Хроматографическое выделение гидролаз (нуклеаз, фосфатаз, хитиназ) и их использование в биотехнологических процессах

Варламов, Валерий Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Хроматографическое выделение гидролаз (нуклеаз, фосфатаз, хитиназ) и их использование в биотехнологических процессах
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Хроматографическое выделение гидролаз (нуклеаз, фосфатаз, хитиназ) и их использование в биотехнологических процессах"

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В.Ломоносова

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ СОВЕТ Д 063.41.01

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ГИДРОЛАЗ (НУКЛЕАЗ, ФОСФАТ АЗ, ХИТИНАЗ) И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ВИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ( 03.Q0.23 - биотехнология)

Иа правах рукописи

ВАРЛАМОВ Валерий Петрович

ДИССЕРТАЦИЯ на соисканий ученой степени доктора химических паук в форме научього доклада

МОСКВА - 1094

Работа выполнена в лаборатория биополимеров Института элементоорганических соединений км. А.Н. Несмеянова РАН и в Центре "Биоинженсрия" РАН.

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор Б.А. Клящицкий доктор биологических наук, профессор В.В. Мосолов доктор химических наук, профессор Г.И. Яковлев Ведущая организация АО "Биотехнология"

Защита состоится часов на

заседании специализированного совета Д 063.41.01 при Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В. Ломоносова (117671, Москва, пр. Вернадского, 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МКТХТ им. М.В. Ломоносова ( 119831, Москва, Малая Пироговская ул., 1).

Доклад разослан " февраля 1994 г. •

Ученый секретарь ^ '

специализированного совета кандидат химических наук

старший научный сотрудник А.И. Лютик ■

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ающалъносяь прсблежы . Важность форментшг препаратов для народного хозяйства и научных исследований трудно переоценить, йленно с использованием бнсокоо'-л гееннах фзрлэнтов, спсцкфичеам глдрол и зуггда определенные связи, удалось в последние годи расшифровать структуру ряда белков и нуклеиновых кпелог. Помаю этого,ферментные препараты имеют большое практическое значение, так как многие отрасли прошапенности: виноделие, пивоварение, производство спирта, сыроделие, производство чая и многие другие основали на использовании фермэнтативных процессов. Широкому применении ферментов в народном хозяйстве препятствуют слскюсть ц дороговизна выделения феркептов, а такие недостаточная стабильность ферментов в растворах. 3 качестве сырьевых источников ферментов наиболее перспективными являются г.ккробиолсгичес:-а1в, т.к. существуют различила возможности регуляции процосса биосинтеза в жзлаемом ншравлэнки , а такие открывается возмогшости практически иеограничекного масштабирования процесса производства Ферченгов.Что касается выделения фэрйьнтоь, то,безусловно, здесь ва пэрвня тиген выходят хроматографичеекке методы» без которых яевосмозгтс представить вздележе чистых ферментов, Наиболее эффективкнм хроматографяческим приемом является т.н. а^фигнач (биоспещзфическая) хроматография. В последние года успехи з выделении чистых ферментов часто связаны с использованием т.ездоа5-фннных сорбентов: халатных .гидрофобных, содержащих красители.Хотя механизм этих взаимодействий не всегда я.сеп, тем не мене о использование псевдоаф^аншх (ила т.н. группсиэциф:ггтах) сорбентов часто дает прэкргеюе' результаты. К сояаяенив, рынок российских сорбентов крайне беден, поэтому разработка как принципиально новых тапсв сорбентов, так и кодификация уже известный крайне акт у альта.

Недостаточная стабильность фэрментов в ряде случаев может бнть с успехом преодолена кспальг.оваяием г.н. гаадобилизовгшкых формектов,особенно в тех случаях когда используемый носитель инертен и стабилен. Ишобшгззованшэ ферменты также яе ^агрясняи/г продукты реакгрш, что чрезвычайно важно при получении соединений медицинского назначения. В свете вышеизложенного,работу,посвященную выделению, ис-^ледовакню свойств и применению гвдролитичзсъ-эт

ферментов следует отнести к числу актуальных в бяотехнологак. и иисепериоП енаимолопш. Данная работа является частью исследований в раьмах кордишруемой Ш РШ программы "ви^жо-химичвские основы биологии и биотехнологии" л Государственной программы "Новейгыо методы 0ЕодЕаон9рЕа4^

Це.:ь и замани исслеОовсжия. Основная задача исслвдовшая заключалась в создания общего мэтодологичоского подхода к Еддоленна практически полезных гвдрогятгаесках ферментов ( нуклеаз, фосфатаз и хятиназ) используя методы а£фшноС и псовдсаффгшюй хроматографии .прэимуцоствекно неталло-хелат аффлкной (1ЯА) хроматографии. Поставленная проблема является комаяэкспой, поэтому требовалось проведениэ работ по следущт направлениям:

1. Разработать новый таи оргавскремаезешых носителей как для аффинной громатогргфии, так и для шйябшкзации ферментов.

2.Синтезировать и изучить новые конкурентные обратимые ингибитора ферментов (нуклеаз) и получить на их основе аффинные сорбенты.

3.Разработать метод неталло-хелат аффинной хроматографии нуклеаз на хелатных лишддах.

4. Разработать метод фракционирования хитиназного комплекса

kuresa.noVII на Х&Л&ТНЫХ СОрбвНТаХ.

5.Созвать новые типы аффинных и псевдоаффинных сорбентов для фракционирования лвдролаз.

6.Разработать новые биотехнолотачвские процессы с использованием выделенных гидролитических ферментов.

Научная новизна работ .

- Ра&рабстаны вовне типы кодифицировавшие органокремнеземшх сорбентов, покрытых гидрофильными органическими полимерами. Показана устойчивость таких сорбентов в водных растворах в перспективы, их использования для аффинное хроматографии н иммобилизаций- ферментов.

- Вяервые изучены, конкурентные интаЗиторы экзонукяэаз типа рИр. а •также их производные рМрй а Крмр. Синтезирован новый класс аффинных сорбентов с- ишобйлизовачвыми через гетероциклическое основание

ингибиторам типа рНр.____• __.._..___________

"^"Предлояен"" нсотг способ синтеза" моаафункшюнадьнцг хвлатнкх сорбентов и на них прозедоно выделение ряда микробных нуклое-> и.

установлена корреляция мэзду топографией хмстиддаовых остатков белка и природой"металла-комплексообразователя.

- Впервые показана возможность применения металло-хелат аффинной хроматографют для Фракционирования хитиназного комплекса 31:гер1;огаусез кигязапоуН.

- Синтезирован рад новых аффинных и псевдааффишгах сорбентов для выделения гидролитических ферментов (фосфатаз, хитииаз).

- С использованием выделенных ферментов осуществлен рад новых биотехнологическмх процессов:

# ферлентолиз нуклеиновых кислот до , нуклеозидов и 5'-нуклеотидов (с использование &кгонуклеазы А5)

# ферментативный синтез олигорибонуклеотидов (с использованием иммобилизованной РККазы

Л*

# получение хитозана иизкомолэкулярного водорастворимого с помощью иммобилизованного хитиназного комплекса.

# получение индивидуальных олигоморов и-дс-глвкозашна (п-2-?) с использованием хитиназного комплекса.

Практическая штшяость. Показано, что модификация креыяоаема соли® алшншя, повышает стабильность исходной матрицы з иоднпх растворах в 10 и более раз. Такой сорбент монет углтешю использоваться в качестве исходного для синтеза хроматографических носителей и для иммобилизации ферлентоз. Данный сорбент(с маркой ХС-хими-чески стабилизированный) по авторскому свидетельству N бвмз: выпускается ГОБ ВНИИНП (г.Дзержинск) в'количествах ЮО кг б год.

Разработана схема покрытия модифицированного кремнезема органическими полимерами (Авторские свидетельства NN .689200,750804) с использованием радикальной прививочной полимеризации, позволяющая получать органокрэмнеземы практически с любыгот функциональным!! группами или их сочетанием. Разработан и внэдрэн на НПО " Виолар " (г.Олайне,Латвия) способ синтеза аффинного сорбгета, содержащего ингибитор "уклеаз ( Авторское свидетельство N юятсм) и способ выделения экзонунлэазы (Аеторское свидетельство N ззооззв;.

Разработан и внедрен на фирг.п "Кемотех" (г.Таллинн, Эстония ) способ синтеза ксзого монофункционального холатно. э сорбоьта (Авт. свидетельство N 1-395640), ппзьолягищка ьндалять непосредственно иг культуральной жидтосуи различныэ £ррмшггы, маркируя услозаг сорбцаи

и десорбции и металл-комгшексообразоЕатедь.

Осуществлен рад практически важных биотехнологическпх гидролитических процессов ( гидролиз нуклеиновых кислот и хнтозава), а также ряд процессов с использованием синтетазной реакции РНКазы и синтетазной реакции хитиназы.

Полученный хитозан низкомолекулярннй водорастворимый в настоящее время проходит медико-биологичес кие испытания в качестве кммуномодулятора ,а также для синтеза противоопухолевых и противовирусных препаратов.

Предложенные в работе аффинные сорбенты, методы и выделенные ферменты шрокс используются в практической работе ряда научных организаций ( ИМБ РАН, ИНЗОС РАН, Институт биофизики РАН, Институт биохимии РАН, Институт биологической и медицинской химии РАМН, Пщбвой институт, Институт иммунологии МЗР.МИТХТ им.М.В.Ломоносова, МГУ им .К! .В .Ломоносова и др.)

Практическая значимость работы и новизна порученных в ней результатов подтверждается и тем, что по данным исследованиям получено 20 авторских свидетельств к патентов. J

Публикации.Осковны е результаты диссертации опубликованы в одной монографии. 2 обзорах, 60 научных публикациях и зацищены 20 авторскими свидетельствами и патентами.

_____________Основные полококия, виносихыэ па гашпу:

. - Синтез новых чипов аффинных и псевдоа№пмых сорбентов (сорбентов с лигавдзми тша pNp, халатных сорбентов , фосфанатных сорбентов , сорбентов с сульфатировшшыки полисахаридами, сорбентов на основе хитина н зитозана)

- Хрокатографическое выделение гидролитических фарлентов (экзоцук-леазы А5, FHKaSIi Bacillus interredius. РНКаЗЫ Aapergillua pallidum Apj , PHKaSU Aspergillus clavatus Cj, ЭНДОНуКЛеаЗЫ Serratia' naroencens, фОСфатаЗЫ ИЗ КИШЭЧНИКа тшеня, хитиназ Straptomycee kurssanovH)

- Реализация новых биотехнологических процессов с помощью выделенных ферментов (гидролиз нуклеиновых кислот, гидролиз хитоза-на, синтез олигорибонуклеотидов,синтез олигомеров N-Ac-глюкозамина)

Апробация работ. Материалы диссертации докладывались на более чем 50 кендународных и отечественных симпозиумах и конференциях, среди которых: 2,3,4 и 5 Всесоюзный симпозиум по молекулярной и еидкостной хроматографии (Звенигород, 1982; Рига, 1984; Алма-Ата, 1987; Рига, 1990), н,III,IV и v Всесоюзная конференция "Методы получения и анализа биохимреактивов" ( Рига, 1977,1979,1982 и 1937), I и II Всесоюзный симпозиум по иммобилизованным фермерам (Таллинн, 1974: Абовян, 1977), VI,vu и vin Всесоюзный симпозиум " Химия белков и пептидов" (Рига,1983; Таллинн,1987; Тбилиси, 1990),Ш и IV Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Кобулетти,1986; Ташкент, 1988), iv и v Всесоюзный симпозиум по инженерной энзимолопш (Киев, 1983; Вильнюс, 1985), 1 международная конференция "Структура и химия рибонуклеаз" (Москва, 1988), v.vi и vil Дунайский симпозиум по хроматографии (Братислава, 1983; Ялта , 1986; Лейпциг, 1989), 16,17 и 18 международный симпозиум по хроматографии ( Парна, 19^6; Вена, 1988; Амстердам, 1990), vi и IX мездународный симпозиум по биовффинной хроматографии (Прага, 1985; Иокогама, 1991), XI и xvii международный симпозиум по колоночной жидкостной хроматографш (Амстердам, 1987; Гамбург, 1993), 5 Всесоюзная конференция "Новые направления в биотехнологии" (Пущино, 1992), X международный симпозиум "Биоузнаваниэ и аффинная технология "(Гват,1993), мездународный симпозиум "Энзимология хитина" (Сенигалия, 1993)

Содержание работы. Разработка хроматографкческих подходов к выделению гидролитических ферментов включает в себя поиск новых типов исходной матрицы п разработку путей ее модификации, поиск аффективных, стационарных лигандов (ингибиторов ферментов, хелатированных ионов металлов, аналогов субстратов и др.). В данной , работе продемонстрированы широкие возможности химического модифицирования поверхности кремнезема как неорганическими солями , так в органическими полимерами. В качестве аффинных стационарных лигандов использован йирокий круг соединений: обратимые ингибиторы типа рНр (для^нуклеаз), хелатированвыо ионы металл-в (для нуклеег и хчтиназ), аналога субстрата и производные сульфохитозана (для

фосфатазы, модифицированные аналоги субстрата (для хитиназ).В работе

продемонстрироваш новые пути^ прш/еневд выделенных......ферментов. .

тайие '-^взШйнга&Х^

, сишго^дон^еоадов-.^-''Й^д^н^т^

;;: • 1шлявтся-"ценшш1' лейрт^ввщщх* .сщств ^

с^Дйв "заВДтяР'та^ V''" "

.... ix ззег.е^г.ггсг 4«утгл ; ¡х^^ л

v/. --в"пос}1вятёо;гьды

аф^нной.Г^матог]^ / . ■ сдрбв&и ;и шрнстов' стекло"," '^дарагель сщрхром,

отевйдш:'(йздтетд»

природа? р^о^ШЙ;*-^5 ^стойшвость "Х'^п. ^ "^робноту, .^'здраке^ю,',

: меркли та ет^ай^даадбзон ^от.^Бр'_ ^Ап^стрта^^орщ<л' , • наконец-* дешёйи'зяа.г""Й1в!дуе^" уче)якл^и';'^вр^^рсть"'цйп^'^эанш'' кремнезёмов4 '"'рошме''выс^'а^кйфяоа' ^ * вздкоотаой''" "аОДшзвюй ' . хроматограф®;' Однако, по мере рас^еам/^мэ^вдя '»фегщезексв", . стали ввдщ -к некоторые , их^недо'етат^ широкого

гадачв: '^Шз&ь рас^^^ водных средах и уменьшить нвопвцифическ»»"'4 со^циюТ""' ВвлитаиГ"

рство^штоти.....аашж^ от,.. мнощ^^ ^лрижя.:,^ ....рщ^шуры,

"и*т.д. '^^»буш^пь^^^'лааш.,. о^бешо^пди выделешш ^Щ^^жр^Ш^ЩШ'Шп Была "Ййадё;^

- -«г«»! Мёзаша гло&шв .оикшзафашфЬг« «щжтавйсф

• цкрконированного силохрома и силикагеля.хотя и снизили растворимость в 2-5 раз, том не менее концентрация кремниевой кислота в элюатах при рН 9,1 была еще значительной .( > 20 мкг/мл). Наилучшие результаты были получены путем термохимической модификации ¡сромнезема солями алкмшия с образованием устойчивых алЕмосшшнатных кластеров. Содерканко скисла алюминия в таких, сорбентах поставляло от 1 до 5 х, а растворимость была е 20-100 раз пике чем у исходного силохрома, т.е. в элюатах при рН 9,1 концентрация кремневой кислоты не превышала 10 мкг/мл. Резкое умзньшэнпе растворимости кремнезема продемонстрировано на примере

м2

силикагеля. Сшшкагель ЫСА-7Б0 (3„_ =63 /г)(1а) п силикагэль о УД«

ИСА -ХС ,Г

'■Зуд.*58

модифицированы г-в>яянопрош!лтриэтоксисш1апом

/г) (16) оба производства ГОЗ ВШЕ были

к иолучеккнм

производным присоединяли нрз-производное з-аланина предварительно активированное л-скснсугацстшявдоя ( структура сорбентов на рио.1) .

-<сн2>3-

кн — со — <сн,

"I '1

101

-<о>

1а,б но2

Рис.1. Структура сорбентов 1а,б По 1 мл сорбентов 1а, б пометали в тердастнмровзшыэ колонки л с одинаковой скоростью пропускали 1000 мл буфера ЦООС сбъемоз колонки) после чего определяли кодиентрациа оставшихся стедсонарьых лигавзгоа. Количество лигавда определяли по поглодают раствора при ЗЭ5 им, полученного пря обработке сорбента раствором кислоты т; метанола (15:100). Результаты эксперимента сведены в таблицу 1.

Таблица 1.

СОРБЕНТ

ЙСХ0ДШ2

рН = 7,3

рН 9,1

1а Тб

234 (1С№) 263 !К/0*>

170 (7.41.1 253 "зсх;

160 (68») 263 (100Й)

Результаты пршзеденкк& в таблица 1 убедительно показывают высокую стабильность каркаса химически стабилизированного (ХС) силикагеля, выпускаемого ГОЗ В1СКНП по разработанной в дшшо2 работе технологии

Модификация хремиезешоЗ катрпца для последующего

присоединения форг.онтов ила других молекул принципиально могат осуществляться даут^тя путями. Первый путь это модификация крвшозема через крвшеоргашчоские соединения (шгкокси- ил хяорсилсш) с госледущиш пешишраналогичныш превращениями. Наиболее уиотрзбикы-в празстике г-а"г»шопропилтраэтокс.цсилан и 3-(2 .з'-аиокснпропог.сп) прояилтриметоксисияан .Набор сивтвзированшх таким образом ноентолэй в данной работе охватывает практически все требуемые для козалентногс присоединения белкоз и других лигалдов различными способами (около ю химических модификаций).

Несмотря на широкий выбор носителей , получаемых в результате химических модификаций, сушстсэнно балео айзкишныи представляется второй путь модификация крегжззекоз, оснозенние на радикальной прививочной полимеризации на поверхности ешнловых мономеров (Авторс1сио свидетельства СССР ы сезгоо и и 750304). таким путем могут быть получены оргапозсрекнесоьщ практически с любой функциональной группой, а варьируя время н дозу облучения либо г-Сс60, либо рентгенов стазе пзлучеЕпэ, модно получать необходима плотность покрытпя. Мэтод позволяет ' тают при получении соподимераого покрытия (например вгатадстат-акраяавая 1с;слога) варьировать 1<зяа9нтрацкв карбоксильных групп от 50 до 2000 и-'«' па ил прз постоянном юшкосгаа -озганичзсксй часта органокрэмавзска (за счог увеличена доен нолагянвлацетаяа в сопа'зкорэ). эхо особояно вьяно для шкава Езссзгд^кескоа сорбции, обусхшдадноЗ активной поверхность» Крайневе:,:«. В частности,бил тшуъззжХщ) гаришшлса, покрытых дел^ютилазпааатсм.которце содеркагг: от 2 до 20 2 утлорода и оказалось, что органокрэизезт: с Б» угларода уг;о пракгсчоекг но сорбируют БСА при Еб&грглышх рН в отлшиа от исходного салохрога. Следует добавить, что отот набор крешозезлов вЬлшвтзшафзикгного типа имел гфаюргаоски одинаковые физические характеристики (диаметр пор, удольнай позерхность), незначительно отличавшиеся от характеристик дихо;Е-:ого кремнезема даго с случае бсльилх количеств органического пешкэра (15-20 в углерода). С пемодыо катода радикальной прзвицоикй полимеризации были разработаны так

называемые "сзцдвичевые" покрытия, когда к поверхности кремнезема прививает сначала гидрофобный полимер полистирол, а к ному гидрофильный полимер типа полиакриловой кислоты. Такой прием одновременно защищает 1фемнезбшый каркас от растворения н придает ему необходим]® устойчивость в водных растворах. Схематическое строение базовых органокремнеземов и некоторых их производных приведено на рисунке 2. Следует подчеркнуть широкую возможность химических ггадафикаций данных кремнеземов для любых задач аффинной хроматографии и иммобилизации ферлентоз.

сн,

<сн2—>а сооп

ii a) im1 б) r-ch3

I СН,—СН— 1 2 , а

ососн,

^SIC^—(СН2-

iii

С —)

I п

СООСН2СН2ОН

СН2—СН—)п

а!2-

-СН—)

С«2 СрО ch¿-ch2

í'—^N СНз

(Si02 H^-f"'11

S^ У ГГМТГ1Г

vii

соосн2сн?ооо

• ф

NH„

(a,2-f,-,*-(CH2-f-,n ( S102 )-(CH2-CH-)n

СООН ОСОСН, CONH1 CHj )6NH2

viii xx

Рисунок 2. Основные типы органокремнеземных носителей

2. ШИННАЯ З&ОШТОТРШЯ ПУКЯВАЗ Z,l. Конкурентнее ингибиторы

Исходя из того факта ,что конкурентные ингибиторы наиболее подходящие аффинные стационарные лиганда, был проведён скрининг конкурентных ингибиторов нуклеаз (на примера экзонуклеаза А5). В поисках конкурентных ингибиторов, фермента был исследован ряд

Ф,

Рисунок 3. Зависимость скорости гздрапиза (pJAp ^ зкзонуклеазоЗ А5 от концентрации ингибиторов: 1-темие, тишщш, ципдан, Apü, Apüp, . СТР; 2-Ср; 3-рТ; 4-рС; 5-CDP; б-dsENA; 7-рТр

соединений, в то2 ели иной степени сходная с ее субстратам.' Как ввдно из рис.3 ферлентативнуо реакцию гедрализа (pdA>2 практически

Ш ингкбярувт ЕЛИ ЙЯГИбируЮТ S МЛЛОЙ СТОП&КП С03ДЕНЭШ2Я, ED

содержащие фосфатных групп (иашн, ажмвдин н цитцаия), а такг;е соединения, содергазде только одну фосфзтнум группу . В результате ато! работы ингибиторы' были обнаружено среди соединений, содогсгл*!?. две фосфатные группы и сходных с киеешльшм субстратом.. Дня нуклзс-звд-з* .5* -дафосфатоа бычо показано наличие кткбарозавая, причем производные пиримидина (р~р и pdCp) являются более сильных: ингибитора;,и, чем пуркнозые производные (р^Ар к pciGp). Ингабирувщая способность в ряду этих соединений изменяется слйдувдш образом: pacp>pTp:-pdGp>pUp:-pdAp. Структура сахара В pHp такхо судзствэнла для связизания ингибитора с ферментом. Замена углеводного остатка в рТр и pUp на .'М-даокзибутильный а 1,з-даоксипропильннй остатки, как ато имеет место в случае ^-(! ,4-дифосфобутил-2)-тиминз-и

Nj-u ,з-дифосфопропал)-2-урацияа, лишает соединение ивгибярупцей способности. Такве оказалось , что производные дезоксирибозы болев сильные ингибиторы фермента, чем соответствующие производные ркбозы. В частности, pdQp являлся ингибитором, a pGp ее не ингибировал, а деке в небольшой степени активировал.

В качестве субстрата при изучении механизма ингибирозанпя и определения ингибиторов pNp был взят АрАрА. Показано, что эти соединения (за исключением рОр> на основании изучения зависимостей 1/?0 от i/so в присутствии ингибитора и без него, обладают конкурентным механизмом знгибировшшя (прямые пересекаются на оси абсцисс в одной точке).Оная механизм ингибирования. была рассчитана Kt на основании зависимостей Vo/vi от (XI. В этом случае:

КП ___

-, Гд0. а (см.рис.3). Кп «2,4x10 " ы (определена

tg вС(Кш+[30] независимо для (р<1Л>2

Полученные этим методом константы зшгибировшшя для соединений рКр составляли от 0,Зх10~БМ (для р<1Ср) и 8х1(Г5М (для ралр),т.о. близки кезду собоЗ,, той не менее показывали более сильную шшйирухщ® способность пкримвдиновнх производных.

С цель» поиска оптимального ингибитора било продолжено исследование дафосфатов шримкдиыовкх производных и избегая влияния изменений в структуре нуклеотида (введение замэстктэля ь гетероциклическое основание, замены рибозн на арабгоюзу и дозокся -рцбозу, создание фиксированной структуры за счет образования ангид-росоедзнений) на кзгибйторную константу. Синтезированные ингибиторы представлены на рис.«. «осфсршшрокакные производят! е были получены исходя из соответотвущих нуклеозадоз с помшцыо' палкфосфорясй кислоты, за исключением раСр .который оыл получек фосфорилированием р~щайэтилфосфатш.Нэксторие иатаоиторы (pup и рср> были получены танке фзрментативяо исходя из соответствующих гоадополнмероа.

Действие конкурентного ингисгтора на ферззнтатавную реакцию будет максимальным в слагав соответствия конфсрмэции тгибитора сорбционной области фермента да я образования прочного комплекса ингибитор'-фершнт. Круговой - дихроизм является чувствительным методом изучения конформяция,. отришданошх нуклесзддов к нузиеотидоз л ргстсорэ. . На оснозандо в era mm молекулярной

адлиптичлости ( в 1 судили о конформации ингибиторов в растворе.

Ряоунок 4. Строение модафяцвроваыых нуклеозид-2' <3') ,5" -.щфэсфатов.

Для пирииядинопнх нуклеозидое существует вполне приемлемая корреляция ¡«аду яорсиовэдм углом <?с характеризующим взаишшй поворот осхагка сахара и гетероциклического основания вокруг глико-зцдноа связи, и величиной ¡0]. Как видно из таблица 2 ,всо синте-Таблвца 2.Спектра КД к величины Кх нуклеозвд-2' (3') ,5'-дпфосфатов.

СОЕДИНЕНИЕ ыакс' ш (Н20) [ 0) X 1(Г3 Ках 105, И

X 265 +15,2 3,4

xi 281 + в,7 2.3

xii 270 +20,4 7,6

xiii 264 +19,6 3,7

; xi? 219 -46,3 13,2 .

xv 267 + т,4 0,9

эарованные соединения, кроме соединения xxv, техя? полонительный эффект Коттона в дальней У!&-областн. следовательно, можно допустить что в растворе зги соединения существуют преимузце ств еяно в антн-котфорлашш. Наяротив. соединение xiv в спектре КД имеет отрицательный эффект Коттоиа с большой амплитудой и находится в растворе в фиксированной син-конфортации. Константы ингибирования

РОЛИ РО>Нг.Н ■ РО^и.Ч

А Л-Л XI XII О XIII

роли

приведенные в таблице 2 указывает на то, что большинство полученных соединенна мохет быть использовано в качестве лигандов для блоспоцифаческой очистка экзонуклеаз. Наилучшую К1 имел дезоксиури-дин-З' ,5'-дкфосфат, что .видимо, обусловлено свободой вращения гетероциклического основания в 2* -дезокскнуклеотидах вокруг глякозиднсй связи, л принятием конфорлацш, благоприятной для связывания с ферментом. Из полученных результ,' ,ов следует такзе, что фиксированная сиЕ-конформация (соединение хху ) наименее благоприятна для связывания с ферментом и это соединение не козет рассматриваться как эффективный ингибитор .

2.2./фрштыэ сорбент Оля нугиеаа

Для практического использования конкурентных ингибиторов в качестве стационарных лигандов в аффинной хроматография суцествекное значение имеет на только ингибирукщае свойства, но такзе его доступность а возмсявость ковапентного присоединения к носители.' В частности, было установлено, что введение заместителя по 5* -фосфатпсму остатку рнр резко «стает. аягибярущуа способность соединения,а «ведение заместителя по 3' -фосфатной группа дзяе долез? это соэдкп51.т;е субстратом, поэтому наиболее целесообразным клялось прссовдзнзЕив рнр к вссятежа чероз яирггядаковоо основание.

Урлдшз, шзгета з 5' -положит! олектрснодонорше заместители, способен взаимодействовать с арвддиазошювнмя солями, образуя б-аридаазокиезые производные. Зто свойство было использовано дгя присоединения синтезированного в работе нуклеотпдного диганде : 5-оксиурздан-2' (3* ),5'-дифосфата к аминоарзлсодерющему органокрок-незему с помощью реакции азосочетаяия. С целью предохранения луклеотидных лигандов от действия фосфатаз, прясутстз укдих в фер«ентных препаратах, их превращали в метиловые эфиры, хотя зто з некоторой степени понижает иютбяруЕДие свойства лигандов.Константа ипгиблрования, определенная для метиловых эфяров рир составляла 2х1СГ4Ы, аигда как для рир она равнялась 3,4 х1(Т5М. Схзматическои изображение полученных аффинных сорбентов проиведеко на рисунке Б. Сорбент XVI получен исходя из алюсила методом последовательных превращений, начиная с обработки з-(2'^З'-зпоксшгропокси) пропил -триэтоксисилаяом,тогда как сорбент XVII получен на основе алясила с радиациончо привитым поля-р-оксиэтилметакрнлатом. Причем сорбенты

„ были синтезированы с раачичной плотностью стационарного лиганда m 2 до 20 мкыоль/г. о-

но

î си2 )j-o-CH2-cH-cH2-o-<!:-<^y~H-N

xvi

chjo—p—0|

он

( S102 H^-C-lп

V У С00СНо-1

XVII

2 СН2

СН.Р03Н2,Н

« —IÎ -о—с—{О J^

CHjO—O-J

он

CHjPOJ^.H

Рисунок 5. Схематическое строение аффинных сорбентов

Наличие аминоарильной группы в непосредственной близости от шримцдикового 1'бтерощжла, может отрицательно влиять па связывание фермента с иммобилизованным лигавдом, создавая пространственные затру,цнения. Б поисках других способов иммобилизации ингибиторов типа pNp через пиркмидквовое ядро б работе было разработано присседгазние рСр через if -аминогруппу. Учитывая слабую реакционную способность этой аминогруппы,было сштезировано производное с более реакционяоспособной алифатической первичной аминогруппой: N4■■(2-эмщoэтил)-цитадяз-2• (3' 1,5'-да1юсфат. реакцией переамиоирова-Ш1Я из цитидин-2' (3* ), 5' -дифоофага.Для получения аффинных сорбентов в работе был использован либо оргапокремнезем vin (ом. pic. 2} а радиационно привитым сополимером винил ацетата и акриловой кислоты ( sc-4.2), активация которого, проводилась различными способами(ДЦК,

водорастворимые карбсдиикидн, м-оксисукщшимид), либо эпокси-аотгил, присоединение лиг^нда к которому осуществляли через нокку глицина , даглкцюш или триглкцина (сорбенты XVIII, XIX и хх). Дополнительно

О—31—(СН2 ) э-0-СН2-СН~СН2- НН-К-С-Ш-1 СН„ > „-да

' он о

XVIII, Я—СН2-

XIX, п.—сн2-

XX,

■С-ИН-СН2

-с-0

К—СН2-С-ЯН-СН2-С-Ш-СН2 -

Р03Н;Н

. Рисунок 6. Схематическое строение аффинкнх сорбентов

бала проведена этерифякация фосфатных группировок для запшн .'ггганда от действия фосфатазн. Концентрация стационарного латадцг ва типичном аффинном сорбенте XVIII составляла 2-5 «кмапь/г. Сорбент XXI без глициновой вставки был получая из глнхоль-алюсила после его активации р-т»С1.Сразиеийо сорбентов хуш-ххх по емкости но белку и по нуклеазяоа активности говорит о достаточности длшш ноажи из даглацина (сорбент XIX ), тогда как нохка из триглицина (сорбент хх> приводит к худшим результатам, что видаю связано с ео возможным складыванием.

Синтезированные сорбенты были опробованы в перну!) очередь для аффшноа хроматографии экзонуклеазы А5. Из всех, условий сорбции/десорбции оптимальная схема состояла из сорбции в 0,05 М трис-КС1 при рН 6,8 в течении. 16-18 часов при о 4°С и десорбции в линейном градиента: исходный буфер—»>1М трис-ацетат, рН 5,0. Результаты очистки сведены в таблицу 3. Рехроматография давала фракции с соотношением 1^'Ф около 3000 (в случае сорбента XVII) и около 1000 (в случае сорбента XIX).

К сожалению на колонках с описанными выше аффинными сорбентами связывалась не только иуклеаза,' но и частично Ь'-нуклзотидаза и фосфатаза. Поэтому была предпринята попытка специфического

елнирования откх примесей, исгаяьгуя раствора их субстратов ила Таблица з. Охала виОелешм эьсзонуклеони А5 на о#кнкад сорбенте XVII

Стадия Суммарная актив. Удельная акт. К/0 ВЫХОД («1

Исх. препарат 80000 1310 2,5 100

Высаливание 47360 БЭЗО 3,3 59,2

Гель-хром. (С751 <1900 6120 10,2 52,4

Аффинная хром. 21219 8000 150-300 26,5

ингибиторов, например: р-ггатрофенилфосфат, фруктозо-1,б-дифосфат , гуанозик-Б'-мопофосфат. В радо случаев удавалось повысить соотконенне к/в дс 1700 ( при отшвке с помощь» двуоамещензого фосфата Ка и хлорнокислого 11«). Для синтезированиях аффинных сорбентов была показана низкая несиецифичеокая сорбция, около 0,5 мг белка на г сорбента, причём эта величина уменьшалась до 0 при повторном использовании сорбента. • • ■ •.

3. МВТАЛЛО-ХВЗАГ АФ8ШАЯ ХР0ЯА10ГРМЯ Среда разнообразных методов выделения к очистка ферментов мэталл>-хелат аф$ИЕНая хроматография(ШХ) занимает особое место. В основу »того метода полонены координационные взаимодействия ыезду . белковой глобулой и хелатироваявымп на сорбенте ионами переходных металлов. В качестве стационарного хелатообразущего лиганда ыогут : зн ступать дабае группировки сорбента прочно удереввавдиэ ионы ' ы&таллсъ, но оставляющие часть их координационной сферы для ьзашодейэтвзя с белковыми молекулами. Законаморностз процесса образования комплексов, когда в качестве одного из лигаидов высту-пагт объемные и сложные молекулы белков, еще недостаточно изучены, те» не менее принято '.стать, что ионы металлов образует • координационные связи в первую очередь с имвдазольной группой гистлдкна и сульфгвдрюдьной группой цистеина. Отсвда следует, что гастидансодеркашиэ фермент:1, юторыми являятоя большинство нуклеаз, очень пэрсгективные объекты для ША хроматографии. Второй шмеи», на который следует обратить внимание, ето отсутствие субстратной специфичности у 9тих сорбаэтов, то есть фракционирование будет

происходить по степени «ксповзровавшсти гистодшговкх остатков на поверхности белковой глобулы.

Разэзхи» метода МХА хроматографии препятствовало отсутствие отечественых сорбентов. Иззестныо мотода их получения, как правило, давала пашйпзкцЕоналышз сорбенты, т.е. хелатвнй .теганд был прасэ- ! одзнен к катрьце двумя и более способами. Наличие яе на сорбенте стацпонарзого лиганда, присоединенного однозначным способом, сделает процесс хроматогрефга более более селективным и умэяытат ; взаимодействий иной природа. Применено монофункциональных хелатшгх сорбадтов позволит снизать неспецпфяческоа взаимодействие сорбента с разделяемыми белками я повысить эффективность хроиатогрйфаческого процесса. При исссльзованшг монофункционального хелатяого сорбента на заклотнтольной стадии очистки белков становятся воэлохной элюция бессолевым буфером (например, разбавленной уксусной кислотой), что позволит лнофидьно высустеатв получаемый препарат без предварительной стадии обессоливалия.

3.2. Сорбент с еруппироекаш ихшоОщгсусной кислоты (ИДК)

КезофужцнональЕмо тридеятчтшв ИДК-сорбвдац онлк получвяя путем арасосдянонпя даялютозах (дшеттового шпт днэтилоеогс) ь-рг-ров к эяскскяктивиропаннам носемлш в безаолюй среде с ко сл вдутом с'.г.глеиием ачожнопфаршх групп р-ютвсррмз схчрЛ ::еда. Удаление хлоргядратз с дкадкгдового гфгра ОДК при получонги сорбентов проводилось добазяеигои рассветного таличес-гва раствора олкогшшта (иетияата ила втилята) натрия, т.к. было найдено, что яра обработке более слабыми органическими основаниями (пиридин.триэтиламин) вужннг эффект не достигается. По-ьидимому, ею объясняется тзм, что дъалкмовыЯ ефир ¡да является более слабим основалчем.

Для сдагеза хелаипгх сорбента» были использованы мгокси -сшох-роми, полученные. кис черег-. модификации 0-(2' ,3' -эгоккиреясксм; чрохг/кггршаотоксисиаанш, так и рва прививочную асудмэржэацпп гот-зддолового эфира метакралоБой нислсти (рнсуьок 7). Второй способ предпочтите.'сьяйе, т.к. на поверхности кре«аогемЕз:Р иатшцн образуется разветвленное оргьничегкоэ покрытие (сорбент х:пп содержал до 15.» С/, зашцавдэе че от растворения, сникащов неспя--цийЕячеак>в сорбцак г. двшзв ослч» высока хоацеитрадию г-гсоксигрутп ¥, как следствие, Селян зксякую конионтрпиго халатных группировок

ишвдвд-ксусной кислоты (до 100 мкмолей на 1 мл).

-ОН +. (С1)331-СН»СН2 —И 3102 \-0-31-СН"СН2

о X ххи о

I' / \ ц

СН3 о ' ¿Н3 о

XXIII

, , о сн,соо~

1 I и / 2 X

0-^ 1СНСН2СН2 ССОСН2 уНСН2 N--------Си

СН3 ОН \н2С007''

XXIV

Рисунок 7. Схема «штеза ИДК-садохрома

При синтезе халатных сорбентов важную роль играл выбор растворителя. Еели для синтеза ВДК-силохрома был с успехом использован гептан, то в 'случае органических носителей требовался растворитель, который но вызывал бы необратимой деформации гранул, не шал груш, способных реагировать с оксирановым циклом и хорошо растворял диалкЕловыа эфглры ИДК. Оптимальным растворителем оказался диметил-сульфоксвд.

Смыленво слошоэфирной группировки кшнодиуксусной кислоты удалось осуществить с помощью солей меди в условиях разработанных в работе за 3-5 минут при комнатной температура.

Прадлссшгаый способ получения монофункциональных ШЩ-сорбентов, исходя из впоксисадериадих носителей .является универсальным, так как позволяет получать халатные сорбенты на основе носителей различной природа (кремнезем, синтетические полимер*, природные полисахарида.). Получаемые сорбенты являшея монофункциональными, что подтвередается отсутствием десорбции иоаов мадл при промывке заряженного сорбента ацетатным буфером при рН 4,0 с 1Ы хлористого натрия. По разработанной е работе технологии (Авт. евлд.и 1335640) о 1983 дянякп порйнкты выпускались на предприятии . "Кемотех" (г.Таллинн, Эстонка)'

3.2. Соравтт с группировкам! эгтиенсгюмртетрауксусной ¡¡ислот (ЭДТА).

Для получения монофункционального холагного пентадентагаого

ХХШ+№Н1СН2С00В>2

СиШ

сорбента было использовано свойство ЭДГА образовывать с Со (Ш) пятикоордшацяоЕнне комплекса, в которых одна группа остается свободной. Присутствие свободной СООН-грушш отчетливо шайгаодается та ИК-спектрэх комплекса, где наряду с полосой поглощения 1650 см"1 (координированные СООН-грушш), имеется полоса 1720 см-1, прияадлезащал свободой СООН-группа. Схема синтеза представлепа на рас. 8. В качестве ковденсирувдих агентов использованы традиционные

Рисунок 8. Строение ЗДТА-сялсхрома

водорастворимые карбодаямвды, а также разработанные в лаборатории биополимеров ИНЭОС . РАЙ м.н'-дисукцгошгадилсульфи-г (ДСИС) и дшентафторфеншюульфит (ДПФФС), применяемые в пептидном синтезе. Описанным способом били псиучепы монофункциональные хелатше» сорбенты как на основе крлчаззема, тан и на осров-з Ай-агарозн с концентрацией стационарного лиганда от в до 17 мнмоль/мл.

3.3.. Вэаияовейслбие доОельмхх соевинеюа! с ИДК-сорвекют .

Для иэуления рэли гистидина в координационном взаимодействии белков с хелаткровавЕНш коньки металлов был синтезирован модельный ш2

тетрапептид : ^у-нха-Аге-Ргс-ов?!, у которого сатдащены все группы, способные образовывать коорданационвне связи, кроме имидасольксго кольца гастидина. В качество хельтного сорбента окл взя.г

НЦК-Тойилерл HW-55 по следовательно заряжаемый ионами Сини, ык in, zndii, fei ni), uni il> и Co(ii). Результаты проведенного эксперимента показали,что в случае использования сорбента в feim» uni id- и со< it) формах сорбция отсутствует и пептид выходит в свободном объеме. Если халатный сорбент заряжен ионами znim и особенно мк id имеется уже значительное удерживание, тогда как в случав сорбента в Си( и i-форме пептид прочно сорбируется и алюция достигается только при понижении pH. При синтезе втого тетрапептвда образовывались побочные продукты присоединения аминокислот к незамещенному имвдазольному кольцу гиствдина. Эти продукты не имели сродства к заряженному халатному сорбенту и выходили в свободном объеме. Таким образом Си( п )-ИДК-сорбент ыохет связывать пептид шш белок с единственным поверхностным остатком гистидина. Для выяснения возможной роли в процессе комплексообразования с *елатированным ионом сыт атома азота пептидной связи был синтезирован метиловый эфир м^-фталилгистидака . Оказалось .что хроматографаческое поведение этого соединения, не содераащего пептадной связи,оказалось в целом схедавд с поведением тетрапептвда, что ■ еще раз подчеркивает доминирующую роль остатков гистидина в процессе коишюксообразовання.

Продолжая научения процесса комплексообразования пептидов и белков на заряженных ЦДК-сорбентах,был такие синтезирован модельный

OBzl

гексапелтяд: Hia-Hia-Gln-Leu-Aep-Pro-OBzi. При изучэнии его хрома-тографичэсшго поведения на ИДК-сорбенте, заряженном различными металлами, оказалось, что гекеалептид о двумя гистидинами не имеет сродства к сорбенту в сош )- и Fei il ) формах и выходит в свободном объеме. Однако в случае использования ионов Oui II), Nit ni и Zn( и i происходит сорбция,причем сродство пептида к иммобилизованным ионам никеля столь велико, что элюция достигается только в присутствии 50. мМ ЗДТа. Следует отметить, что остаток гистидина со свободной аминогруппой при нейтральных pH прочнее удерживает ион меди, чем грушшротш ИДК. уто явление ранее Сило отмечено при работе с метиловым эфиром гаствдина, который -при нанесении да Cut и )-вдк-сорббвт "выхватывает'* ионы меди и выходит не сорбируясь. Следовательно, в случае гексотеятида сорбция на иммобилизованных ионах меди происходит только за счет второго остатка гистидина и у"

она слабее, чем в случае использования ионов никеля, гдэ сорбция осуществляется двумя остатками гиствдина.

3.4. ВсаиесОейсабие нухлеаэ с ШЩ-сорЗекгаш.

Докшшрувдая роль остатков гистидина во взаимодействия балков с хелатаровавнимн нонами металлов била продемонстрирована в работе на примере РНКазы ВасШш 1пЪвгоэсИив 7Р.Этот фермент (МВ=12,2 кД) продставляот собой кошактнув белг.звув глобулу с вдшствешым остатком гастидша 101, расположенным на поверхности, и к точу .те но содоряит остатков цистеша. Схематическая атошая структура РНКазн представлена на рте. 9а. Хроматогрвфическое поведение этого

фермента принципиально нэ отличается от поведения модельного

...........

& с

Рисунок 9. Атомные структура РНКаз: Bacillus intermediiui 7Р (а) И Aspergillus elavatus (б) (ВЫПОЛНЭНН А.ПвВЛОВСКИМ И К.ПОЛЯКОВЫМ,ИН РАН)

тетрапвпткда, а именно, фермент сорбировался только на халатированных ионах меди, а удерживание на ИДК-сорбантах на нип )-и 2n( Ii 1-формах было незначительным. Это отличив,вероятно, связано с различием размеров молекул белка и твтрапептнда.Датые результаты показывают возможность применения МХА хроматографии для белков, содержащих хотя бы один поверхностный остаток гистидина (в случав ИДК-сорбентов в cuiiD-форме.

Из исследованных в работе нуклеаз выраженное предпочтение к ИДК-сорбентам в Cudi) форме проявляла бактериальная нуклеаза Serratia юагсвасепз (МВ=30 кД). Этот фермент содерютт 6 остатков гистидина и 4 остатка цистеша, тем не менее отсутствие сродства к

ИЖ-сорбентам .заряженным ккш и 2п<п), позволяет предаолокить, что среди них нет поверхностных и сближенных в пространстве. :

Исходя из экспериментов по хроматографическому поведению модельного гексапаптида , условием сорбции на хелатированшх ионах Znim.ii мк н) является двухточечный .контакт, т.е. когда два сближенных остатка гистидина служат донором одному пону ыатаиа-:«>-мплексообразователя. Зга положения хорошо подтвервдаится хроматографическим поведением гуанилрибонуклоавы А«р«.г-сИ1ия Этот фермент (МБ = 11,2 кД) имеег три остатка гаствдина (9,40 и 92 ) два из которых(40 и 92) сблкгеш в третичной структуре и находятся на поверхности белковой глобула ( Рис.9 б). Дса.остатка цистеша, им&одиеся в составе ТНКазы С^. по-видимому, образуют дисульфвдный мостик и не }частвует в процессе комплексообразованпя. В соответствии с сяшдаемым хроматографичесшпл поведением фермент сорбировался не только на Си(тх >-идк-сорбвнте, но п на ИДК-сорбентах, зарякешшх ионам никеля и цинка, причем в двух погхяздша случаях злюиия происходит при рй 5,0, тогда как с Си1 II )-ИДК-сорбвнта фермент эляировелся при более низких значениях рй (4,9-4,3). Это дает возможность предпологать, что сорбция в данном случае на хелатированных ионах кеда таюце осуществляется га счет двухтэчечного контакта, т.к. фермеат с одним остатком гистидина, например РНКаза ВшШиз шьэгшолиха 7Р влиаруется с такого го сорбента при рй 6,0.

3.5. Использовании МХА хролтоерсфш Оля очитки щриеаэ.

Полученные результаты по изучению хроыатографического поведония нуклеаа и модельных соединенна- позвсшми в дальнейшем-' успешо использовать метод ЫХА хроматография- для их очисти?. Следует подчеркнуть ел# одну особенность ЫХАХ, которая заключается' в том, что процесс сорбции и- десорбции можно провещать в , присутствии большого количества солей ( до БМ Наси, неионных детергентов .органических растворителей. Эта особенность дает' возможность проводить очистку непосредственно из фильтрата культуральной жидкости (КЗ), а таклэ расширяет возможности прямой стыковке иХАХ с другами видами хроматографии.

Очистка РККазн в&сИ1ия 1^вгов<11ия 7Р непосредственно из культуральной жидкости была проведена на СиШ )-ВДК-силохрсмо, иые-

КЗ№ гвдроф&яьноз полимерное покрытие, йиюсть этого сорбента по тсокоочищенной РНКазе составила 10 мг/мл, что при одинаковой емкости стационарного лаганда выше ,чем у ИДН-Тойоперша в 0-4 раза. В результате такой хроматография удавалось очистить РНКазу в 15-20 раз с выходом по активности 80£. Фермент по данным алентрофэрэза в ШАГ в дена^«!групщх условиях был свободен от других белковых прлг.асеЛ .При десорбции РНКазн в&сШиз intermedios 7? било продемонстрировано одно из преимуществ монофункционального халатного сорбента серэд сорбентом, полученным по методу Пората (J.Porat;., 1975». с 55ДК-агарозы .полненной по разработанной технологии, 0,1 и уксуслсЯ кислотой удалось элюирсеать 85s сорбарованоой РЖазн и пеносродствэнпо ее .кпофйлизовать, тогда как с ИДК-агарсзи, полученной ло методу Пората фэртея^ эдюнровался только с добавлением з клекоту 0,5М хлористого натрия.

Как упэ отмэчалось випв, бекгоривлььая эвдонуклеаза Serratia ~-^cenconi взаимодействует с ИДК сорбентом тоже только в случае ого злрядкя яояаш мзда, иоемзтря па наличие 6 птегиданоп. Выделение (юрг'екта такае провода® нэпосредстяено из филът „.ета хультуралыюй идкостя из сульфат-гиямонийаой фракции. В выбрэышх нами чшзвиях. сорбция К2 па сш'П >~ИДК-агарозу тагсаэ сорбировались рпзесяыо балки с притеодптичьскол активностью» которые, оджхо, щ.та элшрованы отдельно яри pH 6,0, тогда как зндонукмеаза у »болыгама белковыми пркмэсями алвировалась при pH 5,0. в влбрагянх словкях достигалась очистка фермента в 30-40 руз и для получения омогешого белка трабо'валась доочистка на фосфоцодлкшозэ Р— 1 í. Б ззультате такой двухстадиЛноЗ очистки Пая получен практически эмогеняый фермент гп данном здехтрофирзза ь 1ШГ в йеватуриррвдяс хювиях (Рис. 106,трек 3>. В результате счядаш суммарный выход по аквшета составлял около 80 ж.

Дальнейшее изучения выделенная эндонуклеазы, которая были ■ободна от фосфагазшЯ, фосфомонэ- ж фоифодаястзрезчой активности, •назало при анаягзо н-кондевых остатков алиноааслот дансильнш: тодом, наличие двух остатков :C-iu и Азр'. Проведенный мвкярофорез отсутствии дэяату р антоз и обнярукедае з препарате двух аимаяиески акткзнкх Оелмждх шигочентов с ¡?I-7,1 J? 7 вдетел.ъетвуот о гйчерогезиемзтя кукл»а&я (Рис.106,трек 4>.Далькей-э фракцьокироеиш с немощью асноозивпасг* з^мгадгрзфш на dcae-

Тойоиерл-б5оз позволило выделить дье электрофорегическ? гомогеншо • фракции (нуклеазг з^ % Би^> (Рис.Юб) соответствующие ьо изозлектри-ческим точкам и н-котщевым остаткам аминокислот компонентам исходного белка и не отличающиеся от него по удельной активности. В дшпиейшем оказалось , что нукпеазы Эл^ и представляют собой две изоформы фермента к нуклеаза йп^ содержит на и-коще трипептид: Лзр-тьг-1_еи. Калгане в структуре ферлэнта дополнительного трипептида, содержащего остаток дакарбонсвой кислоты, изменило заряд молекулы (по данным ионообменной хроматографии и определения р!), но не изменило существенно ковфоршщю белковой глобулы, т.е.

не пржзеда к нереэксповированив остатков гистидзша, принимающих

■24

'„«'./К'Я''

—

яка*

1-ыаркеры (14.4.-34 £-{ГЛЫра5 \'Х з,»- препарат нуклэага косяе СиПХЫЩ к Р-11

5-зндснухлоааы Зп,

6-звдоауклеаз* 2с,

12 5 1 5 6

Т'ис/нох 10. (а) Хроматография зкдоъуклгаз:; на колонка (1x4,8 сы) с ЗЕАЕ-ТоЯоперл.Элщия градиентом 0-0,2М НаС1 в 10 к>М ^рис-ис1< Рна,з) 1-А>30;2-активность.(б) Электрофорез в 11Ш' препаратов эядонуклеазк в присутствия зш (троки 1-3} К бе^ ДбматурЭЕТОВ (трэки 4-6)

участие в связьшакш с хелатированныш иолами металлов в '.{ХАХ.

Способность ферментов связивагься с шаабилизовгнгами конами раглячшх металлов расширяет возксыости метода 5ЖХ. Как сдедеваго ■лг опытов проведенных с модальным» пиирдамг, очистка ферментов

ьо г,- гоо

щих сродство к NifII) я Zn! il )-хелатннм сорбентам, будет более селективной на этих сорбентах, чем в случае сорбента в Cuíid форме Т.к. таков способ взаимодействия реализуется реже и »следовательно, сорбция балластных банков менее вероятна. Так, например, с псмощью {ИХ на Zn! II )-КДК-агарозе из коммерческого препарата знсокоочищенноя. РЖазы S, Asper^iiiuз oiavatus было удалено значительное количество минорных примесей, которые ьэ удавалось удалить многочисленными другими видами хроматографии. в результате был получен практически гомогенный бэлок по дактам электрофореза в 1ШГ в присутствии sos. Высокая селзктязность Zndi >-идк-сорбентоз по отношению к ферментам, имеющем два сближенных остатка глстидояз, позволяет проводить МХАХ непосредственно из фильтрата культуральной гшдкости. Такая технология очистки была разработана для выделения РНКазы Ар J Aspergillus pailidus, которая гомологична РНКазе Gj и отличается от нее только четырьмя аминокислотными заменами я также содеркит два сближенных остатка гис/идина (Гис-40 и Гис-У2), могущих служить донорами для одного иона металла. Проведение МХАХ pa 2n(iI)-ИДК~агаро?е позволяло наносить на колонку обьмом 100 мл

(а) (61

Юбо зооо joao «во.

12 3 1

Рисунок 11. (а) Хроматография РНКазЫ Aspei*£lllu3 pallidus на 2n» II ) ВДК-агарозе. УЪавновеаивавдий буфер:-О,1М Na-ацетатвнй буфер,pif/.О содеряащай 0,5Н NaCl. Злюция тем ав буфером при рН 5,0.(б)Электро-форез в пааг в присутствии sds 1-маркеры, 2- ггоепарат РНКагы, 3-иэсорбированный материал, 4-'исходная КЖ A3pargillu3 pallidus

около 1 л фильтрата культуральной жидкости и получать с количественным выходом 300-кратно очшгешшЗ фермент, практически не содервдий белковых прсмесей (Рис. 11а,б). Последующая доочистка

от пигмента го выбранной схеме с использованием фосфоцаюшло5и Р-11 позволила получить РНКазу с удельной активность»,

соответствующей активности гомогенного фармента- Аналогичная двух-стадойная очистка РНКазы С, позволяла также непосредственно из К2 получать практически гомогенный фермент прагодный для олигорибснук-леотидного синтеза. Производство атях 'гуаши РНКаз было налажено в НПО "Бполар" (г.йлайне, Латвия). • ;

Для проверки применимости метода 1ШХ для очистки ферментов, третичная структура которых неизвестна, в качестве объекта был выбран препарат скзонуклеазы Аб актиномадетов. Ранее для очистки этого фермента была, использована аффинная хроматография ва иммобилизованных вуклеотвдкых лигандьх (Рио.Ь.6). В препарате екзо-нукдеаза основными: . нежелательными примесяш являются не специфическая щелочная фосфатаза и 5' -нуклеотудаза, также имеющие сродство к '¿спошьзозаннам лпгандам, что, возможно, и являлось причиной получения экзонуклеааы Аб с примесными ^активностями. Было

7 « 1.» ; и

ЛЙ 4 14«

» 10 1« и м м

Рисунок 12. Хроматография ькзсшуклеаэы АБ АаЫпотуова «р. ва ниш ИДК-силохроке. Колонка 1x6,6 ск. Ур&вкоиешгаамций буфер: Б »и трис-нсх, рЛ б,е, содержащий 1 Ы Ы&С1. элхщия-градиент рй (6,8-4,2) 5 нн4-ацетатного оуфера, содержащего 1М НаС1. Несорбировенный

маторияд после первой хроматографии (А) рехроматографироваяи в тех же условиях (Б). Контроль по активности Сед./мл) нуклеаздай (!),&•-нуклеотидасной (2), фосфагазной (3) и по белку (4). )■■.,.

предположено, что применение метода ИХАХ не связанной с субстратной

специфичностью разделяемых Ферментов, окажется перспективным.

Учитывая олоаный характер разделяемой белковой смеси , сило решено в качестве иона-шли/ексообразсватель использовать N1(11), который к тому же оказывает минимальное влияние на нукле;;зную активность. Хроматографяческое разделение препарата экзонуклеазы А5 было проведэяо в две стадии (Рис. 12 А,Б) На первой стадии полностью отделялась фосфатаза, которая обладала самым сильным сродством к сорбенту,тогда как б'-яукквотидаза не сорбировалась в этих условиях (Рис.12 А). НосорбирсванЕая фракция, содержащая такие экзовуклеа-зу А5 (около 25» общего ее содержания в препарате) ,сы.пг подвергнута рехроматографии на том же сорбенте. При этом в адсорбированной фракции оказалось более 9Сж Б'-нуклооткдазы, а при элвцни в градиенте рН Оил получен белковый пик (Рис 12 3), обладавший нуклеазной активность» и практически гомогешшй по данным электрофореза з ПЛАТ

4. АМшные сорбент для палочных фосфатаз.

В настоящее время полочные фосфатазы широко используются в иммуноферментном анализе в качестве ферментного маркера различных молекул, для ферментолиза нуклеиновых кислот до нуклеозидов, а также в научных исследованиях по генной шконерки. В качестве источника щелочной фосфатазы были изучены тонкий кишечник гренландского тюленя и плаценту человека. Технические препарата. этих фермеьтов выпускались НПО "Еиолар" (г.Олайне .Латвия) и имели активность не более 50 единиц на ыг белка.

4.1.Фосфонапхые сорбент . Одним из перспективных способов очистки фосфатаз является аффинная хроматография. Так как фосфатаза расщепляет фосфомоноэфирную связь, стационарные лиганда фосфонатного типа, вмеищив связь Р~С будут устойчивы к ее действию, и благодаря топо-хшяиескому соответствию, они могут связываться о фвраентом. Характер и сила этого связывания зависят от механизма ингибированил, который шгет быть различным дня фосфатаз из различных источников. В работе был изучен механизм ингибированил щелочной фосфатазы аз плаценты человека и из тонкого кишечника гренландского тюленя. Константа Михаадиса (К^) этих ферментов по отношений к р-штрофетш-фссфату оказались равными соответственно 5,6x10-6 М и 1,2х10_Е5 М.

Известно, что для ряда фосфатаз однозамещгшшй фосфат натрия (Ка2НРо4) является ингибитором, поэтому, с учетом его возможного использования в качества аффинного элюента , было изучено влияние на реакцию катализируемую исследуемыми фосфатазами. Оказалось, что в обеих случаях ингибированае носит конкурентный характер с константами ингибировавия K^^e^xiO"5 и (для плацентарной фссфг-тазы) и =8,2xlCfs м (для фосфатазы из кипечзжка гренладского тюленя). Определение [<тг_<Знло проведено по методу Лайнуивера-Берка по графику двойных обратных величин 1/v от i/s. Из анализа этого графика вытекал конкурентный механизм иигиОирования щелочкой фосфатазы грснлендскогс тюлэня С'ензилфосфоновой и р-нитройензалфос-фоновой кислотами с соотзэтстзенно 4х10~5 И и 1,9х10~5 М. Для бензилфосфонсвой кислоты Кгаг была определена таете по зависимости vo/vi от концентрации ингибитора 1X1 и составила 2,2x10Ы.Что насается ингибированзя этими соединениями щелочной фосфатазы из плаценты человека, ю оказалось, что в случае беззилфосфояовой кислоты икгибирование носит смешанный характер и . не была определена, г в случае штробензялфосфоновой кислоты ингабирование является бесконкурентным с Кшг=1,33x10"^. По всей видимости слоите механизмы ингибирования щелочной фосфатазы из плаценты человека voseo объяснить наличием нескольких изофорл ферлента отличающихся по своим физико-химическим характеристикам.

Полученные результаты по изучению характера ингибирования щелочной фосфатазы гренландского тменя производными бензклфосфоно-вой кислоты позволяли надеяться на успешное применение р-аминоб зн-. зкдфосфоновой кислоты в качестве аффинного стационарного лиганда. Вилл получены сорбент xxvii на основе органокремнезема и сорбент xxvш на основе агарозы (Рис. 13). В обеих случаях в качестве спейеера был использован тирамин, что позволяло присоединять лиганд методом азосочетанля.

Характер взаимодействия таких сорбентов со щелочной фосфатазой довольно сложный. Наличие ароматических групп и заряженной фосфонатной группировки обуславливает смешанное гидрофобво-ионное взаимодействие с различными участками белка. Десорбция щелочной фосфатазы путем повышения ионной силы хлористого натрия удается с трудом, причем она элгаруется двумя активными пиками в виде камера и тетрамера и в очень -бшкшх объемах. Гораздо более аффект?явная ■ \

(з102\.сн2-сн-.п \____/ со-!;н-сн2сн2-{ О >-он

XXVII N"N<0 >-СН2-Р-0Н

ОН

КН2

^роза^—о-с-нн-с^ -сн2 -<рУон

XXVIII Н-К'-^ОУ-СН?-Р-0Н

он

Рисунок 13. Структура фосфопатяых сорбентов

йлгдая достигается путем добавления в аяюент ?0 мМ , <шля»-

Пргсся, как било отмечено выиэ, хслпсуреетьлм ингибитором Фзргзмд, что подтверждает скоспецифическую природу взаимодействия фйрмепт-лигавд. Удельная активность выделенного фэрмента дсотагада 4000 единиц, а частота била подтверждена &яекгрофорезом е донатуркрувдк условиях{Рис.16 б),где наблвдалась единственная белковая зона около 70 кД, что соответсвует одно!! субъ&диенкца фермента (КВ =--270 .ч£).

4.2. Сорбенты с сулързтшро5саалии тсс.шсахариВат Другим классом псездоа№®кых. сорбентов, разрайотагс-ых длч выделения щелочной фосфатазы грвнлшдског-о тшетя, являются сорбенты,содержание в качостзэ стаанонзрното лиганда сульфатпровеяны в полисахариды; денотран сульфат, гепарин • и таг-озач-сульфат. Изучено ингабяровичкя ферментативной реакции расщепления р нитро-фенилфосфата (1/У от 1/5) понаяалс, что гжибяроваяяе дскстран -сульфатом носят конкурентный характер, гепарином н^кснкурентный я хптозан-су.чьфагом смешанный. Необходимо отметать, что это отнесение является относительным и относится к конкрзтклм образцам полисахаридов и, уштызая их. гег-эрогбндссть, этк зависимости могут нои другой характер. Лналззсруя возуожзш- способы иммобилизации »таз; ддаодг, цхэддетеенж оыдо исе-та*« о^.аьо гедарсге* $ хито-зан-сульфату.

Причем присоединение гепарина проводили м к ¿Н-агарозе, так и х СН-агарозе с помощь» зодораствоимы! карбодшмидоп. Несмотря на го,что аффтше сорбенты,содержание в качестве стационарного лкган-да гепарин применяются достаточно широко и выпускаются многими фирмами, ранее не было известно о сорбентах , содержащих гепарин, присоедаенный к СК-агарозе. Самое удивительное то, что именно аффинный сорбент гепариа-СН-агароза показал неожиданную специфичность по сравнении с сорбентом гепарин-АН-агароза. Если в первом случаэ удельная активность щелочной фосфатазн во Фракции элкируемой 0,2М достигала 5000 единиц, то во втором случае не гревышала 100-200 единиц при низкой емкости сорбента. Причина столь высокой спевдфичзости мсжет бить объяснена р.ажсстьж -С00Н группировок гепарина для взаимодействии с выделяемым ферментом. Наличие 2е аминогрупп в гвсаркно, через которые ссуоостБЛЯбтся присоединение не очевидно. Зозмоичс они прязадибааг срочно-сгязан-нсму остаточному белку в гепарине, а возможно &то связано с частичным двзацетияироваиием тчштсозаминвяг групп.

Далее было предположено,что существенно лучше результаты даст аффинный сорбзпт, ■ содержащий в качества стационарного лвгазда сульфатировянный н-сукцгеил хктсзан (получен по методика А.И.Гаиза-заде, ИШ РАН),т.к. лигснд может клеть контролируемое количество, и ашно- и карбоксильных групп.Такие сорбеш'ы были синтезирована с варьруемоЯ концентрацией стационарного лиганда от 5 до 50 мм на ил. Выделяемая на атих сорбентах щелочная фоофзтаза с удельной активность» не менее 5000 едижц была практически гомогенна по данным электрофореза в ПЛАТ. Разработанные аффинные сорбенты с сульфатарозаншки полисахаридами выпускались на предприятии ,:Ке.мотэх" (г.Тамшнн, Эстония ) по авторскому.свид.СССР N 1479511 , э. технологические схемы выделения шапочной фосфатааы гренландского, гжленя реализованы в НШИЗиолар (г.Олайло, Латвия ) по авторским звадетельстввм СССР мы 1554370, 158962. На выделение щелочной [юсфмазк с использованием суль&атироваккото хитогэна получено :акае положительное решение от 29 ишя 1933 на -выдачу патента :оссш по заявке N 92-014490/13 (приоритет 25.12.92).

). фрскиутиро&хние хжинсзного НОЛПХ&КСа ЯЬгерЬошусеа кигзэы^1:. .

вернокты хлишазяого комплекса в последние годи привлекает к

а.-;

•себе возраставдэо внимание не только как инструмент для биоконверсии хитинаУхитозана. Ферменты хитиназного ксилглекса проду1 даруются высшими растениями в ответ на атаку патогена, являясь таким образом одним из элементов защитной системы растений. Хптиназы могут играть роль биологических фунгицидов как экзогенные ферментные препараты, так н в виде клонированного в вистеq pacíешм гена микробиологического проясховдения.

5.1. Использование UXA и гидрофобной, тролапографшх

Учитывая сложность белковой смеси фильтрата культурэльной аидкости streptonyoos korлsanovii, содержащей по крайней мере четыре хитиназа и одну хитобиазу, в качестве ключевого ыотода их фракционирования было реяено использовать моталло-хелат аффшшу» хроматографии, которая,как уже подчеркивалось ранее , не связана с субстратной специфичностью, что позволяет успешно разделять фермента одного класса, i 1а рис. Н приведено фракционирование фильтрата ICS

3tr«ptomyces kurrsanovii на Olí XX ¡-ИДХ-агарОЗЗ. ЗЛЖЩЛ ОСУЩОСГВЛЯ-

лась ацетатными буферами с пониканием рН. На хелатной колонке не

/к,„'*"-','хС'" г*,*,,«-'

Ржуиоп 14. Хроматография фильтрата Ш З.кигзаапс^И на Си( II )-ИДК-агарозе. Колонка (2x4,5). Обозначения: 1-^дд ,хитиназа(ед/мп);

3-рН; 4-л^, хптобиаза (од/мл); з-д^, протеаза (ед/мл)

сорбировалась бальная часть балластных белков, в том числе около 8СХ протеазной- активности 'и практически вся хитооиазкал активность.Здесь следует заметить, что данное распределим активностей относится; к конкретным условиям эксперимента, а в других случаях возмокэн« полный проскок зитобиазн, что лишний раз подчеркивает широкие возмоявосга метода металло-х&лат аффинной

зи

хроматографии. В результате такого фракционирования било выделено две фракции в которых была сосредоточена практически вся хктпназная

ч и и,

Рисунок 15. Хроматография'фракции 1уна оутил-Тойоперяо. 1- А280! 2- лх(ед/мл); з- концентрация Ма,,зо4 ,ы; 4- (ед/ш). Стрелкой показано начало элвдш 0.02М Ка-фосфатшм буфаром, рН 7,0

активность: фракция и и фракция IV .Затем фракция IV была расфракцко-нирована на бутал-Тойоперле 65СЗ в градиенте понижения концентрации сульфата натрия (Рис. 15), что далс возможность получать фракцию VII

( тшМ/мач ) *

---' (г

н и .V п ге фгвкцяя

-—г -*-г

12 3 4

Рисунок 16. (а) Хроматография фракцяиУШна октил-сефарозе. 1- А-^;

2-концентрация Ыа2зо4,М; з-Ах(ед/мя);фракции:IX-Хит 26, х- Хит 42;

Стрелкой показано начало елюции 0,02М Иа~фосфатным буфером, рН 7,0. ' "------"------ _ ------- твии йШ. 1 -маркеры (14,4-94 кДЬ

Электрофорез в ГШГ в 2- Хит 42-, 5- Хит 26! 4-

5ракция\лна рис. 15).

зг

состоящую практически из гомогенной хитиназы с молекулярным весом 20 кД (Хит 20) и фракциитт, состоящей из двух хитин аз 42 кЛ (Хит 42) и 25 кЛ (хит 26). Последние две хитшазы были эффетиивно разделены гидрофобной хроматографией на октил-сефарозе (Ряс. 16а) , что подтверждается данными электрофореза в ПЛАТ в денатурирующих условиях (Рис. 166).

Четвертая из хитиназ Streptoiaycea kuraaanovil (МВ=40 кД) была выделена также в апектрофоретически гомогенном состояние из фракции il после ЫШ (Рис.14) о использованием окгал-сефарозы.

5.2. Лффшная хрояяюгрсфя хшинса

Для фракционирования хитиназного комплекса представлялось интересным опробование аффинных сорбентов на основе хитина/хитозана В фильтрате культуральной жидкости основная доля хитиназной активности принадлежит двум ферментам :Хит-42 и Хит-26. поэтому именно для выделения этих ферментов синтезировались сорбенты и подбирались условия элюции. Первые вксперименты по аффинной сорбции хитиназ Streptomycea kuraaanovil на КрИСТЭЛЛИЧеСКОМ ХИТИНе бЫЛИ Нб

удачноыми. Сорбция хкгиназ оказалась столь сильной, что элшровать их удавалось лгааь в денатурированном виде при сильно щелочных рН. Было решено синтезировать такие сорбенты которые с одной стороны сохраняли бы сродство к хитиназам, а с другой стороны были бы устойчивы к хитинолитическому перевариванию. Структура фрагае^та синтезированного сорбента типа 1 приведена на рисунке 17. Эти

Рисунок 17. Строение фрагаента аффинных сорбея: m типа 1 на основе хитина/хитозана. (а), г? -i? —M; (б), ï?-Ac, î?«H; (в), (г), R1 "Ас, R2-P!-О H OPr ), (Ао- ацетил, opг- изопрояилокси).

сорбенты помимо остсва из ацетилированких остатков глючозамина содержали сшивки гидрофобной природа, а также ионогенные фосфоэфирнче и фосфэдиэфирные группировки. Сорбенты' типа i были получены в виде сферических гранул на основе т.н. регенерированного хитина, т.е. исходя из растворов хитозава. После сшивания эти сорбенты были подвергнуты исчерпывающему ацетилированиь. Сорбент типа 2 цринципиально отличался тем, что был получен в виде, частиц неправильной формы из кристаллического хитина, фосформирован и дополнительно сшит глутаровым диальдегидом. Сорбент типа 1 тол низкую хитинолитическую перевариваемость (около В» при 37°с по сравнения с коллоидным хитгаом), а сорбент типа 2 был полпостьа резистентен к действию хитинолитического комплекса, ^акционирование отхкнаэного комплекса s.v.urseanovii было проведено с использованием биосд&цифического взаимодействия меаду хитиназами и хи1иновам сорбентом. Это взаимодействие является слссшым и основывается на образовании электростатических, гидрофобных и водородных связей, поэтому, подбирая условия сорбции и послздукс.ей ступенчатой элвдш, важно было уловить различив в сродство четырех ХЕГГИНаз КЗ Ptreptomyceo kuresnnGvil К ИСЛйЛЬЗубМЬ!М аффИННКМ сорбентам. Результаты экспериментов привели к схеме элгащи с использованием 10 ш фосфатного буфера при рН 7,1 с последовательным добавлением хлористого натрия, 2м мочовшш и 5с№ метанола. Последние фракции содержали праетически гомогеннув хитиназу с молекулярной массой 42 кД по данным электрофореза в ПААГ в присутствии sds. Фракции,содержащие очиценную ьгг 42 немедленно диализовали против фосфатного буфера. Анализ зсех фракций показал, что хитиназ-ная активность присутствовала практически во всех фракциях, однако лит 42 имела максимальное сродство к атому сорбенту и была элюгроваяа последней практически в гомогенном виде с ; удельной активностью окшю 10 единиц. Стога резкое феноменальное различие меаду хитиназзш в сродстве к аффинному сорбенту является неожиданном. Как было установлено, между Хит 42 и Хит 26 существует дахе иммунологическое родство. Для этого были получены поликлональные кроличьи антитела к Хит 42 и к Хит 26 и проведена перекрестная преципитация. При этом наблюдались четкие зоны преципитации .как при взаимодействии антисыворотки со своим антигеном, тек и при перекрестной прецтттацт. Тем не менее, ¡Сит 42 связывалась с

сорбентом типа 1 к 2 намного сильнее,чем Хит 26.Pai.ee била отмечена тождественность поведения этих ферментов на Си tIIi-ИДК-агарозе (Рис. 14) и на бутил-Тойопорле (Рис.15),тогда как на октил-агарозе уке удалось их количественно разделить. Было предположено, что причиной, влияющей на сродство хитиназ к аффинным сорбентам может быть степень ацвтшшрования остатков глюкозашва. Для подтверсздеьая этого были сшггезированы сорбенты типа 1, но с меньшей степенью ацетшшрования (проводилось щелочное дезацетилиропанис полностью ацетилированных образцов). Оказалось, что при уменьшении степени ацетшшрования до 30-4СК »сорбент полностью меняет свою специфичность, а именно, позволяет по той ге схеме элиции выделять практически гомогенную Хит 26 . Таким образом были разработаны схемы выделения высокоочиценных хитиказ с молекулярными весами 42 и 26 кД на одном п том хе аффяшом сорбенте (Рис.17), отличающемся степенью ацетилирования.

6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЯДРОМШЕСКМ ФЕРМЕНТОВ В ХИОТВХНОЛОГШСКЯХ

ПРОЦЕССАХ

6.1. ГШЭролиа нуклеиновых нислст.

Экзонухлбаза Д5 актиношцетов является одним из немногих ферментов гадродизущах РНК и ДНК до 5' -нуклвотидов (аналогично фосфодиэстэразе змвинового ада).В начале исследований была показана возможность эффективного получения сшсн Б'- нуклвотидов с использованием высокоочшденкой экзонухлеазы (соотношение нуклоаза/ фосфатаза > зоо) иммобилизованной на срганонрошегемных сорбентах различными способами. Затем схема била принципиальна улучшена путем использования иммобилизованной эндонуклеазы A22S или бактериальной евдонуилеазы Serratia marcsscens которыэ ГЯДроЛЙЗОВаЛЯ РНК (В случае эндонуклеазы А238) и РНК/ДНК ( в случае эндонуклеазы Serratia ßsrceacana I ДО ОЛИГОНУНЛВОТВДОВ С КОНЦбЕЫМ 5'-фОСфаТОМ. При пропускании раствора субстрата (РНК) через колонку с эндонуклэазой л236 в гндролизате обнаруживается 5-10« вуклеоткдов, а при прохождении того • se субстрата через колонку с ишобютгзованяой вкгонукяеазой А5 выход нуклвотидов составляет 4и-45*. Пропугашя тот ке субстрат последовательно через две колонки, в гндролизате получают нуклеотвдц с 80-90% выходом. В последовательном режиме, коленки работали периодически в течение месяца,при этом наблвдалась

потеря около ЗС& ферментативной . актаввооти. - .Далее гадролизат разделяли на ашонообненниках (АЗ 17 или ¡Ьм)х-п. Конечные продукты идентифицировали как 5' -нуклеотэды с. памощьь 5'-кухлеотэдазц,а также с использованием БХ.ТСХ и УФ-спектроскопии. Безусловно, еде более эффективен гетерогенный биокатализатор, содержащий эвдояукяеазу и экзонуклеазу па одном носителе. В этом случае для экзонукяеазн А5 отсутствует стадия диффузии субстрата ш раствора через диффузионный слой к ферменту,т.к. продукта расцепления РНК/ДНК эндонуклеазой являются субстратами для экзонук-леази. Но несмотря на высокую нуклеазнуо активность оотму-обадизованвого препарата, его применения мешает малая стабильность при длительной работе, которая уступает стабильности индивидуально иммобилизованных ферментов.

Яуклеозида и их производные являются ключевыми совдпнеипми в синтезе целого ряда противоопухолевых и противовирусных препаратов. Среди различных методов их получения ферментативный является наиболее удобным. Препарат экзонуклеага А5 (или А13) содергаезШ вуклеазную, фосфатэзпую я б'-куклеоткдазпув активности является одним из наиболее ' подходяща инструментов для осуществления итого процесса. Процесс фармэнтолаза ДНЕ до иукяеозидов с выдалэнавм я характеристикой индивидуальных нукльомздов был ррэрасотаз совместно БПО "Биотехнология" а НПО "Еиалар" (Латвия). Сулоствепно повысить эффективность процесса в работе удалось использованиам иммобилизованного йиокатализатора на органокрзкнезеиэ, что существенно сшшало затраты иа очистку к разделение реакционной смеси и позволяло проводить процесс в регулируеыом режиме.

6.2. Олияорибону&юстОхый ш»э

Известно, что гуашиспациф^ая . рибонуклеаза АзрпггШиз с 1ауа1:ив обладает высокой. синтетйЗБой активностью, не уступающей, а б некоторых случаях превосходящей активность зарубежного коммерческого фермента ШКазк Т^. В работе- бкла разработана схема получения высокоочвденногэ фермента с помощью !ШХ (стр.25), а для ълогежратаого использования его в сигайте о^шчэрйойунлеотидов требовалась разработка способа и&'обилизэции и подбор носителя. В качестве носителя был использован 'адшинвзировакний крег.аезьм, содержащий вииноалкипьннэ и «миноарклыгае группы. 8 настоял» б вршч

структура рыбозухлеагн Аарвгк1\1иа (Мол.вес--11242)

полностью установлена, что облегчало выбор способа иммобилизации. 3 соотаз фершнта входит 6 остатков аспаргаиновой и 4 остатка глуташшовоЯ кислот, а такжо ю остатков тирозина, что позволяло надеяться на успешное присоединение фермента к носителю через свободные карбоксильные группы ( с помощью водорастворимого карбодиимида) и через тирозиновые остатки (азосочетание). В то ае время Ая{1?б и 01и«в.а таккэ пять остатков тирозина (38,42,45,66,57) участвуют в формировании активного центра, поэтому их химическая кодификация могла нарупить уникальную натлзную структуру фермента. ,В случае иммобилизации РНК&зы методом азосочетания оказалось, что иммобилизация проходит количественно, но процент проявления активности (по ?НК) но превышал 2, ч.в. были затронуты функцаогаль-но вазные остаиш тирозина.

Учтивая наличие в молекуле фермента большого количества свободных карбоксильных групп, а также удаленность большнства аз пах от активного центра, была проведена иммобилизация РНКазы на амянированных крешаземах в различных условиях. Варьируя условия проведения реакции удалось получить прелареты проявляющие до 662 шстиености по сравнению с нативным ферментом. Синтотазная активность лмэпео этих препаратов и была исследовала.

В первув очередь была исследована стабильность иммобшгизозан-пой ШСаза С,, а также прочность связывания фермента с но акт ел ем, что особенпо ваано для проведения. олигорябонуклеотидшго синтеза. Эта параметры бала изучены используя в качестве модельной системы сайтов СрС пз с > р и С при 4°С-. Оказалось, что тгри 12 кратном использования шаюбилизсванного препарата, его активность сохраняется, а состав реакционной смеси посла отделения ее от фермента остается постоянным ' в течение 24 чьсов, т.е. Фермент прочно ковалентво присоединен к алпшшзлровааному кремнезему и не сшвается в раствор.

Используя в качестве донора фосфата гуанознн-2' ,3'-циклофосфат. а в качестве акцептора- да- п трмвуклеотвды. устойчивые к действию гуапая-РНКазк, шмобдлизоваиная РНКаза 02 была использована для препаративной наработка тргауклеозвддифосфатов и тетранукяеозидтри-фосфатов, ямвхшх гуаниловый остаток на б*-конце (Таблица 4). Выход олкгонуклеотидов зависит от начальной концентрации субстрата, уве-

Таблица 4 .Синтез трануклеозиддифосфатов и тетрануклеозндтрифосфатов • в присутствии .иммобилизованной РНКазы С^ (12 мг/мл: (акцептор 1/ (донор) «в) ■

От -чэнухлеотвд 1 Ор) Выход В *

м Иммобилизованная РНКаза С2

РНКаза С2 в растворе"

СрАрС 0,02 12 7

СрАрС 0,02 10 -

СрЦрС 0,02 19 5

СрАрА 0,05 12 -

СрАри 0,05 14 10

СрОри 0,05 20 -

врирС 0,05 24 -

СрИрС 0,1 31 '»

йрСрС 0,1 40 33

СрирУри^ 3,05 13 -

СрАрА-рА 0,05 10 -

"Начальная концентрация донора = 0,02.4 и отношение IакцепторV (донор) -5

личиваясь с ее ростом (см »„тез Ср'ЛрС в табл.4 ),а таюга от структуры 5'-концевого нуклеозвда-акцэптора, тогда как 3'-концевой нуклеозид практически не влияет на выход. Сопоставление полученных результатов с известными показывает, что препарат иммобилизованной РНКазы С2 по эффективности превосходит нативную рибонуклеазу С2 и о успехом моют быть исшльзовьн для препаративной заработки олигонуклеотидов. Препарат иммобилизованного 4 ¿ментп сохранял активность четыре года ( Работы по олигорибонуклеотидаому синтезу проводились совместно с лабораторией С.М.Кенодаровой, ИБФ РАН). .

б.з. шшитвиып ГИДРОЛИЗ ХЯТОЗАИА Учитывая многочисленные пути применения гидролизатов хитозана, была показана возможность исяользо; ания как гомогенного катализа с

{

аримонаниеы фильтрата культуральнэй кидкости streptocycea ; kuraranovü так и гетерогенного- с пспользовэнием хмзпшзеого кош- ! лекср., присоединенного к водонерастворпмым носителям. £

Дяя гидролиза был использован хитозан со стегенью дезацегияирования 80-Р-5* , полученный из крабового хитина при щелочной обработке, в виде 1* раствора в О.ЗМ Na-ацетатпом буфере i при рН 5,0. Исходная средневязкссткая молекулятазая касса хитсзана около. 200 кД. Оказалось, что хкгозан, несмотря на высокую степень дезацетилироваяня, легко гадролнчовался хитиназннм комплексом в течение двух часов до водорастворимого низкомолекулярного иггозана, имеющего Н^ менее 4 кД. Возмсдшость ферментолиза хитозана хитиназннм комплексом связана , с одной сторона, с наличием в хитозане ацетагирсванных остатков глшозамина, с другой стороны с достаточно широкой субстратной специфичностью хитиназного комплекса

Straptomyees lrureaanovl i.

Данные ш разделению с подошью высокоэффективной гель-проняхаияей хроматографии продуктов гидролиза зитозана представлены в таблице 5. Из таблицы видно, что по мере гидролиза среднее молекулярные веса убывают, а полвдисперсность сначала резко . увеличивается,, а затем уменьшается, приближаясь к единице. Такой 0 характер изменения состава гэдролнзата мовно объяснить присутствием в Н2 ко?ш!окса шганаз различного механизма действия, а татае хктобвазы. Видало реакцив гидролиза хитозана начинает ферменты к неупорядоченным механизмом действия, чтс приводит к большому разбросу по колекулярзш весам. Затем это различие нивелируется

ТАБЙЩ Б. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕСОВ К ПОЛНИИСШРСНОСТЙ ГИДРОЛИЗАТОВ ХИТОЗАНА С ШШЦЬЮ ВЭЗК

Время реакции «V . Un П

о i исход, хнтозал) 200000 105233 59594 1,7658

3 МВДуТН 105000 19220 5411 3,Ь517

5 тпшут 690С0 20060 6933 2,8932

10 минут 24400 883 676 1,3059

где: Кл-среднэвязкоотный молйкуляшнй вес (Дальтон) Mw-средневесовой молекулярннй вес (Дальтон) Мп-среднечисловой молекулярный вес (Дальтон) D -полидисперсность

другими ферментами.

Это отчасти подтверждается изучением гидролиза хгаозана с помощью индивидуальных хитиназ (Хит 42, Хит 26 и Хит 20) вискоза-утричэским методом (Рис. 18).Ферлеыты Хит-42 и Хит-26 (кривые 1, 2) гадролизуют хитозан так, что вязкость исходного раствора уменьшает*-

Рис. 18. Гвдролиэ 0,5» раствора хитозана в 0,3 М На-ацетатном , буфере, рН 5,0 (Концентрация ферментов в растворе 0,01 ед/щ)

1- гидролиз Хит 42

2- гидролиз Хит 26

3- гвдролиз Хит 20

„ Ю 20 33 W fff '» " £,маь'

ся в течете первых кину? роакц&и. Такое резкое уиеяьыешг» вшет» высокомолекулярного субстрата происходит при гидролизе фврлолтщ^, действующая по сндо-мэшак-му, когда размзр кааройояак^ уменьшается в несколько мз. ¡Ьтротив. при глдралазо хатозакз о помощью Хкт 20 (кривая 3) происходит плавно* уменььшие »шекуйа^ь кого веса характерное для Федотов дейитвухвдх по окзо-моханаза?.

Дня медицинского прикенешм низкоколекуляряых производи^ г.:тозапа большое значение имеет чистота продукта, и оссбйшд отсутствие белковых примесей. Поэтому использование хитшазазгз комплекса з иммобилизованном состоянии представляется перспекифвдл Для иммоб71Лизации было использоваао два типа хиг^аазных комплексен; 1) комплекс частично очищенный на Cu< II )-ИДК-агароза (фракция IV - ы рис.14), 2) фильтрат культуральдай жидкосги в 0,11« фосфатном буфзрз (рН 7,2). Учитывая, что субстратом в данной ферментативной роающ является хЕтозан с молекулярной массой 200000 Да и более, а таща Еысокуи вязкость 12 -ного раем ра хитозана, в качестве носитед$ были использованы алясвды на основа кирокопоркстых сшшкагелей диаметром пор около 2500 А. На основе саликагедя MCA-250Q--X0

сконструированы препаративные реакторы. Наилучше результаты по фэрментолизу хитозана давала двухстадийная схема. На первой стадии использован иммобилизованный хнтиназный комплекс первого Tima ,а процесс проводили при рН 5,0, получая при этом хитозан со средневяэкостной молекулярной массой 30-60 нД. Затем, повышая рН до 6,2 и испсльзуя иммобилизованный комплекс ферментов второго типа (ф;ш>грат культуральной падкости) процесс проводили водорастворимого хитозана со средневязкостаой молекулярной массой 5 кД и менее. Получаемый продукт имел хоровую растлоржость в ппроком даапозоне рН, дистиллированной вода, физиологичэском растворе. В настоящее время проводятся его модико-бкологичесниэ испытания. Синтезированные в работе гетерогенные бионатилизато' ; стабильны в процессе фериеятолизз, выдергивали двухнедельную непрерывную эксплуатацию без видимого уменьшения фараеятатнвной активности и были использованы болев года.

Продукты глубокого фврмеятоляза хитозана быет пспользовгкы для получения индивидуальных н-Ас-глюкозгагкнов со стзпепыо гошкерязация от 2 до 7, явдяядаася цежюггоа паяупродуктгмя для получеяш .тасарствекных прзпархтсв. Продукты фэр¡елтолпза были подвергнуты лсчврпывяккему ацзталпрэзпяяв, затем подвергнута грубому фракционирования на гель-лроиннакдаЗ колонка (Р-2) с пссле-дуягм разделением в реззям БЭНХ на обращепш-фазозсй колонке С-16 в соде. Вяла отработш-гм условия получения нидзвпдуальЕых оякгомеров (п»2-7! з препаративных количествах (десятки мг).

S.4. Гийрэ.'.иэ lh\o-XUZC0.Ul200a^X!pU¿jQe ЛИКШЙЗОЯЦ С ЫВ 42 U 28 ¡(Д.

Блля получены н-Ас-гстоа,тгосахарзды со степенью полгиеризации з-э с содержанием основного вещества не менее 00%. Продукты ферчез-таяиза олягосахарэдов хитиназагас 42 a 2S за 5 и 30 минут анализировали с помоць» ВЗНС на сшшкаголэ С-13. • Хроматографические пики был? проинтегрцровены и содерсаниэ хитоолигосахарадов выражено в %. Из представленной таблицы 6 видно, что при гидролизе всех к;зкско-шлекулярннх субстратов за 5 мшу? выделяется сзысе БОЯ n-ac-gic, а такге 20-3GS три-н-ацетзшитотряозн, которая гадролизуется хуже, чем и-ацетилхитотетра- и N-ацетилхктопентаоза. Содержание N-ацетил-хитоСиозн в продуктах пиролиза колеблется от 7 до 13 г. При пиролизе олзтоморов хитиназой 42 в течение 30 кинут набдвдается

ТАБЛИЦА 6. СОДЕРЖАНИЕ йЛКГОСАХ№ИДОВ (X) В ПРОДУКТАХ ГИДРОЛИЗА ЖГИНЛЗОИ 42 U) И ЖГШЗОЙ 26 (Б)

(А)-

Н-Ао-ХИТООЛИГО- Время, продукт ы гидролиза (S)

сахарад МИН N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 Ы-6

(GlcNAc i, 5 6?., 9 7,0 29,8

(GlcNAc Ц 30 61,0 13,1 22,0 — — -

! GlcNAo* 5 59,5 15,4 27,6 0,5 -

( GlcNAo )4 30 57,5 13,0 25,5 2,6 1,2. -

t GlcNAc )«■ 0 • Ь ' 34,5 а,5 23,0 . 3,2 6,2

(GlcNAc Ig 30 51,2 и,а 20,6 3,7 7,0 1,9

„

(GlcNAc )3 5 76,3 10,5 13,2 _

{GlcNAc )3 30 " 70,2 12,9 16,9 -

(GlcNAc ^ 5 63,8 12.5 23,7

(GlcNAc )4 30 65,) 1 3,3 19,7 5,0 0,2

(GlcNAcl5 5 65,7 12,8 18,5 2.0 0,5

(GlcNAc 30 71,7 1,2 6,4 9.3 10,9

(В!

Обозначения: N-1: н-Ас-глюкозашт; N-2: И-Ас-хитоОиоза и т.д.

преобладание в продуктах Гидролиза моно- и трисахарида, но отмечено и появление более высокомолекулярные олпгосахаридов в количества 1-2 а. Этот феномен более ярко вцраьен при гидролизе, в течение 30 минут N-ацетилхитотетраозы и N-ацетйлжтошнтаозы хнтиназой 26, когда образуйся более высокомолэкулярине слигосахарзды в количестве 6-10 х. При этом содержание ы-ацетилхитебиозы и м-ацетил хитотриозы резко уменьшается по сравнения с пятиминутным гидролизом до 1-3 ж. Таким образом видно, что хнтпназя 26 способна осуществлять реакция тракогллкозилирования, в которой, главным образом принимают участие в качестве субстратов димер м тример л-ацэтилг.такозамина. '

í2

выводы .

1. Разработай новые типы модифицированных оргаяокрзжюзеьашх сорбентов .термически обработанных салями алюгяшия и покрытых гидрофильными органическими псшайраш путем радикальной прививочной полимеризации. Показана устойчивость таких сорбентов в родных растворах и перспективы их использования для аффинной хроматографе! и иммобилизации ферментов.

2. Впервые изучены конкурентные ингибиторы яуклеаз типа рНр, а такке синтезировавы лх производные с модификациями в различных частях молекулы. Синтезирован новчй класс аффинных сорбентоз яуклеаз с иммобилизованными через гетероциклическое пирялядиновое основал« инге бит «эрами типа рмр.

3. Разработаны новые способы синтеза монофункциональных хелатных сорбентов, содеркащах в качестве стационарного лигаада шинодпуксусиув кислоту (ТрЭДСКТаТЕЫЙ лягавд) и &тглевд1й»я!нтетрауксусную кислоту (пентадентатннй лигавд)

4. 51а примере синтезированных гаствдянсодерггаих пептидов , а такко микробных нуклеаз с установленной третичной структурой доказана дослпруюцая роль поверхностно экспонированных гисткдиков во взаимодействии с хелатпрованннми зона\га металлов.

5. Разработаны технологические схема выделения высотеочзпценвдх пуклеаз кянробпого происхождения непосредственно из фяльтратоз культуралыюи пвдкоста с использованием кеталло-хслат аффинной хреглачогрэфии.

5. Впервые прпкзяен кетсд когаздо-ашг? афишной хрекатографки для ФраКЦИОНПрСВ'йЯЗЯ ЯЯППаСНОГО КОУШШКСа 5±горгсЕусоз kursB.nr.avii. в сочетания с дуг-пкл хроыатографэтеекпя! .кзтодамн выделено четыре гомогенных яатаказы с молекуляриная зесата 42 , 40, 28 и 20 кД и изучены их свойства. Обьаругена траясглпяозплиругцая активность у хптаназы 25 кД, позволяет^ проводить сгнтез (Ы-Аг-Ие , исходя пз дилеров и триеров

7. Впервые синтезирован рад новых аффинных и псевдоаффизных сорбентов для выдолення фосфатаз п хитшгаз.

Разработаны методы ковалентной иммобилизации нуклеаз на

органокремнеземных носителях. С помощью шкосишизованшх препаратов гкзонуклеаза осуществлен 'гидролиз РЖ и ДНК до нукяеозидов ад 5'-нуклеотидов, а с помощью иммобилизованной РНКазы С, осуществлен синтез олигорибонуклеотидов.

9. Впервые осуществлена иммобилизация хитиназного комплекса на кремнеземных носителях и разработан процесс двухстадийногр ферментолиза хитозана в низкомолекулярнце продукты о Ш менее 5 кД. Проведена препаративная наработка хитозана водорастоворимого , проводятся его биологические испытания в качестве ишуномодоятора, а такке в качестве противовирусного и противоопухолевого препарат*, в ковалентных конъюгатах.

10. Впервые разработана схема препаративного ферментативного получения ивдивидуальких олигомэров N-Ac-глюкозамзша (г.-2-7). разработаны методы препаративного выделения их с помощью обращешкь фазовой ВЭЮС со степенью чистоты более S5 ».

Основное содержание работ изложено 6 следущах публтятцях:

1. С.В.Рогозин, В.Б.Варлаков, Д.Г.Ваяьконкмй. Получение модефацг-рованных кремнеземов для присоэдшмш'л биологачески активных соединений// Известия АН СССР. сзр. хамя.-1975.-» 3.-0.1718-17?^.,

2. В.П.Варлшсв, Т.Н.Яьвова, Д.Г.Башювскиа, В.Я.Мокоов.Р.И.Татар-екая, С.В.Рогсжин. Иммобилизованная экаонуклеаза Л5 п go использование для получения 5'-нуклеотидов// Биооргад.ттл.-1975,-Т.1.-Н 6.-С.816-320.

3. В.П.Варламов, Г.Е.Ванникова, Д.Г.Вальковский, Н.Ы.Абросимова-Амельянчик, С.В.Рогсгаш ,Р.И.Татарская. Иммобилизованная эвдонук-леаза А236 и ее использование для получения Б' -нуклеотидов//Биоорг. химия.- 1976-Т.2.-И4.-С.558-563.

4. К.Г.Скрябин, Б.П.Варламов, В.М.Захярьев, С.В.Рогозин. Новый тип сорбентоа для иммобилизации нуклеиновых киапот// EaoopraH.xfflöffl.-1976.-T.2.-N 9 .-<3.1416-21.

5. З.Е.Варламов, Д.Г.Вальковский, С.В.Рогсжин,В.Я.Ыокеев. Е.В.Чур-санов. Носитель ферментов для процесса разложения нуклеиновые кислот и их солей// A.c. СССР н 4557«. B.ii.-lStfö-N

t. В. П. Варламов, Д.Г.Вальковский, С.В.Рсшяя , Р. И. Татарская, Т.Н.Львова. Способ получения 5*-вуклеотидов// А.с.СССР N 4Б7703 B.B.-1S75 -ЯЗ.

"Г

7. В.П.Вашшмотз, Т.Н.Львова, Г.Е.Ватшкова, Я.М.Аброскмоза-Амельян-чпк, Д.Г.Вальковский, С.В.Рого:-пш, Р.И.Татарская. Способ получения

. 5'гнуклеотцдов// A.c. СССР N 521281. Б.к.-lSTft .-N26.

8. С.В.Рогсотн, В.А.Сергеев, Д.Г.Вальковский, А.М.Мамцис, В.П.Варламов, И.К. Осипов. Способ комплексной переработки биомассы //

A.С.СССР Ы 557765 . В.И.-1ЭТ7 . -Н1в.

9. В.П.Варламов, А.В.Власов, Г.Е.Банникова, Б.Л.Цетлин, с.В.Рогозин. Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений // А.с.СССР м 689200. Б.и.-1Эао .-N44.

10. А.И.Артекова,В.П.Варламов, А.В.1Шс9лев,Г.Л.Кустова,Б.А.Лшткивд.

B.С.Никитин, С.В.Рогокщ, А.С.Фалина. Способ получения модифицированного кремнеземного носителя// A.c. СССР н 638431 .B.ü.-istq.-n зб

11. З.И.Лозинсгай, В.П.Варлгмов, С.В.Рогокин . Способ получения ТНОЛСОДерЖЕЩИХ сорбентов// Д.С.СССР.N 771106. Б.И.- 1980.-N33.

■ 12. В.П.Варламов, м.Г.Впфша, Е.С.Вайиврлан, С.В.Рогожин. Каггоиногг-лировенгшй оргапокремзезем как сорбент для гидрофобной хроматографа! глжсозт'даз// A.c. СССР n ююоез. s.u.- юаз.-тз. Í3. В.П.Варламов , Г. Е. Ванникова , Д.Л.ЗэЗдана, В.В.Тарасевич,

C.В.Рогспин. Способ получения биоспецяфгческого сорбепга//А.с. с сер М 1037514. B.a.-íS33.-JM4.

14. ЦЛЗ. Лгали .ВЛТ.Вардгков .Г.И.Квесстадза, С.В.Рогсшп. Швюбя-дгиецгл «г-азяггзд па ноортезэтесках носителях// Прикладная бгохнм. а 1тасробиологля.-1973.- и i .-с. 13-16.

15. Т.Н.Львова, , Р.П.Татпрсхяя, Т.Л.Воксша, С.З.Сиксняа, В.П.Барязжз ,Д.Г.Вальковеккй, С.В.Рогозин j/uA.Sars Ингибиторы экзонукзеага &5// Ваязэтви-Ш!® «3. -яг. - с. 350-363.

16. Г.ВЛгпкгяяя, В.П.Еаряаисв, О.В.Рогоггш. Синтез и исследование гпгябатороз окзшуклеазн AB// Brcopr.:mí.~iS73.-T.4.-N5.-c.825-831.

17. в.И.Карпепко, В.П.Варламсв, Я.РЛйлссешсо, О.В.Рогозш . Юймо-йкяпзздет кяотск кетаяожеяяндве бактеряй// Кпфоййодогпя.- 1980.-Т.6.-С. 1S5D-S0.

13. В.Й.Язтяч, Н.Н.СемеЕова, В.П. Варламов, С.В.Рогозин. Итлобили-зацзя ДИГС по. ксд!фзщровйяных неЬргашпюсюп: сорбекгах// Наохшш.-1S80.-T.45.-H9.-С.1597-1602.

19. И.А.Вчсхпшко, Н.Г.Евстратова, Я.Ю.Кондратьева, Г.А.Серебрзя-няксва, Р.П.Эгстпгпбева, З.П.Варламов, Н.Н.Семэяоза, С.В.Роговая. Слгтзз бяоспэцпфаческих сорбентов дяя выделения белков//

Биоорган.жмия.-1980.-Т.6.-N 9.- с. 1355-1360.

20. Г.Е.Ваншкова , В.П.Варламов, О.Л.Самоонова, О.В.Гогааш. Аффинная хроматография нуклеаз. 2. Выделение экзонугаеазы Л5 щ оргянокремнеземных сорбентах с иммобилизованным 5-оксиурадещ-2' (3' ),5'--дафссфатом// Биоорган. химкя.-1982.-т.8.-м г.- с.212-219.

21. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, С.В.Рогоаин . Биоспецифическая хроматография вуклеаз. III. Синтез и использований органохремнеземяых сорбентов с иммобилизованными производными цити-дина// Биоорган.химия.-1983.-Т.9.-Nil .-С.1505-1513.

22. В.П.Варламов , Г.Н.Львова, Г.Е.Банникова,Н.Н.Абрсскмова-Амельян-члк, В.Я.Мокаев, ?. И. Татарская, С.В.Рогожин - Получение 5'-нуклеотидов из нуклеиновых кислот двухступенчатым гидролизом км-мобилизованными нуклеазачи актиномицетоь// Тезисы докладов Xi Мевделезского съезда . г.Алма-Ата.- 1975.- Т.е.- С. 15.

23. В.П.Варламов, Г.Е.Банникова, А.В-Власов .Б.Е.Гадас, Б.Л.Цетлид, С,Б.Рогожин. Новый тип сорбентов для иммобилизации белков е аффиннсй хромат ографш!// Тезисы докладов II Бсесошг/jro ааыозиука "^ммобишзовашше ферменты". г.Абсвяч.- i977.- СЛ.

24. В.П.Варламов, С.А.Лопатин, Г.Е.Бызвикова, С.В.Рагожн. Литавр-оСменная хроматография фаршггоь//. Teusca докладов VI Всесо*сэдога симпозиума "Химия белков и пегаэдов". г.Рига.- 1283. - с.5-5.

25. В.П.Варламов,КЕ.Баишкова, C.E.Forcsim. Имюбзшкшцад модифицированных нукпеозвддафосфатов на оргашкрвкяэземвдх сорбентах для Оиоспецафичаской хроштографта зкзонуклеазы А§// Тезисы докладов IV Всесоюзного симпозиума "Ищшн&рнзя энзимологвиЧ, Г.Киев.- 1983.- 4.2.-С-51.

26. З.П.Варламов, Г.Е.Банникова, С.А.Лог-аган, С.В.Рогома . Биэспэ»' цяфическиэ метода выделения нузслеаз и фосфатаз// Тезисы докладов IV Всесоюзного симпозиума по мэдициьслсой внивмологаи. г.Алка-Ата ,-ÎS33.-C.E3. "

27. В.П.Ва р ляиов, С .Д. Лопатил, Г.Е.Ешянкова, 0.В.Рогожи. Лигандосбмэвная хроматография нуклеолитьчеехих фермешгоЕ// докладов m Всесоюзного симпозиума по молекулярной жидкостной} хроматографии. г.Рига.- 1984.- C.Î54-155.

23. Г,Е.Банникова, В.Н.Варламов, С.В.Рогс-хик. Аффинная хромав crpv фил нуклеаз (обзор)// Виоорган.химия.- 1984.-Т.10.-к 3.-с.293-317.

..29.:.; В.П.Варлшлов-, .С.А.уТопатин, С.В.Рогожин. Лйгаэдосбиенпая хроудаография -ферментов,-?..Синтез хелатных сорбеятов и очистка* эхзснуклеазы А5 актявсмиз'етов//. Биоорганич. химия - 1S34.-T.10.-N 7.-С927-Э34. - .;.

30»-м В.П.^ряамов,---.Д!.Е.Банн2кова, Л.А.Орна, С,И. Вэзбсродова, С.В.Рогожин.Иммобилизгция^нуклеаз на органокремнеземных сорбентах// тмезисы . докладов-.^) Всесоюзного симпозиума,по инженерной аззкх'олог. :• чГ.Кобулетти.- 1Э85.Г„-¡¡Sil .-C>-25i.

31: В.П.Варламов . Современные методы выделения и очистки нущеолитаческих ферментов//Теетсы докладов Всесоюзной конференции

■ "Нуклбазы микроорганизмовг.Рига.-1985.-С.50-52.

32. Л.А.Орна ;,А.А.Зейдака,' В,П.Варламов .С.И.Безборэдова. Иммобг лизациял рибонуклеаз - и Рь, . на органокрешеземных. носителях

■ карСодомздшм ..методом// т.озясы докладов Всесоюзной конференции .^Нуклеазы;микроорганизмов"; г.Рига.- 1385.-с. 93-95.

33. В.П.В а рдамов ,С.А,Лспатин, Г.Е.Ванникова, И.А.Андршпша, С.В.Рогожин. Синтез хелатных сорбентов и их применение для ЛОХ ферментов// Тезисы докладов 3 Всесоюзной конференций "Биосинтез ферментов микроорганизмами". г.Кобулетти.- 1SSS.- с. 84.

34.. О.Ю.Ползвая, Р.Г.Василов, В.П.Варламов , Л.А.Селезнева, ,,'iü.P.Перфильева . Синтэз. реагентов для иммуноферментного анализа простогландчна f2c<// Тезисы Всесоюзного совещания "Синтез и с.-исмедованиэ-прсстоглаядинов", г.Таллинн.-1986.- с.31. 35..-В.П.Варламов, Г.Е.Банникова, С.А.Лопатин, С.В.Рогожин. . Внделе-няе фзрментов' .методом. ляЕгандообмешой хроматография// Тезиса докладов.';*!! (.Всесоюзного:'-, симпозиума по шла! белков и пептидов. Г. Талжшн.-1987 .-С. 29-30. 15;36;i:>;,:.B,n.BapjiaM.0B¿'..'.>'P.íЕ;ВаТ1Еикова,. .• H;Av Авдрнашяа*\ ..С.В»роговин. Использование'оульфироваеккх^по-тасахаридс^ для выделения очистка.и иммобилизации ферментов/:/ ;;. .^Тэзксн'" докл .а доз iy , Всесоюзной конференц ии .i:" Биосинтез* ^ферлантов. микрооргаяизма?я1.".-.тг-Тагоент. -1988,ÍGA32S ',,V^¡víK1'.- '«aiíi'v. •■ , .■ •••• vn-, :.-.{ л .-»-c. '" ." 37. В.П.Варламов '.Сгд.ЯойаЯШ,"Т.Е.Банникова, .С.В.Рогогяш.:. Выделе-нкеги счисма ферментов .иотйдом "лигандсобмеянсй хроматограф»;// Тез ¡кИ '-докладов - всесоюзной конфзрвкцяи •ГВиделеше-.-очистка-^и ,-аяздяз

за. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, Г.Н.Тимофеева, С.А.Лопатин,С.В.Ро-гожин. Лигандообменная хроматография бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens// БиОТвХНОЛОГИЯ.-1988.-Т.4.-N2.-С.231-34. "9. С.А.Лопатин,В.П.Варламов, C.B.Рогожин, Х.Э.Арукаэву, М.Э.Хага. Способ получения сорбента для лигандообменной хроматографии белков// A.c. СССР Н 1395640. Б.и.- 1988.- N 18.

40. Г.Е.Банникова, В.П.Варяамов, С.В.Рогожин . Способ выделения и ОЧИСТКИ бактериальной андонуклеазы Serratia пагсвасапа// A.C. СССР.- N 1392902 .-1990.-N17.

41. С.А.Лопатин, В.П.Варламов , С.В.Рогожин. Хроматографическое изучение участков связывания микробных нуклеаз с хелатированными ионами металлов// Биотехнолоп£Я.-1989.- T.5.-N2.-С. 183-188.

42. В.П.Варламов, С.В.Рогозин, Л.А.Орна, С.И.Безбородова, С.А.Смо-лянинова, М.А.Соболева, С.М.Ненодарова. Получение и использование иммобилизованной гуанилрибонуклеазы// '«Ферленты микроорганизмов. Москва. ВНИИСЭКШ.- 1989.-Ч.2.-С.212-223.

43. С.А.Лопатин, В.П.Варяамов, Б.А.Даванков. Лигандообменная хроматография белков и ферментов (обзор)// Биоорганическая химия.-1990.5.16. -N6. -С. 725-750.

44. Г.Е.Банникова,Е.В.Благова,В.II.Варламов,А.А.Дементьев,й.П.Куранова, Е.Ю.Моргунова, А.А.Дементьев, С.В.йишпников. Выделение, исследование структуры и кристаллизация андонуклеазы Serratia œarcescens"// Тезисы докладов Всесоюзное симпозиума "Химия белка".г.Тбилиси.-1990

45. Г.Е.Банникова, Е.Е.Благова, В.П.Варяамов , Е.Ю.Ыоргунова", А.А.Дементьез, С.В.Шляпников. Разделение изоформ и кристаллизация эвдонуклеазы Serratia marcescena //БиООргаН.ХИМИЯ.-1990. -Т.16. -N12.-С.1670-1682.

46. И.А.Стояченко, В.П.Варшлоз, В.А.Даванков, Н.Я.Кобзева, Н.А.Тиунова, А.М.Незбородов. .Способ получения -^тиназ АоМпощусва

; . kurssanovll// t С. СССР N 1756354.-Б.И.1992.-N 31.

47. Л.А.Ермекбаева, В.П.Варламов, С.И.Безбородова, А.М.Безбородов. Иммобилизация рибонувдеазы Aspergillus paliidus// Прикладная биохимия и микробиология--1S30.-Т.26-- N 5.-С.609-615.

46.'Л.А.Ермекбаева, В.П.Варламов, С.И.Безбородова, А.М.Безбородов. Выделение и очистка ингибитора рибон тслеазы Aspergillus

pallidua// Приклад, биопы. И микроб.-1990.- T.26.-N 6.-С.754-760. -

49. И.А.С г ояченко, В.П.Варламов, В.А.Даваяков, Н.Я.Кобзева, Н.А.Тиунова, А.М.Везбородов. Получение вксокоочищенккх хитстаз Act. kursaanovii// Приклад.бИОХИМ.И МИКроб.-1991.-Т.27.-N1.-С.45-52

50. И.Б.Лещинская, В.П.Варламов, Б.М.Куриненко. Нуклеазы бактерий. Издат. Казанского Университета. 1991. 13,5 печ.л. (монография). 81. М.К.Кндулен, Н. А.Замятина, В.П.Варламов, А.В.Ильина. Изучение антивирусного действия модифицированной бактеркальн' 1 рибонуклеазы// Биологические науки.- 1992.-к 4.-с.87-89.

52.. В.П.Варламов, И.А.Стояченко. Ферментативный гидролиз хитозана// Груды 3 Всесоюзной конференции по хитину.- Москва.- 1992.-е. 56-63. рэ. В.Л.Варламов, А.И.Гамзазадо. Способ очистки щелочной фосфатазы р тонкого киаечника тшеня// Полож.решение от 29 июня 1933 н-выдачу патента России по заявке N 92-014490 с цриоркт. 25 док 1992.

54. А.В.йльша, В.П.Варламов, В.Е.Тихонов, И.А.Ямсков,В.А.Даваяков. рздэление ВЫСОКООЧКЦвНКОЙ ХИТИНазЫ Streptonycea kursoanovli на !.Ю-¿Шфицированном хитине// Биотехнология.-1993,- к 2.-С.25-28.

55. И.А.Стоячонко, В.П.Варламов . Получение яшшаз streptomycea fiurasanovii н исследование некоторых их свойстз// Биотехнология .-1993.-м 2.-С.29-36.

56. С.А.Лопатин, В.П.Варламов,А.В.Ильина, А.А.Шульга,О.С.Гринченко, К.Г.Скрябин, М.П.Кирпнчшкоз. Универсальный способ очистка гедао-шиенерного соматотропипа человека и его мутантов с использование!! иетаддо-хелат аффинной хроматографии// БЯОЗШИЯ.-1994.-Т.59. - N 2 .-С.226-230 .

57. K.G.SkryaMn, T.Y.Yenfcstern, V.U.Zacharysv, Y.F.Yarlaroov , S.V.Rogozchin, A.A.Baev . A Now Type of Supports for the Ijmoblllzation Nucleic Acids and Its Application// Hoppe Ssylarз Zeitachrift fur Physiologischa Chanie.-19T6.-B.357.-H.3S.337.

58. V.P.V&rlaoov, S. A.Lopatyn, G.E.Banr.ikova, I. A. Andtruschlna, S.V.Rogozchin,. 3ynthesi3 chelat sorbanta and it3 application for LEG of enzymea// Abatracts VI Intarnat. Syap. on Bioaffinity Chron. and Related Usthoda.- Praga.- 1985.- p.71.

59. G.E.Bannikova, V.P.Varlanov, G.N.Timofeeva, S.V.Rogozchin . Llgand-exchange chromatography of bacterial endonuclease// Abatr. VI Inter.Symp. on Bioaffinity Chrom.4 Rsl.Uet.-Г -aga.-19eS.~P.3.

60. V.P.Varlamov, G.E.Bannikova, S.A.Lopatyn, S. V.Rogozchin. Specific sorbt-nts for chromatography of nucleolytic enz ytoes// Chroca.tograhy'04 . Akadeaiai Kiado.- Budapest .-1966.- P. 127-134. M. V.P.Varlaoov, G.E.Baimikova, S.A.Lopatyn, I.A.Andryuschina, ö.V.Rogozohin. Ligand-excliange chromatography of nucleases// J. of Chromatography.- J9S6.- V.364.-P.215-223.

62. V.P. Varlamov, S.A.Lopatyn, G.E.Bannikova, I.A.Andruschina , S.V.Eogozchin. Llgand-exchang© chromatography of nucleases and phosphatases// Abstracts 16th .Int. Syrap. on Chromatog.-Paria.-19B6.

63. V.P.Var'laraov, S .A .Lopatyn, G.E.Bannikova, S.V.Rogozchin. Ligand-exchangs chromatography of erczyoes// Abstracts XI Internat. Symp. on Column Liquid Chreraatorraphy.- Amst!srda;n.-19S7.- P.91 .

64. V.P. Varlainov, I .A. Andruschlna, E. A.Arena, S.V.Eogozchin. Chro-nv.togrsphyc iosthods purification of alkaline phosphatase// Abstr. 17 Internat. Synp. on Chromatography.- tfien.-19i33.- V.U.- P.105.

65. V.P.Varlaaov, S.A.Lopatyn, G.E.Bannikova. Ligand-exchange chromatography in study topography of nucle^sea// Abstracts VII Buna.be Symposium on chromatography.- Leipzig.-1989 .- 1(0 130.

66 . ^ Varlanov, S.A.LopiT.yn, G. E.Bannikova. Interaction of nucleases with cholated aetal ion.;// In: Structure and cheniatry ribonucleases. Eds. : A. Pavlo vsky, K. f'o jyaiov,-Moscow. -19Ö9 ,-P.3S3-391 67. V.P.Varlamov, I.A.Andruschlna, E.A.^rena, V.A.Eavankov . The chromatographic rotheds purification alkalln-i phosphatase //II Internat.Syisp. Bioaed. Appi .Crore»tog.& Electrophor.-Tallinn.-1990.

66. V .P.Varlainov, I.A.Stoyaohonko, V.A.Eavankov. Isolation of chitinasfis fron culture iwidiuja by maans liga.nd~sxcha.ngtJ chromatography// Abtftr.13 Xnt. Syr>p. Chromatogr.- Amaterdatn.-£990 ,

69. G.E.Eannikova, K.V.Elagova, A. /. .Döaö.-jtiov, E.Yu.Uergunova, A.M.Mikchailov, S.V.Sc'ulyapnlkov, V.P.Varlamov, B.K.Vainstöin. Twij, Isoforce Serratia oarcesceii". nucleus«. Crystal 1 _iat io.i and prellcl" nary X-ray investigation,'/ Siccham.Intsr.-1991 .--V.24 .-N5.-P.ei3-8JJ!

70. V .P.Varlarcov, I .A.Stoy3.chenko Purification of uicrobiai chitinaass// Abstracts 5th lvrcam-t, Sympo3iuio on Af f init-y Chroiuatogr.-i.phy.- Yokohama.- 1991.- P.HI.

71. E. V.Blacjova, E.Yu.Korgunova, G.E.BanniJcova, A.A.Dsisantiov, A.!i.Wi*.challov, 3. V. Shlyapnikov, V. P. Var laraa v , B.K.Valrjstein. Crystallisation ¡od. preliminary X-ray Investigation of tho Ssrratia osrcoscons nuclease// Butl. Da Soc. Catal. Clen. - 1992.-V.13.-fJ l.-F. 303-392.

72. V.E.Tlkfconov, I. A.Y&riskov, 7.P. Varls-cnv, A. V.Tliyna, V.A.Davasikov. ChltinolytJo dijjiistiMli ty of crosslinked ohitosan £<jls by eniyss cokj>1<w frcB Str&ptoayocs kurseanovii/Y Biotechnology & Appl. Biocbera., 1993, v.17, p.251-256

73. A.Y.Iliyna, V.P,Varlaoov, V.E.TD'.ho.oov, I.A.Yamakov. Isolation of two cliitinases fron Straptomyecs Kurssanovli using crosalinlced ehltin/chlto3an ¡jola// J. Molecular Secoanition.-lS93.-V.6.~N1 .-P.8

74. Y.P.V&rlaiaov. Tho chitin-degrading enzyira systoa of tho Straptoaycoa kurenanovii// Abstracts Intornat. Syap. "Chitin EnzyTsalogy".- Senlgallia. - 1993- P.45,

75. I.A.Stoyacha.iko, V. P. Variants v. ¡«vesication of N-Ao-chitool i-gooacoharidoa hydro lya la by Stroptomycos kurasano"ll chttinasos// In : Chltln Enzynology. Ed.: R. Huzz&ralll,- Ancona.-1993.-?.447-52

76. A.V.Ilylna, V.P.Varlaiaov,7.E.Tikhonov,I.A.Yiuaskov, V.A.Davankcv. Isolation of chltinaao froa Streptonyc»» kuraaanovll uaing croaa-1 Inked chltln gala// Ab3traota 17th Internat. Synp.on Coluari Liquid Chrooatogr.-Hamburg.- 1993.-7.1.-P.315. #

77. A.V.Ilylna, Y.P.7arlaoov, V.E.Tikhonov, I .A.Yatnskov, 7.A.Davan-kov. One-atop isolation chltinaoea Streptcmyceu kursaunovii uaing chltln gala// Biotechnology 2> Appl.BloohaD.-1994.-V.19.

Заказ 9 ■ Тираж 90 Бесплатно

Ротапринтная МИГХТ имЛ.В.Ломоносова М.Пироговская ул., д!

Информация о работе

Варламов, Валерий Петрович
доктора химических наук
Москва, 1994
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы