Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ ПОЛУЧЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ ПОЛУЧЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА - ■ ' И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

- - На правах рукописи

УДК 576.852.23.095.383.547.915 УМНОВА Эвелина Федоровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ ПОЛУЧЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ

- Специальность 03.00.07 — микробиология

. Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

о /' '-¿V '' ' -

/ ( 1

/ I

I

Работа выполнена в лаборатории ХФК «Акрихин» (Купавна Московской обл.) и на кафедре микробиологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Воробьева Л. И.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, про фессор Суворов Н. Н., кандидат биологических наук Тропина В. И.

Ведущая организация — Институт органической химии РАН.

Защита диссертации состоится «^С» . »-М-*?^ . 1992 г.

в час. на заседании специализирован^ совета

К. 20 35.06 в Московской сельскохозяйственной гни им.

К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, • шрязев-ская, 49. Ученый совет ТСХ/ .

С диссертацией » о озк в Пт vA.

Автореферат разослъ . 02 г.

Ученый секрет специализированно!о ^

кандидат биологич

/

Л. В. Мосина

Введение гидроксильноЗ группы в стероидную молекулу представляет собой одну из ключевых реакций в синтезе высокоэффективных стероидных лекарственных средств- Большинство лекарственных препаратов противовоспалительного действия стероидной природы являются производными преднизолона, природного соединения, содержащего Ир-гидроксигруппу. Именно этим определяется важная роль процессов Щ-гидроксилирования вещества S Рейхштейна и его аналогов. •

Микробиологическая трансформация стероидов отличается стерео-

специфичностью и региоспецифичностыо, недоступными с помощью чисто химических методов, которые требуют защиты сразу нескольких положения громоздкой молекулы субстрата для проведения целенаправленной реакции.

В настоящее время известно множество микроорганизмов, используемых для трансформации стероидов. Прикладное значение имеют такие грибные культуры, как Curvularia lunata . и Tieghe-' mella orchidls , обладающие Пр-гидроксилиругацей активностью.

Интенсификация микробиологических процессов с целью увеличения производства стероидных гормонов приводит к необходимости углубленного изучения микробиологических трансформаций. В синтезе гидрокортизона, дексаметазона, синафлана используют ряд стероидных субстратов, отличающихся присутствием в молекуле различных заместителей. При разработке биотехнологии кортикоидов необходимо учитывать кинетические закономерности их ферментативного превращения.

Физико-химические особенности биотрансформации, такие как

концентрация и способ введения исходного стероида в трансформационную среду, присутствие в ней растворителей и их концентрация, размер и форма кристаллов стероида в конечном счете определяют эффективность всего процесса.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ TI НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. сольск»,ч<> <í •'аДвмии и,л. К. А. /(■¡мир.'^еаа

инв. HbJbSÉZSi

, Физиологическое состояние микроорганизмов перед контактом со стероидом и во время биоконверсии обуславливается составом питательной среды» способом отделения выращенной биомассы от остатков питательной среды, если используют неразмножающиеся клетки, присутствием в трансформационной культуральной жидкости активаторов или ингибиторов реакции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в комплексном изучении ферментативного Нь-гидроксилирования кортикостероидных соединений грибами Сшлт1аг1а ЗлтаЪа 3? /70 и Песете 11а огсЬ1<11з Р /74 для выявления факторов интенсификации процесса микробиологической трансформации.

Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетические и некоторые физико-химические особенности Пб-гидроксилирования различных кортикостероидов, отличающихся присутствием различных заместителей в молекуле.

2. Определить факторы, влияющие на физиологическое состояние культур и их трансформационную активность.

3. Выделить и «идентифицировать пигменты гриба С.1апе4а

а также исследовать соотношение процессов пигментогенеза и гид-роксилирования.

НАУЧНАЯ ЬОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенного исследования установлено, что эффективность Пб-гидроксилирования производных вещества з Рейхштейна грибом С.гипаНа определяется химическим строением исходного стероида и способом его введения в транформационную среду. Усложнение химического строения стероида приводит к снижению скорости реакции, а исключение органического растворителя из состава среды трансформации - к падению выхода Щ-гидроксипродуктов.

Показана способность гриба С. 1ипа1;а к избирательному гидро-

- лизу I'?-!.- и 21-ацетоксигрупп в зависимости от рН среды. Ферментативный гидролиз сопряжен со снижением баланса стероидов. Дисбаланс нарастает по мере.увеличения концентрации стероидного * субстрата.

Изучены и выявлены оптимальные условия индуцирования гид-роксилазной активности у гриба С. luneta в неростовых условиях. Длительность периода индукции не превышает трех часов. Индукция фермента подавляется метанолом и нуждается в меньшем насыщении среды кислородом, чем его экспрессия.

Активность трансформирующей культуры зависит от способа ее отделения от остатков питательной среды. Частичная инактивация, возникающая после сепарации биомассы или длительного голодания, может быть восстановлена с помощью инкубации мицелия в растворе глюкозы. . •

В результате проведенного исследования показана четкая зависимость трансформирующей активности другой гидроксилирующей культуры, Tieghemelia oxchidis Р /74,от состава питательной среды. Оптимизация состава среды позволила повысить выход продукта при сокращении длительности реакции в синтезе синафлана, фторсодержащего кортикостероида, на 10%. Качество субстанции, как установлено, находится в прямой зависимости от интенсивности окраски трансформационной среды, которую можно регулировать исходным значением рН и содержанием органических компонентов.

Впервые выделены черный и розовый пигменты стероидгидрокси-лирующей культуры С. luneta ^ q помощью качественных реакций черный пигмент идентифицирован, как меланин. На основании данных УФ-, ИК- и масс-спектрометрии предложена структура розового пигмента, который накапливается при торможении биосинтеза меланина и, вероятно, является его интермедиатом.■

Установлена вторичная метаболическая природа меланина, а

также взаимосвязь его формирования с процессами окисления экзогенных субстратов, таких, как глюкоза и кортикостероиды.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННЭСГЬ. Предложена технология биотрансформации V7Á, 21-дигидрокси-16л-метил-прегн-4-ен-3,20-диона, полупродукта в синтезе дексаметазона, отличающаяся способом внесения стероидного субстрата в трансформационную среду. Новый способ обеспечивает сокращение длительности IIp-гидроксилирования и стабилизацию выхода продукта.

В отчичие от известного способа получения r¡4-ацетата гидрокортизона из 17,21-диацетата,17<*,21-дигидрокси-прегн-4-ен--3,20-диона с использованием культуры рода Corynebacteriun и Curvularis luneta разработана биотехнология превращения этого субстрата в гидрокортизон с помощью единственно? трансформирующей культуры C.iuna-ta . Увеличение выхода продукта составляет около I05Í по сравнению с получением гидрокортизона из вещества S Релхштейна.

Предложено использовать для 11 ¡ь-гидроксилирования кортико-стероидов реактивированную культуру C.lunata , обеспечивающую в промышленных условиях увеличение производительности микробиологической трансформации вещества S Рейхштейна в 1,5-2,0 раза за счет увеличения его концентрации в трансформационной среде от 1,0 г/л до 1,5-2,0 г/л. Метод реактивации культуры позволяет также осуществлять в промышленных условиях гидроксилирование трудно доступного 17-ацетата ГМ,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20--диона. Повышение выхода Пр-оксипродукта на ¿(Л в этом случае происходит за счет экранирования I-U- положения з стероидной мопекуче. Работа апробирована в условиях производства стероидных гормонов на ХФК "Акрихин". Предложенный метод реактивации кучьтуры создает базу для расширенного производства кортикосте-роидных чекарственных препаратов.

Оптимизирован состав среды для выращивания трансформационной культуры и проведения трансформации I6J*, 17<*,21-тригидрокси--б^-фтор-прегна-4-ен-З,20-диона 16,17-ацетонида. Среда обеспечивает сокращение длительности реакции гидроксилирования, повышение выхода продукта более, чем на 10% и улучшение качества получаемой субстанции. Эффект от использования оптимизированной »

среды в производстве синафлана на ХФК "Акрихин" составил около 200 тысяч рублей.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации получено I авторское свидетельство на изобретение, опубликованы' 9 печатных работ и рефераты 4 отчетов о ДОР. Результаты исследований изложены на заседании кафедры микробиологии биологического факультета Московского университета.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (3 главы), материалов и методов, результатов исследования (3 главы), обсуждения результатов, практического использования полученных результатов, выводов, списка используемой литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 182 страницах машинописного текста, содержат 28 таблиц, 32 рисунка. Список литературы включает 225 источников.

ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬ,ЧАЯ ЧАСТЬ.

Объект и методы исследования. Объект исследования представ-ЧЯЛИ штаммы грибов Curvularici limeta и Tie¿¡iemella orchidis, соответствующие коллекционным культурам F А0 и ï/74 из Всесоюзно'1 коллекции промышленных микроорганизмов. Эти культуры обладают стероидгидроксилирующей активностью, основным продуктом трансформации является Пв-гидроксипроизводное.

Культуры хранили в лиофильно-высушенном состоянии в ампулах. Содержимое ампул использовали для засева твердых сред в

пробирках. Выращенную исходную культуру пересевали на среды того же состава для получения рабочих кутьтур, которыми инокута-ровали жидкие среды. Для проведения трансформации применяли инмулят третьей генерации на жидкой среде, выращенный в аэрируемых условиях.

Трансформировали следующие стероидные субстраты:

, где

к2' : Н

: С0СН3

Rj.R2.R3: И; : СОСН3

И1, К2 :

, ^ ! СОСН3 ! СН3

81.: Р; »4 :

\

к2 и к3

/ /С\

СНп

СЧл

17л,21-дигидрокси-прегн-4-ен-З,20-дион (вещество Б Рейхштейна)

17-ацетат 17<,21-дигидрокси-прегн-4--ен-3,20-циона С17*-ацетат б )

21-ацетат 17а ,21-дигидрокси-прегн-4-ен--3,20-диона (21-ацетат б )

17,21-диацетат 17л,21-дигидрокси-прегн--4-ен-3,20-диона (17А,21-диацетат з )

ГМ,21-дигидрокси-16а1-метил-прегн-4--ен-3,20-дион (1бл-метил-з)

1бл, 17л,21-тригидрокси-6л-фтор-прегн--4-ен-З,20-диона 16,17-ацетонид

Стероиды вносили в культуральную жидкость в виде микрони-зированной водной суспензии или метанольного раствора. Содержание стероидов определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Силуфол УФ-254 полуколичественно; количественный анализ проводили на спектрофотометре СФ-26 или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Милихром".

Содержание аммонийного азота определяли методом отгонку глюкозы-с помощью антронового реактива.

Черный пигмент гриба Curvularia lunata выделяли после кислотного или щелочного гидролиза мицелия при автоклавировании, розовый пигмент - экстракцией хлороформом и последующей препаративной хроматографией. Пигменты идентифицировали с помощью качественных реакций на меланин, ИК-, УФ- и масс-спектрометрии. ИК-спектры черного пигмента снимали в вазелиновом масле, розового - в пленке на спектрофотометре Ш-20 (ГДР), поглощение в. ультрафиолетовой и видимой областях спектра - на спектрофотометре Csry (Япония). Масс-спектр розового пигмента снимали на приборе Финиган - Мат 4615 с прямым вводом вещества в ионный источник при энергии ионизирующих электронов 70 эв с использованием в качестве газа-реагента аммиака.

ОСЮВШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Основная задача исследования-интенсификация процесса Пб--гидроксилирования кортикостероидных гормонов культурами грибов Curvularia luneta и Tiegliemella orchidis.

В этом плане.рассматривали два аспекта: увеличение выхода продуктов микробиологической трансформации и увеличение её производительности.

Изучение кинетических и физико-химических особенностей

11£>-гвдроксилирования кортикостероидных соединений.

Кинетика IIft-гидроксилирования грибом С. lunata. Введение

некоторых заместителей в молекулу стероидного субстрата позволяет получать лекарственные соединения, отличающиеся более высокой эффективностью, чем гидрокортизон или преднизолон: такие как дексаметазон, синафлан, а также обеспечивает повышение выхода Пр-оксипродукта за счет экранирования 14л-положения в случае 1";Уч-ацетатов.

Исследование кинетики Пр>-гидроксилирования этих соединений показало, что наиболее доступным для монооксигеназной системы гриба С. 1апа£а является 17л,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20-дион (вещество Б ), в меньшей степени 17-ацетат 17л,21-дигидрокси-прегн-4-ен-З,£С-диона (17А-ацетат г) и Г*".,£1-дигидрокси-16Л--метил-прегн-4-ен-З,20-дион (1бЛ-метил-3), судя по максимальной скорости реакции и значениям константы Михаэлиса (•»С'4; 45 мкМ«час~*: г-1 и 5,0; 1,0; 0,83 мМ соответственно). Микробиологическая пригодность этих субстратов к трансформации определяется особенностями их химического строения и не зависит от растворимости. Так, увеличение растворимости от 8,8 мгДОО мл при переходе от вещества г к 17л-ацетату з до 27,1 мг/100 мл не обеспечивало увеличение скорости реакции окисления, а при близ- » ких значениях растворимости вещества б и 16а-метил -э (8,8 и 10,3 мг/100 мл) максимальная скорость гидроксилирования первого субстрата была в 9 раз выше второго.

Увеличение растворимости индивидуальных соединений с помощью введения в реакционную среду метанола или циклодекстри-на не приводило к увеличению скорости ферментативной реакции.

Трансформация 17<ч,21-дигидрокси-16л-метил-прегн-4-ен-3,,20--диона (1&Л-метил- я ). Синтез дексаметазона включает реакцию Нр>-гидроксилирования Хбл-метил- Э. Способ подготовки этого субстрата к трансформации определяет эффективность процесса: его скорость и выход. Растворение 16^-метил- з в метаноле и введе-

ние полученного раствора в культуральную трансформационную жидкость обеспечивало более высокий выход продукта, чем при механическом измельчении стероида. Однако метанол ингибировал начало процесса трансформации, что связано с увеличением длительности гидроксилирования. Обнаружена способность 16^-метил-З образовывать при рекристаллизации в водной среде из метанольно-го раствора полиморфные кристаллы, достигающие в некоторых случаях 80-100 микрон. Для достижения высокой скорости растворения стероида и его трансформации размер кристаллов не должен превышать 15 микрон.

Токсическое воздействие растворителя удалось элиминировать при введении метанола в концентрации 2-3% через несколько часов после контакта гидроксилирующей культуры со стероидом, который измельчали в этом случае механическим цутем. Такой способ подготовки субстрата позволил при минимальной длительности трансформации стабилизировать высокий выход Ilp-оксипродукта.

Трансформация 17,21-диацетата 17.*. 21-дигидрокси-гтрегн-4-ен--3-20-диона (I7c>v,21-диацетата S ). Культура С. luneta обладает способностью гидроксилировать кроме 11^-положения и другие позиции стероидной молекулы. Поэтому при трансформации вещества s Рейхштейна образуются нежелательные примеси, преимущественно 14*-оксисоединение в количестве до 20-25$. Известно, что защита 17-го углеродного атома, например остатком уксусной кислоты, обеспечивает экранирование 14^-позиции, вследствие чего повышается направленность микробиологического IIf>-гидроксилирования.

В качестве ацетилированных субстратов использовали I7ok-ацетат s и 17<*,21-диацетат S . Трансформация этих соединений затруднена по сравнению с веществом s , однако выход оксипро-дукта в случае ТТЛ.-ацетата- s достигал 90%. Установлено, что способ введения в трансформационную среду 17Л,21-диацетата s ,

как и 1бл-мети1- , определяет выход целевого П^-сксипродукта. Трансформация с использованием метанольного раствора с}5страта проходила с существенно большим выходом, чем в отсутствие метанола. Токсическое действие растворителя на трансформационную культуру при концентрации 17*,21-диацетата S 0,5 г/л и l,bf об метанола не проявлялось. Повышение нагрузки стероида до I г/л, сопоставимо" с гидроксилированием вещества s , приводило к необходимости увеличить концентрацию растворителя до об. При этом трансформация замедлялась, а выход продукта падал.

Гидровизирующая активность культуры С Д ar.rtt- . Исследовали способность культуры гидролизу 21- л -ацетатов кортикосте-роидов. Оптимагьными условиями д-я г-грсиэа 21-ацетоксигруппы в молекуле Г^.гГ-диацетата ь являйся р" среды око^о 6,С; при снижении рН субстрат утилизировался медленнее, гидролиз 17А-аце-тата S практически не происходил. Повышение рН среды до 7,0-8,С приводило к отщеплению ацетоксигруппы в 17^-позиции и тем быстрее, чем выше значение pli среды.

Способность культуры C.lvr.atn к избирательному гидролизу можно использовать для получения из 17л ,21-диацетата s 17^-аце-" тата s , его Ilf- -гидроксилирования и последующего гидролиза 17а--ацетата гидрокортизона с образованием целевого продукта - гидрокортизона - без выделения из культуральноР жидкости полупродуктов. Фактором регуляции последовательности реакций является принудительное изменение рН среды трансформации. При концентрации субстрата I7K,21-диацетата û 0,5 г/л увеличение выхода гидрокортизона составило 7-10^ по сравнению с П^-гидроксилированием вещества s Рейштейна.

Трансформация 17*,21-диацетата ь с концентрацией более 0,5 г/л приводила к дисбалансу исходного стероида и продуктов реакции. Показано снижение содержания продуктов при дезацетили-

ровании ряда субстратов: 21-ацетата s , 17л-ацетата гидрокортизона и I7Á,21-диацетата S. Возможно, что образующаяся в результате омыления ацетилированных стероидов уксусная кислота индуцирует усиление в клетках гриба метаболических путей использования углерода стероидного происхождения, т.е. деструкции стероидного скелета. Известно, например, накопление на фоне гидролиза 17л--ацетата гидрокортизона значительного количества микотоксина радицинина ( otridevsky , i960).

Влияние некоторых факторов на трансформационную активность культур С. lunete и T.orcïiidie.

Индукция. Индукцию трансформационной активности гриба С. lunsta изучали в неростовых условиях. Культура проявляла максимальную активность через 2-3 часа после контакта с индуктором-субстратом. В отсутствии стероидного субстрата гидроксилирующая активность снижалась.

Показано, что метанол подавляет формирование гидроксилазной активности у исследуемой культуры. Вероятно^ этим объясняется

снижение токсичности растворителя для процесса гидрокси-чирования в случае введения его в трансформационную среду после завершения индукции. В отличие от биосинтеза бактериальной 15р--стероидгидроксияазы Baoillug negsterium .подавляемого в присутствии стероидов (Bers, 1981), увеличение концентрации индуктора не тормозило индукцию IIô-гидроксилирующей активности гриба С • J llanta. 4 .

Установлено, что индуцирование фермента происходит эффективней при меньшем насыщении среды кислородом по сравнению с оптимальным в процессе трансформации. Аналогичный эффект известен для монооксигеназных систем некоторых других микроорганизмов, таких как aiit?,opus nisricnnn (Hanish ,1980), Pellicnlarle filamentosa (Clorlc,

Ввделение стадии индукции в биотехнологии кортикостероидов не обязательно, т.к. индуктором IIр-гздроксилазной активности может служить непосредственно субстрат трансформации.

Реактивация гидроксилирующей активности у СДдпа-ta . Для трансформации стероидов использовали покоящуюся культуру, т.к. в присутствии источников азотного и углеродного питания выявлено замедление реакции. Выращенную биомассу отделяли от остатков питательной среды с помощью фильтрации или сепарации в промышленных условиях. Установлено, что последняя приводит к частичной инактивации культуры. Снижение II р> -гвдроксилирующей активности можно моделировать с помощью преинкубации трансформирующей культуры в воде или фосфатном буфере.

В ходе трансформации, осуществляемой отсепарированной культурой, наблюдали торможение накопления продукта реакции. Длительность торможения зависела от концентрации стероидного субстрата и его химической структуры (рис.1).

гидрокортизон, мг/мл

гидрокортизона,

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

100

Рис.1. Зависимость длительности периода торможения от

исходного стероида. Гидроксилирование вещества 5 с нагрузкой 1-1 г/л, 2-2 г/л, 3 - 17<>1 -ацетата 8 с нагрузкой 0,6 г/л.

При трансформации наиболее доступного субстрата, вещества Б с нагрузкой I г/т (I), вслед за коротким периодом торможения наступата самопроизвочьная реактивация, достаточная для успешного завершения реакции. Увеличение нагрузки (2) или введение заместителей в молекулу вещества ь (3) было связано с увеличением длительности торможения, неполной трансформацией субстрата и образованием сильнополярных побочных продуктов.

Предложен метод реактивации отсепарированной или подвергнутой длительному голоданию культуры, который заключается в преин-кубации мицелия в 0,3 - 0,55? растворе глюкозы. Обработка глюкозой полностью элиминировала торможение, либо снижала его длительность. Уровень активности культуры оказывался достаточным для реализации рассмотренных выше процессов (рис. 2). Гидрокортизон,

мг/мя 17=1.-ацетат гидрокортизона.

% к исходному

1,21

Рис. 2. Глюкозная реактивация культуры С.

Гидроксилирование вещества 5 с нагрузкой I - 1,5 г/л; 2 - 2 г/л; 17л-ацетата 5 с нагрузкой 0,6 г/л -3

Метод глюкозно^ реактивации позволяет в промышленных условиях повысить производительность микробиологической трансформации вешества ь в 1,5 - 2,0 раза за счет увеличения его концентрации

в трансформационной среде от 1,0 г/л до 1,5 - 2,0 г/л, а также осуществлять гидроксилирование трудно доступного ГМ-ацетата Б. Использование последнего субстрата обеспечивает повышение выхода продукта по сравнению с биоконверсией вещества Б на 205?.

Оптимизация состава питательной среды в синтезе синафлана. В многостадийном синтезе фторированного кортикостероида синафлана введение гидроксильной группы в 11^-положение стероидной молекулы осуществляли с помощью гриба ИееИетеНа огсМсИз .

Выращенную биомассу не отделяли от остатков питательной среды, »

т.к. отсепарированная культура полностью инактивируется. Питательная среда в этом случае,кроме обеспечения достаточного накопления биомассы и высокой активности культуры, должна не мешать извлечение продукта.

Исходная среда Р имела интенсивно коричневый цвет. Продукт, выделенный из культуральной жидкости методом экстракции и упаривания, представлял собой вязкую темно-коричневую аморфную массу. С целью снижения интенсивности окраски среды изменен её состав в сторону обеднения. Проверена микробиологическая пригодность нескольких питательных сред измененного состава. Выращенная на этих средах культура накапливала меньшую биомассу, чем на исходной среде, однако сохраняла высокую гидроксилирующую активность. Продукт, полученный с использованием самой светлой модифицированной среды Ру, отличался высоким качеством: сыпучая субстанция имела кремовый цвет.

На втором этапе подобрана среда", критерием пригодности которой служило повышение выхода целевого продукта. Среда с условным названием "А" обеспечивала трансформацию исходного стероида 16А,17<Л,21-тригидрокси-б«М>тор-прегн-4-ен-3,20-диона 16,17-аце-тонида с более высоким быходом, чем контрольная среда Р^; достиг нутое на среде Рд качество продукта сохранялось (табл. I).

I I

Таблица I.

Влияние состава питательной среды на процесс Пр-гидроксилированид в синтезе синафлана*

Комп

)ненты среды, %

Трансформационная .культура_

Содержание продукта в культуральноя жидкости

«5 ГОИ

щ

к га

I

о р.

ЙМ

я а ш ч о ОЗЗ нов X о к ш а! Ж 3 2 се В.О с. ю я С •В*о о

е?

&

(М

с?

о

см «

<

о

и

Биомасса, РН г/л

в % к за- в % к загру-груженному женному на 1г биомассы

р 3,0 1,0 0,3 0,5 - 0,5 - - - 5,84 4,36 69,6 11,9

р3 2,0 - 0,2 0,5 - 0,5 - - - 5,57 4,06 70,8 12,7

А 1,0 - 0,5 0,3 0,7 0,1 0,04 0,03 5,32 3,56 80,2 15,1

х Данные таблицы I представляют собой результаты испытания сред в 40 повторностях каждого варианта в ферментерах.

Установлено, что интенсивность окраски среды А после стерилизации зависит от её кислотности. Так, поглощение средой в видимой части света резко возрастало при её защелачивании, в то время как в отсутствие глюкозы оптическая плотность среды мало изменялась при увеличении рН. Последнее справедливо и для 0,2 % раствора глюкозы.

Полученные результаты подтверждают имеющиеся в литературе Нилов, 1965) данные о том, что в присутствии растворенных азотистых веществ и Сахаров могут образовываться темноокрашенные продукты их взаимодействия. Такие соединения недоступны для микроорганизмов в качестве источников питания. Поэтому установление светлой окраски среды Л с помощью изменения рН способствует повышению не только качества продукта трансформации, но и биологической полноценности питательной среды табл.2).

Таблица 2.

Зависимость накопления биомассы и содержания глюкозы в среде А от исходного значения рН.

рН среды до стерилизации

Среда А 2,0 4,0 5,0 5,6 6,0 7,0 8,0

Биомасса, г/л - 3,6 4,0 4,7 5,4 - 5,8

Содержание глюкозы после стерилизации % к исходному 90 91 94 84 79 74

Оптимальным можно считать интервал значений. р*Л 5,5-6,0, в котором возможно получение светлой среды, незначительные потери глюкозы в

процессе стерилизации и накопление биомассы, достаточной для успешного IIр-гидроксилирования. Использование оптимизированной по составу и рН среды А вместо исходной среды Р обеспечило увеличение содержания гидроксилированного продукта на 10 % (табл.I). Экономический эффект от

внедрения этой разработки на ХФК "Акрихин" в производстве синафлана составил около 200 тыс. рублей.

ИЗУЧЕНИЕ ПИГМЕНТОВ ГРИБА С.ил^А.

Выделение и идентификация черного пигмента. Гриб С.1и-и4р обладает способностью к пигментообразованию. По мере старения мицелия цвет его изменяется от соломенно-желтого до темно-оливкового. Пигмент гриба С.гилиго прочно связан с клетками. Экстракция I Р щелочью или концентрированной кислотой приводила к частичному извелечению пигмента, но и после повторной обработки мицелий сохранял черную окраску. Пигмент был ¿идентифицирован, как метанин, на основании совокупности исследованных свойств и положительных качественных реакций на этот класс соединений.

Уф-спектры кислотного и цепочного пигмента характризовались сбщим поглощением, снижающимся с увеличением дчины волны. Такой характер УФ-спектра свойственен всем мепаниновым пигментам, выделенным из различных природных*источников. ИИ-спектр пигмента обнаруживал несколько пиков поглощения разноЛ интенсивности. Увеличение поглощения в области 1650 см-* и 3130-3500 см-* можно связать с присутствием сопряженных карбонильных и гидроксильных групп, характерных для меланинов. Явление меланиногенеза свойственно многим представителям семейства ..р^усе-с , к которому принадлежит исследуемый объект.

Выделение и идентификация розового пигмента. Повышение температуры инкубации , имеющей оптимум при 28°С, свыше ЗС°С ингибировапо меланиногенез и стимутаровало накопление розового пигмента. В масс-спектре пигмента, снятого в условиях химической ионизации, наб подали сгабыЕ1, малоинтенсивный пик иона с массоЛ 49С, а также гики осколочных ионов Ш-ОН) (-т/"473), (М-С->2С0Н448), (М-ОЧ-СН-СОК г/- 431), (М-СС-^СО) (п/=4С6), (М-ЗС-^СОМ V- 364), (М-0К-2СН2С0)( у= 389), пик последнего

- 18 -

иона максимален в-спектре.

В масс-спектре отрицательных ионов пигмента наблюдали пики аналогичных ионов, но имеющих массу на единицу меньше ( m/z 447, 430, 405, 338, 363, 344, 328), что соответствует отличию характера фрагментации положительных и отрицательных ионов.

Величина молекулярной массы и характер фрагментации молекулярного иона позволяют предположить для полученного розового пигмента структуру III, образование которой можно представить как процесс конденсации двух молекул I,3,8-триоксинафталина и одной молекулы 1,3,6,8-тетраоксинафталина: •

ОН ОН ' О О

sYl

Рис. 3. Предполагаемая структура,розового пигмента (III).

I - таутомерная форма 1,3,6,8-тетраоксинафталина, II - 1,3,8-триоксинафталина.

В соответствии с предлагаемой структурой масс-спектр характеризуется потерей гидроксильной группы, а также последующими выбросами молекул кетена, указывающих на присутствие в структуре частично гидрированных фрагментов Л-тетралона, т.е. данные масс-'-спектров не противоречат предложенной структуре.

В ИК-спектре этого пигмента наблюдали полосы поглощения в области 1680 и 1720 см~*, характерные для валентных колебаний карбонильной группы, сопряженной с ароматическим кольцом. Кроме того, в области 3400-350Ö см~* имелась широкая интенсивная полоса поглощения, которую можно интерпретировать, как полосу

валентных колебаний гидроксильной группы. В У-5-спектре розового пигмента наблюдали полосу поглощения при 240 нм, а также четыре полосы при 485, 520, 545 и 558 нм, кроме того плечи при 475 и 510 нм. Это характерно Д"я поликонденсированной сильно сопряженной ароматической системы и полностью подтверждает предполагаемую структуру розового пигмента.

Условия биосинтеза пигментов. Способность С. к обра-

зованию частично конденсированных окисленных 1,3,8-триоксинафтали-и I.3,6,8-тетраоксинафталина

наУсвидетельствует о синтезе меланина этим микроорганизмом по пентакетидному пути, известному для некоторых грибов. Полифенол-сксидаза отличается особой термочувствительностью и, возможно, инактивация этого фермента у С. îjictc при повышении температуры приводит к ингибированию меланиногенеза. В то же время происходит накопление интермедиатов пемтачетидного пути и их частичная конденсация, продуктом которой является розовый пигмент.

Способность к пигментообразованию проявлялась у С. i^mtn на поздних фазах развития. В логарифмической и начале стационарной фазы мицелиЧ сохранял соломенно-желтый цвет. В процессе роста культуры происходило закисление инокулята параллельно с потреблением аммонийного азота. Меланин в этих условиях формировался очень медленно. Устранение неблагоприятного воздействия низкой кислотности среды за счет исключения из ее состава ( х Н^^'РО^ обеспечивало бурный рост мицелия: сдвиг рН в кислую сторону происходил только в первые часы, а затем рН смешался в нейтральную область. Накопление меланина начиналось также, как и на стандартной среде, после завершения роста, но происходило более интенсивно. Соотношение процессов роста и меланиногенеза свидетельствует о вторичной метаболической природе меланина. Установлено, что меланиногенез всегда связан со скоростью гидроксили-рования: мицелий гриба темнел по мере окисления стероидного субстрата и в конце реакции имел интенсивно черную окрасну. В от-

сутствии стероида в тех же условиях пигментация формировалась значительно медленнее и зависела от длительности инкубации.

Введение в буфер в начальный момент инкубации другого субстрата окисления - глюкозы интенсифицировало биосинтез меланина, как и 11^-гидроксилирование. Повышение температуры культураль-ноЯ жидкости более 30°С вызывало подавление гидроксилирования и меланиногенеза.

Ингибиторный анализ. Для изучения возможной корреляции

гидроксилирования стероидов и накопления меланина исследовали *

влияние некоторых соединений на эти процессы. Известные ингибиторы меланиногенеза вносили в растущую культуру, голодную среду с мицелием или в трансформационную культуральную жидкость.

Наиболее сильными "ингибиторами меланиногенеза для исследуемой культуры являются бензгидроксамовая кислота (БГК), 8-оксихи-но-лин и азид натрия, их эффект проявлялся уже при концентрации

- М"^, а также метанол в концентрации 3$ и более. Эти соединения тормозили гидроксилирование стероидных субстратов: при концентрации БГК более М-^, 8-оксихинолина более М-^ и азида нат-рил более процесс блокировался полностью.

При полном подавлении трансформации ингибиторами черный пигмент отсутствовал. Совпадение условий проявления стероидгидро-.ксилазной активности и меланиногенеза, их активации и ингибиро-вания, а также усиление синтеза пигмента в присутствии стероидов позволяют предположить взаимосвязанность этих двух процессов.

В исследовании впервые показано ингибирование микробиологического гидроксилирования стероидов бензгидроксамовой кислотой, классическим ингибитором цианидрезистентного дыхательного пути переноса электронов. Нечувствительность к цианидам полифермент-

9

ных гидроксилирующих систем микросомальной фракции печени, митохондрий коры надпочечников и гидроксилаз грибного происхождения

известна. Поэтому IIp-гидроксилазу О.innata , вероятно, следует рассматривать, как одну из альтернативных дыхательных цепей, формирующуюся в экстремальных условиях голодания в присутствии стероидных субстратов.

Ь Ы В О Д Ь'

1. Проведено исследование кинетики Пр-гидроксилирования производных вещества S Рейхштейна культурой Curvuiaria lunata Установлено, что скорость ферментативной реакции зависит от химического строения субстрата и снижается при введении заместите чей в молекулу.

2. Одним из факторов, определяющих эффективность микробиологической трансформации замещенных производных вещества S , является способ внесения исходных стероидов в культуральную жидкость. Присутствие органического растворителя в трансформационной среде обеспечивает высокий стабильный выход Пр-гидрокси-продуктов. Подобраны оптимальная концентрация и время введения метанола в процесс при трансформации 17<*,21-дигидрокси-76*~ме-тил-прегн-4-ен-3,20-диона, полупродукта в синтезе дексаметазона.

3. Установлена способность С. lunata к избирательному гидролизу 1%1- и 21-ацетоксигрупп в зависимости от кислотности среды. Показано, что ферментативный гидролиз сопряжен со снижением баланса стероидов. Дисбаланс нарастает по мере увеличения исходной концентрации субстрата. С учетом полученных данных разработана биотехнология экономически эффективного превращения 17,21--диацетата 17с*,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,2С-диона (17«<,21-ди-ацетата ь ) в гидрокортизон с помощью единственной трансформирующей кучьтуры С.luneta • Фактором регучяции последовательности реакций является принудительное изменение кислотности среды трансформации. Увеличение выхода продукта составляет около 10% по сравнению с использованием в качестве исходного стероида

вещества s .

4. Показано, что длительность периода индукции стероидгид-роксилазы C.lunata в неростовых условиях не превышает трех часов. Индукция фермента подавляется метанолом и нуждается в меньшем насыщении среды кислородом, чем его экспрессия.

5. Установлено, что наибольшая гидроксилирущая активность ' свойственна мицелию С. luneta , отделенному от питательной среды. При этом сущёственную роль играет способ отделения: сепарация, применяемая обычно в промышленных условиях в отличие от фильтрации в лабораторных условиях, приводит к частичной инактивации ферментов.

.6. Найден способ реактивации мицелия С.luneta , заключающийся в преинкубации отсепарированной биомассы гриба в.растворе глюкозы. Установлены оптимальные условия реактивации (2-4 часа преинкубации в 0,3-0,51 растворе глюкозы), обеспечивающие в промышленных условиях увеличение производительности микробиологической трансформации вещества s Рейхштейна в 1,5-2,0 раза за счет увеличения его концентрации в трансформационной среде от 1,0 г/л. до 1,5-2,0 г/л, а также гидроксилирование 17-ацетата 17^.,21-ди-гидрокси-прегн-4-ен-3,20-диона (ITA-ацетата s ), трудно доступного для гриба в других условиях.

7. Оптимизирован состав среды для выращивания трансформирующей культуры Tieghemella orchidia и проведения IIр-ГИДр0КСИ-лирования 1бА,17Л,21-тригидрокси-6^-фтор-прегн-4-ен-3,20-диона 16,17-ацетонида, полупродукта в синтезе синафлана. Новая среда -обеспечивает сокращение длительности реакции, повышение выхода продукта более, чем на 10%, и улучшение качества полученной субстанции. Эффект от использования оптимизированной среды в производстве синафлана'на химико-фармацевтическом комбинате "Акрихин" составил 200 тысяч рублей.

8. Впервые выделеш черный и розовый пигменты гидроксили-руклцей культуры C.iunata . Черный пигмент идентифицирован на основании качественных реакций, УФ- и Ид-спектров, как меланин; розовый пигмент по данным УФ-, ИК- и масс-спектрометрии, как продукт конденсации двух молекул 1,3,8-триоксинафталина и одной молекулы I,3,6,3-тетраоксинафталина. Исследованы условия пигмен-тогенеза грибом.

9. Выявлены вторичная метаболическая природа меланинового пигмента и зависимость его формирования от окисления экзогенных субстратов, таких, как глюкоза и стероиды. На основании результатов ингибиторного анализа IIß-гидроксилирования и меланиноге-неза выдвинуто предположение о взаимосвязанности этих процессов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Авторское свидетельство 1568496.СССР, МКИ ССГ7 5/СО, способ получения стероидных соединений/Рыжкова В.Н., Клубничкина Г.А., Быкова Т.М., Гусарова Т.И./Сорокина Н.П., Зверева M.JI., 5мнова Э.Ф. и др. - » 4402195/30-13(049630); 3аявл.13.04.88; Опубл.Открытия.Изобретения, не публ. в открытой печати. -1990. - № Ь. - С.56.

2. Беликов В.Г., Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф. Изучение возможности использования р-циклодекстрина для совершенствования процесса получения преднизолона//Хим.-фарм. журн. - 1901. - № 2. - С.48-49.

3. Беликов В.Г., Компанцева. Е.В., Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф. Изучение возможности использования* pt-цшслодекстрина в производстве синафлана//Биотехнология. - 199Г. - F5. — С.63-64.

4. Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф., Кудрин С.А. Количественное определение кортексолана в культуральной жидкости методом ГЖ// Фармация. - 1991. - » I. - С.33-34.

5. Гаврилин 11.В., Умнова Э.Ф., Кудрин С.А. Количественое опреде-

ление предниэолона в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии//Фармация. - 1991. - № 2. - С.67-68.

6. Гидрокортизон. Изучение нового пути синтеза из смеси диацетата и триацетата вещества s Рейхштейна. Отчет о ШР/ХФК "Акрихин" Руководитель Э.Ф.Умнова - № ГР 0I87003544I; Инв.# 02880063812. - Купавна, 1988. - 21С.//ЬНГИЦентр, Сб.реф. ГОР и ОКР, серия .17, Химия. - 1989. - * 7. - С.42. - P.6I.07.89.302.

7. Изучение метода реактивации гидроксилирующей культуры в производстве гидрокортизона: Отчет о НИР/ХШ "Акрихин"; Руководитель Э.Ф.Умнова - К ГР 01890074822; Инв. № 02890059910. -Купавна, 1989. - 26С.//ВНГИЦентр, Сб.реф. НИР и (ЖР, серия 17, Химия. - 1990. - К 6. - С.66. - P.6I.06.90.56I.

8. Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Ботезат-Белый Ю.К., Умнова Э.Ф Андроник И.Я. Исследование взаимодействия р-циклодекстрина с кортексолоном//Хим.-фарм.журн^ - 1990. - т.24. - № 10. - C.8I--82. '

9. Компанцева Е.В., Гаврилин М.В., Умнова Э.Ф., Кудрин С.А. Коли' чественное определение гидрокортизона в культуральной жидкости

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии//ШИТЭХИМ Научно-тех.реф.сборник, сер. Методы анализа и контроля качества продукции. - 1990. - № 5. - С.24-26.

10. Синафлан. Оптимизация процесса гидроксилирования на микробиологических стадиях: Отчет о ЖРДФК "Акрихин". Руководитель Э.Ф .Умнова - * ГР 01850052341; Инв. № 02870066815. - Купавна.

1987. - 23С.//ЬНГИЦентр, Сб.реф. НИР и (ЖР, серия 17, Химия. -

1988. 15. -43.41. -P.61.15.88.316.

11. Синафлан. Усовершенствование технологии на химических и микробиологических стадиях: Отчет о ШР/ХФК "Акрихин". Руководитель Э.Ф.Умнова. - * IP 01850052341; Инв. * 02870048179. - КупавНа, 1987. - 15С.//ВШЦентр, Сб.реф. НИР и ОКР, серия 17, Химия. -

1988 — № 8. — С. 76. — Р. 61.08.88.578.

12. Умнова Э. Ф., Воробьева Л» И. Особенности меланиногене-за у гриба Сипги1апа 1ипа1а//Биологические науки.— 1991. — в печати.

13. Умнова Э. Ф., Рыжкова В. М., Воробьева Л. И. Гидрокси-лирование 16а-метил-17ос, 21-диоксипрегн-4-ен-3-она// Хим.-фарм. журн.— 1990. т. 24. — № 6. — С. 56—58.

14. Умнова Э. Ф., Рыжкова В. Н , Терентьев П. Б. Пигменты гриба Сипш1апа 1ипа1а, обладающего стероид-гидрокси-лирующей активностью //Хим.-фарм. журн.— 1990.— т. 24. — № 7 — С. 60—62.

Бесплатно

Тип, ТСХА, Зак. 859, Тир. 100

4 '""' -Л