Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование и применение новых кремнеземных сорбентов для хроматографии биополимеров
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Конструирование и применение новых кремнеземных сорбентов для хроматографии биополимеров"
На правах рукописи
ОФИЦЕРОВ ВЯЧЕСЛАВ ИВАНОВИЧ
Конструирование и применение новых кремнеземных сорбентов для хроматографии биополимеров
03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Кольцово, 1998
Работа выполнена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Министерства здравоохранения Российской федерации
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор С.Н. Загребельный
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Э.Г. Малыгин доктор биологических наук С.Х. Дегтярёв доктор биологических наук В.В. Хомов
Ведущая организация:
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН
Зашита состоится « ^ ^ » сентября 1998 г. в 9—на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 633159 Новосибиская область, Кольцово
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан « лэ » июля 1998 г. Ученый секретарь
диссертационного совета
Т.Н. Шубина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одним из ключевых этапов в решении ряда проблем биоорганической химии, молекулярной биологии и биотехнологии является получение высокоочшценных биологически активных соединений. В начале 80-х годов интенсивное развитие медико-биологических наук привело к значительному расширению сферы использования олигонуклеотидов, пептидов и белков высокой степени очистки. Однако темпы совершенствования методов синтеза олигонуклеотидов и пептидов, а также темпы роста числа создаваемых методами генетической инженерии продуцентов рекомби-нантных белков значительно опережали развитие методов получения этих биополимеров в индивидуальном виде. Доступность их для научных исследований и практического применения, таким образом, оказалась в прямой зависимости от дальнейшего прогресса в области методов разделения, очистки и анализа.
Основным способом получения высокоочищенных веществ является жидкостная колоночная хроматография. Большие успехи в области разделения и анализа низкомолекулярных биологически активных соединений были достигнуты с внедрением в практику высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимой по разрешающей способности с газо-жид-костной хроматографией. Однако в хроматографии биомакромолекул успехи были значительно скромнее. Для разработки высокоскоростных и производительных методов разделения биополимеров необходимы механически прочные, высокоемкие макропористые сорбенты с хорошими гидродинамическими свойствами и длительным сроком эксплуатации. При использовании в аналитической хроматографии они должны обеспечивать высокую эффективность разделения наибольшего числа компонентов за наименьшее время, а при препаративном применении—максимальный выход целевого продукта с требуемой степенью чистоты и активности при наименьших затратах. Мягкие широкопористые сорбенты, полученные на основе полисахаридных гелей или синтетических полимеров, традиционно применяемые в лабораторной практике для анализа и очистки биополимеров, не удовлетворяли этим требованиям. Число твердокаркасных коммерческих сорбционных материалов, разработанных специально для различных типов хроматографии биомакромолекул было явно недостаточным.
Таким образом, актуальной стала задача целенаправленного получения новых макропористых жестких сорбентов для эффективного разделения биополимеров. Как показал анализ литературы, одним из наиболее перспективных подходов к конструированию таких хроматографических материалов является использование пористых кремнеземных матриц с химически модифицированной поверхностью. Однако исследования в этой области к началу выполнения настоящей работы были весьма фрагментарны, что было обус-
ловлено недостаточным развитием теории и практики синтеза и применения хроматографических сорбентов.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в проведении комплексного исследования кремнеземных сорбционных материалов, разработки новых высокоэффективных сорбентов для хроматографии биополимеров и применении синтезированных сорбентов для решения конкретных научных и практических задач, связанных с использованием методов хроматографического анализа и препаративного получения в индивидуальном виде олигонуклеотидов, пептидов, белков различных классов.
В задачи исследования входило:
- изучить методы химической модификации поверхности кремнеземов и синтезировать матрицы, обладающие комплексом свойств, требуемых для получения на их основе ряда новых хроматографических сорбентов;
- разработать высокоэффективные анионо- и катионообменной сорбенты, изучить их свойства в сравнении с лучшими коммерческими ионитами, отработать оптимальные условия применения для хроматографии олигонуклеотидов, белков и пептидов как в аналитическом, так и в препаративном масштабах;
- изучить факторы, влияющие на обращенно-фазовую хроматографию малорастворимых гидрофобных белков, разработать стратегию их эффективного разделения;
- на основе синтезированных сорбентов разработать новые эффективные методы хроматографического анализа и получения высокоочищенных биомакромолекул, использовать их для проведения исследования структуры и свойств ряда вирусных, рекомбинантных белков и иммуноглобулинов;
- разработать подходы к получению новых высокоёмких твердокаркасных носителей для эффективной иммобилизации различных биоспецифических лигандов и использования полученных сорбентов в аффинной хроматографии, в том числе для препаративной очистки белков, применяемых в производстве ряда медицинских иммунодиагностикумов.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основе проведенных исследований разработаны методы модификации широкопористых кремнеземов и получения матриц со свойствами, необходимыми для конструирования новых высокоэффективных сорбентов для анионообмен-ной, катионообменной, аффинной хроматографии биополимеров.
При создании ионитов композиционного типа изучена зависимость их селективности, сорбционной емкости и неспецифического гидрофобного связывания биополимеров от диаметра пор кремнеземной матрицы и строения сшитого полимерного слоя.
Показано, что синтезированные композиционные сорбенты превосходят по разрешающей способности, емкости и стабильности коммерческие ВЭЖХ-носители «щеточного» типа. Отработаны условия эффективного разделения на новых сорбентах протяженных олигонуклеотидов, пептидов и белков различных классов.
Разработан метод очистки малорастворимых гидрофобных белков с помощью ВЭЖХ на синтезированных широкопористых обращенно-фазовых сорбентах. Метод использован для получения недоступных ранее индивидуальных белков вирусов клещевого энцефалита, гриппа, Марбург, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. В результате проведенных исследований получены новые данные о свойствах этих белков, их строении и посттрансляционной модификации. Проведены структурные исследования выделенных с помощью ВЭЖХ рекомбинантных интерферона а2 человека, ангиогенина и д других белков. Доказана их идентичность природным аналогам.
На основе применения ионообменной хроматографии на синтезированных сорбентах разработан способ выделения иммуноглобулинов класса О из сывороток крови человека и животных, а также новый метод количественного анализа подклассов 1«0. Изучены индивидуальные физико-химические и биологические свойства подклассов кролика, козы, овцы, лошади. Выделен и охарактеризован неизвестный ранее покласс козы. Впервые выявлены общие закономерности изменения состава подклассов в процессе иммунизации животных различными антигенами. Разработан подход к препаративному получению высокоактивных инизкореактогенных иммуноглобулинов из гипериммунной лошадиной сыворотки.
Синтезирован ряд новых кремнеземных аффинных сорбентов, исследованы их свойства и показано преимущество в селективности, гидродинамических характеристиках и стабильности над традиционно используемыми носителями на основе полисахаридных матриц. Разработаны носители для препаративной иммуноаффинной очистки антивидовых антител, применяемых в технологии производства ряда медицинских иммуно-диагностикумов.
Разработан новый иммунометрический метод определения хориони-ческого гонадотропина человека (ХГЧ), основанный на использовании двух типов высокоочшценных поликлональных антител к разным антигенным детерминантам молекулы ХГЧ, полученных из одной антисыворотки с помощью последовательной двухэтапной аффинной хроматографии на композиционных носителях. На основе его созданы и внедрены в производство ЗАО «Вектор-Бест» наборы реагентов для иммуноферментного качественного и количественного определения хорионгонадотропина.
Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференция и симпозиумах, в том числе: V Всесоюзной конференции «Методы получения и анализа биохимических препаратов» (Юрмала, 1987), VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов (Таллин, 1987), Всесоюзной конференции «Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицине и микробиологической промышленности» (Ташкент, 1989), конференции Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева «Молекулярная сорбция биологически активных веществ» (Пенза, 1990), Международной конференции «Medical biotechnology, immunization and AIDS» (Ленинград, 1991), Международной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии» (Витебск, 1993), II Международной конференции «AIDS, cancer and retroviruses» (Санкт-Петербург, 1993), XI Международном конгрессе по вирусологии (Иерусалим, 1996), а также на научных конференциях и семинарах НПО «Вектор», Новосибирского института биоорганической химии и МГУ. По материалам исследований опубликовано 35 работ, включая 2 авторских свидетельства и 2 патента РФ.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, 4 глав собственных исследований, заключения и выводов. Она изложена на 206 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц, 27 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 238 источников.
Работа выполнена в рамках ряда научно-исследовательских работ и научно-технических программ в 1983-1997 годах в НПО, а позднее ГНЦ ВБ «Вектор».
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ НОВЫХ КРЕМНЕЗЕМНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ИОНООБМЕННОЙ И АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ БИОПОЛИМЕРОВ
Как показал проведенный нами в первой главе настоящей работы анализ литературных данных, общими требованиями к кремнеземным сорбентам для анионо-, катионообменной и аффинной хроматографии биополимеров является гидрофильное окружение функциональных ионогенных групп и лигандов, а также максимальное экранирование силанольных групп матрицы от контактов с разделяемыми веществами. Мы высказали предположение, что модификация поверхности кремнеземов гидрофильными полимерами может стать универсальный подходом к получению матриц, на основе которых возможен синтез новых высокоэффективных сорбентов для различных типов хроматографии. Представленные во 2 главе данные посвящены результатам исследований, проведенных нами в этом направлении. 2.1. Анионообменные сорбенты
С целью конструирования эффективных анионитов для ВЭЖХ биополимеров мы провели исследования в области макропористых кремнеземных сорбентов, модифицированных сшитым полиэтиленимином. В опубликованных ранее работах для получения композиционных анионообмен-ников этого типа были использованы преимущественно полиамины молекулярной массы 600-800. Однако разрешение олигонуклеотидов и ряда белков на колонках с данными сорбентами была недостаточным.
Основное влияние на селективность композиционных сорбентов, очевидно, оказывает структура ионогенного слоя, которая зависит от свойств полимера, метода закрепления его на поверхности носителя, а также пористости исходной матрицы. Поэтому мы провели изучение разрешения биополимеров сорбентами этого типа, варьируя размер пор матрицы, молекулярную массу ПЭИ, метод его нанесения на силикатную поверхность и тип сшивающего агента. С этой целью был получен ряд сорбентов для препаративной ИОХ на основе пористых стекол и силикагелей с различным диаметром пор (табл. 1). В результате изучения их свойств было установлено, что лучшей разрешающей способностью обладали композиционные сорбенты, полученные сшивкой прочно удерживаемого поверхностью силикатной матрицы слоя полиамина, который не удалялся при многократной промывке этанолом. По разрешению олигонуклеотидов эти аниониты превосходили сорбенты со сшитым без предварительной отмывки слоем ПЭИ. Максимальную селективность показали аниониты на основе пористых стекол и силикагелей с диаметром пор 50-100 нм, ПЭИ-35 000, сшитым алифатической эпоксидной смолой
7
Таблица 1
Аниониты на основе пористых носителей, модифицированных сшитыми полиаминами
№ Носитель Опор, Полиамин Сшивающий Емкость
п.п. ни агент мэкв/г*
1. СРС-10 7,3 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,69
2. СРС-10 34,4 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,49
3. СРС-10 70,0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,34
4. СРС-10 105,0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,29
5. СРС-10 140,0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,24
6. К1еБе1де1-60 6,0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,94
7. Силохром С-120 30,0 ПЭИ-600 ДЭГ-П 0,88
8. Силохром С-80 50,0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,79
9. Силохром С-2 70,0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,73
10. Аэросилогель МСА-1 120.0 ПЭИ-600 ДЭГ-1 0,63
11. СРС-10 106,0 Диэтилентриамин ДЭГ-1 0,33
12. СРС-10 106,0 Попизтипенпопиамин ДЭГ-1 0,35
13. СРС-10 106,0 ПЭИ-35000 ДЭГ-1 0.56
14. СРС-10 106,0 ПЭИ-60000 ДЭГ-1 0,60
15. Силохром С-80 50,0 Диэтилентриамин ДЭГ-1 0,56
16. Силохром С-80 50,0 Полиэтиленполиамин ДЭГ-1 0,64
17. Силохром С-80 50,0 ПЭИ-35000 ДЭГ-1 1,15
18. Силохром С-80 50,0 ПЭИ-60000 ДЭГ-1 1,25
19. Силохром С-2 70,0 ПЭИ-35000 ДЭГ-1 0,91
20. Аэросилогель МСА-1 120.0 ПЭИ-35000 ДЭГ-1 0,80
21. СРв-Ю 70,0 ПЭИ-35000 1,2-Дибромэтан 0,61
22. СРС-10 70,0 ПЭИ-35000 1,4-Дибромбутан 0,59
23. СРв-Ю 70,0 ПЭИ-35000 ЭД-20 0,54
24. Силохром С-80 50,0 ПЭИ-35000 1,2-Дибромэтан 1,33
25. Силохром С-80 50,0 ПЭИ-35000 1,4-Дибромбутан 1,28
26. Силохром С-80 50,0 ПЭИ-35000 ЭД-20 1,12
27. СРв-Ю 70,0 ПЭИ-35000 ДЭГ-1 0,59
28. СРС-10 70,0 ПЭИ-35000 1,2-Дибромэтан 0,62
29. СРб-Ю 34,4 ПЭИ-35000 ДЭГ-1 0,74
30. СРв-10 34,4 ПЭИ-35000 1,2-Дибромэтан 0.79
31. Силохром С-2 70, ПЭИ-35000 1,2-Дибромэтан 0,96
* Определена по пикриновой кислоте
ДЭГ-1 или 1,2-дибромэтаном. Они значительно превосходили по разрешающей способности широко используемую для препаративной хроматографии олигонуклеотидов ОЕАЕ-целлюлозу, на которой смесь из семи чистых олиго-нуклеотидов практически не разделяется (рис. 1). Структура ионогенного слоя полученных сорбентов, вероятно, способствует наиболее эффективному массообмену полианионов олигонуклеотидов.
Синтезированные высокоёмкие анионигы хорошо зарекомендовали себя в лабораторной практике, где были использованы для препаративного выделения большого числа синтетических дезоксирибонуклеотидов протяженностью до 15 нуклеотидных звеньев. При этом на колонку размером 14x150 мм допустима нагрузка 700 -1000 ОЕ,60 реакционной смеси без заметного снижения качества очистки олигонуклеотвда.
Рис. 1. Хроматография смеси олигодезоксирибонуклеотидов длиной 9-15 нуклеотидных звеньев на различных анионитах.
Колонки размером 4x120 мм, элюция линейным градиентом концентрации ИаС1 в 7 М мочевине с 0,01 М трис-НС1(рН 7,0) со скоростью потока 14 мл/ч. Цифрами оБзначен пик олигонуклеотида соответсвующей длины, а - сорбент № 13 (СРв-ЮбО, ПЭИ-35000, ДЭГ-1); б ~ сорбент № 17 (С-80, ПЭИ-35000, ДЭГ-1); в ~ ЭЕАЕ-целлюлоза (С1~ форма).
Аналогичная схема синтеза была применена нами для получения композиционных анионитов с размером частиц 10 мкм для ВЭЖХ. Однако синтезированные носители, как было показано в результате исследований, уступали по селективности олигонуклеотидов одному из лучших коммерческих сорбентов для ВЭЖХ — РагйвН БАХ. Известно, что этот анионит «щеточного» типа содержит в качестве функциональных групп привитые четвертичные алкиламины. Ионогенные группы ПЭИ-сорбентов представлены вторичными и третичными аминами с меньшими значениями рКа. Мы предположили, что дополнительное алкилирование, приводящее к квартернизации аминогрупп, может оказать положительное влияние на разрешающую способность ПЭИ-сорбентов.
В таблице 2 представлены свойства синтезированных композиционных сорбентов с квартернизованными аминогруппами, анионообменная ёмкость которых существенно выше, чем у сорбента РагйвН БАХ, несмотря на значительно большую удельную поверхность последнего.
Таблица 2
Свойства аннонообменных сорбентов для ВЭЖХ
Матрица нм S, м2/г Степень квартернизации Емкость Гидрофобность
мэкв/г BSA мг/г нь, мг/г BSA мг/г НЬ, мг/г
LiChospher Si-1000 100 15 51 0,42 63 - 51.5 -
Kieselgcl Si-500 50 50 48 0,73 90 - 11,3 -
Силохром C-80 50 80 50 0,95 115 157,0 7,5 17,5
Силохром С-120 30 120 49 1,30 144 192,0 8,1 13,0
Армсорб Сил-30 30 150 48 1,40 137 - 0,3 -
Partisil SAX 5 400 100 0.40 - - - -
Сравнительное изучение хроматографических свойств ряда различных анионитов показало, что максимальными разрешением и селективностью обладал композиционный сорбент с ионогенным слоем из сшитого квартер-низованного ПЭИ, названный «Полисил-СА-500», (табл. 3). В отличие от коммерческого анионита Partisil SAX, он обеспечивал практически полное разделение восьми синтетических олигодезоксирибонуклеотидов протяженностью 9-20 оснований (рис. 2). Следует отметить, что эффективность квартернизации ПЭИ-сорбентов с целью улучшения их характеристик была подтверждена позднее в работе Ренье с сотр.
Таблица 3
Сравнение селективности и разрешения ашюнообменников*
Сорбент (основа ионогенного слоя) Селективность Разрешение
«1,2 «1,3 а,,* Кг R.,3 Rl,4
С-80, сшитый ПЭИ 1,83 1,58 3,33 1,3 0,9 2,3
С-80, сшитый и квартернизованный ПЭИ (Полисил - С А-500) 2,54 4,30 7,46 5,3 6,6 9,7
Partisil SAX 2,14 3,29 5,57 1,4 2,5 4,3
* для хроматографии использовали смесь олигонуклеотидов (I - CAAGCCTCCA, 2 - G Т G ТТЛ С С G АЛ, 3 - GAAAGGTAGATAA, 4 - AAAAACGCTTACAA).
А,
1КН,ГО,),М
Рис. 2. Анионообменная хроматография смеси 9-20-членных олигодезоксирнбонуклеотндов.
Колонки 3,2x250 мм: а — Полисш-СА-500; б — Partisil SAX. Элюция линейныйм градиентом концентрации фосфата калия, рН 6,5 в 30% ацетонитриле: скорость потока 1,5 мл/мин (а) и 1,0 мл/мин (6). Цифры над пиками обозначают длину олигонуклеотида.
Для изучения эффективности разделения белков новыми композиционными анионитами мы использовали смесь овальбумина и ингибитора трипсина из сои, имеющих близкие изоэлектрические точки (4,7 и 4,5, соответственно). ВЭЖХ проводили на колонках с сорбентами Полисил-СА-500 и Полисил-СА-300 (на основе силохрома С-120) варьируя состав, рН и скорость подачи элюента. Повышение значения рН элюентов с 5,3 до 8,5 улучшало разрешение белков (рис. 3). Это, по-видимому, связано не только с суммарными зарядами разделяемых белковых молекул, но и с неполной квартернизацией сшитого полиэтиленимина на носителе (см. табл. 2), за счет чего дополнительный вклад в ионообменную емкость сорбента вносят остаточные третичные, а, возможно, также вторичные аминогруппы.
Рис. 3. Влияние рН на разделение смеси овальбумина (1) и ингибитора трипсина из сои (2).
Колонка (3,2x250 мм) с сорбентом Полисил-СА-300 (10 мкм), линейный градиент концентрации КН^РО^, скорость потока 1 мл/мин, л) - рН 5,35; б) -рН8,5.
Изменение скорости потока от 0,5 до 1,5 мл/мин не снижало разрешение модельных белков (рис. 4). Это позволяет уменьшить время хроматогра-фического процесса и имеет большое значение для очистки высоко лабильных белков.
В результате проведенных исследований было также установлено, что высокая анионообменная емкость полученных композиционных сорбентов
позволяет использовать при ВЭЖХ повышенные удельные нагрузки разделяемых веществ. Кроме того, хорошая совместимость с биомакромолекулами и низкая неспецифическая сорбция обеспечивают при хроматографии высокие выходы с колонок целевых продуктов.
Время, мин Время, мин
Рис. 4. Влияние скорости потока на разделение смеси овальбумина (1) и ингибитора трипсина из сои (2).
Колонка (3,2x250 мм) с сорбентом Полисил-СА-500 (10 мкм), элюция линейным градиентом концентрации КН2Р04 рН 7,5.
а) скорость потока 1,5 мл/мин;
б) скорость потока 0,5 мл/мин.
2.2. Катионообменные сорбенты
С целью разработки новых катионообменных носителей для ВЭЖХ белков и пептидов мы провели синтез и изучение свойств двух типов катеонитов на основе силохромов С-120, С-80 и силикагеля Армсорб Сил-30. «Щеточные» катиониты были получены путем последовательной обработки исходных матриц у-аминопропилтриэтоксисиланом, а затем янтарным ангидридом; катионообменники композиционного типа — ацилированием янтарным ангидридом кремнеземов, содержащих на поверхности слой сшитого 1,2-дибомэтаном полиэтиленимина средней молекулярной массы 35000. Карбоксилсодержащие композиционные сорбенты были названы «Полисил-К-300», «Полисил-К-500» и «ПолиАрмсорб-К-300».
Синтезированные сорбенты двух типов, как видно из данных представленных в таблице 4, практически не отличались по основным параметрам (Опор, удельной поверхности и ионообменной ёмкости), за исключением высокого гидрофобного связывания белков, которое было выявлено у «щеточ-
ных» катеонитов. Композиционные сорбенты, в отличие от сукцинамидо-пропильных катионитов, показали высокую селективность при хроматографии белков (рис. 5). Это, очевидно, обусловлено наличием в композиционных носителях высоко гидрофильного полимерного слоя, а также его хорошей совместимостью с белками.
Время, мин
Рис. 5. Разделение контрольной смеси белков: овалъбумина (1), рибонуклеазы (2), цитохрома С (3), лизоцима (4).
Элюция градиентом концентрации фосфата калия, рН 6,5; скорость потока 1,0 мл/мин;
а) Колонка (3,2x250 мм) с сорбентом Полисил К-500,
б) Колонка (4,6x250лш) с аминопропилсущинатным производным силохрома С-80.
При изучении поведения белков на колонках с композиционными катеонитами было установлено, что их разрешение значительно зависит от рН элюентов и оптимально при рН 6,5 (табл. 5). Белки с изоэлектрической точкой ниже 6,0, например, ингибитор трипсина из сои и BSA, не задерживаются на колонке и элюируются свободном объеме. Выход разделяемых белков с колонок был достаточно высоким (91,7-99,7%) при нагрузке 4-10 мг белка на 1 г сорбента. Это свидетельствует о том, что имеющиеся на композиционных сорбентах неацшшрованные аминогруппы не участвуют в электростатическом взаимодействии с белками.
Таблица 4
Сравнительная характеристика синтезированных катпоиообмешшков
Сорбент Удельная 1-^пор, Содержание аминогрупп, ммоль/г Емкость Гидрофобное
поверхность, м2/г НМ до апили-рования после аци-лирования по нь, мг/г связывание НЬ, мг/г
Силохром С-120-К* 120 30 0,3 0,002 75 112
Силохром С-80-К* 80 50 0,2 0,005 48 62
Полисид-К-500 80 50 1,0 0,55 46 5
Полисил-К-300 120 30 1,3 0,54 88 13
ПолиАрмсорб-К-ЗОО 130 30 1,4 0,66 105 3
* Сукцинамидопропил-кремнеземы
Таблица 5
Зависимость разрешения (R) белков от величины рН
рН Кл/Р кл/ц Ru/P
5,45 7,7 5,1 2,9
6,50 7,9 4,5 3,4
7,50 7,1 3,2 4,4
Обозначения: л - лизоцим, р - рибонуклеаза, ц - цигохром С
В результате проведенных исследований было также установлено, что скорость элюции при хроматографии на колонках с сорбентами Полисил-К может быть увеличена в 4 раза (от 6 до 24 см/мин) при снижении разрешения белков всего на 30%. Такой высокоскоростной режим разделения важен для проведения очистки лабильных белков.
Применение композиционных катионитов в ВЭЖХ допускает использование больших удельных нагрузок белков на сорбенты. Например, на колонке размером 3,2x250 мм удовлетворительное отделение основного вещества от примесей наблюдается при загрузке коммерческих препаратов рибонук-леазы до 25 мг и лизоцима до 15 мг как по отдельности, так и в смеси (рис. 6).
Времл. мин
Рис. 6. Влияние величины загрузки белков на разрешение.
Колонка (.3,2x250 мм) с сорбентом Полисил-К-300 (10 мкм), условия разделения в подписи к рис. 5;
а) нанесено 0,5 мгрибонуклеазы (1) и 0,1 мглизоцима (2).
б) нанесено 25 мгрибонуклеазы (1) и 15 мг лизоцима (2).
ВЭЖХ на колонках с композиционными катионитами была нами использована для разделения положительно заряженных пептидов. При оптимизации условий хроматографии было найдено, что разрешение пептидов значительно повышается при добавлении в элюенты до 25% ацетонит-рила. Существенное влияние на эффективность их разделения оказывает также рН элюентов (наилучшее разрешение пептидов получали при рН 6,5-7,5). При ВЭЖХ смеси из 5 синтетических пептидов, имеющих заряд от О до +4, в подобранных оптимальных условиях было получено их четкое разделение и выход с колонки в порядке увеличения заряда (рис. 7).
Таким образом, в результате проведенных исследований большого ряда синтезированных сорбентов разработаны новые высокоэффективные анионо- и катионообменные носители для ВЭЖХ биополимеров. Оптимизированы условия применения данных сорбентов для разделения биомакромолекул различной природы и выявлены факторы, влияющие на их разреше-
ние. Показано, что разработанные композиционные иониты превосходят по ёмкости, селективности и стабильности коммерческие «щеточные» сорбенты и могут успешно использоваться для получения высокоочищенных олигонук-леотидов, белков и пептидов.
Рис. 7. Катионообменная ВЭЖХ смеси пептидов.
1 — пептид дельта-сна (Б81Р), 2 — нейропептид из моллюска (ПШР-амид), 3 — вещество Р, 4 — а-пеоэндорфин (1-10), 5 — динорфин А (1-13). Колонка (3,2x250 мм) с сорбентом Полисил-К-300 (10 мкм), элюция градиентом концентрации фосфата калия рН 7,5 в 30% ацетонитриле; скорость потока 1,5 мл/мин.
2.3. Сорбенты для аффинной хроматографии
С целью конструирования новых жестких макропористых аффинных сорбентов мы использовали кремнеземы, модифицированные попереч-носшитыми полимерами. Для их получения силохром С-80 с адсорбированным слоем поливинилового спирта, полиэтиленимина, декстрана О-маннита сшивали эпоксидной смолой ДЭГ-1. Путем ацшгарования модифицированных матриц янтарным ангидридом и превращения введенных карбоксильных групп в ]Ч-гидроксисукцинимиднъге эфиры были получены активированные носители для синтеза аффинных носителей. Их свойства были изучены на примере иммобилизации соевого ингибитора трипсина (табл. 8).
Хотя количество лиганда на всех полученных аффинных сорбентах различалось незначительно (17,5-22,0 мг/г сорбента), носитель с матрицей, модифицированной сшитым декстраном, имел значительно меньшую динамическую емкость по трипсину, что, по-видимому, обусловлено наличием стерических затруднений для взаимодействия «фермент-лиганд».
Таблица 6
Свойства композиционных сорбентов на основе силохрома С-80 с иммобилизованным соевым ингибитором трипсина (СИТ)
Основа полимерного покрытия Количество иммобилизованного СИТ, мг/г сорбента Емкость по трипсину
мг/г сорбента мг/мг СИТ
Декстран/ДЭГ-1 22,0 2,9 0,13
ПВС/ДЭГ-1 18,7 7,2 0,38
D-маннит/ДЭГ-1 17,5 6,0 0,34
ПЭИ/1,2-дибромэтан 20,0 7,6 0,38
Аффинные сорбенты на основе ПВС- и ПЭИ-модифицированных си-лохромов показали максимальную емкость по трипсину. Однако при дальнейшем изучении ряда аффинных сорбентов на основе ПВС-силохрома было выявлено, что при изменении рН элюентов с 7,5 до 2,3 (условия элюции антител с колонки) происходит отщепление части иммобилизованных лиган-дов. Мы предположили, что это обусловлено недостаточно эффективным закреплением слоя ПВС на силохроме. Однако, при дополнительном ковалентном связывании ПВС с матрицей произошло снижение емкости полученных аффинных сорбентов. Поэтому в дальнейшей работе мы использовали только активированный ПЭИ-носитель, названный «Полисил-АФ».
При изучении свойств носителя Полисил-АФ с иммобилизованными аффинно-очищенными антителами кролика против IgG человека было установлено, что его динамическая ёмкость составляет 0,09 мг IgG человека на 1 мг иммобилизованного лиганда. Это на 30% больше, чем связывают аналогичные лиганды, иммобилизованные на сефарозу с активированными сложноэфирными группами.
Аффинная хроматография сыворотки кролика против IgG человека на колонке, упакованной композиционным носителем с иммобилизованными иммуноглобулинами G человека, позволяет получить высокоактивные, гомогенные по электрофорезу в агарозе и ПААГ антивидовые антитела (рис. 8).
В композиционном аффинном сорбенте с иммобилизованным белком А из Staphylococcus aureus 1 мг лиганда при хроматографии специфически связывал до 8 мг IgG человека. Это свидетельствует о несущественном влия-
нии процесса иммобилизации на композиционную матрицу на иммунохими-ческие свойства белка А.
б
в
0 112
0,6
а
<<■ г
0,4
0,2
о
40
80 мин
Рис. 8. Аффинная хроматография сыворотка кролика против ^С человека.
а) Профиль элюции с колонки (10x70 мм) с сорбентом Полисил АФ-^С ; буфер для нанесения—0,5 М№аС1 в 0,25 МКН^РО^рН 7,5; буфер для элюции антител — 0,5 М глицин-НС1, рН 2,3 (смена буфера показана стрелкой); скорость потока 0,5 мл/мин. 1 — фракция выделенных с колонки антител.
б, в) Электрофорез исходной сыворотки (0) и очищенных антител (1) в 1 % агарозе и 7,5% ПААГсоответственно. М —белковые маркеры (молекулярные массы в кДа).
Как показали проведенные исследования, полученные композиционные аффинные носители позволяют использовать высокие скорости потока элюентов как при хроматографии, так и при регенерации колонки. Они обладают высокой стабильностью. После проведения 150-200 циклов хроматографии заметного снижения емкости сорбентов, а следовательно и отщепления лигандов не наблюдалось.
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ ВЫСОКООЧИЩЕННЫХ ГИДРОФОБНЫХ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Одной из задач, которая может быть решена с помощью обращенно-фазовой хроматографии, является получение в индивидуальном виде белков с целью установления их структуры, изучения физико-химических и других свойств. Однако при ВЭЖХ белков нередко возникают проблемы, обусловленные их сложной гетерогенной структурой и способностью к многоцентровому необратимому связыванию с обращенно-фазовыми сорбентами. Дополнительные сложности возникают при работе с малорастворимыми (гидро-
фобными) белками. Основной целью настоящей части работы явилась разработка общего метода получения индивидуальных гидрофобных белков различных классов с помощью ОФХ.
К началу выполнения исследований ассортимент широкопористых коммерческих носителей для разделения белков был весьма ограничен, а необходимые сорбенты нам недоступны. Поэтому мы синтезировали новые стационарные фазы для ОФХ, исходя из отечественных силохромов С-80 и С-120. Частицы кремнеземов обрабатывали диметилоктадецилхлорсиланом, а затем непрореагировавшие силанольные группы «кэпировали» триметил-хлорсиланом. Это позволило получить ОФХ-сорбенты, не содержащие по данным проведенного анализа остаточных силанольных групп на поверхности.
Предварительное исследование разрешающей способности новых сорбентов, названных «Полисил-ОДС-500» и «Полисил-ОДС-ЗОО», в отношении белков было проведено с использованием стандартной для ОФХ пептидов системы элюции: градиент ацетонитрила в 0,05-0,1% трифтор-уксусной кислоте. Однако при попытке хроматографии структурных белков вируса гриппа их удалось выделить с выходом менее 15% и с недостаточной степенью очистки. Это совпало с опубликованными ранее данными по ОФХ белков вируса гриппа на широкопористом носителе Aquapore КР-ЗОО.
Низкий выход и неудовлетворительное разрешение обусловлены, вероятно, слабой растворимостью белков в используемых элюентах, а также формированием ассоциатов полипептидов, способных прочно связываться с сорбентом. Поэтому для успешного разделения гидрофобных белков с помощью ОФХ необходимо было подобрать подходящие условия элюции. В ходе наших экспериментов хорошо зарекомендовала себя элюирующая система на основе муравьиной кислоты. В концентрации 60% и выше муравьиная кислота может также быть использована для приготовления из исходных вирионов растворов белков для хроматографии.
Оптимальный состав элюентов для ОФХ белков на сорбентах Поли-сил-ОДС-500 и Полисил-ОДС-ЗОО был подобран на модельной смеси (оваль-бумина и бычьего сывороточного альбумина). Максимальное разрешение этих белков удалось получить при использовании градиента пропанола в 40-60% муравьиной кислоте (рис. 9 г). При проведении в данных условиях ОФХ структурных белков вируса гриппа (рис. 10) с выходом более 80% были получены электрофоретически гомогенные гемагглютинин (НА), нуклеопро-теиновый (№) и матриксный белок (М). Следует отметить, что проведение ОФХ с такой системой элюентов позволяет использовать большие нагрузки белков на сорбент. Так, на колонке размером 4,6x50 мм можно без ухудшения качества очистки разделять до 2 мг исходной смеси вирусных полипептидов.
0,2
л
/
/
/
(И
. /
/
/
и
/
/
----
1« 20 3)а
1« Мм.
10 20 30 к
II 20 ЗОмЬ
Рис. 9. Рзделсние контрольной смеси белков бычьего сывороточного альбумнна (1) и овальбумнна (2).
Элюенты: А —муравьиная кислота: вода 6:4; В (для а и в) —муравьиная кислота-ацетонитрил-вода 5:4:1; В (для б и г)—муравьиная кислота-изапропанол-вода 5:4:1; штриховой линией показано процентное содержание элюента В в элюенте А; скорость потока 1 мл/мин;
а, б) - Колонка (4,6x40 мм) с сорбентом Полисил-ОДС-ЗОО (10 мкм); в, г) - Колонка (4,6x40 мм) с сорбентам Полисил-ОДС-500 (10 мкм). А,»
1 2 3
I .
I ■■ ' 66
45 24
30 мин
Рис. 10. Хроматографическое разделение белков вируса гриппа А, штамм Ленинград 385/80, подтип Н31Чг.
а) Профиль элюции белков с колонки (4,6x40 мм) с сорбентом Полисш-ОДС-500 (10 мкм); элюенты: А — 60% муравьиная кислота, В — муравьиная кислота-изопропанол-вода 4:5:1; штриховой линией показано процентное содержание элюента В в элюенте А; 1,2,3 — фракции, соответствующие белкам ЫР, М, НА.
б) Электрофорез полученных фракций в 13% П/ЫГв восстанавливающих условиях; цифры справа — молекулярные массы маркерных белков (в кДа).
ГЛАВА 4. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗРАБОТАННЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ И ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАДАЧ
4.1. Выделение гидрофобных белков с помощью ОФХ, изучение их строения и свойств
Разработанный метод ОФХ гидрофобных белков позволяет, используя аналитическую колонку, получить высокоочищенные белки в количестве, достаточном для проведения многих исследований. С его помощью мы выделили ряд недоступных ранее белков вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ), гриппа и Марбург. На рис. 11 приведен пример разделения структурных белков ВКЭ. Гомогенность полученных белков подтверждали электрофорезом в ПААГ, а также количественным анализом их аминокислотного состава, результаты которого хорошо совпали с теоретическими данными, рассчитанными на основании структуры соответствующих генов.
Поскольку процессинг структурных белков флави- и альфавирусов слабо изучен, мы провели эксперименты по определению аминокислотной последовательности Ы-концевых участков выделенных вирусных белков. На основании данных сиквенса капсидного белка ВКЭ, было установлено, что после его трансляции происходит протеолитическое отщепление К-концевого метионина, так же, как у изученных ранее капсидных белков других флави-вирусов.
45
36
40 мня
Рис. 11. Очистка белков вируса клещевого энцефалита с помошыо ОФХ.
а) Профиль элюции белков с колонки. Условия разделения приведены в подписи к рис. 10. 1,2 — фракции, соответствующие С- и Е-белкам ВКЭ.
б) Электрофореграмма фракций (1,2) и исходной смеси белков ВКЭ (0) в 13% ПААГ; цифры слева —молекулярные массы маркерных белков (в кДа).
Определить последовательность аминокислот N-концевого участка гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита нам не удалось. Это, вероятно, обусловлено наличием в нем модифицированой N-концевой аминокислоты, не вступающей в реакцию с фенилизотиоцианатом, который используется для секвенированпя белков. По-видимому, посттрансляционные изменения гликопротеина Е в ВКЭ отличаются от процессинга аналогичных белков в близкородственных флавивирусах (желтой лихорадки, Западного Нила, Денге), где N-концевая аминокислота незаблокирована.
Определение структуры капсидного белка ВВЭЛ представляло особый интерес, так как анализ опубликованной последовательностиего геномной 26S РНК показал, что трансляция С-белка может происходить с одного из трех инициирующих ATG-кодонов. Ни один из этих кодонов не удовлетворяет правилу Козака, поэтому теоретический выбор их предпочтительности не возможен. К началу выполнения настоящей работы были опубликованы данные по первичной структуре капсидного белка только одного представителя рода альфавнрусов (Синдбис). Он транслируется с первого ATG-кодона и содержит ацилированный N-концевой метионин. Полученные нами при секвенировании выделенного капсидного белка ВВЭЛ результаты соответствуют его трансляции с третьего инициирующего ATG кодона 26S РНК. Однако нельзя полностью исключить варианты синтеза С-белка с одного из двух предыдущих ATG кодонов. В этих случаях, в результате процессинга синтезированного полипептида должно происходить отщепление лидерного пептида и образование зрелого капсидного белка.
В целом, на основании полученных нами экспериментальных данных можно сделать однозначный вывод, что механизм биосинтеза С-белков в вирусах Синдбис и ВЭЛ различен.
До выполнения настоящей работы не было опубликовано данных по прямому определению аминокислотной последовательности, а также локализации дисульфидных связей в молекуле гемагглютинина (НА) вируса гриппа А подтипа Н^, что, очевидно, объясняется отсутствием метода его получения в гомогенном виде. С помощью разработанного нами метода НА, нуклеопротеиновый (NP) и матриксный (М) белки были получены в индивидуальном виде. При секвенировании выделенного гемагглютинина впервые для подтипа HjN, вируса гриппа была определена последовательность аминокислот N-концевых участков тяжелой и легкой полипептидной цепи НА.
Для локализации некоторых дисульфидных связей в гемапнотинине был использован его высокомолекулярный полипептидный фрагмент. Он был получен по разработанному нами способу, заключающемуся в обработке бромистым цианом вирионов гриппа, диссоциированных муравьиной кислотой. В этих условиях NA-, NP- и М-белки расщепляются по кислотола-бильным связям Asp-Pro и метионину до низкомолекулярных пептидов, а из НА образуется высокомолекулярный фрагмент в 386 аминокислот (рис. 12).
Для выделения его реакционной смеси использовали ОФХ на сорбенте Полисил-ОДС-500.
Рис. 12. Схема фрагментации гемагглютинина вируса гриппа А, штамм Киев 59/79, подтип Е^Г*.
5-5 —- дисулъфидные связи, заштрихованы пептиды легкой и тяжелой цепи, входящие в высокомолекулярный бромциановый фрагмент НА и соединенные дисульфидными связями; пронумерованы цистеины, образующие эти связи, а также С-концевые аминокислоты легкой и тяжелой цепи НА.
При секвенировании фрагмента НА были определены И-концевые аминокислотные последовательности олигопептида (1-273) тяжелой цепи и двух пептидов, связанных с ним Б-Б-связями. Полученные данные позволяют сделать вывод, что цистеин в положении 4 тяжелой цепи гемагглютинина образует дисульфидную связь с цистеином в положении 137 легкой цепи НА, кроме того, дисульфидный мостик связывает между собой а аминокислоты в положениях 42 и 276 тяжелой цепи НА. Это подтверждает высказанную ранее гипотезу о сходном расположении дисульфидных связей в гемаг-глютининах родтипов Н, и Н вируса гриппа.
В экспериментах, проведенных с использованием метода иммуноблот-тинга и радиоиммуноанализа, показано, что хроматографически очищенные гемагглютинин и его бромциановый фрагмент, специфически взаимодействуют с противовирусной гипериммунной сывороткой кролика. Следовательно, они сохраняют часть антигенных свойств нативного белка, несмотря на жесткие условия, использованные для их получения.
При исследовании рецепторных свойств гемагглютинина вируса гриппа подтипа Н,И,, проведенных нами с помощью метода конкурентного радио-рецепторного анализа, впервые было установлено, что полипептид НА (1-273), полученный восстановлением и карбоксиметилирированием бромцианового фрагмента НА, способен специфически взаимодействовать с рецепторами клеток (рис. 13). Это позволяет сделать вывод, что основной
325
221
линейный участок гемагглютинина, узнающий рецепторы клеток, находится в полипептидном фрагменте тяжелой цепи НА, включающем аминокислоты с 1 по 273. Дальнейшие исследования, очевидно, могут привести к его более точной локализации.
Рис. 13. Зависимость связывания 1251-меченного вируса гриппа с клетками L9Wot концентрации немеченных белков и их фрагментов.
По оси абсцисс — концентрация конкурентов по белку (в МхНУ7); по оси ординат—связывание меченного вируса с клетками (в % от максимального); 1 — НА; 2 — смесь восстановленных и карбоксиметилированных цепей НА; 3 — бромциановый фрагмент НА; 4 — полипептид НА (1-273). Представлены усредненные данные трех независимых экспериментов.
Другой сферой приложения разработанного метода ОФХ гидрофобных белков было его применение для получения индивидуальных рекомби-нантных белков с целью доказательства идентичности их структуры природным аналогам.
Так, из малорастворимых телец включения, образующихся в высокопродуктивном штамм-продуценте клеток Е. coli, с помощью хроматографии был выделен электрофоретически гомогенный рекомбинантный интерферон а2 человека (рис. 14). Как показали проведенные исследования, аминокислотный состав, N-концевая последовательность аминокислот, С-концевые аминокислоты, определенные после исчерпывающего гидролиза исследуемого полипептида карбоксипептидазами А, В и Р; а также данные пептидного картирования полностью подтвердили соответствие первичной структуры рекомбинантного интерферона его природному аналогу.
0,6
0,4
0,2
/
/
/
0 1
50
10
20
30 мия
Рис. 14. ОФХ рекомбинантного интерферона а2 человека.
а—профиль элюции с кол онки (4.6x40 мм) с сорбентом Полисил-ОДС-ЗОО (Юмкм), градиент элюента Б (смесь ацетонитрила, изопропанола и воды — 3:1:1) в 58% муравьиной кислоте (А), скорость потока 1 мл/мин.
б — электрофорез исходной смеси(О) выделенной фракций (1) в 12,5% ПААГ
ОФХ на колонках с сорбентом Полисил-ОДС-ЗОО была также использована нами для очистки рекомбинантных ангиогенина и макрофагально-гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с целью изучения их стороения и свойств, для проведения комплекса работ по белковой инженерии с использованием нитчатого фага М13, а также ряда других исследований.
о
4.2. Применение композиционных анионитов для хроматографии протяженных олигодезоксирибонуклеотидов
Химически синтезированные олигонуклеотиды длиной несколько десятков оснований необходимы для решение многих научных и практических задач в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии. Для разработки эффективного метода очистки таких олигонук-леотидов мы провели оптимизацию условий их выделения из реакционных смесей с помощью ИОХ на новых композиционных сорбентах. С этой целью был изучен ряд элюентов, содержащих соли (КН2Р04, Ыа,Р20?, ЫаС1,1ЛС1, 1дСЮ4,1л2804, Иа2504 и другие), а также различные органические раство-
рители, снижающие вторичное неэлектростатическос взаимодействие веществ с ионитами. Найдено, что лучшее разделение олигонуклеотидов большой протяженности обеспечивает использование градиента фосфата калия и тгрофосфата натрия в растворах, содержащих до 30% ацетонитрила. Время хроматографического процесса в таких условиях может быть сокращено в 1,5-2 раза.
Использование колонок с новыми композиционными анионитами и подобранной системой элюшш позволяет эффективно выделять из реакционной смеси гомогенные олигонуютеотиды длиной 30-70 нуклеотидных звеньев (рис. 15). Высокая емкость сорбентов даёт возможность применять повышенные нагрузки исходной реакционной смеси олигонуклеотидов на колонки при сохранении хорошего разрешения. Так, на колонке размером 3,2x250 мм (объем 2 мл) можно проводить эффективное разделение 100-900 О.Е.254 реакционной смеси олигонуклеотида, в зависимости от его протяженности.
[N»^,0,1. м 0,1
0,06
Рис. 15. Выделение гептаконтадезоксирибоолигонуклеотида из 20 ОЕ,54 реакционной смеси.
а) Профиль олюции с колонки (3,2x250 лш) с сорбентом Полисил-СА-500 (10 мкм), градиент концентрации N0^,0, в 30% ацетонитрше, рН 6,5; скорость потока 1,5 мл/мин, температура 55 °С; заштрихованная область — собранная фракция ол игонукл еотида.
б) Электрофореграмма собранной фракции олигонуклеотида (2) и исходной реакционной смеси (1) после мечения "Р-у-АТР в 10 %ПААГ.
Для новых сорбентов характерна высокая стабильность. Колонки, проработавшие в течении года и использованные для проведения нескольюк сотен хроматограмм реакционных смесей олигонуклеотидов, сохраняли высокое качество разделения.
4.3. Использование новых анионитов для очистки иммуноглобулинов класса С
На основе применения композиционных анионитов нами были разработан эффективный метод хроматографической очистки фракции из сывороток крови человека и ряда животных. Высокая емкость новых сорбентов позволяет использовать упрощенный вариант подготовки исходной сыворотки для хроматографии. Он заключается в разбавлении образца водой до удельной проводимости не более 0,05 мкСм/см. Сыворотку кролика, например, разбавляли в 2 раза, человека — в 3-4 раза, лошади — в 8-10 раз. При хроматографии фракция, содержащая выходит в объеме элюата, незначительно превышающем объем образца, нанесенного на колонку. Максимально допустимая нагрузка составляет 1,0 и 1,5 мл неразбавленной сыворотки на грамм сорбента Полисил-СА-500 и -СА-300, соответственно. Это позволяет использовать небольшие по объему колонки для эффективной полупрепаративной очистки ^й-фракции антител.
На рис. 16 приведена ИОХ кроличьей сыворотки на сорбенте Полисил-СА-500. Пик, выходящий при нанесении образца и в стартовом буфере, содержит практически чистые иммуноглобулины класса й, которые хорошо отделяются от остальных сывороточных белков. Аналогично ведут себя при хроматографии на новых анионитах человека, морской свинки, лошади, козы, барана, причем их выход с колонки достигает 90-98%.
3,2
1,6
/
[КН,РО,],М
/
У
0,2
0,1
0 ! 2'
4 5 6 7
Я
Рис. 16. Разделение сыворотки кролика.
а) Профиль элюции с колонки (3,2x250 мм) с сорбентом Полисил-СА-500 (10 мкм), градиент концентрации КН^РО^рН 6,5; скорость потока 1,5 мл/мин, нанесено 1 мл сыворотки; 1-8 — отобранные фракции.
б) Электрофореграмма фракций (1-8) и исходной сыворотки (0) в 1 % агарозе.
Полученные с помощью разработанного метода иммуноглобулины класса О человека и животных были использованы в синтезе ряда аффинных сорбентов для препаративной очистки антивидовых антител.
б
4.4. Анализ подклассов 1дв с помощью ИОХ на новых анионитах. Состав и свойства подклассов 1д6 в сыворотках крови животных
Изучение состава и свойств подклассов иммуноглобулина С в сыворотках крови животных актуально при решении как научных, так и практических задач (исследованию гуморального ответа на введение различных антигенов, выбору рациональных схем иммунизации, получению высокоактивных препаратов антител и т.д.).
Разработанный нами метод анализа подклассов основан на использовании ВЭЖХ на колонках с композиционным сорбентом Полисил-СА-500. С целью повышения эффективности разделения подклассов были подобраны и оптимизированы: метод предварительного фракционирования исходных сывороток крови перед хроматографией для удаления балластных сывороточных белков, а также состав элюентов и профиль градиента. На рис. 17 приведен хроматографический анализ подклассов в сыворотке овец. Они элюируются с колонки в трех пиках, первый из них является гамма-2-глобулином, а второй и третий—гамма-1 -глобулинами (соответствующим подклассам 1§С2 и овцы).
0.2 -
Рис. 17. Разделение иммуноглобулинов С овцы после фракционирования сыворотки капрнловоП кислотой.
а) Профиль эмоции белков с колонки (3,2x50 мм) с сорбентом Палисил-СА-500 (20 мкм) ступенчатым градиентом КС1 (0; 0;04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,24; 0,30 М) в 0,01 фосфате калиярН 6,5; объем каждой ступени 16 мл; скорость потока 2 мл/мин; 1-5 — отобранные фракции
б) Электрофорез в 1 % агарозе фракций (1-5), исходной сыворотки (Б) и центрифугата после ее обработки каприловой кислотой (С).
Разработанный метод был использован нами для анализа подклассов 1^(3 кроликов, коз и лошадей, иммунизация которых широко применяется для получения специфических антител к различным антигенам. При этом было выявлено, что в сыворотках крови всех иммунизированных животных происходит значительное изменение состава подклассов 1§С}. Увеличивается содержание иммуноглобулинов с большим отрицательным зарядом, которые у неиммунизированных животных присутствуют лишь в следовых количествах (рис 18). Исследование динамики появления антител в процессе иммунизации кроликов и коз неочищенными вирусными антигенами показало, что резкое увеличение содержания ^О в этих хроматографических фракциях происходит уже после первого цикла иммунизации (табл. 7). При изучении специфичности антител было установлено, что данных фракций слабо активны в отношении вирусных антигенов и имеют высокий титр к антигенам печени и мозга, концентрация которых в препаратах, используемых для иммунизации значительна. Большинство противовирусных антител в сыворотках кроликов и коз элюируется с колонки в первом пике.
0,2
0,1
J
0 12 3
20
40 0
20
40 мин
Рис. 18. Разделение иммуноглобулинов С сывороток козы.
Условия хроматографии приведены в подписи к рис. 17. а — неиммунная сыворотка;
б — сыворотка козы после б циклов гипериммуннизации 10% гомогенатом печени морской свинки, инфицированной вирусом Эбола;
е — электрофорез в 1% агарозном геле исходной гипериммунной сыворотки (0) и -содержащих фракций 1-3.
в
Таблица 7
Состав и иммунохнмические свойства ^С сывороток кроликов, иммунизированных сложным» антигенами
Циклы Хроматографичсскиепики, время выхода
5 — 6 минут 9 — 11 минут 13—15 минут
Вид иммуни- Количество титры Количество титры Количество тугтры ан-
антигена зации де, % от ативирус- IgG, % от антиви- ^С, % от тивирусных
суммэрн. ных анти- суммарн. русных суммарн. антител в
содержан. тел в ИФА содержания антител в содержания ИФА
ИФА
Гомогенат печени м/свинки, икфицир. вирусом Марбург 0 83,012,5 6,8+1.5 1,2+0,8
1 52,8±1,2 1:40 28,5+5,6 <1:10 9,5±0,6 <1:10
2 43,2+7,7 1:120 38,4+3,3 1:20 10,2±0,7 <1:10
3 32,5+0,8 1:320 42,4+8,2 1:80 15.4+0,6 1:20
4 41,5+1,6 1:640 45,6+5,7 1:80 14.6+2,5 1:10
5 51,9+2,3 1:1080 36,2+2,3 1:60 12,8+2,2 1:10
Гомогенат мозга мыши, инф. вирусом ВсЭЛ 0 79,5+1,9 5.4+1,8
1 48.6+3,5 1:160 31,4+7,8 1:80 6,8+1,8 <1:10
г 38,6+2.7 1:480 52,4±3,3 1:120 15,3+2,3 1:20
3 43,3+3,4 1:640 41,9+5,6 1:180 12,6+0,9 1:40
4 48,6+6,4 1:1280 39,4+4,7 1:240 13,5±1,1 1:20
Ранее были опубликованы данные, что в гипериммунных лошадиных сыворотках имеется подкласс 1"С}пу который отличается от других подклассов по физико-химическим характеристикам (в частности, большему отрицательному заряду) и биологическим свойствам. Однако сведения о наличии аналогичного подкласса у других животных отсутствовали. Поэтому мы провели более детальную характеризацию фракции иммуноглобулинов козы из третьего хроматографического пика (время выхода 38-40 мин., рис. 18) и сравнение их по физико-химическим и биологическим свойствам с ранее изученными подклассами ^О, и козы.
На основании исследований, проведенных с использованием электрофореза в ПААГ и 1% агарозе, иммунодиффузии с сывороткой, специфичной к тяжелой цепи ^С; экспериментов по связыванию с иммобилизованным белком А, а также данных по специфичности (иммуноблотинг, ИФА) и индекса в реакции нейтрализации (табл. 8), было предположено, что эта фракция антител является неописанным ранее в литературе третьим подклассом козы. Это предположение было подтверждено выявленными с помощью анализа аминокислотного состава и пептидного картирования различиями в первичной структуре С-концевых Рс'-фрагментов трех подклассов козы, в которых, как известно, располагаются изотопические детерминанты антител.
Таблица 8
Свойства подклассов из гипериммунных сывороток коз против вируса Эбола
Подклассы иммуноглобулина в ИФА, обратные титры к антигенам Индекс в реакции нейтрализации
вируса печени
1620+800 750+200 3,75+0,75
1а 760+360 2800±1200 1,75+0,5
1§0 1Ь 680+120 8500±2100 1,05±0,25
Таким образом, в результате проведенных исследований впервые было установлено, что в сывотках крови коз имеется неизвестный ранее, третий подкласс ^О, отличающийся строением, физико-химическими и биологическими свойствами от двух описанных в литературе подклассов. По номенклатуре, применяемой для обозначения подклассов ^О морской свинки, крысы и мыши, мы назвали его а присутствующий в неиммунных сыворотках коз подкласс с аналогичным гамма-1-изотипом тяжелых цепей —
Широко распространенным методом получения иммуноглобулинов из сывороток крови является спиртовое фракционирование. Однако в литературе практически не отражены данные о составе подклассов 1§С в препаратах гамма-глобулинов. Для решения этой задачи мы предложили использовать разработанный нами метод анализа подклассов. На примере исследования препаратов гамма-глобулинов лошади и козы показана перспективность его применения с этой целью. Так, в частности, было установлено, что состав подклассов в гамма-глобулинах козы существенно отличается от состава исходных сывороток, за счет того что при спиртовом фракционировании наибольший выход (80%) имеет а минимальный — (30%).
Известно, что гамма-глобулины, полученные из гипериммунных лошадиных сывороток, часто вызывают у людей анафилактические реакции. Их используют только в тех случаях, когда недоступны аналогичные препараты из плазмы крови человека. Поэтому изучение подклассов в гипериммунных сыворотках лошадей представляет как научный, так и практический интерес.
Используя анионообменную хроматографию на сорбенте Полисил-СА-500, мы выделили из гипериммунной лошадиной сыворотки против вируса клещевого энцефалита три фракции иммуноглобулинов, содержащие подклассы 1£гОа+ и 1«0(Т) При исследовании их специфичности
(табл. 9), сенсибилизирующей активности и склонности к агрегатообразо-ванию было установлено, что основное количество антител к ВКЭ находится
во фракции 1§Оа+ Подкласс имел максимальный титр к антигенам мозга мыши (в частности, к миелину), составляющим значительную часть препарата, используемого для иммунизации лощадей; вызывал наибольшее количество случаев тяжелой анафилаксии у морских свинок, а также образовывал наибольшее количество агрегатов, по сравнению с другими подклассами.
Таблица 9
Специфичность подклассов гнпериммуииой лошадиной сыворотки против ВКЭ
Исследуемые препараты Концентрация белка, мг/мл Антитела к антигенам ВКЭ, обратные титры Антитела к антигенам мозга мыши, обратные титры ИФА
ИФА РТГА суммарн. АГ миелин
Сыворотка 78,0±2,5 44000+2500 2560± 1280 27000+6200 24000±8500
18Оа+1£Оь 19,6±3,1 80000 + 4200 Ш0±640 4С00+480 400+120
I фс 18,0+1,5 27000+1200 320 + 80 840±180 2000±1500
15,0+0,2 9200+320 80+20 24000+8400 21000±6000
Таким образом, реактогекность лашадиного гамма-глобулина против ВКЭ, как следует из полученных экспериментальных данных, обусловлена в значительной степени наличием в препарате подкласса обладающего максимальной среди других подклассов сенсибилизирующей активностью, коррелирующей с его повышенной способностью к агрегатообразованшо.
4.5. Получение высокоочищенных препаратов лошадиных иммуноглобулинов против вируса клещевого энцефалита
На основании данных, полученных при изучении свойств подклассов 1ор в лошадиной сыворотке, нами было предположено, что селективное удаление подкласса из препарата гамма-глобулина против ВКЭ может существенно снизить его реактогенные свойства. С этой целью мы провели дополнительную очистку на анионообменном сорбенте Полисил-СА-500 коммерческого препарата лошадиного гамма-глобулина. Удельная активность выделенных антител возросла более чем в 1,5 раза, а содержание в них основного вещества повысилось с 82% до 98%.
Было изучено также три варианта применения препаративной хроматографии для получения антител из исходной гипериммунной лошадиной сыворотки против ВКЭ. В первых двух она использовалась для замены одной из стадий фракционирования сыворотки этиловым спиртом, в третьем — на колонку наносили разбавленную в 10 раз исходную сыворотку. Во всех вариантах очистки были получены препараты антител, не содержащие подкласса Как видно из представленных в табл. 10 данных, антитела с
максимальной противовирусной активностью были выделены при использовании третьего варианта (хроматографии разбавленной сыворотки). Предварительное фракционирование сыворотки перед хроматографией этанолом приводит к заметному снижению удельной активности выделенных иммуноглобулинов (на 29-41% при однократном и на 47-58% при двукратном осаждении белков спиртом).
Таблица 10
Свойства препаратов ^С, полученных из лошадиной сыворотки против ВКЭ с помощью хроматографии на аииоиите Полисил-СА
Препараты К.ол ячество ^О, % Удельная активность, обратные титры/мл Выход
по белку, % по активности, %
РТГА РИА х 100 РТГА РИА
Исходная сыворотка 32,5+2,4 16,4+2,! 82,6±5,6
После двукратного осаждения спиртом и хроматографии >99 24,3±4,3 86,0±8.1 22,2±1,6 22,2±1,6 21,1+1,3
После однократного эсаждсния спиртом и хроматографии 98,6±2,8 34,2±7,4 И4,8±22,8 21,2±2,8 59,1±6,7 30,1±5,2
После хроматографии исходной сыворотки 98,2±1,2 58,5±7,8 161,3+20,2 22,5+3,2 7б,9±б,1 40,2±2,5
Из полученных данных следует, что анионообменная хроматография на сорбенте Полисил-СА-500 может быть успешно использована для получения высокоактивных лошадиных иммуноглобулинов против ВКЭ, с пониженным содержанием реактогенных примесей.
4.6. Применение композиционных аффинных сорбентов для получения высокоочищенных антигенов и антител
В настоящее время аффинная хроматография широко применяется для получения препаратов антител и антигенов, используемых для иммунодиагностики различных инфекционных заболеваний, для определения с помощью иммуноферментного анализа многих гормонов и опухолевых маркеров.
С целью иммуноаффинной очистки белков вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) мы получили кремнеземный композиционный сорбент с иммобилизованными антителами к ВИЧ. В качестве лиганда для иммобилизации на активированный носитель Полисил-АФ была использована фракция 1§0, выделенная ИОХ на сорбенте Полисил-СА-500 из пула сероположительных к ВИЧ-1 сывороток крови людей. Для сравнительных испытаний был также синтезирован сорбент, содержащий аналогичный лиганд, иммобилизованный на ВгСЫ-сефарозу.
На колонках, упакованных этими иммуносорбентами, проводили очистку белков ВИЧ-1 из концентрата вируссодержащей культуральной жидкости, полученной после наработки вируса на моноцитах человека (табл. 11). Как видно из представленных данных, количество антител, иммобилизованных на сефарозной матрице, в 5 раз выше, чем на носителе Поли-сил-АФ. Однако удельная активность, степень очистки и выход белков ВИЧ при хроматографии на композиционном иммуносорбенте были выше, чем на сефарозном носителе. Кроме того, его лиганды связывали в 2 раза больше антигенов ВИЧ.
Таблица 11
Характеристика иммупосорбентов, для очистки белков ВИЧ*
Носитель Количество иммобилизованных ^С, мг/г сорбента Количество связанных антигенов ВИЧ Удельная активность антигенов ед. ИФА/мг** Степень очистки белков Выход антигенов с колонки, % от исходи.
мг/г сорбента мг/мг лиганда исходного концентрата очищенного антигена
Полисил- АФ 5,4 0,03 0,056 11,6 7403 638 37,6
ВгСМ-сефароза 27,8 0,08 0,028 11,6 5260 453 33,4
* - приведены усредненные данные трех экспериментов; ** - ед. ИФА — обратный титр в твердофазном ИФА
На основе активированного носителя Полисил-АФ был также синтезирован ряд композиционных иммуносорбентов для очистки антивидовых антител. Эти высокоёмкие носители позволяют проводить получение аффинно-очищенных антител с хорошим выходом и высокой удельной активностью (табл. 12). Колонки с иммобилизованной на носителе Полисил-АФ фракцией человека в течение ряда лет используются для препаративной аффинной очистки антивидовых антител, используемых в технологии производства ЗАО «Вектор-Бест» для серийного выпуска ряда диагностических иммуноферментных тест-систем. В производственных условиях иммуносорбенты композиционного типа выдерживали без существенного снижения эффективности разделения 1,5-2,5 года работы, причем за этот период времени на них проводилось по 200-300 циклов хроматографии.
Таблица 12
Характеристика Полислл-АФ-иммуносорбентов для очистки антивидовых антител*
Лиганд Количество иммобилизованного лиганда, мг/г сорбента Количество связавшихся антител Удельная активность единиц ИФА/мг** Выход с колонки активности, % от исходной
мг/г сорбента мг/мг иммобилизованного лиганда исходной сыворотки очищенных антител
hG4e.11 7,4 6,9 0,93 480 26000 77,8
1§°крод 6,0 4,9 0,81 400 16000 98,0
9,9 5,9 0,59 800 38000 92,0
* - приведены усредненные данные трех экспериментов; ** - единиц ИФА — обратный титр в твердофазном ИФА.
Хроматография на новых композиционных аффинных носителях была нами применена для получения из поликлональной сыворотки к хорио-ническому гонадотропину человека (ХГЧ) двух фракций высокочищенных антител к его различным антигенным детерминантам. Для иммобилизации на сорбенты использовали синтетический пептид, соответствующий С-кон-цевой антигенной детерминанте Э-цепи молекулы ХГЧ, а также высокоочи-щенныйхорионгонадотропин. При последовательном фракционировании на колонках с данными носителями сыворотки к ХГЧ выделяли фракцию аффин-но очищенных антител к С-концевой антигенной детерминанте р-цепи ХГЧ и антитела к антигенным сайтам ХГЧ вне этой области молекулы. Такой подход послужил основой для создания нового способа определения хорион-гонадотропина, защищенного патентом России. Данный способ был использован для конструирования иммуноферментных наборов для качественного и количественного определения ХГЧ в моче и сыворотке крови человека. Разработана технологии производства данных наборов и в настоящее время они выпускаются серийно в ЗАО «Вектор-Бест».
выводы
1. Изучена модификация ряда кремнеземов гидрофильными полимерами: декстраном, полиспиртами и полиэтилениминами различной молекулярной массы, сшитыми эпоксидными смолами и дигалогенидалканами; разработаны методы получения полимерных покрытий, обеспечивающие высокую сорбционную емкость, максимальное экранирование силанольных групп поверхности матрицы при незначительном уменьшении размера её пор. Отработаны методы введения в полимерные слои функциональных ио-ногенных групп, а также активных групп для иммобилизации биоспецифических лигандов. На основании проведенных исследований разработан универсальный подход к синтезу широкого круга новых кремнезёмных сорбентов для жидкостной хроматографии биомакромолекул различной природы.
2. Для решения ряда аналитических и технологических задач разработаны высоэффективные композиционные носители для анионообменной, катионообменной и аффинной хроматографии биополимеров. Полученные сорбенты по емкости, селективности и стабильности превосходят коммерческие сорбенты «щеточного типа». Оптимизированы условия практического применения новых композиционных сорбентов для разделения сложных смесей протяженных олигонуклеотидов, пептидов и белков в аналитическом и препаративном масштабах.
3. На основе использования полученных анионитов разработаны:
- эффективный способ очистки иммуноглобулинов класса в млекопитающих;
- метод количественного анализа подклассов в сыворотках крови.
В результате исследований, проведенных с применением данных
методов:
а) изучены подклассы иммуноглобулина в кролика, козы, овцы, лошади; выявлены их различия в физико-химических свойствах и биологической активности;
б) впервые установлены общие закономерности изменения состава подклассов ^О в сыворотках крови животных в процессе их иммунизации различными антигенами;
в) выделен и охарактеризован новый иммуноглобулин козы, представляющий неизвестный ранее подкласс
г) разработан метод препаративного получения высокоактивных иммуноглобулинов лошади против вируса клещевого энцефалита, не содержащих примесных белков, а также высокореактогенного подкласса 1«С(Т).
4. Разработан эффективный метод очистки гидрофобных белков обращенно-фазовой хроматографией на синтезированных новых широкопористых сорбентах. В экспериментах с его использованием:
а) получены недоступные ранее индивидуальные белки вирусов гриппа, клещевого энцефалита, Марбург, венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Проведено исследование и получены новые данные о свойствах, строении этих белков и их посттрансляционной модификации;
б) подтверждена гипотеза об сходном расположении дисульфидных связей в гемагглютинанах вируса гриппа подтипов Н1И1 и Н,М2. Впервые локализован участок молекулы гемагглютинина Н1, формирующий его рецепторный сайт;
в) выделены индивидуальные рекомбинантные интерферон а2 человека, ангиогенин и ряд других белков. На основании аминокислотного состава, строения И- и С-концевых фрагментов молекулы, пептидного картирования доказана идентичность структуры исследованных полипептидов соответствующим природным аналогам.
5. Получены новые аффинные сорбенты композиционного типа для препаративной очистки антивидовых антител, применяемых в производстве медицинских иммунодиагностикумов. Показано преимущество разработанных сорбентов в селективности и эксплутационных свойствах над традиционно используемыми в аффинной хроматографии носителями с полисаха-ридными матрицами.
6. На основе применения синтезированных аффинных сорбентов разработан подход к получению из поликлональной сыворотки двух фракций высокоочшценных антител, специфичных к разным антигенным детерминантам белка. При практической реализации такого подхода был создан новый иммунометрический способ определения хорионического гонадотро-пина человека, сконструированы и внедрены в производство два иммуно-ферментных набора для его качественного и количественного определения.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Офицеров В.И., Ямщиков В.Ф. Хроматография олигонуклеотидов на пористых носителях, модифицированных полиэтиленимином.// Биоорган, химия. 1983. Т. 9. №9. С. 1248-1253.
2. Швалье А.Ф., Самуков В.В, Офицеров В.И. Новый синтез N-оксисук-цинимидного эфира 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты .//Журнал общей химии. 1985. Т. 55. Вып. 9. С. 2162.
3. Акименко З.А., Зыков С.А., Офицеров В.И. Способ получения антигенного фрагмента гемагглютинина вируса гриппа А.// Авт. Свидетельство СССР № 1398130. Заявл. 25.06.86. Зарегистр. 22.01.88
4. Юркина Э.А., Акименко З.А., Зыков С.А., Офицеров В.И. Рецепторные свойства гемагглютинина вируса гриппа и его полипептидных фрагментов.// Молекул, генетика, микробиол., вирусол. 1988. № 6. С. 4348.
5. Самуков В.В., Мазуркова H.A., Калашников В.В., Офицеров В.И., и др. Антигенные свойства синтетических фрагментов тяжелой цепи гемагглютинина вируса гриппа А.// Молекул, генетика, микробиол., вирусол. 1988. № 7. С. 35-39.
6. Швалье А.Ф., Самуков В.В, Офицеров В.И. Способ получения 3-(2-пиридилдитио)пропионовой кислоты.// Авт. Свидетельство СССР № 1152953. Зарегистр. 03.01.85.
7. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Юркина Э.А., ФроловаС.Б., Офицеров В.И. Лошадиный гамма-глобулин против вируса клещевого энцефалита высокой удельной активности.//М., 1990. Юс. Деп. в ВИНИТИ 14.09.90. № 5060-В.
8. Акименко З.А., Зыков С.А., Ястребов С.И., Офицеров В.И. Высокоэффективная жидкостная хроматография и характеризация структурных белков вируса гриппа. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. № 12. С. 1637-1642.
9. Швалье А.Ф., Самуков В.В., Офицеров В.И., Калашников В.В., и др. Иммунохимические и биологические свойства синтетических фрагментов последовательности 124-144 лейкоцитарного интерферона человека а2. // Биоорган, химия. 1990. Т. 16. № 7. С. 916-925.
10. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Фролова С.Б., Офицеров В.И. Способ получения иммуноглобулина G.//Abt. Свидетельство СССР № 1516185. Заявл. 30.06.88. Опубл. 03.01.90.
11. Ильичев A.A., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев H.H., Ерошкин
A.M., Офицеров В.И., Акименко З.А., Петренко В.А., Сандахчиев Л.С. Использование нитчатого фага M13 для белковой инженерии.// Молекул, биология. 1990. Т. 24. Вып. 2. С. 530-535.
12. Ястребов С.И., Дедкова Л.М., Фролова С.Б., Офицеров В.И. Анионооб-менная хроматография белков на модифицированных полиэтиленимином кремнеземных сорбентах.// Биотехнология. 1991. № 3. С. 43-46.
13. Ястребов С.И, Офицеров В.И. Катионообменные кремнеземные сорбенты для высокоэффективной хроматографии белков.// Биотехнология. 1991. № 4. С. 43-46.
14. Акименко З.А., Зыков С.А., Шапров В.В., Офицеров В.И., Гилева И.П., Кравченко В.В., Сандахчиев Л.С. Химически синтезированный ген обеспечивает в клетках Escherichia coli биосинтез полипепгида, структура которого соответствует лейкоцитарному интерферону а2 человека.// Доклады Академии наук СССР. 1991. Т. 319. № 5. С. 1248-1251.
15. Дедкова Л.М., Ястребов С.И., Офицеров В.И. Антитела гипериммунных сывороток животных. 1. Активность подклассов Ig G, выделенных из лошадиной сыворотки против вируса клещевого энцефалита.// Известия СО РАН. 1992. № з. с. 21-24.
16. Ilychev A.A., Minenkova О.О., Kischenko G.P., Tat'kov S.I., Karpishev N.N., Eroshkin A.M., Ofitserov V.l., Akimenko Z.A., Petrenko V.A. and Sandakhchiev L.S. Inserting foreign peptides into the major coat protein of bacteriophage M 13.// FEBS Letters. 1992. V. 301. № 3. P. 322-324.
17. Коновалов E.E., Локтев В.Б., Покровский А.Г., ФедюкН.В., Черных А.И., Нечаев Ю.С., Куляндин С.А., Киприянов С.М., Офицеров В.И. Изучение антигенной структуры белка р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа с помощью моноклональных антител.// Вестник АМН СССР. 1992. Т. 59. №9-10. С. 55-59.
18. Пак В.Н., Офицеров В.И. Способ получения гиалуронидазы.// Патент РФ № 2027759. Заявл. 03.02.92. Зарегистр. 27.09.95.
19. Дедкова Л.М., Кудоярова Н.М., Шапров В.В., Сабиров А.Н., Офицеров
B.И. Антитела гипериммунных сывороток животных. 2. Подклассы иммуноглобулинов G в нормальных и гипериммунных сыворотках коз.// Известия СО РАН. 1993. № 6. С. 8-13.
20. Гилева И.П., Бондарь Т.С., Блинова H.H., Халдояни С.К., Кравченко В.В., Ястребов С.И., Офицеров В.И., Коробко В.Г. Экспрессия в Е. coli синтетического генамакрофагально-гранулоцитарного колониестимулирующе-го фактора.// Доклады Академии наук СССР. 1994. Т. 336. № 2.
C. 254-256.
21.Офицеров В.И., Ястребов С.И., Николаева E.H., Дедкова Л.М., Покровский А.Г., Фролова С.Б. Композиционные сорбенты для аффинной хроматографии белков.// Биоорган, химия. 1994. Т. 20. № 10. С. 10891094.
22. Дедкова JI.M., Кудоярова Н.М., Чепурнов A.A., Офицеров В.И. Состав и иммунохимические свойства козьих иммуноглобулинов против вируса Эбола.//Вопросы вирусологии. 1994. Т. 39. № 5. С. 229-232.
23.Мерзликин Н.В., Чепурнов A.A., Истомина H.H., Офицеров В.И., Воробьева М.С. Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для диагностики лихорадки Эбола.// Вопросы вирусологии. 1995. Т. 40. № 1. С. 31-35.
24.Юркина Э.А., Офицеров В.И., Самуков В.В., Мизенко Г.А., Калашников В.В., Фролова С.Б.,Сабиров А.Н. Иммунометрический способ определения хорионического гонадотропина человека.// Патент РФ № 2062473. Заявл. 30.06.88. Зарегистр. 20.06. 1996.
25. Юркина Э.А., Офицеров В.И., Самуков В.В., Дедкова JIM., Мизенко Г. А., Решетников С.С., Фролова С.Б., Калашников В.В., Сабиров А.Н., Рис В.И. Иммуноферментный метод определения хорионическкого гонадотропина человека с использованием поликлональных антител.// Клиническая и лаборат. диагностика. 1997. № 1. С. 8-10.
Тезисы докладов:
26. Офицеров В.И., Акименко З.А., Зыков С.А., Юркина Э.А., Дедкова Л.М. Структура некоторых пептидных фрагментов гемагглютинина вируса гриппа А. // Сборн. тез. VII Всесоюзн. симпоз. по химии белков и пептидов. Таллин. 1987. С. 87.
27. Офицеров В.И., Зыков С.А., Акименко З.А., Дедкова Л.М., Ястребов С.И. Очистка структурных белков вируса гриппа обращенно-фазовой хроматографией. // V Всесоюзн. конф. «Методы получения и анализа биохимических препратов»: Тез. докл. Юрмала. 1987. С. 671.
28. Ястребов С.И., Дедкова Л.М., Офицеров В.И. Хроматография белков и фрагментов ДНК на ионообменных сорбентах из модифицированных кремнеземов и целлюлозы.// «Проблемы использования целлюлозы и ее произв. в медицине и микробиол. промышленности» Тез. докл. Всесоюзн. конф. Ташкент. 1989. С. 31-32.
29.Ястребов С.И., Офицеров В.И. Ионообменные кремнеземные сорбенты для высокоэффективной хроматографии белков. // Конф. ВХО им. Менделеева «Молекул, сорбция биол.активн. веществ»: Сборн. тез. Пенза. 1990. С. 68.
30. Ofitserov V.I., Yastrebov S.I. and Nikolaeva E.N. New composite supports for biotechnology.// Abst. of International conference «Medical biotechnology, immunization and AIDS». Leningrad. 1991. P /7-4.
3LDedkova, L.M. Nikolaeva, Ofitserov V.I. and Frolova S.B. Comparative evaluation of different chromatographic methods for purification of the immunoglobulines G. // там же, P /7-5.
32. Agatitsky V.G., DedkovaL.M., Yastrebov S.I., Ofitserov V.I. Effective methods for purification of human immunoglobulins A, M and G. // там же, P /7-6.
33.Офицеров В.И., Дедкова Л.М., Старостина О.Ю. Иммуноферментное определение антител к антигенам трематод. // Тез. докл. Междунар. научн. конф «Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии». Витебск. 1993. С. 34-35.
34. Gileva I.P., Bondar T.S., Khaldoyanidi S.K., Kravchenko V.V., Yastrebov S.I., Ofitserov V.I.. Expression of artificial gene for granulocyte-macrophage colony stimulation factor in E.coli. Abst. of II International conference «AIDS», cancer and retroviruses, St.-Petersburg, Russia. 1993. P. 26.
35. Dedkova L.M., ZubavicheneneN.M., Chepurnov A.A., Ofitserov V.I. Changes in composition and immunochemical properties of goat immunoglobulines in the process of immunization with Ebola virus. // - . .onaj congress of virology. Jerusalem, Israel. 1996. P. Ъ
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Офицеров, Вячеслав Иванович, Кольцово
/ »
йо
«г- -
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Министерства здравоохранения Российской федерации
о ///> /
На правах рукописи
.....................................................
ОФИЦЕРОВ ВЯЧЕСЛАВ ИВАНОВИЧ
КОНСТРУИРОВАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ КРЕМНЕЗЁМНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИИ
БИОПОЛИМЕРОВ
03. 00.23 - биотехнология
Диссертация
на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор С.Н. Загребельный
Кольцове, 1998
Оглавление
Список использованных сокращений 4
Введение 6 Глава 1. Кремнеземные сорбенты в хроматографии биополимеров
(Обзор литературы) 9
1.1. Особенности хроматографии биополимеров 12
1.2. Методы модфикации кремнеземов, используемые для получения хроматографических сорбентов 16
1.3. Ионообменная хроматография 18
1.3.1. Анионообменная хроматография 20
1.3.2. Катионообменная хроматография 27
1.4. Гель-проникающая хроматография 29
1.5. Аффинная хроматография 32
1.6. Обращенно-фазовая хроматография 38
1.7. Гидрофобная хроматография 44
1.8. Заключение 48 Глава 2. Получение и исследование свойств новых кремнеземных сорбентов для ионообменной и аффинной хроматографии биополимеров 51
2.1. Анионообменные сорбенты 51
2.2. Катионообменные сорбенты 67
2.3. Сорбенты для аффинной хроматографии 78 Глава 3. Получение высокоочищенных гидрофобных белков
с помощью обращенно-фазовой хроматографии 83
Глава 4. Примеры использования разработанных сорбентов для
решения исследовательских и практических задач 90
4.1. Выделение гидрофобных белков с помощью ОФХ,
изучение их строения и свойств 90
4.2. Применение композиционных анионитов для
хроматографии протяженных олигодезоксирибонуклеотидов 106
4.3. Использование новых анионитов для очистки
иммуноглобулинов класса О 110
4.4. Анализ подклассов с помощью ИОХ на новых анионитах. Состав и свойства подклассов в сыворотках крови животных 113
4.5. Получение высокоочищенных препаратов лошадиных
иммуноглобулинов против вируса клещевого энцефалита 131
4.6. Применение композиционных аффинных сорбентов
для получения высокоочищенных антигенов и антител 134
Глава 5. Экспериментальная часть 138
5.1. Реактивы и материалы 138
5.2. Оборудование 141
5.3. Синтез и изучение свойств сорбентов 142
5.3.1 Анионо- и катионообменные сорбенты 142
5.3.2 Сорбенты для аффинной хроматографии 146
5.3.3 Сорбенты для обращенно-фазовой хроматографии гидрофобных белков и полипептидов 147
5.4. Выделение, структурная характеризация и изучение свойств белков 148
5.4.1. Общие методы анализа белков 141
5.4.2.Исследование структуры и свойств вирусных и рекомбинантных белков 149
5.4.3. Выделение фракции иммуноглобулина в, анализ и изучение свойств подклассов животных 159 Заключение 166 Выводы 169 Документы по внедрению результатов диссертационной работы. 172 Литература 183 От автора 206
Список использованных сокращений:
АФХ - аффинная хроматография;
БАВ - биологически активные вещества;
ВВЭЛ- вирус венесульского энцефаломиелита лошадей;
ВВсЭЛ- вирус восточного энцефаломиелита лошадей
ВКЭ - вирус клещевого энцефалита;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГПХ - гель-проникающая хроматография;
ГФХ - гидрофобная хроматография;
ДЭГ - диэтиленгликоль;
ИОХ - ионообменная хроматография;
ИФА - иммуноферментный анализ;
кДа - килодальтон
МПС - макропористое стекло;
ОФХ - обращенно-фазовая хроматография;
ОЕ260 - количество вещества с оптической плотностью при 260 нм, равной
единице. ПААГ - полиакриламидный гель; ПВП - поливинилпирролидон; ПВС - поливиниловый спирт; ПЭИ- полиэтиленимин; РИА - радиоиммуный анализ; РН - реакция нейтрализации; РТГА - реакция торможения гемагглютинации; ТФУ - трифторуксусная кислота; BSA - бычий сыворотояный альбумин; CPG - стекло с контролируемым размером пор; DEAE - диэтиламиноэтил; НА - гемагглютинин; НЬ - гемоглобин;
IgG - иммуноглобулин класса G; NP - нуклеопротеиновый белок; OVA - овальбумин; SDS - додецилсульфат натрия.
Введение
Одним из ключевых этапов в решении рада проблем биоорганической химии, молекулярной биологии и биотехнологии является получение высо-коочищенных биологически активных соединений. В начале 80-х годов интенсивное развитие медико-биологических наук привело к значительному расширению сферы использования олигонуклеотидов, пептидов и белков высокой степени очистки. Однако темпы совершенствования методов синтеза олигонуклеотидов и пептидов, а также темпы роста числа создаваемых методами генетической инженерии продуцентов рекомбинантных белков значительно опережали развитие методов получения этих биополимеров в индивидуальном виде. Таким образом, доступность их для научных исследований и практического применения, оказалась в прямой зависимости от дальнейшего прогресса в области методов разделения, очистки и анализа.
Основным способом разделения биологически активных веществ является жидкостная колоночная хроматография. Большие успехи в области их анализа были достигнуты с внедрением в практику высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), основанной на использовании монодисперсных сорбционных материалов с диаметром частиц 3—10 мкм. По разрешающей способности сравнимая с газо-жидкостной хроматографией, ВЭЖХ позволила успешно проводить разделение и анализ низкомолекулярных веществ. Однако в жидкостной хроматографии биополимеров успехи были значительно скромнее. Для разработки высокоскоростных методов анализа и производительных методов препаративной очистки биополимеров потребовались механически прочные макропористые сорбенты с хорошими гидродинамическими свойствами и длительным сроком эксплуатации без снижения разрешающей способности. При использовании в аналитической хроматографии они должны обеспечивать высокую эффективность разделения наибольшего числа компонентов за наименьшее время, а при препаративном применении -
максимальный выход целевого продукта с требуемой степенью чистоты и активности при наименьших затратах
Мягкие широкопористые сорбенты, полученные на основе полисахаридных гелей или синтетических полимеров, традиционно применяемые в лабораторной практике для анализа и очистки биополимеров, не удовлетворяли этим требованиям. Число коммерческих твердокаркасных сорбентов, разработанных специально для различных типов хроматографии высокомолекулярных биологически активных веществ было недостаточным.
Таким образом, актуальной стала задача целенаправленного получения новых макропористых жестких сорбентов для эффективного разделения биополимеров.
Как показал анализ литературы, одним из наиболее перспективных подходов к конструированию таких хроматографических материалов является использование пористых кремнезёмных матриц с химически модифицированной поверхностью. Однако исследования в этой области к началу выполнения настоящей работы были весьма фрагментарны, что было обусловлено недостаточным развитием теории и практики синтеза и применения хроматографических сорбентов.
Цель настоящей работы заключалась в проведении комплексного исследования кремнеземных сорбционных материалов, разработке новых высокоэффективных сорбентов для хроматографии биополимеров и применении синтезированных сорбентов для решения ряда научных и практических задач, связанных с использованием методов хроматографического анализа и препаративного получения в индивидуальном виде олигонуклео-тидов, пептидов и белков различных классов.
В задачи исследования входило:
- изучить методы химической модификации поверхности кремнезёмов и синтезировать матрицы, обладающие комплексом свойств, требуемых для получения на их основе рада новых хроматографических сорбентов;
- разработать высокоэффективные анионо- и катионообменной сорбенты, изучить их свойства в сравнении с лучшими коммерческими иони-тами, отработать оптимальные условия применения для хроматографии олигонуклеотидов, белков и пептидов как в аналитическом, так и в препаративном масштабах;
- изучить факторы, влияющие на обращенно-фазовую хроматографию малорастворимых гидрофобных белков, разработать стратегию их эффективного разделения;
- на основе синтезированных сорбентов разработать новые эффективные методы хроматографического анализа и получения высокоочи-щенных биомакромолекул, использовать их для проведения исследования структуры и свойств ряда вирусных, рекомбинантных белков и иммуноглобулинов;
- разработать подходы к получению новых высокоёмких твердокар-касных носителей для эффективной иммобилизации различных биоспецифических лигандов и использования полученных сорбентов в аффинной хроматографии, в том числе для препаративной очистки белков, применяемых в производстве ряда медицинских иммунодиагностикумов.
Глава 1
Кремнезёмные сорбенты в хроматографии биополимеров
(Обзор литературы)
Получение высокоочищенных индивидуальных биологически активных веществ (БАБ) является сложной проблемой. Исходные растворы БАВ, полученные в результате химического синтеза, из различных природных источников или продуцентов, созданных методами генетической инженерии, как правило, представляют собой смесь десятков, а то и сотен веществ. Ряд компонентов этой смеси может иметь близкие к целевым продуктам физико-химические свойства.
Успехи, достигнутые в области получения БАВ высокой степени очистки, стали возможными во многом благодаря широкому использованию методов жидкостной хроматографии. Хроматографическое разделение основано на различиях в размерах молекул (гель-проникающая хроматография - ГПХ), зарядах (ионообменная хроматография - ИОХ), гидрофобных свойствах (гидрофобная хроматография - ГФХ и обращенно-фазовая хроматография - ОФХ), а также их сродстве к тем или иным лигандам (аффинная хроматография - АФХ).
Развитие хроматографии и её возможности в первую очередь зависят от успехов в разработке и внедрении в практику новых, более совершенных сорбционных материалов [1-3]. Основные требования к сорбентам, предназначенным для различных типов хроматографии биологически активных веществ, включают:
- высокую проницаемость частиц сорбента для молекул разделяемых веществ, свободный доступ этих веществ к адсорбционным центрам, группам или лигандам на поверхности сорбента и эффективное обратимое взаимодействие с ними;
- высокую емкость;
- низкий уровень неспецифического связывания компонентов смеси разделяемых веществ;
- минимальное влияние на биологическую активность целевых продуктов;
- механическую прочность, достаточную для создания в упакованных колонках адекватного потока элюентов;
- незначительное изменение размера частиц сорбента при изменении рН и ионной силы;
- стабильность в условиях эксплуатации сорбентов адсорбционных центров, функциональных групп или лигандов, участвующих в разделении веществ;
- устойчивость к деградации микроорганизмами;
- доступность и невысокую стоимость.
Совершенствование сорбционных материалов идет по пути максимального удовлетворения этих весьма противоречивых требований. Исследования в этой области постоянно ведутся во многих научных лабораториях и фирмах-производителях хроматографических сорбентов и материалов [4]. Вместе с тем, целенаправленный синтез эффективных сорбентов сдерживается, с одной стороны, сложностью хроматографических процессов, для которых невозможно дать даже приближенное математическое описание, с другой - недостаточно развитыми методами исследования свойств сорбционных материалов [5]. Вероятно, поэтому лишь незначительная часть из большого числа синтезированных и изученных хроматографических сорбентов обладала тем комплексом свойств, который позволил им найти реальное применение в практике.
Повышение эффективности и скорости разделения веществ при хроматографии может быть достигнуто путем ускорения массообмена между стационарной и подвижной фазами колонок за счет использовании гранул сорбентов меньшего размера и увеличения скорости подвижной фазы. Однако при этом в колонках возрастает гидродинамическое сопротивление слоя сорбента потоку элюента, для преодоления которого необходимо использовать повышенные давления. Разработка способов получения механически прочных микрочастиц сорбентов размером 5 -20 мкм, методов их упаковки в колонки, а также соответствующей хроматографической аппаратуры (насосов, колонок, детекторов и т.д.) привело в середине 70-х годов к
созданию высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В настоящее время существует несколько вариантов хроматографии, которые отличаются по размерам, типам и эффективности колонок и сорбентов, по производительности разделения, по требованиям к оборудованию, а также затратам на сорбенты, растворители и аппаратурное оформление процесса.
По применяемым в хроматографической системе давлениям можно выделить три типа жидкостной хроматографии [6]:
- хроматография низкого давления, создаваемого гидростатически или с помощью перистальтических насосов, величина его выражается обычно в см Н20;
- хроматография среднего давления (10—30 атм), в которой используются стеклянные колонки, а также изготовленные из полимерных материалов фитинги и соединительные трубки и;
- хроматография высокого давления, достигающего сотен атмосфер; в ней используются колонки из стали или специального высокопрочного стекла.
В настоящее время ВЭЖХ с использованием миниколонок и хроматографов высокого давления - основной метод анализа БАВ, позволяющий, как правило, получить результат за 5—40 минут [7-9].
При выборе оптимального варианта препаративной хроматографии БАВ приходится сталкиваться с рядом трудностей и проблем. Требования к способу очистки определяются как свойствами конечного продукта, так и целью его применения. Если выделенное вещество предназначено для использования в качестве лечебно-профилактического или диагностического препарата, то его абсолютное количество не является очень большим, и технология его получения может представлять собой увеличенный в 2—10 раз лабораторный вариант очистки. Белки или пептиды, которые будут использованы как субстанция лекарственных средств, должны быть максимально очищены от примесей для сведения к минимуму побочных эффектов препаратов, в то время как применение их в диагностике не предъявляет таких жестких требований.
Препаративная очистка БАВ с помощью ВЭЖХ позволяет сократить время проведения процесса в десятки раз, что значительно уменьшает риск потери биологической активности целевым продуктом. Однако затраты на такую очистку могут быть чрезмерно высокими. Поэтому в каждом конкретном случае целесообразность использования препаративной хроматографии высокого, среднего или низкого давления определяется многими факторами.
В целом, сфера применении методов ВЭЖХ в современной биотехнологии постоянно расширяется. Они все больше используются не только для анализа и контроля биотехнологических процессов, но также становятся основным методом получения в препаративных количествах высокоочищен-ных БАВ, в том числе высокомолекулярных.
1.1. Особенности хроматографии биополимеров
Такие биологически активные вещества, как нуклеиновые кислоты, поли- и олигонуклеотиды, белки, гликопротеины, гликолипиды, пептиды, поли- и олигосахариды являются средне- или высокомолекулярными полимерами. Для хроматографии таких биомакромолекул необходимы широкопористые сорбенты, размер пор которых обеспечивает свободную диффузию этих веществ [10-12]. Обычно с этой целью используют хроматографи-ческие носители с диаметром пор в интервале 10—100 нм. Следует отметить, что с увеличением размеров пор заметно уменьшается удельная площадь поверхности сорбентов, что приводит к снижению их емкости и эффективности разделения. Поэтому выбор оптимальной пористости сорбентов необходимая и важная стадия подготовки и к аналитической хроматографии биополимеров, и к их препаративной хроматографической очистке.
Биомакромолекулы имеют уникальную самоорганизующуюся пространственную структуру, которая в белках задана последовательностью аминокислот, а в нуклеиновых кислотах - последовательностью нуклеиновых оснований. Третичная и четвертичная структура биополимеров в растворах поддерживается за счет внутримолекулярных электростатических,
гидрофобных взаимодействий и водородных связей. Следует отметить, что удерживание веществ хроматографическими сорбентами осуществляется за счет аналогичных взаимодействий. Поэтому фиксирующие пространственную структуру биополимеров внутримолекулярные взаимодействия при хроматографии конкурируют с силами притягивания веществ к поверхности сорбентов, и когда последние преобладают, биомак�
-
Офицеров, Вячеслав Иванович
-
доктора биологических наук
-
Кольцово, 1998
-
ВАК 03.00.23
- Технология получения биосовместимых сорбционных материалов с иммобилизованными биологически активными веществами
- Синтез композиционных аффинных сорбентов с магнитными свойствами и их технологическое использование при изготовлении чумных иммунобиологических препаратов
- Синтез сорбентов с заданными свойствами и создание на их основе биопрепаратов иммобилизованных ферментов
- Хроматографическое выделение гидролаз (нуклеаз, фосфатаз, хитиназ) и их использование в биотехнологических процессах
- Биотехнология получения сорбционных материалов (энтеросорбентов) с заданными свойствами
