Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селективный анализ кортикостероидных гормонов с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Черкасова, Ольга Павловна, Новосибирск

Сибирское отделение Российской Академии Наук Институт Лазерной физики Лаборатория биофизики волновых процессов

на правах рукописи

Черкасова Ольга Павловна

Селективный анализ кортикостероидных гормонов с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной

хроматографии

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(03.00.04 - биохимия)

Научный руководитель: д.б.н. В.И.Федоров

Новосибирск, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Биосинтез стероидных гормонов 10

1.2. Методы анализа кортикостероидых гормонов 23

1.2.1. Традиционные методы анализа 23

1.2.2. Хроматографические методы. 25

1.2.3. Микроколоночная хроматография 34

1.3. Методы выделения кортикостероидных гормонов из биологических

образцов 37

1.3.1. Экстракция органическими растворителями 37

1.3.2. Твердофазная экстракция 38

1.3.3. Обработка надпочечников 40

1.4. Содержание кортикостероидных гормонов в крови и надпочечниках в

интактном состоянии и при различных воздействиях 41

1.4.1. Содержание кортикостероидных гормонов в отдельных надпочечниках (асимметрия надпочечников по массе и продукции гормонов). 41

1.4.2. Содержание кортикостероидных гормонов в надпочечниках животных при различных воздействиях. 44

1.5. Постановка задачи исследования 51

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52

2.1. Схема эксперимента 52

2.2. Взятие анализируемого материала 53

2.3. Реактивы 53

2.4. Условия хроматографирования 53

2.5. Набивка хроматографических колонок 54

2.6. Вычисление площадей хроматографических пиков 54

2.7. Измерение времен удерживания 54

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 55

3.1. Разработка методики селективного определения кортикостероидных гормонов в плазме крови и ткани надпочечника человека и животных 55

3.1.1. Подбор условий хроматографического разделения 55

3.1.2. Экстракция кортикостероидных гормонов из сыворотки крови человека

60

3.1.3. Определение кортикостероидных гормонов в плазме крови крыс 70

3.1.4. Определение кортикостероидных гормонов в ткани надпочечника. 70

3.1.5. Обсуждение 77

3.2. Исследование содержания кортикостероидных гормонов в плазме крови и

ткани надпочечника у крыс в интактном состоянии и при хроническом воздействии 85

3.2.1. Концентрация кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови крыс первой группы 85

3.2.2. Содержание кортикостероидных гормонов в надпочечниках животных первой группы 86

3.2.3. Масса левого и правого надпочечника у крыс первой группы 90

3.2.4. Обсуждение 92

3.3. Исследование содержания кортикостероидных гормонов в плазме крови и

ткани надпочечника у крыс, подвергнутых острому воздействию 97

3.3.1. Концентрация кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови животных второй группы 97

3.3.2. Содержание кортикостероидных гормонов в надпочечниках крыс второй группы, подвергнутых острому оперативному вмешательству 98

3.3.3. Масса левого и правого надпочечника контрольных и подопытных животных второй группы при оперативном вмешательстве 104

3.3.4. Обсуждение 105 3.4. Исследование содержания кортикостероидных гормонов в плазме крови и

надпочечниках крыс через 6 месяцев после отмены хронического воздействия 111

3.4.1. Содержание кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови крыс третьей группы 111

3.4.2. Содержание кортикостероидных гормонов в надпочечниках животных третьей группы 112

3.4.3. Масса левого и правого надпочечника контрольных и подопытных животных третьей группы 117

3.4.4. Обсуждение 119 ВЫВОДЫ 124 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 126

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Кортикостероидные гормоны играют важную роль во всех процессах, происходящих в организме. От уровня функционирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы зависит существование самого организма. Поэтому своевременная и достоверная информация о функционировании надпочечников, о концентрации кортикостероидных гормонов в крови имеет большое научное и практическое значение.

Существует целый ряд хорошо известных и широко используемых в научной и медицинской практике методов анализа кортикостероидных гормонов. Среди них флюориметрические методы, радиоиммунный анализ и метод конкурентного белкового связывания. Все перечисленные методы анализа кортикостероидных гормонов недостаточно селективны, так как определяют суммарное значение целого ряда близких по структуре и функциям гормонов, что находит свое отражение в искажении результатов анализа как в научной, так и в клинической практике. Кроме того, существенным недостатком для всех перечисленных методов является то, что за одну процедуру определения упомянутые выше методы дают один показатель, для определения целого ряда гормонов необходимо большое количество крови, дополнительные временные и материальные затраты.

Наиболее селективными являются хроматографические методы анализа. Тонкослойная хроматография обладает низкой чувствительностью - около 100 нг на одно определение и требует большого количества крови или надпочечников от нескольких лабораторных животных. Анализ кортикостероидных гормонов газовой хроматографией требует получения летучих производных и проведения реакций дериватизации. Сложности возникают из-за того, что СП-боковая цепь является термически

неустойчивой и претерпевает деградацию при используемых повышенных температурах. Необходимость тщательной очистки гормонов, получение летучих производных, высокие требования к чистоте реактивов и дороговизна приборов ограничивают распространение методов газовой хроматографии как в научных, так и в клинических лабораториях.

Многие исследователи считают методы газовой хроматографии громоздкими и недостаточно точными и отдают предпочтение высокоэффективной жидкостной хроматографии, которая, используя те же закономерности разделения веществ, что и газовая, позволила существенно упростить пробоподготовку. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии лишены недостатков, характерных для всех упомянутых выше методов, не требуют, в большинстве случаев, реакций дериватизации, трудоемкой пробоподготовки.

В традиционной высокоэффективной жидкостной хроматографии используют аналитические хроматографические колонки длиной 250 мм и диаметром 4,6 мм и анализируют в крови человека, в основном кортизол, иногда кортизол и кортизон, а в крови крыс только кортикостерон.

Создание метода микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии открывает новые перспективы в количественном определении гормонов. Метод характеризуется высокой чувствительностью, селективностью и точностью анализа, оперативностью, что особенно важно в клинической практике. Одновременное уменьшение диаметра хроматографической колонки и ее длины привело к увеличению чувствительности в несколько раз по сравнению с традиционными методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, снизило расход дорогостоящих сорбентов и растворителей. Поскольку прямое перенесение и воспроизведение условий хроматографии и обработки проб, описанных в литературе для традиционной высокоэффективной жидкостной хроматографии, невозможно для микроколоночной хроматографии, ее

развитие повлекло за собой необходимость создания адекватных методов определения кортикостероидных гормонов, которые, используя преимущества данного вида хроматографии, позволили бы одновременно в одной пробе определять целый спектр кортикостероидных гормонов и их метаболитов, что не позволяют сделать существующие методы анализа.

В связи с этим, цель работы состояла в разработке методики селективного определения кортикостероидных гормонов в биологических образцах с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии и ее применении в экспериментальных исследованиях.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Подобрать оптимальные условия хроматографирования и подготовки проб для количественного определения кортикостероидных гормонов в биологических жидкостях и тканях методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2) Исследовать содержание кортикостероидных гормонов в крови и надпочечниках у крыс в интактном состоянии, при лапаротомии, потреблении безотрубевой диеты и при различном возрасте.

Научная новизна

Методика определения кортикостероидных гормонов в крови и надпочечниках человека и лабораторных животных с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет в одной пробе одновременно определять все классы кортикостероидных гормонов, секретируемых корой надпочечников: глюкокортикоиды, минералокортикоиды и андрогены. Селективность данной методики такова, что наиболее распространенные в гормональной кортикостероидной терапии препараты (дексаметазон и преднизолон) не влияют на определение эндогенных стероидных гормонов.

Получены оригинальные данные по содержанию кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови крыс в интактных условиях, при лапаротомии и при различном возрасте .

Предложен оригинальный способ обработки надпочечников, благодаря которому в одном надпочечнике крысы одновременно можно определить альдостерон, дезоксикортикостерон, кортикостерон и 11-дегидрокортикостерон.

Прослежена динамика изменений глюко- и минералокортикоидной функции надпочечников у животных различного возраста и при лапаротомии.

Показана асимметрия надпочечников крыс по содержанию альдостерона, дезоксикортикостерона, кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона, а также изменение характера асимметрии при различных воздействиях.

Показано влияние безотрубевой диеты на концентрации кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в плазме крови, а также содержание альдостерона, дезоксикортикостерона, кортикостерона и 11-дегидрокортикостерона в надпочечниках крыс.

Практическая ценность работы

Методика позволяет в одной пробе крови человека и животных оперативно определять концентрации целого ряда жизненно важных кортикостероидных гормонов, что имеет большое научное и практическое значение для биологии и медицины. Данная методика также позволяет определять содержание кортикостероидных гормонов в ткани надпочечниках, что имеет значение для дифференциальной диагностики.

При разработке диет и внедрении различных пищевых добавок в рацион человека и животных необходимо учитывать баланс глюкокортикоидной и минералокортикоидной функций надпочечников.

Внедрение результатов работы

Метод определения кортикостероидных гормонов в крови человека утвержден Министерством здравоохранения СССР в качестве методической рекомендации для клинического применения (решение № 10-11/37 от 01.04.91) и внедрен в ряде лечебно-профилактических и научно-исследовательских учреждений СНГ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Методика определения кортикостероидных гормонов с помощью микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии дает преимущества по сравнению с традиционной высокоэффективной жидкостной хроматографией в достижении более высокой селективности и чувствительности.

2. Существует асимметрия надпочечников по содержанию альдостерона, дезоксикортикостерона, кортикостерона и 11 -дегидрокортикостерона. Характер асимметрии изменяется при различных воздействиях.

3. Безотрубевая диета вызывает активизацию коры надпочечников и изменение характера асимметрии.

Апробация работы

Материалы диссертации обсуждены:

-на IV Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата, 1987г.)

-на 2-й международной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины" (Бишкек, 1995 г.)

-на международной конференции, посвященной 75-летию со дня рождения профессора М.Г.Колпакова "Эндокринные механизмы регуляции функций в норме и патологии" (Новосибирск, 1997 г.)

-на международной научно-практической конференции "Природные минералы на службе человека (минеральная среда и жизнь)" (Новосибирск, 1997 г.)

-на международном симпозиуме "Итоги и перспективы развития современной медицины в контексте XXI века" (Бишкек, 1998 г.)

-на 1-й международной конференции "Педагогические и медицинские проблемы валеологии" (Новосибирск, 1999 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (гл.1), описания материалов и методов исследования (гл.2), изложения результатов собственных исследований и их обсуждение (гл.З), выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 144 страницах машинописного текста, включая 22 таблицы и 18 рисунков. Список использованной литературы насчитывает 204 названий работ, из них 160 иностранных.

1. Глава 1. Обзор литературы

1.1 . Биосинтез стероидных гормонов

Все стероидные гормоны являются производными циклопентафенантренового ряда и состоят из четырех колец А,В,С и Д (рис. 1) [Сергеев П.В.,1984]. Гормоны, секретируемые корой надпочечников, условно делятся на три группы: глюкокортикоиды (кортикостероиды, влияющие на обмен углеводов, белков, жиров и нуклеиновых кислот), минералокортикоиды (кортикостероиды, влияющие на обмен солей и воды) и андрогены.

Основные этапы биосинтеза стероидных гормонов изучены достаточно хорошо и представлены в работах Юдаева Н.А.(1976), Соффер Л. (1966) и др.

Предшественником всех стероидных гормонов является холестерин. В организме млекопитающих ферменты, катализирующие реакции превращения холестерина в стероидные гормоны, сосредоточены главным образом в надпочечниках, семенниках, желтом теле и плаценте.

Рисунок 1. Нумерация углеродных атомов в молекуле стероида

Схема биосинтеза стероидных гормонов представлена на рис. 2. Превращение холестерина начинается с его гидроксилирования в 20а- или 22Я-положении с образованием монооксипроизводных холестерина и затем 20а,2211-диоксихолестерина. Последнее соединение после отщепления боковой цепи образует прегненолон и изокапроновый альдегид [Юдаев, 1976; Gower, 1988]. Окисление боковой цепи холестерина происходит в митохондриях и является начальным и лимитирующим этапом стероидогенеза. Эта реакция происходит при участии цитохрома Р-450 и требует присутствия Ог и НАДФН. Далее прегненолон может гидроксилироваться в разных положениях и превращаться в прогестерон, 17а-оксипрегненолон, 11 Р-оксипрегненолон, 21-оксипрегненолон, 17а,21-диоксипрегненолон и 18-оксипрегненолон, которые, в свою очередь, претерпевают дальнейшие превращения.

В микросомах коры надпочечников при участии 17а-гидроксилазы, НАДФ, 02 и цитохрома Р-450 прогестерон превращается в 17а-оксипрогестерон. Эти два стероида являются субстратами для другого фермента микросом - 21-гидроксилазы, которая катализирует образование 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола. Эти 11-дезоксикортикостероиды транспортируются в митохондрии и при участии 11 (З-гидроксилазы, локализованной во внутренних мембранах этих органелл, превращаются в кортикостерон и кортизол [Prader е.а., 1985].

В клетках клубочковой зоны 17-гидроксилаза относительно неактивна, но в митохондриях данных клеток отмечается высокая активность 18-гидроксилазы и 18-дегидрогеназы, которые катализируют превращение кортикостерона в альдостерон и связаны с внутренней митохондриальной мембраной [Gover, 1988]. Однако кортикостерон не единственный предшественник на пути образования альдостерона. Было показано, что у крыс образование альдостерона может идти и через прегненолон, минуя

сн,

¿Н-СВ^СН,

17-гццроксилаза ►

20а-окснхолнстерин

22!К.-гидроксилаза митохондрии

СН, ОН

¿н—сн^сн,

¿к'

сн, сн,

20сс-гидроксилаза -►

22К-оксихолестерин

Рис. 2. Схема биосинтеза кортикостероидных гормонов в надпочечниках

А - прегненолон

17а - ОН - Д - 17а-оксипрегненолон

17а, 21 - ОН - А - 17а, 21-диоксипрегненолон

18 - ОН - Д - 18-оксипрегненолон

11Р - ОН - Д - 11 (3-оксипрегненолон

21 - ОН - Д - 21-оксипрегненолон

11(3, 21 - ОН - А - 11(3, 21-диоксипрегненолон

П - прогестерон

ДОК - 11-дезоксикортикостерон

В - кортикостерон

А - 11-дегидрокортикостерон

Б - 11-дезоксикортизол

Б - кортизол

Е- кортизон

18 - ОН - В - 18-оксикортикостерон

18 - ОН - ДОК - 18-оксидезоксикортикостерон

18 - он -ДОК

18-ОН-4

стадию образования прогестерона через промежуточное образование 21-оксипрегненолона, 11 ß,21 -диоксипрегненолона и 18-оксипрегненолона [Юдаев,1976].

Основным кортикостероидным гормоном у крыс является кортикостерон. Под действием фермента 11 ß-оксистероиддегидрогеназы происходят взаимопревращения кортикостерона в 11-дегидрокортикостерон (вещество А) и кортизола в кортизон.

Фермент 11 ß-оксистероиддегидрогеназа (llß-ОСД, ЕС 1.1.1.146) широко распространен в организме человека и животных [Lopez Bernai А е.а., 1981; Юдаев,1976; Пыцкий, 1976]. Этот фермент осуществляет взаимопревращения 11-оксикортикостероидов и 11-кетостероидов. В организме крыс он осущес