ

Безусловно реальная корречяция генотипа и фенотипа при недостаточности 21-гидроксилазы очень сложна В каждом случае фенотип больного зависит от действия различных допо шительных факторов Так, если у больных удается идентифицировать только одну мутацию прогноз развития заболевания остается неизвестным Если вторая, не идентифицированная мутация, будет относиться к группе «мягких» мутаций то на клиническом уровне заболевание будет протекать в более мягкой форме Если она представляет собой ботее тяжелый дефект, то и заболевание будет протекать с тяжёлыми последствиями В каждом случае нельзя так же исключить наличие компенсаторных мутаций Оптимальным для интерпретации данных ДНК-диагностики и клинического прогноза является наличие конкретной мутации в гомозиготном состоянии, что встречается достаточно редко

Принимая во внимание то, что доля выявленных мутаций у пациентов с недостаточнлстью 21-гидрокслазы относительно невысока (84%-СТФ, 70%-ПФ, 41%-НФ) изучение

полиморфных ДНК-маркеров, сцепленных с геном CYP21A2 остается весьма актуальным при молекулярной диагностике недостаточности 21-гидроксилазы

Нами было проведено исследование отдельных полиморфизмов в генах HLA-DQA1 и MICA При анализе полиморфизма в экзоне 2 гена HLA-DQA1 нами выявлено 5 различных групп аллелей изучаемого гена *0101*0102, *0103, *0201*0б01, *0301 и *0401*050, встречающиеся в попутяционнои выборке с частотой от 7% до 37% Проведенный анализ позволил опредечить частоты мажорных аллелей гена HLA-DQA1, характерных для Северозападного региона России К наиболее частым можно отнести аллели *0101*0102 и *0401 *0501 (37% и 28%, соответсгвенно)

Частота аллетей *0101*0102 варьирует в различных группах больных от 28 до 43% В группе с СТФ наблюдается незначительное увеличение частоты аллеля *0103 (9%) по сравнению с остальными группами пациентов (ПФ-3% НФ-8%) и популяционной выборкой (7%j Частота аллечя Ю301 в группе бочьных с ПФ недостаточности 21-гидроксилазы соответствует таковой в популяционной выборке (16% и 16%, соответственно) У пациентов с СТФ НФ аллель *0301 идентифицирован с частотой 11% и 15%, соответственно Распределение аллелей HLA-DQA1 статистически значимо отличается между группой пациентов с СТФ формой заболевания и популяционной выборкой (р=0,0445, х2=с' 772 df 4) Частота аллелей *0201*0601 в группе с СТФ (24%) достоверно выше по сравнению с таковой в популяционной выборке (12%) (р=0,0357, df 1) Интересно отметить, что г группе ботьных с СТФ частота ачлелей *Ü401*05(J1 значительно меньше (14%) чем у бо.ьных с ПФ (34% р=0,03, df 1) с НФ заболевания (27% р=0,05, df 1) и в популяционнои выборке (28%, р-~0 02 df 1)

Работ посвященных исследованию неравновесия по сцеплению между отдельными мутациями ген«' CYP21A2 и HLA-j аплотипами очень мало Мало внимания уделялось гену HLA-DQA1 и не было ошечсао работ, где упоминался бы ген MICA в связи с недостаточное i ,ло 21 -г идроксила ад

Сравнительный анализ распределения аллелей геча HLA-DQA1 на хромосомах, несущих делению гена и в популяционной выборке выявил статистически значимые различия (р=0,0242 х2=11 221, df 4) Неравновесие по сцеплению отмечено между данной мутацией и аллелями *020j '0601 (р=0 002) Вероятно, это связано с возникновением делеции гена на хромосомах, несущих соответствующие аллели гена HLA-DQA1 Для остальных изученных мутаций не выявлено неравновесия по сцеплению с определенными аллелями гена HLA-DQA1

Таблица 4 Распределиие алле ieü гена HLA-DQA1 j пациентов с различными формами недостаточное ги 21-гидроксилазы и в популяционной выборке

Аллели HL Í-DQA1 Клинические формы

СТФ ПФ НФ Популяционная выборка

п % п % п % п %

*0101*0102 30 43 9 28 43 34 74 37

*0103 6 9 1 3 10 8 13 7

*0201*0601 16 23 Гп^О.О.Ш 6 19 21 16 24 12

*0301 8 11 5 16 19 15 33 16

*0401*0501 10 14 ф=0,03)* (р=0,05)** (о=0 02)*** 11 34* 35 27** 56 28***

Всего 70 100 32 100 128 100 200 100

При анализе полиморфизма в гене MICA нами выявлены все 5 аллелей гена MICA, описанные в работе Миуки с соавторами (аллели, содержащие 4, 5, 6, 9 QCT- повторов (*А4,

*А5, *Аб и *А9) и один аллель, включающий пять повторов с дополнительной всгавкой G-нумеотида (*А5 /)) (Mizuki et al 1997) Проведенный анализ позволил определить частоты мажорных алтелей гена MICA, характерных для популяции Северо-западного региона России К наиболее частым аллелям можно отнести аллели *А5 1 и *А9 (33% и 25%, соответственно) Распредетение частот аллелей гена MICA статистически значимо отличается между группой пациентов с СТФ формой заболевания и популяционной выборкой (р=0 0319, х2=Ю,564 df 4) В группе больных с СТФ аллель *А6 выявлен с частотой достоверно более высокой, чем в популяционной выборке (26% и 16%, соответственно р=0,05, df 1) Сравнительный анализ распределения частот аллелей гена MICA межд> группой больных с ПФ, НФ и популяционной выборкой не выявил статистически шачимых различии (р>0,05, df 4) Анализ распределения частот аллелей гена MICA на хромосомах несущих делецию гена и в популяционной выборке выявил статистически ¡начимые разтичия между изученными группами (р=0 0307 %2=10,66, df 4) Неравновесие по сцеплению отмечено между данной мутацией и аллелем *Аб Частота аллеля *А6 в инной группе достоверно выше чем в популяционной выборке (30 и 21%, соответственно р=0,05 df 1)

Установлено что дедеция гена достоверно чаще встречается на хромосомах, несущих HLA-DQA1*02U1*0601 М1С*А6 и, вероятно, возникла на хромосомах, имеющих данный гаплотип Да .ьнейшие работы в этой области могут помочь уточнению возраста и происхождения отдельных мутаций

Таблица 5 Распределение а тлел ей гена MICA у пациентов с различными формами недостаточно!, ги 21-гидрокситазы и в популяционной выборке

Аллети гена MICA Клинические формы

СТФ ПФ НФ Популяционная выборка

п % 11 % п % п %

*А4 1? 17 8 25 19 15 26 12

*AS 7 10 3 9 11 9 28 14

*А5 1 27 37 13 41 46 36 66 33

*Аб 19 26 (Р=0,05) 5 16 32 24 32 16

*А9 7 10 (р=0,005) 3 9 (Р=0,05) 20 16 (р-0,05) 50 25

Всего 7? 100 32 100 128 100 200 100

С целью определения информативности MICA- и HLA-DQA1- систем для пренатальной диагностики недостаточное!и 21-гидроксилазы нами проанализированы образцы ДНК из 47 полных семей

При этом 55% семей (26 из 47) являются полностью информативными по HLA-DQA1, 40% (18 из 47) частично информативными по данной системе и 5% (3 из 47) - не информативными Тогда как по полиморфной системе MICA 53% семей (25 из 47) являются полностью информативными, 32% семей (15 из 47) частично информативными и 15% (7 из 47) - не информативными При комплексном обследовании семей по обеим полиморфным системам 94% семей (44 из 47) являются полностью информативными, 4% семей (2 из 47) частично информативными и 2% семей (1 из 47) не информативными

В данных семьях в 72% (34 из 47) выявлен молекулярный дефект гена CYP21A2 в обеих мутантных хромосомах, в 19% (9 из 47) - в одной хромосоме и в 9% (4 из 47) семей мутации не обнаружены

При комплексном семейном анализе при недостаточности 21-гидроксилазы с учетом мутационных нарушений и особенностей полиморфизмов MICA и HLA-DQA1

информативность семей для пренатальной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы или для уточнения гетерозиготного носительства в семьях попадающих в группу риска по данному заболеванию составляет 98%

При конверсии больших участков псевдогена, последовательность гена СУР21А2 может включать несколько мутаций В этом случае молекулярно-генетическое исследование не позволяет определить, находятся ли мутации на одной хромосоме, или принадлежат двум разным Дчя избежания ошибок, необходимо проведение обследования не только больного с недостаточной ью 21-гидроксилазы, но и его родителей

Результаты данного исследования позволяют разработать оптимальную стратегию пренатальной диагностики в семьях с ВГКН на основе метода непосредственного определения м\ 1аций (прямого метода) и анализа сцепленных маркеров (косвенного метода) Принципиальная схема пренатальной диагностики в семьях с ВГКН представлена на рисунке 8

Рис.8 Принципиальная схема пренатальной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы

Оптимальная схема обследования пациентов с недостаточностью 21-гидроксилазы такова на первом этапе проводится детекция мутаций, соответствующих клинической форме заболевания На втором этапе необходимо проводить исследование гена на возможность наличия сопутствующих мутаций, возникающих в результате рекомбинацяонных событий Такой алгоритм применим и при проведении пренатальной диагностики в семьях высокого риска недостаточности 21-гидроксилазы Важно отметить, что исследование ДНК плода не должно ограничиваться детекцией только тех мутаций, которые были идентифицированы у родителей пробанда Необходимо иметь представление о гене целиком, чтобы по возможности исключить возникновение мутаций de novo

На данный момент, с использованием схемы пренатальной диагностики в семьях с недостаточное 1ью 21-гидроксилазы проведено 35 пренатальных диагностик и в девяти случаях у плода выявлено заболевание

Результаты наших исследований свидетельствуют о том что для сотьтеряющей и для простой виригиной формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой спектр диагностически значимых мутаций Согласно полученным данным при сольтеряющей форме недостаточное i и 21-гилроксичазы наиботее частыми мутациями являются делеция гена и мутация сплайсинга во втором интроке гена CYP21A2 Гогда как при простой вирильной форме ведущими являются мутация сплайсинга и мутация в интроне 4 - I172N Делеция гена по своей распространенности у больных с ПФ занимает третье место В целом при СТФ и ПФ заболевании диагностически наиболее значимыми являются четыре из двенадцати исследованны\ мутаций Это - делеция гена, мутация сплайсинга в интроне 2, мутация в экзоне 4 -111Т\ и мутация Q318Х в экзоне 8

У больных с неклассической формой при тщательном отборе по клиническим признакам, базальному и стимулированному уровням 17-гидроксирогестерона различные типы мутаций были идентифицированы в 41% мутангных хромосом

Наши рез) лгаты свидетельствует о высокой значимости комплексного анализа, включающего идентификацию частых мутации, характеристику клинической картины заболевания и проведение пробы с АКТГ в диагностике неклассической формы недостаточное и 21-гидроксилазы при врожденной гиперплазии коры надпочечников

ВЫВОДЫ

1 Анализ м\таций в гене CYP21A2 позволяет определить молекулярный дефект, приводящий к развитию недостаточности 21-гидроксилазы в 84% мутантных хромосом при СТФ в 70% ынтных хромосом при ПФ и в 41% хромосом при НФ заболевания

2"Дчя каждой клинической формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой специфическии спектр мутаций в гене CYP21A2

3 Описан новый «химерный» ген, включающий в себя 5' -участок гена CYP21A2 и 3' -участок псевдогена CYP21A1P

4 Делеция luía CYP21A2 имеет неравновесие по сцеплению с аллелями *0201 *0601 гена HLA-DQA1 и ' \6 гена Ч1СА

5 Существует ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа 1 и типа 2 У больных с неклассической формой недостаточное ni 21-гидроксилазы «химерная» конструкция ген/псевдоген встречается с частотой в 2,5 большей, чем в популяционной выборке

6 При коми icKCHOM семейном анализе с учетом мутационных нарушений в гене CYP21A2 и особенностей полиморфизмов генов MICA и HLA-DQA1 информативность семей для молекулярной шагностики недостаточности 21-гидроксилазы составляет 98%

7 Разработана схема молекулярной диагностики в семьях, входящих в группу риска по рождению ребенка с недостаточностью 21-гидроксилазы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ-

1 Осиног;екая Н С Иващенко Т Э , Соболева Е Л , Плотникова Е В , Потин В В , Баранов В С Спектр мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы у больных с адрено-генитальным синдромом И Генетика -2000 -№8 - С И 47-1149

2 Осиновская Н С Особенности проведения молекулярной диагностики при врожденной гш-ерплазии коры надпочечников // Мояекулярно-биологические технологии в медицинской практике - 2002 - Новосибирск, Альфа-Виста - вып 2 - С 111-119

3 Осиновская Н С , Иващенко Т Э , Баранов В С Анализ ассоциации аллелей DQA с мутациями гена 21-гидроксилазы у больных с врождённой гиперплазией коры надпочечников '/Генетика - 2004 - т 40 - №! - С 97-101

4 Соболева Е Л , Осиновская Н С Баранов В С , Иващенко Т Э , Потин В В Неклассическая форма Врожденной Гиперплазии Коры Надпочечников (Этиология, Патогенез, Диат ностика) // Журнал Акушерства и женских болезней - СПб - 2006 - т LV -№2 - С 53-57

5 Осиновская Н С Иващенко Т Э , Соболева Е Л , Баранов В С Мутационные повреждения гсиа 21-гидроксилазы как молекулярная основа врожденной гиперплазии коры надпочечников // Мед генетика - приложение 1 - 2006 - т 5 - С 30-37

6 Осиное« ая_Н С Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) как дефицит 21-гидроксилазы Современное представление и генетическая диагностика// Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике - Новосибирск, Альфа-Виста - 2006-вып 9 - С 84-108

7 Осиновская Н С Иващенко Т Э Соболева Е Л , Баранов В С Мутационные нарушения при различных формах ВГКН и особенности молекулярной диагностики дефицита 21-гн (роксилазы при стертых формах заболевания // Мед генетика - 2007- т 6, №4-С 35-41

8 Осиновская Н С Молекулярная диагностика адрено-генитального синдрома в С -Петербурге // Мат Международной конференции по реабилитации детей-инвалидов с редкими генетическими заболеваниями "Врачи мира-пациентам" - СПб - июнь,1998

9 Осиновская НС Соболева ЕЛ, Плотникова ЕВ, Иващенко ТЭ Спектр мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы у больных с адреногенитальным синдромом Ссвсро-Запа шого региона России // Медико-генетическая служба СПб к 30-летию МГЦ - СПб - 1999 - С 129-132

10 Соболева ЕЛ, Осиновская НС Потин В В Проба с АКТГ в диагностике неклассическои формы АГС // Актуальные проблемы современной эндокринологии мат 4 веер конгр эндокр-в - СПб - 2001 - С 510

11 Осиновская Н С Опыт молекулярной диагностики гиперплазии коры надпочечников вследствие депшшпа 21-гидроксичазы '/ Мат Международной конференции по реабилитации с гей-инга шдов с редкими генетическими заболеваниями «Врачи мира пациентам» - С I /б 2003 С 16

12 Osinovskaya N, haschenko 1 Baianov V Molecular diagnosis of congenital adrenal hyperplasia m the North-West Russia // 91'1 international clinical genetics seminar - Cyprus -July, 1998 - P 236

13 Osinovskaya N , haschenko T Baranov V Analysis of CYP21 gene mutations m Russian patients affected by steroid 21 hydroxilase deficiency// Progress in prevention of genetic diseases -Prague-June, 1999-P 25

14 Osinovskaya N S , Ivaschenko T E , Baranov V S Analysis of DQA1 polymorphism m CAH-Russian pauents H HGM2001 - Apr 2001 - Abstract book - P 64

15s Osinovskaya N S Ivaschenko T E. Analysis of gene conversions <ш the patients-with the non-classical foim of steroid 21-hydroxylase deficiency // Eur J Hum Genet - Munich, Germany -June - 2004 - V 12 - P 268(PQ851)

"16 Osinovskaya N S , Ivaschenko T E, Soboleva E L A CYP21B/CYP21P chimeric molecule as a possible cause of nonciassical form of Congenital Adrenal Hyperplasia // Eur J Hum Genet -Prague, Czech Republic - May, 2005 - V 13 - P 270(P0877)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Осиновская, Наталья Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биохимические и клинические аспекты врождённой гиперплазии коры надпочечников (ВГКН)

1.1.1. Врожденная гиперплазия коры надпочечников: общее представление и клинические формы

1.1.2. Частота недостаточности 21-гидроксилазы при ВГКН в различных популяциях

1.1.3. История изучения ВГКН

1.1.4. Биосинтез глкжокортикоидов и минералкортикоидов

1.1.4.1. Общая характеристика биосинтеза глюкокортикоидов и минералкортикоидов

1.1.4.2. Участие 21-гидроксилазы и биохимические нарушения системы синтеза кортизола и альдостерона

1.1.5. 21-гидроксилаза - структура и функция белка

1.2. Молекулярная основа и генетический анализ недостаточности 21-гидроксилазы

1.2.1. Структура и локализация генов CYP21A2 и CYP21A1P

1.2.2. Анализ мутаций, обуславливающих недостаточность 21-гидроксилазы

1.2.2.1. Общая характеристика мутаций, обуславливающих недостаточность 21 -гидроксилазы

1.2.2.2. Конверсия гена как механизм возникновения "химерных генов"

1.2.2.3. Спектр мутаций, характерных для Европейских популяций

1.2.3. Корреляция генотип - фенотип

1.2.4. Генетическая диагностика недостаточности 21-гидроксилазы

2. МАТЕРИНЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы, ферменты, оборудование

2.2. Характеристика группы обследуемых больных и популяционной выборки

2.3. Методы исследования

2.3.1. Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови человека

2.3.2. Выделение ДНК из пятен крови

2.3.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.3.4. Рестрикционный анализ

2.3.5. Гетеродуплексный анализ

2.3.6. Проведение электрофореза и визуализация результатов

2.3.7. Методы статистического анализа

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Частоты мутаций гена CYP21A2 в Северо-западном регионе России при классических формах недостаточности 21-гидроксилазы (СТФ-сольтеряющая и ПФ-простая формы)

3.2. Частоты мутаций гена CYP21A2 в Северо-западном регионе России у больных с подозрением на неклассическую форму (НФ) недостаточности 21-гидроксилазы

3.3. Идентификация новой «химерной» конструкции в локусе 6р21.

3.4. Анализ «химерных» генов в локусе 6р21.

3.5. Анализ корреляции генотип-фенотип

3.6. Анализ полиморфизма в экзоне 2 гена HLA-DQA

3.6.1. Распределение аллельных вариантов гена HLA-DQA1 у пациентов с СТФ, ПФ, НФ недостаточности 21 -гидроксилазы и в популяционной выборке

3.6.2. Частоты аллелей tqhzHLA-DQAI на хромосомах, несущих различные мутации в гене CYP21A

3.6.3. Анализ частот генотипов по гену HLA-DQA1 в различных группах больных с недостаточностью 21-гидроксилазы и в популяционной выборке

3.7. Анализ GCT- повторов в гене MICA

3.7.1. Распределение аллелей гена MICA у пациентов с СТФ, ПФ, НФ недостаточности 21-гидроксилазы и в популяционной выборке

3.7.2. Частоты аллелей гена MICA на хромосомах, несущих различные мутации в гене CYP21A

3.7.3. Анализ частот генотипов по гену MICA в различных группах больных с недостаточностью 21-гидроксилазы и в популяционной выборке

3.8. Диагностическая ценность полиморфных систем генов MICA и HLA-DQA1 и оценка перспективности их использования для пренатальной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы

3.9. Принципиальная стратегия пренатальной диагностики в семьях с недостаточностью 21-гидроксилазы

4. ЗАКЛЮЧЕН®

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ недостаточности 21-гидроксилазы при врождённой гиперплазии коры надпочечников"

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных проблем молекулярной генетики человека является создание национального банка данных о характере мутационных повреждений определённых генетических детерминант при наиболее распространённых наследственных патологиях.

Врождённая гиперплазия коры надпочечников (ВГКН) -распространённое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное в 95% случаев дефицитом фермента 21-гидроксилаза. В Европейской популяции частота встречаемости ВГКН достаточно высока и составляет 1:2,5-10000 новорожденных (Fitness J., 1999).

Недостаточность 21-гидроксилазы характеризуется выраженным генетическим и клиническим полиморфизмами. Наиболее тяжёлые клинические проявления наблюдаются у детей с сольтеряющей формой (СТФ) заболевания. Дети рождаются с выраженными расстройствами обмена веществ, вызванными нарушениями синтеза глюкокортикоидов и минералкортикоидов в коре надпочечников. У девочек, кроме того, имеется нарушение формирования наружных половых органов. При отсутствии своевременного и правильного лечения дети погибают на первых неделях жизни от надпочечниковой недостаточности. В связи с нерешённостью проблем ранней диагностики недостаточности 21-гидроксилазы большое медицинское и социальное значение имеет профилактика заболевания, ставшая возможной только с появлением молекулярно-генетических методов. Необходимость знания молекулярной природы мутационных повреждений гена 21-гидроксилазы при данном заболевании связана с тем, что биохимический метод диагностики (определение уровня 17-ОН прогестерона) не всегда точно отражает клиническую картину заболевания, и применение его в пренатальной диагностике недостаточности 21-гидроксилазы может привести к ошибочному диагнозу.

В настоящее время известно более 100 мутаций в гене CYP21A2, кодирующем белок 21- гидроксилазу. Проводившиеся последние годы во всем мире исследования локуса 6р21.3, в котором картирован ген CYP2IA2, выявили гетерогенность недостаточности 21-гидроксилазы на молекулярном уровне и определили целый спектр ВГКН-обуславливающих мутаций. После открытия неравновесия по сцеплению между ВГКН и HLA-локусом, внутри которого картирован ген CYP21A2, появилась возможность использовать HLA-типирование для пренатальной диагностики данного заболевания.

Для каждой отдельной популяции существует свой специфический спектр мутаций, знание которого, а так же знание особенностей полиморфизмов в генах, входящих в HLA-локус, таких как HLA-DQA1 и MICA являются необходимыми для проведения мероприятий по медико-генетическому консультированию пациентов и планированию семьи, а также для проведения скрининговых программ с целью выявления гетерозиготных носителей мутаций в гене CYP21A2. Цель и задачи исследования.

Разработать алгоритм молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы на основе анализа гена CYP2IA2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать частоты мутаций в гене CYP2IA2 у больных с недостаточностью 21-гидроксилазы при различных клинических формах заболевания.

2. Проанализировать полиморфизм генов HLA-DQA1 и MICA в группах больных с сольтеряющей, простой вирильной (ПФ) и неклассической формами (НФ) заболевания.

3. Проанализировать неравновесие по сцеплению между мутациями гена CYP21A2 и аллелями генов HLA-DQA1 и MICA.

4. Определить значимость полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы.

5. Разработать на основе полученных данных оптимальную схему молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы.

Научная новизна работы.

В результате проведённого исследования впервые определён спектр мутационных повреждений гена CYP21A2 у больных с недостаточностью 21-гидроксилазы Северо-западного региона России. Разработан метод идентификации мутации P453S на основе рестрикционного анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции Rsal. Описан новый «химерный» ген, включающий в себя 5' -участок гена CYP21A2 и 3' -участок псевдогена CYP21AIP (тип 2) и разработана методика его выявления. Выявлена ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа I и типа 2. У больных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы выявлены «химерные» конструкции ген/псевдоген (тип 2). Впервые проведен анализ частот аллелей и генотипов по гену MICA у больных с различными формами недостаточности 21-гидроксилазы. Впервые определена информативность GCT-повторов гена MICA для диагностики недостаточности 21-гидроксилазы. Выявлено неравновесие по сцеплению между мутациями в гене CYP21A2 и аллелями гена MICA. Выявлены достоверные отличия в распределении генотипов по гену MICA между группой больных с НФ недостаточности 21-гидроксилазы и популяционной выборкой и между группой больных с ПФ и популяционной выборкой. Впервые проведена оценка информативности семей с высоким риском рождения ребёнка с недостаточностью 21-гидроксилазы, основанная на комплексном исследовании мутаций в гене CYP21A2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA.

Практическая значимость

В результате исследования спектра мутаций в гене CYP2IA2 и полиморфизмов генов HLA-DQA1 и MICA разработана оптимальная схема молекулярного обследования семей, попадающих в группу риска по рождению ребёнка с ВГКН. Определен тип мутационных повреждений и проведена пренатальная диагностика недостаточности 21-гидроксилазы в 35 семьях, имеющих детей с ВГКН. Полученные результаты явились материалом для подготовки методических рекомендаций по пренатальной диагностике ВГКН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показано, что для каждой клинической формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой специфический спектр мутаций в гене CYP2IA2.

2. Показано, что клиническое проявление недостаточности 21-гидроксилазы зависит от «тяжести» молекулярного дефекта в гене CYP21A2. Так, при «тяжелых» мутациях соответствие фенотипа генотипу равно 94%, при «легких» - 100% и в группах с мутациями «средней тяжести» - 87,5%.

3. Описана новая «химерная» конструкция (тип 2), состоящая из последовательности гена и псевдогена. Выявлена ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных химерных» генов типа 1 и типа 2. У больных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы «химерные» конструкции ген/псевдоген (тип 2) выявлены с частотой в 2,5 большей, чем в популяционной выборке.

4. Выявлены достоверные отличия в распределении частот аллелей гена HLA-DQA1 между группой больных с СТФ недостаточности 21-гидроксилазы и популяционной выборкой.

5. Выявлены статистически значимые различия между группой больных с СТФ и популяционной выборкой по частотам аллелей гена MICA.

6. Показано, что комплексный анализ полиморфизмов в генах HLA-DQA1 и MICA позволяет повысить информативность семей для пренатальной диагностики до 98%.

Апробация работы. Результаты работы представлены на 9-м международном семинаре по клинической генетике (Кипр, 1998), на Международной конференции по реабилитации детей-инвалидов с редкими генетическими заболеваниями: "Врачи мира-пациентам" (С.-Пб, 1998), на Конференции по прогрессу в профилактике наследственных болезней (Прага, 1999), на Европейском конгрессе по генетике человека (Вена, 2001), на 4-м Всероссийском конгрессе эндокринологов (С.-Пб, 2001), на конференции «Врачи мира пациентам» (С-Пб., 2003), на Европейском конгрессе по генетике человека (Мюнхен, 2004) и (Прага, 2005), на конф. «Современное состояние и новые подходы в дородовой профилактике наследственных болезней и врождённых пороков развития» (С.-Пб, 2005), на конф. «Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике» (Новосибирск, 2006), на конф. «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (Москва,2006), на конф. «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2006).

Диссертация апробирована на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врождённых болезней ГУ НИИАГ им. Д.О.Отта.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ. Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описание результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 146 ссылок. Диссертация иллюстрирована 20 Таблицами и 15 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Осиновская, Наталья Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Анализ мутаций в гене CYP21A2 позволяет определить молекулярный дефект, приводящий к развитию недостаточности 21-гидроксилазы в 84% мутантных хромосом при СТФ, в 70% мутантных хромосом при ПФ и в 41% хромосом при НФ заболевания.

2. Для каждой клинической формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой специфический спектр мутаций в гене CYP21A2 .

3. Описан новый «химерный» ген, включающий в себя 5' -участок гена CYP21A2 и 3' -участок псевдогена CYP21A1P.

4. Делеция гена CYP21A2 имеет неравновесие по сцеплению с аллелями *0201*0601 гена HLA-DQA1 и *А6 гена MICA

5. Существует ассоциация между «идиопатической» андрогенизацией и наличием у данных больных «химерных» генов типа 1 и типа 2 . У больных с неклассической формой недостаточности 21-гидроксилазы «химерная» конструкция ген/псевдоген встречается с частотой в 2,5 большей, чем в популяционной выборке.

6. При комплексном семейном анализе с учетом мутационных нарушений и особенностей полиморфизмов генов MICA и HLA-DQA1 информативность семей для молекулярной диагностики недостаточности 21-гидроксилазы составляет 98%.

7. Разработана схема молекулярной диагностики в семьях, входящих в группу риска по рождению ребёнка с недостаточностью 21-гидроксилазы.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Врождённая гиперплазия коры надпочечников и в частности недостаточность 21-гидроксилазы является достаточно распространённым аутосомно-рецессивным заболеванием. Из-за высокой частоты встречаемости, особенно неклассических форм (до 1% в популяции) недостаточность 21-гидроксилазы представляет большую медико-социальную проблему. Одной из важных задач для диагностики этого заболевания является знание характера мутационных повреждений в отдельных популяциях.

Во многих странах Западной Европы уже доступны идентификации более 90-95% мутаций гена CYP21A2. Отсюда вполне реальным стало скринирование всех новорожденных (или тех, у кого отмечено повышение содержания 17-гидроксипрогестерона в крови) на наличие мутаций гена CYP21A2 для досимптоматической диагностики заболевания. Как показывают обширные эпидемиологические исследования во Франции и во многих других странах, раннее досимптоматическое выявление недостаточности 21-гидроксилазы, безусловно, оправдано, так как позволяет начать лечение задолго до появления клинических симптомов, и гарантирует более благоприятное течение болезни. Наличие передовых молекулярных технологий в диагностике позволило в ряде стран Западной Европы приступить к скринированию всей популяции на носительство мутаций гена CYP21A2, с тем, чтобы выявлять гетерозиготных носителей и проводить эффективную профилактику этого заболевания.

В 2006 году в России недостаточность 21-гидроксилазы вошла в ряд заболеваний, на которые проводится скрининг новорожденных, поэтому возросла актуальность исследования спектра и распространённости мутаций в гене CYP21A2 в Российской популяции.

Решающим преимуществом молекулярной диагностики по сравнению с другими методами исследований является то, что объектом исследования является непосредственно ДНК больного, поэтому, диагностику можно проводить не только на тех тканях, где экспрессируется соответствующий ген, но практически на любых клетках организма, из которых можно выделить ДНК. Более того, ДНК-диагностика возможна практически на любой стадии развития организма.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что для сольтеряющей и для простой вирильной формы недостаточности 21-гидроксилазы характерен свой спектр диагностически значимых мутаций. Согласно полученным данным при сольтеряющей форме недостаточности 21-гидроксилазы наиболее частыми мутациями являются делеция гена и мутация сплайсинга во втором интроне гена CYP21A2. Тогда как при простой вирильной форме ведущими являются мутация сплайсинга и мутация в интроне 4 - I172N. Делеция гена по своей распространенности у больных с ПФ занимает третье место. В целом, при СТФ и ПФ заболевании диагностически наиболее значимыми являются четыре из двенадцати исследованных мутаций. Это - делеция гена, мутация сплайсинга в интроне 2, мутация в экзоне 4 - I172N и мутация Q318X в экзоне 8.

У больных с неклассической формой при тщательном отборе по клиническим признакам, базальному и стимулированному уровням 17-гидроксирогестерона различные типы мутаций были идентифицированы в 41% мутантных хромосом.

Наши результаты свидетельствует о высокой значимости комплексного анализа, включающего идентификацию частых мутаций, характеристику клинической картины заболевания и проведение пробы с АКТГ в диагностике неклассической формы недостаточности 21-гидроксилазы при врожденной гиперплазии коры надпочечников.

В настоящем исследовании помимо ранее описанной «химерной» конструкции 1-го типа выявлен новый «химерный» ген, включающий в себя 5' -конец гена CYP21A2 и 3' -конец псевдогена CYP21A1P. Мы предполагаем, что выявленные нами «химерные» конструкции 2-го типа, кодируют фермент 21-гидроксилазу с незначительными нарушениями функциональной активности. По-видимому, именно по этой причине данное нарушение чаще определяется у больных с более мягкими симптомами недостаточности 21-гидроксилазы и у женщин с «идиопатической» андрогенизацией. При анализе спектра мутаций в гене 21-гидроксилазы выявлено наличие «химерных» генов 1-го и 2-го типов более чем у половины больных с "идиопатической" андрогенизацией, что может указывать на наличие у них латентной формы недостаточности 21-гидроксилазы.

Состояние репродуктивной системы у женщин с латентной формой недостаточности 21-гидроксилазы практически не исследовано. Это можно объяснить тем, что данную форму заболевания, как правило, выявляют случайно при семейных обследованиях. Значительную часть женщин с латентной формой заболевания представляют собой гетерозиготные носители, имеющие в геноме один мутантный аллель гена CYP21A2. Эти лица считаются практически здоровыми. Их обычно выявляют в семьях, где родился ребенок с классической формой недостаточности 21-гидроксилазы. Клиническим аспектам гетерозиготного носительства мутантного гена CYP21A2 внимания почти не уделялось. Отдельные исследования свидетельствуют о достаточно высоком проценте гетерозиготных носителей среди больных с гирсутизмом. Мы предполагаем, что во многих случаях у женщин с латентной формой или среди больных с гирсутизмом возможно наличие «химерных» генов типа 2, которые и могут оказывать опосредованное влияние на клиническую картину заболевания.

Наличие мутантных аллелей гена CYP21A2 в гетерозиготном состоянии может сопровождаться дисфункцией коры надпочечников, которая у женщин фенотипически проявляется в виде нарушений репродуктивной функции. На этом основании женщин - гетерозиготных носителей мутантных аллелей по гену CYP21A2 следует относить к группе высокого риска по возникновению осложнений в системе репродукции, особенно в период ее становления и при беременности.

Было установлено, что аллели и генотипы по гену HLA -DQA1 системы HLA и гену MICA, картированным на коротком плече хромосомы 6 обладают неравновесием по сцеплению с отдельными клиническими формами недостаточности 21-гидроксилазы. Работы в этой области могут помочь уточнению возраста и происхождения отдельных мутаций. Использование полиморфных систем HLA -DQA1 и MICA может существенно повысит информативность молекулярной диагностики в семьях, попадающих в группу риска и имеющих ребёнка, больного с недостаточностью 21-гидроксилазы. Так, по нашим данным, информативность семей по системе HLA-DQA1 составила 55%, по системе MICA - 53% и общая информативность по обеим системам составила 94%.

В настоящее время молекулярно-генетическое исследование широко используют для уточнения диагноза у новорожденных с умеренно повышенным уровнем 17-гидроксипрогестерона, с целью пренатальной диагностики и при медико-генетическом консультировании для выявления носителей мутации среди родственников. Хотелось бы подчеркнуть, что пренатальная диагностика данного заболевания имеет первостепенное значение в семьях, где уже имеются дети с классическими формами недостаточности 21-гидроксилазы. Поэтому актуальным для ранней пренатальной диагностики является непосредственное определение мутаций в гене CYP21A2. У женщин с подозрением на неклассическую форму заболевания большое значение приобретает анализ «химерных» генных конструкций с целью уточнения диагноза и дальнейшего планировния лечения. Учитывая важную медицинскую и социальную значимость проблемы недостаточности 21-гидроксилазы, молекулярные исследования этого гена, безусловно, актуальны как для медицинской генетики, так и для генетики человека. Информация о спектре мутаций для каждой отдельной популяции является необходимой для проведения мероприятий по медико-генетическому консультированию пациентов и планированию семьи, а также для проведения скрининговых программ с целью выявления гетерозиготных носителей недостаточности 21-гидроксилазы.

125

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Осиновская, Наталья Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Башмакова Н.В., Дерябина Е.Г. Неклассическая врожденная дисфункция коры надпочечников в практике акушера-гинеколога // Российский вестник акушера-гинеколога.-2005.- Т.З.- С.14-18.

2. Бондаренко А.Л. HLA и болезни.-Киров.- 1999.- 194 с.

3. Глазер В.М. Конверсия гена // Соросовский образовательный журнал.- Биология.- 2000.-Т. 6, №1.-С. 23-30.

4. Гланц С. Медико-биологическая статистика // М.: Практика.-1999.-459 с.

5. Дедов И.И., Семичева Т.В., Петеркова В.А. Половое развитие детей: норма и патология,- М.-2002.- С. 119-130.

6. Долян Г.Г. Гирсутный синдром у женщин детородного возраста. -1981.- дисс. на соискание ученой степени канд. мед. наук.

7. Иващенко Т.Э., Асеев М.В., Баранов B.C. Методы молекулярной диагностки генных болезней // Мед.лаб.технологии (справочник).-Спб.: Интермедика.- 1999.- Т.2.- С. 603-617.

8. Клиническая эндокринология: Руководство / Под ред. Н. Г. Старковой.- М: Медицина.-1991.

9. Колчанов Н.А., Соловьев В.В., Рогозин И.Б. Молекулярный механизм соматического гипермутагенеза в генах иммуноглобулинов // Докл. АН СССР.-1985,- Т.281, N 4,- С. 994-999.

10. Кузнецова М.Н., Патология репродуктивной функции системы в период её становления // Кн: Руководство по эндокринной гинекологии / Под ред. Е.М. Вихляевой.- М: Медицинское информационное агенство.- 1997.

11. Панфилова Е.В., Карева М.А., Колесникова Г.С., Яровая И.С. и др. Неклассическая форма врождённой дисфункции коры надпочечников у девочек-подростков // Проблемы эндокринологии.-2006,- Т.52, №5.- С. 26-31.

12. Потемкин В.В. Эндокринология/М.: Медицина.-1999,- С. 471-537.

13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных / Москва.- 2003.

14. Сингер М., Берг П. Гены и геномы/М.: Мир.-1998.-Т 1.-С.100-111.

15. Amor M., Parker K.L., Globerman H., New M.I., White P.C. Mutation in the CYP21B gene (lie-172—Asn) causes steroid 21-hydroxylase deficiency // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988,- V.85, №5.- P. 16001604.

16. Baltimore D. Gene conversion: some implications for immunoglobulin genes//Cell.-1981,-V.24.- P. 595-596.

17. Barbat В., Bogyo A., Raux-Demay M.C. et al., Screening of CYP21 gene mutations in 129 French patients affected by steroid 21-hydroxylase deficiency // Hum. Mutat.- 1995.- V.5, №2.- P. 126-130.

18. Bobba A., Iolascon A., Giannattasio S. et al. Characterisation of САН alleles with non-radioactive DNA single strand conformation polimorphism analysis of the CYP21 gene // J. Med. Genet.- 1997.-V.34.- P. 223-228.

19. Brentano S.T., Picado-Leonard J., Mellon S.H., Moore C.C.D., Miller W.L. Tissue-specific, cAMP-induce, and phorbol ester repressed expression from the human P450cl7 promoter in mouse cells // Mol.Endocrinol.- 1990.- V.4.-P. 1972-1979.

20. Brosnan P.G., Brosnan C.A., Kemp S.F., Domek D.B., Jelley D.H., Blackett P.R., Riley W.J. Effect of newborn screening for congenital adrenal hyperplasia // Arch. Pediatr. Adolesc. Med.- 1999- V.153.-P.l 272—1278.

21. Bongiovanni A.M., Root A.M. The adrenogenital syndrome // N.Engl., J. Med.-1963,- V.268.-P. 1283-1289.

22. Campbell R.D., Trowsdale J. Map of the human MHC // Immunol. Today.- 1993.- V.14.- P. 349-352.

23. Carrera P., Bordone L., Azzani Т., Brunelli V., Garancini M.P., Chiumello G., Ferrari M. Point mutations in Italian patients with classic, non-classic, and cryptic forms of steroid 21-hydroxylase deficiency // Human Genetics.- 1996.- V.98.- P. 662-665.

24. Childs В., Grumbach M.M., Van Wyk J.J. Virilizing adrenal hyperplasia: a genetic and hormonal study//J.Clin.Invest.-1956.- V.35.- P.213.

25. Chiou S.H., Ни M.C., Chung B.C. A missense mutation at lie 172—Asn or Arg356—Trp causes steroid 21-hydroxylase deficiency // J. Biol. Chem.- 1990.- V.265.- P. 3549-3552.

26. Cucca F., Lampis R, Congia M. et al. A correlation between the relative predisposition of MHC class II alleles to type 1 diabetes and the structure of their proteins//Hum. Mol. Genet.-2001,- V.10.-P. 2025-2037.

27. Cutfield W.S., Webster D. Newborn screening for congenital adrenal hyperplasia in New Zealand // J. Pediatr.- 1995,- V.126.- P. 118-121.

28. Di Martino-Nardi J., Stoner E., О Connell A., New M.I. The effect of treatment of final height in classical congenital adrenal hyperplasia (САН)//Acta. Endocrinol. Suppl.-1986.- V.279.- P.305.

29. Dupont В., Oberfield S.E., Smithwick E.M. et al. Close genetic linkage between HLA and congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) // Lancet.- 1977,- V.2.- P.1309.

30. Evgrafov 0., Polyakov A., Dzenis I., Baharev V. Preliminary Investigation of Mutations in 21-Hydroxylase Gene in Patients With Congenital Adrenal Hyperplasia in Russia // Hum. Mutat.- 1995.- V.5.-P. 131-136.

31. Ezquietta В., Oliver A., Gracia R., Gancedo P.G. Analysis of steroid 21-hydroxylase gene mutations in Spanish population // Human Genetics.-1995.- V.96.-P. 198-204.

32. Galal, O.M. Rudd B.T. Drayer N.M. Evaluation of deficiency of 21-hydroxylation in patients with congenital adrenal hyperplasia // Arch. Dis. Child.- 1968,-V. 43.- P. 410-414.

33. Gitelman S.E., Bristow J., Miller W.L. Mechanism and consequences of the duplication of the human C4/P450c21/gene x locus // Mol. Cell. Biol.- 1992.-V.12.- P. 2124-2134.

34. Globerman H., Amor M., Parker K.L., New M.I., White P.C. Nonsense mutation causing steroid 21-hydroxylase deficiency // J. Clin. Invest.,.-1988.- V.82, №1.- P. 139-144.

35. Gourmelen M., Gueux В., Pham H.T.M., Fiet J., Raux-Demay M.C., Girard F. Detection of heterozygous carriers for 21-hydroxylase deficiency by plasma 21-deoxycortisol measurement // Acta. Endocrinol. (Copenh.).- 1987.-V.116.- P. 507-512.

36. Helmberg A., Tusie-Luna M.T., Tabarelli M., Kofler R., White P.C. R339H and P453S: CYP21 mutations associated with nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency that are not apparent gene conversions // Mol. Endocrinol.- 1992.-V.6.-P. 1318-1322.

37. Higashi Y., Tanae A., Inoue H., Fudjii-Kuriyama Y. Evidence for frequent gene conversion in the steroid 21-hydroxylase P-450(C21) gene: implication for steroid 21-hydroxylase deficiency // Am. J. Hum. Genet.-1988.-V.42.-P. 17-25.

38. Hsu N.C., Guzov V.M., Hsu L.C. et al. Characterization of the consequence of a novel Glu-380 to Asp mutation by expression of functional P450c21 in Escherichia coli. II Biochim. Biophys. Acta.-1999.- V.1430.- P. 95-102.

39. Hughes I. A., Dyas J., Riad-Fahmy D., Laurence К. M. Prenatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia: reliability of amniotic fluid steroid analysis // J. Med. Genet.- 1987.- V.24.- P. 344-347.

40. Klingensmith G.J., Garcia S.C., Jones H.W., Migeon C.J., Blizzard R.M. Glucocorticoid treatment of girls with congenital adrenal hyperplasia: effects on height, sexual maturation, and fertility // J. Pediatr.-1977.-V.90.- P. 996-1004.

41. Ко T.M, Kao C.H, Ho H.N, Tseng L.H. et al. Congenital adrenal hyperplasia. Molecular characterization // J. Reprod. Med.- 1998,- V.43, №4.- P. 379-386.

42. Kominami S., Ochi H., Kobayashi Y. et al. Studies on the steroid hydroxylation system in adrenal cortex microsomes: Purification and characterization of cytochrome P-450 specific for steroid C-21 hydroxylation//J.Biol.Chem.- 1980.- V.255.- P. 3386.

43. Lee H., Chao H., Ng H., Choo K., Direct molecular diagnosis of CYP21 mutations in congenital adrenal hyperplasia // J. Med. Genet.- 1996,-V.33.- P. 371-375.

44. Lee, H.-H., Niu D.-M., Lin R.-W., Chan P., Lin C.-Y. Structural analysis of the chimeric CYP21P/CYP21 gene in steroid 21-hydroxylase deficiency // J. Hum. Genet.- 2002.- V.47.-P. 517-522,.

45. Lejeune-Lenain C., Cantraine F., Dufrasnes M., Prevot F., Wolter R., Franckson J.R. An improved method for the detection of heterozygosity of congenital virilizing adrenal hyperplasia // Clin. Endocrinol. (Oxf.).-1980.- V.12.- P. 525-535.

46. Levine L. S., Zachmann M., New M. I., Prader, A.; Pollack, M. S., O'Neill G. J., Yang S. Y., Oberfield S. E., Dupont B. Genetic mapping of the 21-hydroxylase-deficiency gene within the HLA linkage group // New. Eng. J. Med.- 1978,- V.299.-P. 911-915.

47. Levine L. S., Dupont В., Lorenzen F. Cryptic 21-hydroxylase deficiency in families of patients witth classical congenital adrenal hyperplasia // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1980.- V.51.- P. 1316-1324.

48. Lee H., Chao H., Ng H., Choo K. Direct molecular diagnosis of CYP2I mutations in congenital adrenal hyperplasia // J Med Genet.- 1996.-V.33.- P. 371-375.

49. Lee H.H., Niu D.M. Lin R.W., Chan P., Lin C.Y. Structural analysis of the chimeric CYP21P/CYP21 gene in steroid 21-hydroxylase deficiency// J. Hum. Genet.- 2002,- V.47.- P. 517-522.

50. Mellon S.H., Miller W.L. Extraadrenal steroid 21-hydroxylation is not mediated by P450c21 // J. Clin. Invest.- 1989.- V.84.- P. 1497-1502.

51. Mercado A.B., Wilson R.C., Cheng K.C., Wei J.Q., New M.I. Prenatal treatment and diagnosis of congenital adrenal hyperplasia owing to steroid 21-hydroxylase deficiency // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1995.- V.80, №7,- P. 2014-2020.

52. Merke D.P., Chrousos G.P., Eisenhofer G., Weise M., Keil M.F., Rogol A.D., Van Wyk J.J., Bornstein S.R. Adrenomedullary dysplasia and hypofunction in patients with classic 21-hydroxylase deficiency // N. Engl. J. Med.- 2000.- V.343.- P. 1362-1368.

53. Meselson M., Radding C. A general model for genetic recombination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1975.- V.72.- P. 358-361.

54. Migeon C.J., Donohoue P.A. Congenital adrenal hyperplasia caused by 21-hydroxylase deficiency- its molecular basis and its remaining problems // Endocrinology and Metabolism Clinics of North America.-1991.- V. 20, №2,-P. 277-296.

55. Miller W.L., Levine L.S. Molecular and clinical advances in congenital adrenal hyperplasia//J. Pediatr.- 1987.- V.lll.-P. 1-17.

56. Miller W.L. Congenital adrenal hyperplasias // Endocrinol. Metab. Clin. North. Am.-1991.- V.20, №4.- P. 721-749.

57. Miller W.L. Phenotypic heterogeneity associated with the splicing mutation in congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency//J. Clin. Endocr. Metab.- 1997.- V.82.- P. 1304 .

58. Molinero L.L., Marcos C.Y., Mirbaha F., Fainboim L., Stastny P., Zwirner N.W. Codominant expression of the polymorphic MICA alloantigens encoded by genes in the HLA region. // Eur J Immunogenet. 2002. -V.29, №4.- P. 315-319.

59. Moore C.C.D., Miller W.L. The role of transcriptional regulation in steroid hormone biosynthesis // J.Steroid Biochem.-1991,- V.40.- P. 517522.

60. Moore C.C.D., Brentano S.T., Miller W.L. Human P450scc gene transcription is induced by cyclic AMP and repressed by 12-0-tetradecanolyphorbol-13-acetate and A23180 by independent cis-elements // Mol.Cell.Biol.- 1990.- V.10.- P. 6013-6023.

61. Morel Y., Miller W.L. Clinical and molecular genetics of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency.// Adv. Hum. Genet.-1991,- V.20.-P.l-67.

62. Morel Y., Bertrand J., Rappaport R. Disorder of Hormonosynthesis // Endocr. Rev.- 1992.- V.22.- P. 305-331.

63. Mornet E. Gibrat J-F. A 3D model of human P450c21: study of the putative effects of steroid 21-hydroxylase gene mutations // Hum. Genet.-2000.- V.106.- P. 330-339.

64. Mullis K.B, Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol.- 1987,- V.155.-P. 335-350.

65. New M.I., Peterson R.E. Disorders of aldosterone secretion in childhood // Pediatr. Clin. North. Am.- 1966.- V.13.- P. 43-58.

66. New M.L., White P.C., Pang S., Dupont В., Speiser P. The adrenal hyperplasias // In: The metabolic basis of inherited disease, 6th edn.( eds. Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D.), New York: McGraw-Hill.-1989.-P. 1881-1917.

67. Nikoshkov, A., Lajic S., Hoist M., Wedell A., Luthman H. Synergistic effect of partially inactivating mutations in steroid 21-hydroxylase deficiency//J. Clin. Endocr. Metab.- 1997.- V.82.- P. 194-199.

68. Ohlsson G., Muller J., Skakkebaek N.E., Schwartz M. Steroid 21-Hydrxylase Deficiency: Mutational Spectrum in Denmark, Three Novel Mutations, in Vitro Expression Analysis // Human Mutation.- 1999.-V.13.- P. 482-486.

69. Ohta T. Allelic and nonallelic homology of a supergene family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1983.- V.220.-P. 157-162.

70. Orta-Flores Z., Cantu J. M., Dominguez О. V., Reciprocal interactions of progesterone and 17-alpha-OH-progesterone as exogenous substrates for rat adrenal 21-hydroxylase. J. Steroid Biochem.- 1976.- V.7.- P. 761-767.

71. Owerbach D., Sherman L., Ballard A.L., Azziz R. Pro-453 to Ser mutation in CYP21 is associated with nonclassic steroid 21- hydroxylase deficiency//Mol. Endocrinol.- 1992,-V.6.-P. 1211-1215.

72. Pang S., Clark A. Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency: Newborn screening and its relationship to the diagnosis and treatment of the disorder// Screening.- 1993.- V.2.- P. 105.

73. Pociot F., McDermott M.F. Genetics of type 1 diabetes mellitus // Genes and Immunity.- 2002.- V.3.- P. 235-249.

74. Prader A., Anders G.J.P.A., Habich H. Zur Genetik des kongenitalen adrenogenitalen Syndroms (virilisierende Nebennierenhyperplasia) // Helv. Paediat. Acta.- 1962.- V.17.- P. 271-284.

75. Risch N. Assessing the role of HLA-linked and unlinked determinants of disease // Am. J. Hum. Genet.- 1987.- V. 40.- P. 1-14.

76. Robins Т., Barbara M., Lajic S., Wedell A. Not all amino acid cluster E6 mutation in CYP21 cause congenital adrenal hyperplasia // J. Clin Endocrinol. Metab.- V. 90, № 4.- P. 2148-2153.

77. Rodrigues N.R., Dunham L., Yu C.Y., Carroll M.C., Porter R.R., Campbell R.D. Molecular characterization of the HLA-linked steroid 21-hydroxylase В gene from an individual with congenital adrenal hyperplasia//EMBO J.- 1987.-V.6, №6.- P. 1653-1661.

78. Rosier A., Levine L.S., Schneider В., Novogroder M., New M.I. The interrelationship of sodium balance, plasma renin activity and ACTH incongenital adrenal hyperplasia // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1977.-V.45.- P. 500-512.

79. Ruuls S.R., Sedgwick J.D. Unlinking tumor necrosis factor biology from the major histocompatibility complex: Lessons from human genetics and animal models//Am. J. Hum. Gen.- 1999.- V. 65,- P.294-301.

80. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory manual.-2-ed. / Cold Spring Harbor Laboratory Press.-1989,- 1885 p.

81. Sherman S.L., Aston C.E., Morton N.E., Speiser P.W., New M.I. A segregation and linkage study of classical and nonclassical 21-hydroxylase deficiency // Am. J. Hum. Genet.-1988.- V.42.- P. 830-838.

82. Simopoulos A.P., Marshall J.R., Delea C.S., Bartter F.C. Studies on the deficiency of 21-hydroxylationin patients with congenital adrenal hyperplasia // J. Clin. Endocrinol. Metab.-1971.- V.32.- P. 438-443.

83. Speiser P. W., Dupont В., Rubinstein P., Piazza A., Kastelan A., New M. I. High frequency of nonclassical steroid 21-hydroxylase deficiency // Am. J. Hum. Genet.- 1985.- V.37.- P. 650-667.

84. Speiser P.W., New M.I. Genotype and hormonal phenotype in nonclassical 21-hydroxylase deficiency // J. Clin. .Endocrinol. Metab.-1987.- V.64.-P. 86-91.

85. Speiser P.W., New M.I., White P.C. Molecular genetic analysis of nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency associated with HLA-B14, DR1 // N. Engi. J. Med.- 1988.- V.319.- P. 19-23.

86. Speiser P.W., Agdere L., Ueshiba H., White P.C., New M.I. Aldosterone synthesis in salt-wasting congenital adrenal hyperplasia with completeabsence of adrenal 21-hydroxylase // N. Engl. J. Med.- 1991.- V.324.-P.145-149.

87. Suemizu H., Radosavljevic M., Kimura M., Sadahiro S., Yoshimura S,, Bahram S., Inoko H. A basolateral sorting motif in the MICA cytoplasmic tail // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 2002.- V.99, №5.- P. 2971-2976.

88. Suwa S. Nationwide survey of neonatal mass-screening for congenital adrenal hyperplasia in Japan// Screening.- 1994.- V.3.- P. 141-151.

89. Todd J.A. Genetic analysis of type 1 diabetes using whole genome approaches // Proc. Natl Acad. Sci. USA.- 1995,- V.92.- P. 8560-8565.

90. Todd J.A. Genetics of type 1 diabetes // Pathol Biol.- 1997,- V.45.- P. 219-227.

91. Townsend S., Dallman M.F., Miller W.L. Rat insulin-like growth factor -I and -II mRNAs are unchanged during compensatory adrenal growth but decrease during AHTG-induced adrenal growth // J.Biol. Chem.- 1990.-V.265.-P. 22117-22122.

92. Tusie-Luna M.T., Traktman P., White P.C. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus // J. Biol. Chem.- 1990.- V.265.- P. 20916— 20922.

93. Tusie-Luna M.T., Speiser P.W., Dumic M., New M.I., White P.C. A mutation (Pro-30 to Leu) in CYP21 represents a potential nonclassic steroid 21-hydroxylase deficiency allele // Mol. Endocrinol.- 1991.- V.5.-P. 685-692.

94. Tusie-Luna M.T, White P.C. Gene conversions and unequal crossovers between CYP21 (steroid 21-hydroxylase gene) and CYP21P involve different mechanisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995,- V.92.- P. 10796-10800.

95. Wassmuth R., Lernmark A., The genetics of susceptibility to diabetes // Clin. Immunol. Immunopathol.- 1989.- V.53, №3.- P. 358-399.

96. Waterman M.R., Simpson E.R. Regulation of steroid hydroxylase gene expression is multifactorial in nature // Recent Prog. Horm. Res.- 1989.-V.45.-P. 533-566.

97. Wedell A., Luthman H. Steroid 21-hydroxylase deficiency: two additional mutations in salt-wasting disease and rapid screening of disease-causing mutations // Hum. Mol, Genet.- 1993.- V.2.- P. 499-504.

98. Wedell A. An update on the molecular genetics of congenital adrenal hyperplasia: diagnostic and therapeutic aspects // J. Pediat. Endocr. Metab.- 1998.- V.ll.- P. 581-589.

99. White P.C., New M.I., Dupont B. Structure of human steroid 21-hydroxylase genes // Proc. Natl. Acad. Sci.USA.- 1986,- V.83.- P. 51115115.

100. White P.C., Speiser P.W. Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Deficiency // Endocrine Reviews.- 2000,- V.21, №3.- P. 245-291.

101. Wilson R.C., Mercado A.B., Cheng K.C., New M.I. Steroid 21-hydroxylase deficiency: genotype may not predict phenotype // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 1995.- V.80.- P. 2322-2329.

102. Witchel S. F., Bhamidipati D. K., Hoffman E. P., Cohen J. B. Phenotypic heterogeneity associated with the splicing mutation in congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency // J. Clin. Endocr. Metab.-1996.- V.81.- P. 4081-4088.

103. Witchel S.F., Lee P.A. Identification of heterozygotic carriers of 21-hydroxylase deficiency: sensitivity of ACTH stimulation tests // Am. J. Med. Genet.- 1998,- V.76.-P. 337-342.

104. Wu D.A., Chung B.C. Mutations of P450c21 (steroid 21-hydroxylase) at Cys428, Val281, and Ser268 result in complete, partial, or no loss of enzymatic activity, respectively // J. Clin. Invest.- 1991.- V.88.- P. 519523.

105. Wu D.A., Ни M.C., Chung Be. Expression and functional study of wild-type and mutant human cytochrome P450c21 in Saccharomyces cerejsiae. DNA//Cell. Biol.-1991.- V.10.- P.201-209.

106. Yamamoto K., Fujiyama Y., Andoh A., Bamba Т., Okabe H. Oxidative stress increases MICA and MICB gene expression in the human colon carcinoma cell line (CaCo-2) // BiochiMICA et Biophisica Acta.- 2001.-P. 10-12.

107. Yanase Т., Simpson E.R., Waterman M.R. 17a-Hydroxylase/17,20-lyase deficiency: from clinical investigation to molecular definitio // Endocr. Rev.-1991,- V.12.- P. 91-108.

108. Zwirner N.W., Fernades-Vina M.A., Statsny P. MICA, a new polymorphic HLA-related antigen, is expressed mainly by kerstinocytes, endothelial cells and monocytes // Immunogenetics.- 1998.- V.47.- P. 139-148.