Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование микробиологических стадий получения кортикостероидных гормонов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование микробиологических стадий получения кортикостероидных гормонов"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 576.852.23.095.383.547.915 УМНОВА Эвелина Федоровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ СТАДИЙ ПОЛУЧЕНИЯ КОРТИКОСТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена в лаборатории ХФК «Акрихин» (Kyi на Московской обл.) и на кафедре микробиологии Биолоп ского факультета Московского государственного университ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель — доктор биологических наук, i фессор Воробьева JI. И.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, г фессор Суворов Н. Н., кандидат биологических н Тропина В. И.

Ведущая организация — Институт органической хи]

В ...... ... ____________________. ,____________ . . !

К. 20.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, ул. Тимиря; екая, 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « . ^¡-^¿¿СЛ, . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета —

РАН.

кандидат биологических наук

JI. В. Мосин

низу I7<- и 21-ацетоксигрупп в зависимости от рН среды. Ферментативный гидролиз сопряжен со снижением баланса стероидов. Дис-5аланс нарастает по мере увеличения концентрации стероидного субстрата.

Изучены и выявлены оптимальные условия индуцирования гид-роксилазной активности у гриба С. lunate в неростовых условиях. Длительность периода индукции не превышает трех часов. Индукция фермента подавляется метанолом и нуждается в меньшем насыщении зреды кислородом, чем его экспрессия.

Активность трансформирующей культуры зависит от способа ее этделения от остатков питательной среды. Частичная инактивация, возникающая после сепарации биомассы или длительного голодания, ложет быть восстановлена с помошью инкубации мицелия в растворе глюкозы.

В результате проведенного исследования показана четкая зависимость трансформирующей активности другой гидроксилирующей культуры, Megheraella orchidia г /74,0т состава питательной зреды. Оптимизация состава среды позволила повысить выход продукта при сокращении длительности реакции в синтезе синафлана, рторсодержащего кортикостероида, на 10%. Качество субстанции, ■сак установлено, находится в прямой зависимости от интенсивности окраски трансформационной среды, которую можно регулировать исходным значением рН и содержанием органических компонентов.

Впервые выделены черный и розовый пигменты стероидгидрокси-яирующей культуры С. lunata ^ с помощью качественных реакций верный пигмент идентифицирован, как меланин. На основании данных /Ф-, ИК- и масс-спектрометрии предложена структура розового тгмента, который накапливается при торможении биосинтеза меланина и, вероятно, является его интермедиатом.

Установлена вторичная метаболическая природа меланина, а

также взаимосвязь его формирования с процессами окисления экз генных субстратов, таких, как глюкоза и кортикостероиды.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕНШСГГЬ. Предложена технология биотрансфор мации ГМ, 21-дигидрокси-16^-метил-прегн-4-ен-3,20-диона, под продукта в синтезе дексаметазона, отличающаяся способом внесе стероидного субстрата в трансформационную среду. Новый.способ обеспечивает сокращение длительности Пр-гидроксилирования и стабилизацию выхода продукта.

В отличие от известного способа получения Щ-ацетата гидрокортизона из 17,21-диацетата,17^,21-дигидрокси-прегн-4~-е -3,20-диона с использованием культуры рода СогупеЪасгег±шп Сигуи1аг1Е Хшшга разработана биотехнология превращения это субстрата в гидрокортизон с помощью единственной трансформиру щей культуры . Увеличение выхода продукта составляет

около 10% по сравнению с получением гидрокортизона из вещестн Б Рейхштейна.

Предложено использовать для ПЦ>-гидроксилирования кортик стероидов реактивированную культуру С.1ш^а , обеспечиЕающук промышленных условиях увеличение производительности микробиол гической трансформации вещества э Рейхштейна в 1,5-2,0 раза счет увеличения его концентрации в трансформационной среде от 1,0 г/л до 1,5-2,0 г/л. Метод реактивации культуры позволяет также осуществлять в промышленных условиях гидроксилирование трудно доступного 17-ацетата ГМ ,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,2 -диона. Повышение выхода И^-оксипродукта на 20% в этом случа происходит за счет экранирования 14л- положения в стероидной молекуле. Работа апробирована в условиях производства стеров ных гормонов на ХФК "Акрихин". Предложенный метод реактивацм культуры создает базу для расширенного производства кортикосп роидных лекарственных препаратов.

Оптимизирован состав среды для выращивания трансформационной культуры и проведения трансформации 16-Л, Г7с*.,21-тригидрокси~ -6ск-фтор-прегна--4-ен-3,20-диона 16,17-ацетонида. Среда обеспечивает сокращение длительности реакции гидроксилирования, повышение выхода продукта более, чем на 10% и улучшение качества получаемой субстанции. Эффект от использования оптимизированной среды в производстве синафлана на ХФК "Акрихин" составил около 200 тысяч рублей.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации получено I авторское свидетельство на изобретение, опубликованы' У печатных работ и рефераты 4 отчетов о НИР. Результаты исследований изложены на заседании кафедры микробиологии биологического факультета Московского университета.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора (3 главы), материалов и методов, результатов исследования (3 главы), обсуждения результатов, практического использования полученных результатов, выводов, списка используемой литературы и приложений. Материалы диссертации -изложены на 182 страницах машинописного текста, содержат 28 таблиц, 32 рисунка. Список литературы включает 225 источников.

ЭКСПЕРИМЕНГАЛЬШ ЧАСТЬ.

Объект и методы исследования. Объект исследования представляли штаммы грибов Curvularin lunato и Tiecheraella orohidis, соответствующие коллекционным культурам р/70 и î/74 из Всесоюзно" коллекции промышленных микроорганизмов. Эти культуры обладают стероидгидроксилирующеИ активностью, основным продуктом трансформации является Пб-гидроксипроизводноэ.

Культуры хранили в лиофильно-высушенном состоянии в ампулах. Содержимое ампул использовали для засева твердых сред в

пробирках. Выращенную исходную культуру пересевали на среды того же состава для получения рабочих культур, которыми инокули-ровали жидкие среды. Для проведения трансформации применяли инокулят третьей генерации на жидкой среде, выращенный в аэрируемых условиях.

Трансформировали следующие стероидные субстраты:

«и СН^

I

го С=0

б

. где

17<*>,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20-дион (вещество s Рейгатейна)

17-ацетат Г7*,21-дигидрокси-прегн-4--ен-3,20-диона (17я -ацетат s )

21-ацетат 17а ,21-дигидрокси-прегн-4-ен -3,20-диона (21-ацетат s )

17,21-диацетат 17^,21-дигидрокси-прег -4-ен-3,20-диона (Ш,21-диацетат s

17^,21-дигидрокси-16^-метил-прегн-4--ен-3,20-дион (К^-метил-Б)

16<А, 17л, 21-тригидрокси-бок-фтор-прегн -4-ен-3,20-диона 16,17-ацетонид

r2« R4 : Н

R3 : С0СИ3 ' R2, R3 : H;

R4 : COCH3

Rj, Rg *. H; К^, R4 i C0CH3

R2 : CH3

F; R4 : H; R2hR3: ч /СНз

Стероиды вносили в культуральную жидкость в виде микрони-зированной водной суспензии или метанольного раствора. Содержание стероидов определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Силуфол УФ-254 полуколичест'венно; количественный анализ проводили на спектрофотометре СФ-26 или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Милихром".

Содержание аммонийного азота определяли методом отгонки^ глгакозы-с помощью антронового реактива.

Черный пигмент гриба Curvularia lunata выделяли после кислотного или щелочного гидролиза мицелия при автоклавировании, розовый пигмент - экстракцией хлороформом и последующей препаративной хроматографией. Пигменты идентифицировали с помощью качественных реакций на меланин, ИК-, УФ- и масс-спектрометрии. ИК-спектры черного пигмента снимали в вазелиновом масле, розового - в пленке на спектрофотометре UR-20 (ГДР), поглощение ультрафиолетовой и видимой областях спектра - на спектрофотометре (Япония). Масс-спектр розового пигмента снимали на приборе Финиган - Мат 4615 с прямым вводом вещества в ионный источник при энергии ионизирующих электронов 70 эв с использованием в качестве газа-реагента аммиака.

ОСЮВШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Основная задача исследования-интенсификация процесса II&--гидроксилирования кортикостероидных гормонов культурами грибов Curvularia lunata и Tieghemella orchidia.

В этом плане рассматривали два аспекта: увеличение выхода продуктов микробиологической трансформации и увеличение её производительности.

Изучение кинетических и физико-химических особенностей

Цр>-гидроксилирования кортикостероидных соединений.

Кинетика П^-гидроксилирования грибом С. lunata. Введение

- а -

некоторых заместителей в молекулу стероидного субстрата позволь ет получать лекарственные соединения, отличающиеся более высокс эффективностью, чем гидрокортизон или преднизолон: такие как дексаметазон, синафлан, а также обеспечивает повышение выхода II^-оксипроцукта за счет экранирования 14л-положения в случае 17с(>-ацетатов.

Исследование кинетики II ¡^гидроксилирования этих соединен! показало, что наиболее доступным для монооксигеназной системы гриба С. lunate является 17<*,21-дигидрокеи-прегн-4~ен-3,20~дио1 (вещество S 5, в меньшей степени 17-ацетат 17л,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20-диона (Ш-ацетат s) и 17<*,21-дигидрокси-16о(.--метил-прегн-4-ен-3,20-дион (16^-метил-5), судя по максимальн( скорости реакции и значениям константы Михаэлиса (400; 105,3; 45 мкМ-час""*: и 5,0; 1,0; 0,83 мМ соответственно). Микроби< логическая пригодность этих субстратов к трансформации определ; ется особенностями их химического строения и не зависит от рас воримости. Так, увеличение растворимости от 8,8 иг/100 мл при переходе от вещества s к 17<к-ацетату S до 27,1 мг/100 мл не обеспечивало увеличение скорости реакции окисления, а при близких значениях растворимости вещества s и 1611,-метил -s (8,8 и 10,3 мг/100 мл) максимальная скорость гидроксилирования первоп субстрата была в 9 раз выше второго.

Увеличение растворимости индивидуальных соединений с помощью введения в реакционную среду метанола или циклодекстри на не приводило к увеличению скорости ферментативной реакции.

Трансформация 17* ,21-дигидрокси-16л-метил-прегн-4-ен-3,20--диона (1бА-метил- я ). Синтез дексаметазона включает реакцию Пр>-гидроксилирования 16л-метил- S. Способ подготовки этого су страта к трансформации определяет эффективность процесса: его скорость и выход. Растворение 16<л-метил- s в метаноле и введе

ние полученного раствора в культуральную трансформационную жидкость обеспечивало более высокий выход продукта, чем при механическом измельчении стероида. Однако метанол ингибировал начало процесса трансформации, что связано с увеличением длительности гидроксилирования. Обнаружена способность 16^-метил-з образовывать при рекристаллизации в водной среде из метанольно-го раствора полиморфные кристаллы, достигающие в некоторых случаях 80-100 микрон. Для достижения высокой скорости растворения стероида и его трансформации размер кристаллов не должен превышать 15 микрон.

Токсическое воздействие растворителя удалось элиминировать при введении метанола в концентрации 2-3% через несколько часов после контакта гидроксилирующей культуры со стероидом, который измельчали в этом случае механическим цутем. Такой способ подготовки субстрата позволил при минимальной длительности трансформации стабилизировать высокий выход 11^-оксипродукта.

Трансформация 17,21-диацетата 17-л.21-дигидрокси-прегн-4-ен--3-20-диона (17^,21-диацетата 3 ). Культура С. 1шмга обладает способностью гидроксилировать кроме П^-положения и другие позиции стероидной молекулы. Поэтому при трансформации вещества э Рейхштейна образуются нежелательные примеси, преимущественно 14-А-оксисоединение в количестве до 20-25$. Известно, что защита 17-го углеродного атома, например остатком уксусной кислоты, обеспечивает экранирование 14А-позиции, вследствие чего повышается направленность микробиологического Пр>-гидроксилирования.

В качестве ацетилированных субстратов использовали 17Л-ацетат э и 17<А,21-диацетат в . Трансформация этих соединений затруднена по сравнению с веществом в , однако выход оксипро-дукта в случае 17л-ацетата-б достигал 90%. Установлено, что способ введения в трансформационную среду 17-^,21-диацетата 3 ,

как и 16н-метил- ь , определяет выход целевого Пз-оксипродукта. Трансформация с использованием метанольного раствора субстрата проходила с существенно большим выходом, чем в отсутствие метанола. Токсическое действие растворителя на трансформационную культуру при концентрации 17^,21-диацетата s 0,5 г/л и 1,5% об. метанола не проявлялось. Повышение нагрузки стероида до I г/л, сопоставимой с гидроксилированием вещества s , приводило к необходимости увеличить концентрацию растворителя до 3% об. При этом трансформация замедлялась, а выход продукта падал.

Гидропизируюшая активность культуры С.luneta . Исследовали способность культуры к гидролизу 21- и 17.*~ацетатов кортикосте-роидов. Оптимальными условиями для гидролиза 21-ацетоксигруппы в молекуле 17ск,21-диацетата s являлся рН среды около 6,0; при снижении рН субстрат утилизировался медленнее, гидролиз -ацетата s практически не происходил. Повышение рН среды до 7,0-8,0 приводило к отщеплению ацетоксигруппы в 17^-позиции и тем быстрее, чем выше значение рН среды..

Способность культуры C.lynsta к избирательному гидролизу можно использовать для получения из 17л ,21-диацетата s 17^-аце-" тата s , его IIf-гидроксилирования и последующего гидролиза 17л--ацетата гидрокортизона с образованием целевого продукта - гидрокортизона - без выделения из культуральной жидкости полупродуктов. Фактором регуляции последовательности реакций является принудительное изменение рИ среды трансформации. При концентрации субстрата 17г'.,21-диацетата ц 0,5 г/я увеличение выхода гидрокортизона составило 7-10$ по сравнению с П^-гидроксилированием вещества s Рейхитейна.

Трансформация 17*,21-диацетата s с концентрацией более 0,5 г/л приводила к дисбалансу исходного стероида и продуктов реакции. Показано снижение содержания продуктов при дезацетили-

ровании ряда субстратов: 21-ацетата к , 17д-ацетата гидрокортизона и 17л,21-диацетата S. Возможно, что образующаяся в результате омыления ацетилированных стероидов уксусная кислота индуцирует усиление в клетках гриба метаболических путей использования углерода стероидного происхождения, т.е. деструкции стероидного скелета. Известно, например, накопление на фоне гидролиза 17л--ацетата гидрокортизона значительного количества микотоксина радицинина ( strijevsfcy » 1980).

Влияние некоторых факторов на трансформационную активность культур С. luneta и Т. orc'aiciie.

Индукция. Индукцию трансформационной активности гриба С. lunata изучали в неростовых условиях. Культура проявляла максимальную активность через 2-3 часа после контакта с индуктором-субстратом. В отсутствии стероидного субстрата гидроксилиругащая активность снижалась.

Показано, что метанол подавляет формирование гидроксилазной активности у исследуемой культуры. Вероятно? этим объясняется

снижение токсичности растворителя для процесса гидрокси-чирования в случае введения его в трансформационную среду после завершения индукции. В отличие от биосинтеза бактериальной -стероидгидроксилаэы Bacillus negsteriun , подавляемого в присутствии стероидов (Berg, 1981), увеличение концентрации индуктора не тормозило индукцию IIS-гидроксилирующеЯ активности гриба С. Júnate.

Установлено, что индуцирование фермента происходит эффективней при меньшем насыщении среда кислородом по сравнению с оптимальным в процессе трансформации. Аналогичный эффект известен для монооксигеназных систем некоторых других микроорганизмов, таких как Rhtropus nisrionnn (linnish ,1980), Pellicularie filamentos? (Glerlc, 1ЭЙ2).

Наделение стадии индукции в биотехнологии кортикостероидов не обязательно, т.к. индуктором II р -гидроксилазной активности может служить непосредственно субстрат трансформации.

Реактивация гидроксилирующей активности у C.l^ata . Для трансформации стероидов использовали покоящуюся культуру, т.к. в присутствии источников азотного и углеродного питания выявлено замедление реакции. Выращенную биомассу отделяли от остатков питательной среды с помощью фильтрации или сепарации в промышленных условиях. Установлено, что последняя приводит к частичной инактивации культуры. Снижение II р,-гидроксилирующей активности можно моделировать с помощью прешкубации трансформирующей культуры в воде или фосфатном буфере.

В ходе трансформации, осуществляемой отсепарированной культурой, наблюдали торможение накопления продукта реакции. Длительность торможения зависела от концентрации стероидного субстрата и его химической структуры (рис.1).

гидрокортизон, мг/мл 17о1-ацетат гидрокортизона,

% к исх.

Рис.1. Зависимость длительности периода торможения от исходного стероида. Гидроксилирование вещества г с нагрузкой 1-1 г/л, 2-2 г/л, 3 - 17«А-ацетата 8 с нагрузкой 0,6 г/л.

При трансформации наиболее доступного субстрата) вещества Б с нагрузкой I г/л (I), вслед за коротким периодом торможения наступала самопроизвольная реактивация, достаточная для успешного завершения реакции. Увеличение нагрузки (2) или введение заместителей в молекулу вещества з (3) было связано с увеличением длительности торможения, неполной трансформацией субстрата и образованием сильн'ополярных побочных продуктов.

Предложен метод реактивации отсепарированной или подвергнутой длительному голоданию культуры, который заключается в преин-кубации мицелия в 0,3 - 0,5% растворе глюкозы. Обработка глюкозой полностью элиминировала торможение, либо снижала его длительность. Уровень активности культуры оказывался достаточным ' для реализации рассмотренных выше процессов (рис. 2).

Гидрокортизон, мг/мл

1%!.-ацетат гидрокортизона, % к исходному

Рис. 2. Глгакозная реактивация культуры С.

Гидроксилирование вещества г с нагрузкой 1-1,5 г/л; 2-2 г/л; 17^-ацетата 5 . с нагрузкой 0,6 г/л -3.

Метод глюкозной реактивации позволяет в промышленных условиях повысить производительность микробиологической трансформации вешества 3 в 1,5 - 2,0 раза за счет увеличения его концентрации

в трансформационной среде от 1,0 г/л до 1,5 - 2,0 г/л, а такж осуществлять гидроксилирование трудно доступного 17*-ацетата £ Использование последнего субстрата обеспечивает повышение вых продукта по сравнению с биоконверсией вещества Б на 20%.

Оптимизация состава питательной среды в синтезе синафлан В многостадийном синтезе фторированного кортикостероида синаф на введение гид'роксильной группы в 11&-положение стероидной молекулы осуществляли с помощью гриба ИесЪетеНа огоЫсИв .

Выращенную биомассу не отделяли от остатков питательной сре *

т.к. отсепарированная культура полностью инактивируется. Пита тельная среда в этом случае)кроме обеспечения достаточного на ления биомассы и высокой активности культуры, должна не мешат извлечение продукта.

Исходная среда Р имела интенсивно коричневый цвет. Прода выделенный из культуральной жидкости методом экстракции и уш вания, представлял собой вязкую темно-коричневую аморфную ма( С целью снижения интенсивности окраски среды изменен её состг в сторону обеднения. Проверена микробиологическая пригодност) нескольких питательных сред измененного состава. Выращенная 1 этих средах культура накапливала меньшую биомассу, чем на ис: ной среде, однако сохраняла высокую гидроксилиругаую активно' Продукт, полученный с использованием самой светлой модифицир ной среды Ру, отличался высоким качеством: сыпучая субстанци имела кремовый цвет.

11а втором этапе подобрана среда, критерием пригодности торой служило повышение выхода целевого продукта. Среда с ус ным названием "А" обеспечивала трансформацию исходного стеро 16^,17^,21-тригидрокси-6<МЕ;тор~прегн-4-ен-3,20-диона 16,17-а тонида с более высоким выходом, чем контрольная среда Р^; дс нутое на среде Р3 качество продукта сохранялось (табл. I).

Влияние состава питательной среды на процесс Пр-гидроксилирования в синтезе синафлана*

Среда

Компоненты среды

к ь

га к &&

и о >>х и а

I

о ъ< а

Я» X

ет я я з ш ч о ? Я §

Е- О СО ЖОХ

ш й ж

а§£

(¡5 К Р

>а«51

с? &

СУ

о

см

в

«а-

о о

СП 02

м С/

3 Р-!

Трансформаци онная .культура_

Содержание продукта в культуральной жидкости

Биомасса, г/л

РН

в % к загруженному

в % к загруженному на 1г биомассы

Р 3,0 1,0 0,3 0,5 - 0,5 - - - 5,84 4,36 69,6 11,9

рз 2,0 - 0,2 0,5 - 0,5 - - - 5,57 4,06 70,8 12,7

А 1,0 - 0,5 0,3 0,7 0,1 0,04 0,03 5,32 3,56 80,2 15,1

сл

I

к Данные таблицы I представляют собой результаты испытания сред в 40 повторностях каждого варианта в ферментерах.

Установлено, что интенсивность окраски среды А после стерилизацш зависит от её кислотности. Так, поглощение средой в видимой части света резко возрастало при её защелачивании, в то время как в отсутствие глюкозы оптическая плотность среды мало изменялась при увеличении рН. Последнее справедливо и для 0,2 % раствора глюкозы.

Полученные результаты подтверждают имеющиеся в литературе Нилов, 1965) данные о том, что в присутствии растворенных азотистых веществ и Сахаров могут образовываться темноокрашенные продукты их взаимодействия. Такие соединения недоступны для микроорганизмов в качестве источников питания. Поэтому установление светлой окраски среды А с помощью изменения рН способствует повышению не только качества продукта трансформации, но и биологической полноценности питательной среды табл.2).

Таблица 2.

Зависимость накопления биомассы и содержания глюкозы в среде А от исходного значения рН.

рН среды до стерилизации

Среда А 2,0 4*0 5,0 5,6 6,0 7,0 8,0

Биомасса, г/л 3,6 4,0 4,7 5,4 - 5,8

Содержание глюкозы после стерилизации % к исходному 90 91 94 - 84 79 74

Оптимальным можно считать интервал значений рН 5,5-6,0, в которо возможно получение светлой среды, незначительные потери глюкозы в процессе стерилизации и накопление биомассы, достаточной для успешног IIр -гидроксилирования. Использование оптимизированной по составу и рН среды А вместо исходной среды Р обеспечило увеличение содержания гидроксилироБанного продукта на 10 % (табл Л). Экономический эффект с

внедрения этой разработки на ХФК "Акрихин" в производстве синафлана составил около 200 тыс. рублей.

ИЗУЧЕНИЕ ПИГМЕНТОВ ГРИБА С. LILWA.

Выделение и идентификация черного пигмента. Гриб C.iunata обладает способностью к пигментообразованию. По мере старения мицелия цвет его изменяется от соломенно-желтого до темно-оливкового. Пигмент гриба C.iunata прочно связан с клетками. Экстракция I К щелочью или концентрированной кислотой приводила к частичному извелечению пигмента, но и после повторной обработки мицелий сохранял черную окраску. Пигмент был индентифицирован,-как меланин, на основании совокупности исследованных свойств и положительных качественных реакций на этот класс соединений.

Уф-спектры кислотного и щелочного пигмента характризовались общим поглощением, снижающимся с увеличением длины волны. Такой характер УФ-спектра свойственен всем меланиновым пигментам, выделенным из различных природных*-источников. И£-спектр пигмента обнаруживал несколько пиков поглощения разной интенсивности. Увеличение поглощения в области 1650 см-* и 3130-3500 см-^ можно связать с присутствием сопряженных карбонильных и гидроксильных групп, характерных для меланинов. Явление меланиногенеза свойственно многим представителям семейства Deaptíooecc , к которому принадлежит исследуемый объект.

Выделение и идентификация розового пигмента. Повышение температуры инкубации C.iunata , имеющей оптимум при 28°С, свыше 30°С ингибировало меланиногенез и стимулировало накопление розового пигмента. В масс-спектре пигмента, снятого в условиях химической ионизации, наблюдали слабый, малоинтенсивный пик иона с массой 490, а также пики осколочных ионов (М-ОН) ( т/а 473), (М-СНрС0)(я/3 448), (М-0Н-СН2С0)( и/,-, 431), (М-2СВ>С0) (т/г 406), (М-ЗСН2С0)( т/а 364), (М-0Н-2СН2С0)(м/2 389), пик последнего

иона максимален в-спектре.

В масс-спектре отрицательных ионов пигмента наблюдали пики аналогичных ионов, но имеющих массу на единицу меньше ( т/и 447, 430, 405, 338, 363, 344, 328), что соответствует отличию характера фрагментации положительных и отрицательных ионов.

Величина молекулярной массы и характер фрагментации молекулярного иона позволяют предположить для полученного розового пигмента структуру III, образование которой можно представить как процесс конденсации двух молекул 1,3,8-триоксинафталина и одной молекулы 1,3,6,8-тетраоксинафталина:

Рис. 3. Предполагаемая структура розового пигмента (III).

I - таутомерная форма 1,3,6,8-тетраоксинафталина, II - 1,3,8-триоксинафталина.

В соответствии с предлагаемой структурой масс-спектр характеризуется потерей гидроксильной группы, а также последующими выбросами молекул кетена, указывающих на присутствие в структуре частично гидрированных фрагментов Л-тетралона, т.е. данные масс -спектров не противоречат предложенной структуре.

В ИК-спектре этого пигмента наблюдали полосы поглощения в области 1680 см-1 и 1720 см~^, характерные для валентных колебаний карбонильной группы, сопряженной с ароматическим кольцом. Кроме того, в области 3400-3500 имелась широкая интенсивная полоса поглощения, которую можно интерпретировать, как полосу

он он '

о о

он

i»

валентных колебаний гидроксильной группы. В У^-спектре розового пигмента наблюдали полосу поглощения при 240 нм, а также четыре полосы при 485, 520, 545 и 558 нм, кроме того плечи при 475 и 510 нм. Это харёктерно для поликонденсированной сильно сопряженной ароматической системы и полностью подтверждает предполагаемую структуру розового пигмента.

Условия биосинтеза пигментов. Способность С. lunatn к образованию частично конденсированных окисленных 1,3,8-триоксинафтали-и 1.3,6,8-тетраоксинафталина

на^ъвидетельствует о синтезе меланина этим микроорганизмом по пентакетидному пути, известному для некоторых грибов. Полифенол-оксидаза отличается особой термочувствительностью и, возможно, инактивация этого фермента у С. luneta при повышении температуры приводит к ингибированию меланиногенеза. В то же время происходит накопление интермедиатов пемтакетидного пути и их частичная конденсация, продуктом которой является розовый пигмент.

Способность к пигментообразованию проявлялась у С. iu.nntf< на поздних фазах развития. В логарифмической и начале стационарной фазы мицелий сохранял соломенно-желтый цвет. В процессе роста . культуры происходило закисление инокулята параллельно с потреблением аммонийного азота. Меланин в этих условиях формировался очень медленно. Устранение неблагоприятного воздействия низкой кислотности среды за счет исключения из её состава ( к tyjJgHPO^ обеспечивало бурный рост мицелия: сдвиг рН в кислую сторону 1роисходил только в первые часы, а затем рН смещался в нейтральную область. Накопление меланина начиналось также, как и на стандартной среде, после завершения роста, но происходило более интенсивно. Соотношение процессов роста и меланиногенеза свидетельствует о вторичной метаболической природе меланина. Установлено, что меланиногенеэ всегда связан со скоростью гидроксили-рования: мицелий гриба темнел по мере окисления стероидного суб-зтрата и в конце реакции имел интенсивно черную окраску. В от-

сутствии стероида в тех же условиях пигментация формировалась значительно медленнее и зависела от длительности инкубации.

Введение в буфер в начальный момент инкубации другого субстрата окисления - глюкозы интенсифицировало биосинтез меланина, как и 11?>-гидроксилирование. Повышение температуры культураль-ной жидкости более 30°С вызывало подавление гидроксилирования и меланиногенеза.

Ингиби-яорный анализ. Для изучения возможной корреляции

гидроксилирования стероидов и накопления меланина исследовали »

влияние некоторых соединений на эти процессы. Известные ингибиторы меланиногенеза вносили в растущую культуру, голодную среду с мицелием или в трансформацивнную культуральную жидкость.

Наиболее сильными 'ингибиторами меланиногенеза для исследуемой культуры являются бензгидроксамовая кислота (ВГК), 8-оксихи-нО'Лин и азид натрия, их эффект проявлялся уже при концентрации

л С

М - М , а также метанол в концентрации 37, и более. Эти соединения-тормозили гидроксилирование стероидных субстратов: при концентрации БГК более 8-оксихииолина более М"^ и азида на1!

с

рил более процесс блокировался полностью.

При полном подавлении трансформации ингибиторами черный пигмент отсутствовал. Совпадение условий проявления стероидгидр( -КСилазной активности и меланиногенеза, их активации и ингибиро-вания, а также усиление синтеза пигмента в присутствии стероида позволяют предположить взаимосвязанность этих двух процессов.

В исследовании впервые показано ингибирование микробиологического гидроксилирования стероидов бензгидроксамовой кислотой, классическим ингибитором цианидрезистентного дыхательного пути переноса электронов. Нечувствительность к цианидам полифермент-

9

них гидроксилирующих систем микросомальной фракции печени, мито' хондрий коры надпочечников и гидроксилаз грибного происхождения

известна. Поэтому IIp-гидроксилазу С. luna ta , вероятно, следует рассматривать, как одну из альтернативных дыхательных цепей, формирующуюся в экстремальных условиях голодания в присутствии стероидных субстратов.

ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование кинетики Пр-гидроксилирования производных вещества S Рейхштейна культурой Curvularia lunata Установлено, что скорость ферментативной реакции зависит от химического строения субстрата и снижается при введении заместителей в молекулу.

2. Одним из факторов, определяющих эффективность микробиологической трансформации замещенных производных вещества S , является способ внесения исходных стероидов в культуральную жидкость. Присутствие органического растворителя в трансформационной среде обеспечивает высокий стабильный выход Пр-гидрокси-продуктов. Подобраны оптимальная концентрация и время введения метанола в процесс при трансформации 1?Л,21-дигидрокси-ТбА-ме-тил-прегн-4-ен-3,20-диона, полупродукта в синтезе дексаметазона.

3. Установлена способность С. lunata к избирательному гидролизу 1%*.- и 21-ацетоксигрупп в зависимости от кислотности среды. Показано, что ферментативный гидролиз сопряжен со снижением баланса стероидов. Дисбаланс нарастает по мере увеличения исходной концентрации субстрата. С учетом полученных данных разработана биотехнология экономически эффективного превращения 17,21--диацетата 17с<,21-дигидрокси-прегн-4-ен-3,20-диона (17=<,21-ди-ацетата s ) в гидрокортизон с помощью единственной трансформирующей культуры-С.lunata . Фактором регуляции последовательности реакций является принудительное изменение кислотности среды трансформации. Увеличение выхода продукта составляет около 10% по сравнению с использованием в качестве исходного стероида

вещества s .

4. Показано, что длительность периода индукции стероидгид-роксилазы C.iunata в неростовых условиях не превышает трех часов. Индукция фермента подавляется метанолом и нуждается в мень шем насыщении среды кислородом, чем его экспрессия.

5. Установлено, что наибольшая гидроксилирующая активность свойственна мицелию C.iunata , отделенному от питательной среды При этом существенную роль играет способ отделения: сепарация, применяемая обычно в промышленных условиях в отличие от фильтра ции в лабораторных условиях, приводит к частичной инактивации ферментов.

6. Найден способ реактивации мицелия C.iunata , заключающи ся в преинкубации отсепарированной биомассы гриба в растворе глюкозы. Установлены оптимальные условия реактивации (2-4 часа преинкубации в 0,3-0,5» растворе глюкозы), обеспечивающие в про мышленных условиях увеличение производительности микробиологиче кой трансформации вещества s Рейхштейна в 1,5-2,0 раза за счет увеличения его концентрации в трансформационной среде от 1,0 г/ до 1,5-2,0 г/л, а также гидроксилирование 17-ацетата 17А,21-ди-гидрокси-прегн-4-ен-3,20-диона (17А-ацетата s ), трудно доступного для гриба в других условиях.

7. Оптимизирован состав среды для выращивания трансформирующей культуры Tieghemella orchidia и проведения IIp-гидроксу лирования 1бЛ,17Л,21-тригидрокси-б<А-фтор-прегн-4-ен-3,20-диона 16,17-ацетонида, полупродукта в синтезе синафлана. Новая среда

'обеспечивает сокращение длительности реакции, повышение выхода продукта более, чем на 10%, и улучшение качества полученной су( станции. Эффект от использования оптимизированной среды в проиг водстве синафлана на химико-фармацевтическом комбинате "Акрихот составил 200 тысяч рублей.

1988. — № 8. — С. 76. — Р. 61.08.88.578.

12. Умнова Э. Ф., Воробьева Л. И. Особенности меланиногенеза у гриба Сигуи1апа 1ипа1а//Биологические науки.— 1991. — в печати.

13. Умнова Э. Ф., Рыжкова В. М., Воробьева Л. И. Гидрокси-лирование 16а-метил-17а, 21-диоксипрегн-4-ен-3-она// Хим.-фарм. журн,— 1990. т. 24. — № 6. — С. 56—58.

14. Умнова Э. Ф.,. Рыжкова В. Н., Терентьев П. Б. Пигменты гриба Сип/и1апа 1ипа1а, обладающего стероид-гидрокси-лирующей активностью //Хим.-фарм. журн.— 1990.— т. 24. — № 7. — С. 60—62.