Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы"

Министерство здравоохранения Российской Федерации

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Царснко Ольга Викторовна

:: и ОД

нЖ правах.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2000

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Глазова Н.В. Научный консультант:

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Писарев O.A. Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Селезнева A.A.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Игнатьева С.М.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Технологический Университет

Защита состоится « ^О » 2000г. в ^ часов на заседании

диссертационного совета К 084.63.01 при Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург,'ул. Профессора Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат диссертации разослан « ^ » 2000г.

с

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

Л 1 t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений современной биотехнологии. Ферментные препараты широко используются во многих отраслях промышленности: медицинской, микробиологической, парфюмерной, сельскохозяйственной и других. Особое значение в настоящее время приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из животного сырья, которые могут успешно заменить препараты аналогичного действия, производимые химическим и микробиологическим синтезом.

Гидролитические ферменты из поджелудочной железы крупного рогатого скота - рибонуклеаза (РНК-аза), дезоксирибонуклеаза (ДНК-аза), трипсин и химотрипсин - обладают выраженным противовоспалительным действием и эффективны при лечении различных гнойно-воспалительных процессов. Кроме того, нуклеазы являются природными регуляторами механизма противовирусной защиты, что позволяет рекомендовать их для лечения и профилактики вирусных инфекций. Использование гидролитических ферментов в медицинской практике в виде внутримышечных и, в особенности, внутривенных инъекций предполагает высокую степень очистки.

Ужесточение требований к качеству лекарственных препаратов требует создания новых подходов к технологии их выделения и очистки. В настоящее время на производстве медицинских препаратов ОАО «Самсон» для получения панкреатических ферментов используется сорбционный метод выделения ферментов из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота на сульфокатионите КУ-23. Однако, дальнейшее разделение ферментов проводят путем дробного фракционирования сульфатом аммония, в результате которого происходит соосаждение белков, что является причиной гетерогенности получаемых препаратов. Помимо этого, последующая индивидуальная доочистка каждого из ферментов многостадийна и осуществляется такими малоэффективными методами, как высаливание, диализ, осаждение органическими растворителями с последующим обессоливанием. Использование этих методов не обеспечивает получения препаратов высокого качества. Поэтому, их замена на высокоэффективные, легко масштабируемые хроматографические методы является актуальной задачей при совершенствовании методов выделения и очистки ферментов.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось изучение закономерностей сорбции панкреатических ферментов на молекулярных и ионогенных носителях различной структуры и разработка на их основе хроматографического способа очистки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение равновесных, термодинамических и кинетических закономерностей сорбции ферментов на различных хроматографических носителях и выбор оптимального сорбента для препаративной хроматографии.

2. Теоретическое обоснование условий разделения компонентов смеси; оптимизация хроматографического процесса по скорости подвижной фазы.

3. Выбор оптимальных физико-химических условий селективной элюции.

4. Масштабирование хроматографического процесса очистки для полупроизводственных условий.

Научная новизна. Впервые изучены равновесные и кинетические параметры сорбции панкреатических ферментов модифицированными и сверхсшитыми полистирольными сорбентами. Установлен преобладающий вклад гидрофобных взаимодействий в изменение свободной энергии процесса при связывании сверхсшитых носителей Стиросорб с ферментами, что учтено при выборе физико-химических условий селективной элюции. Изучено влияние скорости подвижной фазы на процессы хроматографического разделения ферментов из многокомпонентных смесей. Проведен теоретический анализ условий оптимизации разделения в двухкомпонентной системе и предложена модель, позволяющая прогнозировать оптимальную скорость хроматографического процесса, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода из хроматографической колонки в зависимости от соотношений между равновесно-кинетическими параметрами. Впервые осуществлена хроматографическая очистка РНК-азы на сверхсшитом сорбенте Стиросорб.

Практическая значимость. На основании проведенных теоретических и экспериментальных исследований предложен эффективный масштабируемый способ очистки РНК-азы, исключающий недостатки известной схемы очистки фермента и позволяющий увеличить выход целевого продукта, сократить время технологического цикла процесса получения фермента и повысить удельную активность препарата. Предложенный способ апробирован в цехе ферментных препаратов ПМП ОАО «Самсон» (Акт апробации от 12.12.98). Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке № 98122253/13 от 7.12.98 на "Способ очистки рибонуклеазы".

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международной конференции «Фармация в 21 веке: традиции и инновации» (Санкт-Петербург,1999), на Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва,1999), на Республиканской научно-медицинской конференции молодых ученых (Самара,1999).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Высокая селективность сорбции панкреатических ферментов новыми сверхсшитыми сорбентами Стиросорб обусловлена преимущественно гидрофобными взаимодействиями.

2. Модель оптимизации хроматографического разделения в двухкомпонентной системе по скорости подвижной фазы. Экспериментальное доказательство модели при разделении РНК-азы и ДНК-азы.

3. Новый способ хроматографической очистки РНК-азы из производственного высола фермента с использованием сверхсшитого сорбента Стиросорб.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 159 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 124 страницах, содержит 17 таблиц, 33 рисунка.

Материалы и методы.

Объектами исследования в работе являлись ферменты РНК-аза, ДНК-аза, трипсин и химотрипсин производства ОАО «Самсон» (г. Санкт-Петербург).

В качестве сорбентов для исследования были выбраны молекулярные (Полисорб, СКН) и ионогенные (КУ-23) макропористые сорбенты на основе стирола и дивинилбензола, выпускаемые в промышленном масштабе; а также сульфокатиониты на основе сверхсшитого полистирола (Стиросорб), различающиеся условиями синтеза, а именно, количеством катализатора (от 0,25 до 3 моль катализатора БпСЦ на 1 моль сшивающего агента - монохлордиметилового эфира). Сорбенты Стиросорб синтезированы группой В.А.Даванкова и М.П.Цюрулы в ИНЭОС РАН.

В работе был использован модифицированный метод Лоури для определения концентрации белка; метод определения концентрации углеводов по реакции с фенолом и концентрированной серной кислотой.

Определение каталитической активности РНК-азы проводили по методу Анфинсена, основанному на спектрофотометрическом определении кислоторастворимых веществ при длине волны 260 нм, освобождаемых РНК-азой в результате гидролиза РНК.

Активность ДНК-азы определяли методом Кунитца, в основе которого лежит спектрофотометрическое определение продуктов гидролиза ДНК

при длине волны 260 нм, образующихся при воздействии фермента на субстрат.

Определение протеолитической активности трипсина и химотрипсина проводили по модифицированному методу Кунитца.

Колоночную хроматографию, а также гельхроматографический анализ на сефадексе фирмы «Sigma» G-75 проводили с использованием оборудования FPLC System фирмы Pharmacia LKB (Швеция) с автоматической регистрацией оптической плотности растворов на выходе из колонки при длине волны 254 нм.

Результаты и их обсуждение.

1. Изучение равновесных и кинетических закономерностей сорбции ферментов на различных хроматографических носителях.

Для хроматографического выделения и очистки гидролитических ферментов из экстракта поджелудочной железы был исследован ряд известных макропористых неионогенных (Полисорб и СКН) и ионогенных (сульфокатионит КУ-23) сорбентов с модифицированной и немодифицированной поверхностью. Модификация проводилась путем обработки сорбентов ПАВ катионного типа - катамином.

Зависимости емкости сорбции РНК-азы от рН равновесного раствора на различных сорбентах представлены на рис.1 и рис.2. Как видно из рис.1 (кривая 1 и 2), на молекулярных сорбентах Полисорб и СКН не наблюдается изменения емкости сорбции от рН равновесного раствора из-за отсутствия функциональных групп, способных к ионизации. Вид зависимостей существенно изменяется при использовании модифицированных сорбентов Полисорб и СКН (рис.2, кривая 1 и 2). Емкость сорбции РНК-азы уменьшается в кислой области значений рН (при pH<pJ) и возрастает в щелочной области рН (при pH>pJ), что обусловлено возникновением электростатических взаимодействий молекул белка с положительно заряженными группировками катамина.

Изменение вида зависимости емкости сорбции от рН наблюдается также при сорбции фермента на модифицированном КУ-23 (рис.2, кривая 3), так как сульфокатионит проявляет дополнительно и анионообменные свойства за счет введенного в полимерную матрицу модификатора. Как видно, равновесная емкость сорбции РНК-азы на модифицированном КУ-23 практически равна нулю в нейтральной области рН, что делает возможным проведение процесса десорбции в более мягких условиях (рН=7-7,5) по сравнению с немодифицированным КУ-23 (рН>9,5).

2 4 6 8 10

4 6 8 10

Рис.1. Зависимость емкости сорбции РНК-азы от рН равновесного раствора на сорбентах: 1) Полисорб; 2) СКН; 3) КУ-23; 4) Стиросорб.

Рис.2. Зависимость емкости сорбции РНК-азы от рН равновесного раствора на сорбентах с модифицированной поверхностью: 1) Полисорб; 2) СКН; 3) КУ-23.

Как видно из рис.2, в кислой области рН емкость сорбции фермента минимальна на молекулярных сорбентах с модифицированной поверхностью (кривые 1 и 2), и максимальна — на модифицированном сульфокатионите КУ-23 (кривая 3). Поскольку рН заводского экстракта поджелудочной железы < 2, то возможно эффективное использование сорбентов с модифицированной поверхностью для хроматографического выделения ферментов непосредственно из производственного экстракта. При этом модифицированные молекулярные сорбенты Полисорб и СКН могут быть использованы для сорбции балластных примесей из экстракта. В этом случае хроматографическая очистка осуществляется в простом фронтальном процессе при высоких скоростях подвижной фазы. Модифицированный КУ-23 можно использовать для селективной сорбции и десорбции ферментов.

Таким образом, показана перспективность использования сорбционных структур с модифицированной поверхностью для первичного выделения гидролитических ферментов из экстракта поджелудочной железы.

Кроме вышеуказанных сорбентов, были также изучены закономерности взаимодействия ферментов с сорбентами нового типа на основе сверхсшитого полистирола (Стиросорб), которые до настоящего времени не применялись для сорбции крупных органических молекул, особенно таких лабильных структур, как белки и ферменты.

Как видно из рис.1 (кривая 4), емкость сорбции РНК-азы на Стиросорбе превышает значения емкостей сорбции ферментов на изученных сорбентах в 2-3 раза в широком интервале значений рН, что делает его перспективным для тонкой хроматографической очистки ферментов на заключительных стадиях получения.

В работах В.А. Даванкова и М.П. Цюрупы было показано, что сорбента на основе сверхсшитого полистирола значительно отличаются между собой по параметрам пористой структуры, на которую оказывают влияние как степень сшивки, так и условия синтеза сорбентов, в частности, количество вводимого катализатора. Поэтому, теоретический и практический интерес представляло изучение равновесия и кинетики сорбции ферментов на различных образцах Стиросорбов с целью выявления особенностей влияния пористой структуры на процесс сорбции белков, а также для выбора оптимального хроматографического носителя.

Рис.3. Изотермы сорбции РНК-азы на различных Стиросорбах при рН=6 и Т=295К: 1)Стиросорб 0,25; 2)Стиросорб 0,5; 3)Стиросорб 1; 4)Стиросорб 2; 5)Стиросорб 3.

Из представленных на рис.3 изотерм видно, что при сорбции РНК-азы на Стиросорбах, полученных в присутствии небольшого количества катализатора (0,25 и 0,5 моль) и обладающих относительно невысокой удельной поверхностью, наблюдается образование максимума на изотермах, что можно объяснить образованием ассоциатов молекул фермента при С > 1 мг/мл, вследствие чего затрудняется их проникновение внутрь зерен сорбентов. При сорбции фермента на Стиросорбах, полученных в присутствии 1-3 моль катализатора и обладающих большей пористостью, наблюдаются обычные кривые с насыщением, при этом максимальная емкость сорбции значительно возрастает.

По полученным изотермам были рассчитаны коэффициенты распределения панкреатических ферментов (табл. 1).

Таблица 1

Коэффициенты распределения панкреатических ферментов на сверхсшитых изопористых сорбентах Стиросорб

Сорбент Коэффициент распределения Ы

РНК-аза ДНК-аза | Трипсин

Стиросорб 0,25 33 сорбции нет

Стиросорб 0,5 56 84 89

Стиросорб 1 128 165 175

Стиросорб 2 125 158 164

Стиросорб 3 122 147 157

Анализ представленных данных показывает, что наилучшие равновесные характеристики наблюдаются при сорбции ферментов на Сгиросорбах, синтезированных в присутствии от 1 до 3 моль катализатора.

Кинетические кривые сорбции РНК-азы на Стиросорбах представлены на рис.4. Тип кинетики устанавливали анализом кинетической кривой в координатах Бойда Б от "Л, где Б - степень достижения равновесия за время I, сек. Эффективные коэффициенты диффузии рассчитывали по модели "оболочка-ядро", учитывающей конечное неравномерное распределение сорбтив-сорбат (табл.2).

Рис.4. Кинетические кривые сорбции РНК-азы на разлииых Стиросорбах: 1)Стиросорб 0,25; 2)Стиросорб 0,5; 3)Стиросорб 1; 4)Стиросорб 2; 5)Стиросорб 3.

Как видно из рис.4, кинетические кривые сорбции фермента на Стиросорбах 0,25 и 0,5 имеют два линейных участка, что предполагает наличие двух типов внутренней диффузии: сравнительно быстрой с образованием высокоемкостного периферического слоя и относительно медленной диффузии через этот слой вглубь зерен сорбента. Анализ кинетических параметров сорбции ферментов на Стиросорбах 0,25 и 0,5 также показывает, что эффективные коэффициенты диффузии, рассчитанные для двух участков кривых (табл.2), отличаются приблизительно на порядок.

Увеличение количества катализатора (до 1-3 моль) существенно улучшает кинетические характеристики сорбентов: процесс диффузии значительно ускоряется, влияние поверхностного слоя снижается.

Таблица 2

Кинетические параметры сорбции ферментов на Стиросорбах

Сорбент Коэффициент диффузии Оэф, ь.?/с

РНК-аза ДНК-аза | Трипсин

Стиросорб 0,25 5зф1 1,0-10"12 сорбции нет

ЕЬф2 5,3-Ю"14

Пзф 5,0.10 й

Стиросорб 0,5 Боф1 3,3-Ю"12 2,7-10"12 2,4-Ю'12

Т>эф2 1,0-10"13 ^0-10-13 1,0-10"13

1Ъф 9,8-10'14 9,8-Ю-14 9,810'14

Стиросорб 1 3,8-10'13 15,7-10'13 13,6-10'13

Стиросорб 2 3,5-10"13 13,0-Ю"13 12,0-Ю'13

Стиросорб 3 3,8-10"13 13,0-Ю"13 12,0-10"13

На основании проведенных исследований показано, что наилучшими сорбционными характеристиками обладают Стиросорбы с развитой внутренней поверхностью, полученные в присутствии 1-3 моль катализатора. Для дальнейших исследований и разработки хроматографического способа очистки был выбран Стиросорб 1.

Зависимости емкости сорбции панкреатических ферментов от рН равновесного раствора на Стиросорбе 1 представлены на рис.5, из которого видно, что, несмотря на различия в изоточках белков, кривые идентичны: емкость сорбции достигает максимального значения в области рН от 2 до 4 и не зависит от рН в широком интервале значений (~ рН от 4 - 4,5 до 10). Поскольку сорбенты на основе сверхсшитого полистирола имеют большой гидрофобный радикал, то очевидно, что гидрофобные взаимодействия могут вносить значительный вклад в общую энергию взаимодействия молекулы белка с матрицей сорбента.

Рис.5. Зависимость емкости сорбции РНК-азы (1), ДНК-азы (2) и трипсина (3) от рН равновесного раствора на Стиросорбе 1.

С целью выяснения механизма сорбции ферментов на сверхсшитом сорбенте были изучены изотермы сорбции в области значений рН, соответствующих максимальной емкости сорбции ферментов (рН=6-7), при различных температурах. Было показано, что изменение температуры оказывает существенное влияние на механизм сорбции. Изотермы сорбции ферментов при варьировании температур наиболее различаются для ДНК-азы (рис.6), что по-видимому, может быть связано с большей относительной гидрофобностью молекулы фермента. О различном механизме протекания процесса свидетельствует также вид изотерм: кооперативная изотерма (при 278К), изотермы Ленгмюра (при 295К и 308К).

Для определения термодинамических функций взаимодействия панкреатических ферментов с сорбентом на основе сверхсшитого полистирола использовали уравнение для энергии Гиббса и уравнение Гиббса-Гельмгольца. Термодинамическую константу сорбции К рассчитывали по методу графического интегрирования с использованием уравнения Боннера-Аргерзингера (табл.3).

Анализ экспериментальных данных по температурным зависимостям сорбции ферментов, а также термодинамических функций свидетельствует об эндотермичности процесса сорбции. Как видно, термодинамическая константа сорбции возрастает с увеличением температуры, энтальпийный фактор не изменяется, а изменение

свободной энергии Гиббса происходит за счет увеличения энтропийного фактора с ростом температуры.

Сравн, мг/мл

Рие.б. Изотермы сорбции ДНК-азы на Стиросорбе 1 при рН=6 в зависимости от температуры: 1) 278 К; 2) 295 К; 3) 308 К.

Таблица 3

Термодинамические функции сорбции панкреатических ферментов макросетчатым изопористым сорбентом Стиросорб 1

Фермент Температура, Термодинамическая АО, АН, тдв,

К константа сорбции К кДж/моль кДж/моль кДж/моль

278 398 -13,82 0 13,82

РНК-аза 295 402 -14,70 0 14,70

308 409 -15,39 0 15,39

278 794 -15,41 37,94 53,35

ДНК-аза 295 2512 -19,17 37,94 57,11

308 3981 -21,19 37,94 59,13

278 1259 -17,23 26,04 43,27

Трипсин 295 2818 -20,33 26,04 46,37

308 3981 -22,16 26,04 48,20

Увеличение энтропии системы, а также возрастание избирательности сорбции с ростом температуры обусловлено гидрофобным взаимодействием молекул белка с матрицей полимера. Это обстоятельство является важным фактором при выборе элюента, так как в данном случае недостаточно только сдвига рН, а требуется введение компонента, разрушающего гидрофобные взаимодействия.

Известно, что избирательность гидрофобной сорбции существенно снижается в присутствии органического растворителя. На рис.7 представлены зависимости равновесной сорбционной емкости РНК-азы от концентрации органического растворителя (этанола) в растворе, которые показывают, что емкость сорбции значительно снижается при увеличении содержания органического растворителя в растворе. Таким образом, увеличивая концентрацию спирта в элюенте, можно добиться обратимой десорбции фермента с носителя.

Рис.7. Зависимость равновесной емкости сорбции РНК-азы от концентрации этанола в растворе: 1 - при рН=7; 2 - при рН=2.

Однако, при подборе оптимальной концентрации органического растворителя, необходимо учитывать растворимость ферментов в водно-органических средах, а также влияние органического растворителя на каталитическую активность.

2. Изучение динамических процессов сорбции ферментов.

Эффективность динамического процесса сорбции связана с подбором таких условий, которые обеспечивают максимальное разделение целевых и примесных компонентов. Одним из параметров, определяющих эффективность работы хроматографической колонки, является критерий регулярности X, предложенный в теории неравновесной динамики сорбции, который объединяет равновесные, кинетические и гидродинамические параметры сорбции:

Л = 12.(1-®>З^-Но ,

где б - порозность слоя сорбента; К(1 - коэффициент распределения;

Бэф - коэффициент диффузии,

wp - рабочая скорость протекания раствора, м/с;

- средний диаметр зерна сорбента, м; Но - высота слоя сорбента, м.

Для достижения максимального разделения веществ на колонке необходимо подобрать оптимальные условия проведения динамического процесса: скорость пропускания раствора, высоту насыпного слоя сорбента и диаметр колонки. Анализ величин, входящих в уравнение для X показывает, что в заданных условиях (при постоянных габаритах колонки Б, Н; параметрах сорбции Кс1, Взф и диаметре частиц сорбента с!ч)

единственным параметром, сильно влияющим на величину X, является скорость проведения процесса, которая в экспериментальных условиях может различаться на несколько порядков. Соответственно, возможно изменение режима от нерегулярного (А.«0.35) до регулярного, близкого к равновесному (Х»0.35), который считается наиболее благоприятным для хроматографического процесса. Однако, при сорбции медленнодиффундирующих лабильных биологически активных веществ, таких как белки и ферменты, экспериментально было трудно добиться регулярности режима, поэтому, желательно провести эффективное разделение в неравновесных условиях.

В связи с этим, нами был проведен теоретический анализ, позволяющий прогнозировать оптимальную скорость

хроматографического процесса в нерегулярном режиме, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода.

Используя ранее полученную зависимость относительного

удерживаемого объема V от X для внутридиффузионной кинетики сорбции (Елькин Г.Э.,1986 г.), а также уравнение для критериального параметра А, была получена зависимость, устанавливающая взаимосвязь между величиной разности удерживаемых объемов (ДУ)^) и равновесно-кинетическими параметрами сорбции:

а — 1 7 о Iг Мо

где о — и,/.---V0 • —— . постоянная величина для заданной колонки;

¿о 4

Кс1, Кй2 - коэффициенты распределения для 1-го и 2-го компонентов;

Д, Д, - эффективные коэффициенты диффузии дня 1-го и 2-го компонентов, м2/с.

Таким образом, для определенной сорбционной системы при заданных условиях (параметры колонки Ко, Но и диаметр частиц сорбента

£/,) эффективность разделения будет определяться соотношениями кинетических (Д,Д) и равновесных Ш;) параметров для пары разделяемых компонентов, то есть выражением (А*2,/, • Д -К1^ ■ Д).

Соответственно, в зависимости от соотношения между этими

параметрами, функция 2 = /(—) будет иметь различный вид. На рис.8

%

представлена теоретическая зависимость разности удерживаемых объемов (лУи) от приведенной скорости ю, которая определяется как:

где у>>ег1 - скорость сорбции компонентов в равновесных условиях.

Рис.8 Зависимость разности удерживаемых объемов от приведенной скорости при различных соотношениях между равновесно-кинетическими параметрами:

Д , ^ К\- Д Д

Как видно из рис.8, для пары компонентов, различающихся только равновесными параметрами, степень разделения веществ будет возрастать с уменьшением скорости сорбционного процесса при приближении к регулярному режиму (кривая 1); экстремума и инверсии порядка выхода компонентов не наблюдается, так как первым из колонки всегда будет выходить компонент с меньшим коэффициентом распределения.

В случаях, когда компоненты различаются и равновесными, и кинетическими параметрами сорбции, возможна как оптимизация разделения компонентов (кривые 2 и 3), так и инверсия порядка выхода

(кривая 2), которая была продемонстрирована экспериментально в работах Глазовой Н.В. (1995,1996 гг.).

В данном исследовании при изучении процесса сорбции РНК-азы и ДНК-азы на сульфокатионите КУ-23 и Стиросорбах было получено экспериментальное подтверждение теоретических кривых 1 и 3 (рис.8).

С этой целью были рассчитаны соотношения между равновесными (Кс!1 Кс12) и кинетическими (Д,Д) параметрами сорбции ферментов. Было показано, что при сорбции РНК-азы и ДНК-азы на Стиросорбе 0,5 выполняются неравенства, соответствующие кривой 1 (рис.8). То есть в данном случае максимального разделения компонентов можно достичь только в равновесных условиях, что требует низких скоростей сорбционного процесса. В случае сорбции ферментов на сульфокатионите КУ-23 и Стиросорбе 1 выполняются неравенства, соответствующие кривой 3 (рис.8), что говорит о возможности разделения компонентов в нерегулярном режиме. Экспериментальные выходные кривые сорбции РНК-азы и ДНК-азы представлены на рис.9.

Рис..9. Выходные кривые сорбции ДНК-азы (1) и РНК-азы (2) из модельного двухкомпоненгного раствора на Стиросорбе 1 при различных скоростях пропускания раствора: а) 0,94' 10"4 м/с; б) 0,18' 10"3 м/с; в) 0,4' 10"3 м/с.

Из полученных выходных кривых были определены значения удерживаемых объемов VI, разность удерживаемых объемов ¿V, а также рассчитывался критериальный параметр X (табл. 4).

В соответствии с полученными экспериментальными данными рис.9 и табл.4 была построена зависимость лУи2 = /(«), которая имеет вид кривой с максимумом (рис.10), что соответствует теоретической кривой 3 (рис.8). За величину принимали значение скорости при режиме, близком к равновесному.

Таблица 4

Значения критерия регулярности и удерживаемых объемов при различных скоростях сорбции

Фермент \¥1=0,94' Ю-4 м/с Ш2=0Д8' 10"' м/с \Уз=0,4' 10"3 м/с

V;, см1 1 X V), см3 | X VI, см' 1 X

Со рбция на сульфокатионите КУ-23

РНК-аза 3,8 0,42 4,7 0,17 1,8 0,07

ДНК-аза 3,0 0,13 1,5 0,02 1Д 0,02

Разность удерживаемых объемов ЛУу см3 0,8 3,2 0,7

Сорбция на Стиросорбе 1

РНК-аза 3,2 0,11 1,6 0,05 1,0 0,01

ДНК-аза 3,8 0,31 4,4 0,14 1,7 0,04

Разность удерживаемых объемов А V, см3 0,6 2,8 0,7

ДУи

Рис, 10. Зависимость величины разности удерживаемых объемов от приведенной скорости в процессе сорбции РНК-азы и ДНК-азы на Стиросорбе 1.

Анализ рассчитанных параметров, а также полученных теоретически и экспериментально зависимостей показывает, что для данной двухкомпонентной системы при переходе от нерегулярного режима к регулярному существует оптимальная область скоростей, при которой возможно достичь максимального разделения ферментов. С практической точки зрения, процесс сорбционного разделения ДНК-азы и РНК-азы может быть использован при разработке хроматографического метода очистки РНК-азы на Стиросорбе 1, в результате которого можно получить гомогенный препарат РНК-азы, не содержащий примеси ДНК-азы.

3. Исследование процессов десорбции ферментов.

Динамические процессы десорбции ферментов были исследованы как из модельных растворов, так и из производственных высолов, предоставленных цехом ферментных препаратов ПМП ОАО «Самсон».

Выбор условий элюции осуществляли на основании результатов исследования равновесия и кинетики сорбции ферментов. Было показано, что при увеличении содержания органического растворителя (этанола) в элюирующем растворе, возможно добиться полной десорбции фермента с носителя. Однако, при элюции ДНК-азы и трипсина концентрация этанола не должна превышать 50% из-за возможной денатурации и осаждения белковых молекул, а РНК-аза в этих условиях не осаждается. Поэтому, десорбцию проводили элюирующей системой, содержащей 0,1-0,5н HCl, pH = 2 - 3, при различных концентрациях этанола: от 10 до 50%. Выходные кривые десорбции приведены на рис.11,12.

6 8 10 12 14

О 2 4 6 8 10 12 14

Рис. 11. Выходные кривые десорбции ДНК-азы (а) и трипсина (б) на Стиросорбе 1 при различных концентрациях этанола в элюенте: 1)20%; 2)30%; 3)40%; 4)50%.

Рис. 12. Выходные кривые десорбции РНК-азы на Стиросорбе 1 при различных концентрациях этанола в элюенте: 1)10%; 2)20%, 3)30%; 4)40%; 5)50%.

Как видно из рис.11,12, при низких концентрациях этанола в элюенте наблюдается размывание передней и задней границ зоны десорбируемого вещества. Постепенное увеличение концентрации спирта

до 50% значительно обостряет границы хроматографических зон, однако при элюции ДНК-азы и трипсина такая концентрация органического растворителя является недостаточной для полной десорбции (табл. 5). В отличие от них, РНК-аза практически полностью десорбнруется при содержании этанола в элюенте > 30%. Кроме того, достигается значительное концентрирование фермента в элюате.

Таблица 5

Выход ферментов на стадии десорбции при различной концентрации

этанола в элюенте

Концентрация этанола, % ДНК-аза трипсин РНК-аза

10% 2 1 57

20% 14 10 71

30% 19 17 94

40% 32 25 97

50% 46 35 99

На основании полученных данных можно сделать вывод о целесообразности использования сверхсшитого сорбента Стиросорб 1 для хроматографической очистки РНК-азы на заключительных стадиях технологического процесса.

4. Масштабирование процесса хроматографической очистки РНК-азы.

Для масштабирования сорбционного процесса использовали критериальный параметр X. Линейную скорость хроматографического процесса, из-за ее значительного влияния на кинетико-динамические параметры, оставляли постоянной, поэтому основными изменяемыми параметрами, определяющими величину критерия X, являлись размеры колонны.

Рассчитаны характеристики колонки, использование которой позволяет за один хроматографический цикл очищать 1 кг производственного высола РНК-азы. Параметры масштабирования сорбционного процесса, а также геометрические размеры колонны представлены в таблице 6.

Таблица 6

Параметры масштабирования сорбционной очистки РНК-азы

Диаметр колонны О, м Высота колонны Н, м Объем раствора V, м Коэффициент распределения Кб Коэффициент диффузии Б, м2/с Скорость ш, м/с X

0,006 0,035 0,01-Ю"3 128 3,8-10"13 2Л0а 0,38

0,06 0,215 2,5-10"3 1,5

0,12 0,42 16-Ю"3 2,9

В результате проведенных исследований был предложен хроматографический способ очистки РНК-азы из производственного высола фермента, представленный на рис.13. При существующем способе очистки фермента используются стадии многократного высаливания балластных белков и РНК-азы, осаждение ацетоном и спиртом с последующим обессоливанием; а длительность процесса составляет ~ 150 часов. Использование хроматографического способа очистки РНК-азы позволяет резко сократить время технологического цикла очистки (~ в 5 раз) и увеличить выход целевого вещества.

Тц

30 час

Рис. 13. Схема выделения и очистки РНК-азы с использованием хроматографических методов.

Разработанная схема очистки была апробирована в цехе .ферментных препаратов ПМП АО «Самсон» (Акт апробации от 12.12.98). Сорбцию и десорбцию фермента проводили на опытной колонке с1хН = 6x21,5см при выбранных оптимальных параметрах процесса. Анализ полученной субстанции фермента показал, что удельная активность РНК-азы увеличивается в 1,5 - 2 раза при увеличении выхода фермента с единицы сырья - в 3,7 - 4 раза.

Выводы.

1. Показана возможность эффективного хроматографического выделения и очистки панкреатических ферментов на сорбентах с модифицированной поверхностью непосредственно из производственного экстракта поджелудочной железы: предварительная очистка от балластных примесей может осуществляться во фронтальном процессе на модифицированных молекулярных сорбентах Полисорб и СКН, а селективная сорбция и десорбция - на модифицированном КУ-23.

- Высол РНК-азы (сырец)

^ Растворение и фильтрация

Отфильтрованный раствор РНК-азы

I Сорбция на Стиросорбе1, промывка сорбента с ▼ последующей десорбцией фермента. Элюат

| Осаждение РНК-азы этанолом, отстаивание, отделение I осадка с последующей промывкой и сушкой.

Спиртовой осадок РНК-азы

^ Растворение

- Раствор РНК азы на стерильную фильтрацию и лиофюшзацию

2. Впервые исследованы равновесные и кинетические параметры сорбции панкреатических ферментов сверхсшитыми сорбентами Стиросорб, различающимися условиями синтеза, в частности, количеством катализатора. Показано, что наибольшей емкостью и улучшенными кинетическими характеристиками обладают Стиросорбы, полученные в присутствии 1-3 моль катализатора. Осуществлен выбор оптимального носителя - Стиросорба 1, который предложено использовать для индивидуальной доочистки ферментов на заключительных стадиях.

3. Установлен преобладающий вклад гидрофобных взаимодействий в изменение свободной энергии процесса сорбции гидролитических ферментов сверхсшитыми сорбентами. Это учтено при выборе физико-химических условий элюции с обострением хроматографических зон целевых компонентов. Показано, что оптимальным элюирующим раствором является 30-50% этиловый спирт с рН=2-3.

4. Предложена теоретическая модель, позволяющая в зависимости от соотношений между равновесно-кинетическими параметрами сорбции прогнозировать оптимальную скорость хроматографического процесса, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода из хроматографической колонки. Получено экспериментальное подтверждение модели при разделении РНК-азы и ДНК-азы.

5. Разработан и запатентован новый способ очистки РНК-азы из производственного высола фермента с использованием сверхсшитого сорбента Стиросорб 1, позволяющий повысить удельную активность в 1,5-2 раза, увеличить выход фермента с единицы сырья в 3,7-4 раза при сокращении времени технологического цикла очистки в 5 раз. Проведено масштабирование процесса хроматографической очистки РНК-азы для полупроизводственных условий и рассчитаны оптимальные параметры препаративной колонки.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Разработка сорбционно-хроматографической технологии выделения и очистки гидролитических ферментов.// В реферативном сборнике результатов конкурса грантов среди аспирантов и молодых ученых. -С-Петербург, 1998. -С.46.

2. Кинетическое регулирование селективности сорбции в жидкостной хроматографии низкого давления.// ДАН, 1998. - Т.362, №3. - С. 357360 (соавт. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В.).

3. Хроматографические разделения БАВ в кинетически селективных режимах динамики сорбции.// ЖФХ, 1999. - Т.73, №9. - С. 750-754 (соавт. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В.).

4. Использование хроматографических методов для получения ферментного препарата «Рибонуклеаза».// Тез. Республиканской научно-медицинской конференции молодых ученых. - Самара, 1999.-С. 33 (соавт. Ищенко JI.C., Глазова Н.В.).

5. Высокоэффективная хроматографическая очистка фермента рибонуклеазы для создания модифицированных форм.// Тез. Международной конференции "Фармация в 21 веке: инновации и традиции". - С.-Петербург, 1999. - С.50 (соавт. Глазова Н.В.)

6. Препаративное хроматографическое выделение панкреатической рибонуклеазы на сверхспштых полистирольных сорбентах Стиросорб.// Тез. Всероссийского симпозиума по химии поверхности, адсорбции и хроматографии. - Москва, 1999. - С. 188 (соавт. Писарев O.A., Глазова Н.В.).

7. Изучение равновесия и кинетики сорбции панкреатических ферментов сверхсшитыми полистирольными сорбентами Стиросорб.// Тез. Всероссийского симпозиума по химии поверхности, адсорбции и хроматографии. - Москва, 1999. - С. 189 (соавт. Писарев O.A., Глазова Н.В.).

8. Положительное решение о выдаче патента РФ от 14.01.2000 на "Способ очистки рибонуклеазы" по заявке № 98122253/13, приоритет 07.12.98.

Автор благодарит проф. В.А.Даванкова и М.П.Цюрупу за любезно предоставленные образцы сорбентов Стиросорб.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Царенко, Ольга Викторовна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Ферменты поджелудочной железы. Свойства и применение в медицине.

1.2. Основные физико-химические методы, используемые для выделения и очистки ферментов.

1.3. Хроматографические методы очистки белков.

1.3.1. Полимерные носители для хроматографии.

1.3.2. Виды хроматографических процессов. Ионообменная и щдрофобная хроматография

1.4. Термодинамический и кинетико-динамический анализ сорбционнных процессов. Оптимизация хроматографического разделения БАВ.

2. Экспериментальная часть.а.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Структура и свойства панкреатических ферментов.

2.1.2. Физико-химические характеристики сорбентов.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури.

2.2.2. Метод определения углеводов.

2.2.3. Определение активности ДНК-азы.

2.2.4. Метод определения активности РНК-азы.

2.2.5. Определение протеолитичеекой активности.

2.2.6. Гельхроматографический анализ.

2.3. Методики проведения сорбционных экспериментов.

2.3.1 Исследование сорбции белков в статических условиях (рН -зависимость и изотермические процессы сорбции).

2.3.2. Исследование кинетики сорбции белков.

2.3.3. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях.

2.4. Математические методы обработки результатов.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции панкреатических ферментов на различных хроматографических носителях.

3.1.1. Сорбция панкреатических ферментов на ионогенных и молекулярных сорбентах с модифицированной и немодифицированной поверхностью.

3 .1.2. Сорбция панкреатических ферментов на сверхсшитых полиетирольных сорбентах Стиросорб.

3.2. Исследование динамических процессов сорбции и десорбции.

3.2.1. Теоретический анализ условий оптимизации. Изучение влияния скорости подвижной фазы на процесс сорбции ферментов из многокомпонентной смеси.

3.2.2. Изучение сорбции ферментов из экстракта поджелудочной железы на сорбентах с модифицированной поверхностью.

3.2.3. Изучение сорбции и десорбции ферментов в динамических условиях на сверхсшитых сорбентах Стиросорб.

3.3. Масштабирование хроматографического способа очистки РНК-азы.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы"

Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии. Ферментные препараты широко используются во многих отраслях промышленности: медицинской, микробиологической, парфюмерной, сельскохозяйственной и других. Особое значение в настоящее время приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из животного сырья, которые могут успешно заменить препараты аналогичного действия, производимые химическим и микробиологическим синтезом.

Гидролитические ферменты из поджелудочной железы крупного рогатого скота - рибонуклеаза (РЖ-аза), дезоксирибонуклеаза (ДНК-аза), трипсин и химотрипсин - обладают выраженным противовоспалительным и противоотечным действием и эффективны при лечении гнойно-воспалительных процессов различной локализации и этиологии. Кроме того, нуклеазьг являются природными регуляторами механизма противовирусной защиты, что позволяет рекомендовать их для лечения и профилактики вирусных инфекций. Поэтому, для использования гидролитических ферментов в медицинской практике путем внутримышечного и, в особенности, внутривенного введения степень очистки препаратов должна быть высокой.

Проблема повышения качества препаратов требует создания новых подходов к методам их выделения и очистки. Используемые в настоящее время промышленные методы выделения и очистки гидролитических ферментов недостаточно эффективны. Первичное концентрирование ферментов из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота проводится по ионообменой технологии с использованием сульфокатионита КУ-23, однако дальнейшее получение ферментов проводят путем дробного фракционирования сульфатом аммония с последующей индивидуальной доочисткой каждого из ферментов. При этом используются одностадийные статические физико-химические методы (осаждение, диализ, экстракция, высаливание), которые не обеспечивают высокого выхода целевых продуктов, получения препаратов необходимой степени чистоты, связаны е использованием больших объемов органических растворителей и токсичных веществ (в частности, фенол), а также длительны по времени. 5

Вместе с тем, современное состояние развития препаративной хроматографии биологически активных веществ позволяет успешно решать вышеуказанные проблемы.

Целью работы являлось изучение закономерностей сорбции панкреатических ферментов на молекулярных и ионогенных носителях различной структуры и разработка на их основе хроматографического способа очистки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение равновесных, термодинамических и кинетических закономерностей сорбции ферментов на различных хроматографических носителях и выбор оптимального сорбента для препаративной хроматографии.

2. Теоретическое обоснование условий разделения компонентов смеси; оптимизация хроматогафического процесса по скорости подвижной фазы.

3. Выбор оптимальных физико-химических условий селективной элюции.

4. Масштабирование хроматографического процесса очистки для полупроизводственных условий.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Царенко, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ Показана возможность эффективного хроматографического выделения и очистки панкреатических ферментов на сорбентах с модифицированной поверхностью непосредственно из производственного экстракта поджелудочной железы: предварительная очистка от балластных примесей может осуществляться во фронтальном процессе на модифицированных молекулярных сорбентах Полисорб и СКН, а селективная сорбция и десорбция - на модифицированном КУ-23.

2. Впервые исследованы равновесные и кинетические параметры сорбции панкреатических ферментов сверхспштыми сорбентами Стироеорб, различающимися условиями синтеза, в частности, количеством катализатора. Показано, что наибольшей емкостью и улучшенными кинетическими характеристиками обладают Стиросорбы, полученные в присутствии 1-3 моль катализатора. Осуществлен выбор оптимального носителя - Стиросорба 1, который предложено использовать для индивидуальной доочистки ферментов на заключительных стадиях.

3. Установлен преобладающий вклад гидрофобных взаимодействий в изменение свободной энергии процесса сорбции гидролитических ферментов сверхспштыми сорбентами. Это учтено при выборе физико-химических условий элюции с обострением хроматограф ических зон целевых компонентов. Показано, что оптимальным элюирующим раствором является 30-50% этиловый спирт с рН=2-3.

4. Предложена теоретическая модель, позволяющая в зависимости от соотношений между равновесно-кинетическими параметрами сорбции прогнозировать оптимальную скорость хроматографического процесса, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода из хроматографической колонки. Получено экспериментальное подтверждение модели при разделении РНК-азы и ДНК-азы.

5. Разработан и запатентован новый способ очистки РНК-азы из производственного высола фермента с использованием сверхсшитого

110 сорбента Стнросорб 1, позволяющий повысить удельную активность в 1,5-2 раза, увеличить выход фермента с единицы сырья в 3,7-4 раза при сокращении времени технологического цикла очистки в 5 раз. Проведено масштабирование процесса хроматографической очистки РНК-азы для полупроизводственных условий и рассчитаны оптимальные параметры препаративной колонки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Царенко, Ольга Викторовна, Санкт-Петербург

1. Банникова Т.Е., Варламов В.П., Самсонова О.Л., Рогожин C.B. Биоспецифическая хроматография нуклеаз.// В кн.: Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова Думка, 1985. - С. 51-56.

2. Банникова Г.Е., Варламов В.П., Рогожин C.B. Способ вьщеления и очистки бактериальной эндонуклеазы из Serratia marcescens.//Авторское свидетельство СССР № 1392902. Опубл. 7.05.90.

3. Батурина И. Д., Бердыш ев Г. Д. Дезоксирибонуклеазы из внутренних органов карпа. Выделение и некоторые свойства.// В кн.: Разнокачественность онтогенеза у рыб. - Киев: Наукова Думка, 1980. - С. 114-128.

4. Башуро Г.С., Ляпунов H.A. К вопросу о применении катамина при создании готовых лекарственных средств.// Фармация, 1988. №1. - С.35-38.

5. Безбород ова С.И. Рибонуклеазы и родственные белки, а также ингибиторы рибонуклеаз.// Прикладная биохимия и микробиология, 1991. Т.27, №3. - С. 308-329.

6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ., в 2 томах. М.: Мир, 1989. - Т.2. - 590 с.

7. Белякова Л.Д. Хроматографические и адсорбционные свойства сверхсшитых полистирольных адсорбентов «Стиросорб».// В сб.: Всероссийский симпозиум по теории и практике хроматографии и электрофореза. Самара: Самарский Университет, 1999.- С. 151-162.

8. Белякова Л.Д., Василевская О.В., Цюрупа М.П., Даванков В.А.

9. Адсорбционные и хроматографические свойства полимерных сорбентов типа «Стиросорб».// ЖФХ, 1995. Т.69, №4. - С. 696-700.

10. Белякова Л.Д., Василевская Ö.B., Цюрупа М.П., Даванков В.А.

11. Адсорбционные и хроматографические свойства микросферических полимерных сорбентов типа «Стиросорб».// ЖФХ, 1996. Т.70, №8. - С. 1476-1481.

12. Березин A.B., Клячко H.K., Левашов A.B., Мартинек К., МожаевВ.В,, Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987. - 160 с.

13. Быченкова О.В., Ищенко Л.С., Глазова Н.В. Использование хроматографических методов для получения ферментного препарата «Рибонуклеаза».// Тез.Республиканской научной конференции молодых ученых медицинских вузов России. Самара, 1999,- С. 33.

14. Варламов В.П. Хроматографическое выделение гидролаз (нуклеаз, фосфатаз, хитиназ) и их использование в биотехнологических процессах.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени докт. хим. наук. Москва, 1994. -51с.

15. Глазова Н.В., Ефимова Т.Б., Игонина Л.М., Дмитренко Л.В.

16. Использование хроматографических методов для оценки эффективности очистки ферментных препаратов.// Тез. докладов Всесоюзной научной конференции "Технология ключевых соединений, используемых в синтезе БАВ*. Пенза, 1991,- С. 105-112.

17. Глазова Н.В. Сорбционное разделение смесей Б AB в квазиравновесных и неравновесных условиях.// Тезисы докладов Всерос. симпозиума «Биосепарация-96». СПб, 1996.- С. 11.

18. Глазова Н.В., Елькин Г.Э., Рудометова Н.В. Оптимизация ионообменных процессов с использованием ПЭВМ. СПХФИ, 1993. - 19 с.

19. Глухов Б.М. Об участии РНК-азы в механизме противовирусной защиты организма при клещевом энцефалите.// Журн. невропатологии и психиатрии, 1970. Т. 70, вып. 1. - С. 45-48.

20. Горчаков В. Д., Сергиеико В.И., Владимиров В.Г. Селективные гемосорбенты. М.: Медицина, 1989. - 224 с.

21. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

22. Гуторов А.Н., Лесников Е.П., Салганик Р.И., Кривошеее Б.Н. ДНК-аза в терапии простого рецидивирующего герпеса.// Вестник дерматологии и венерологии, 1976. -№11. С. 75-78.

23. Дарбре А. Практическая химия бежа.// Пер. с англ.- М. : Мир, 1989. 623 с.

24. Демин A.A., Салганик Р.И. Терапевтическая активность ДНК-азы при инфекционном мононуклеозе.// Сов. Медицина, 1983. №8. - С. 91-92.

25. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты,- М.: Мир, 1992. 1117 с.

26. Елькин Г.Э. Концепция регулярности режима сорбции в теории и практике ионного обмена органических ионов.// Межвузовский сборник: Ионный обмен и ионометрия, 1990. Вып. 7. - С. 3-15.

27. Елькин Г.Э. Теоретические основы выбора оптимальных режимов сорбции и хроматографии БАВ.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биосепарация-96». -СПб, 1996, СЛ.

28. Елькин Г.Э., Глазова Н.В., Курдявка Л.В. Модификация свойств поверхности макропористых сополимеров путем адсорбции поверхностно-активных веществ.// ЖФХД994.-Т.68, №10,- С. 1782-1783.

29. Елькин Г.Э., Бабенко Г.А., Селезнева A.A., Самсонов Г.В. Кинетика сорбции белков ионообменными смолами. Сорбция химотрипсиногенакарбоксильными катионитами.// Коллоидный Журнал, 1972. Т.34, №2. -€.208-212.

30. Заинкова Н.В. Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источников.// Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб: СПХФА, 1998. - 140с.

31. Игонина Л.М. Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота // Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб: СПХФА, 1996.

32. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Дмитренко Л.В., Заинкова Н.В. Применение сорбционно-хроматографических методов очистки ферментного препарата "Лидаза".// В кн.: Химия и технология лекарственных веществ.-СП6.-1994.-с.14.

33. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Заинкова Н.В. Использование сорбентов для удаления примесей из инъекционного препарата "Лидаза"// Тез.докладов Международного симпозиума "Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма. "-Новосибирск,-1995.

34. Игонина Л.М., Д.Коррадини, Н.В.Глазова, Г.Э.Елькнн, Д.Канарса. Влияние ионов двухвалентных металлов на порядок следования белков при ионообменной ВЭЖХ. // Журнал прикладной химии, 1998. Т. 78, №7. -С. 1094—1098.

35. Иониты. Черкассы: НПО "Пластмассы", 1980,- 32 с.

36. Каталог хроматографичееких материалов для научных исследований.// РАН, Главное Управление материально-технического обеспечения. М.: Наука, 1992.-63 с.

37. Кадолина И.Г. Разработка методов выделения и очистки бактериальных эндотоксинов.// Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. -СПб.: СПХФИ. -1995.

38. Коваленко Г.А. Влияние панкреатических рибонуклеаз на клетки и организм животных: клеточный механизм противовирусного действия.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. Казань, 1986. -19 с.

39. Кокотов Ю.А., Золотарев П.П., Елькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена. Л: Химия, 1986. - 280 с.

40. Колбановская Е.Ю. Структурно-функциональный анализ рибонуклеазы А и родственных белков.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. хим. наук. Москва, 1996. - 22 с.

41. Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В. Хроматография белков на макропористых кремнеземах. Л. .Химия, 1986. - 192 с.

42. Колодзейская М.В., Пилявская A.C. Пептидазы. Киев: Наукова Думка, 1982. - 176 с.

43. Кривошеев Б.Н., Мотовилова H.H., Салганик Р.И., Савиных Ж.М., Стадиик К.И. ДНК-аза в комплексной терапии герпетиформной экземы Капоши.// Вестник дерматологии и венерологии, 1987. №1. - С. 29-33.

44. Лапик A.C., Губенко U.C., Корочкин Л.И., Салганик Р.й.

45. Фармакологическая активность и токсичность нуклеаз.// Фармакология и токсикология, 1977. - Т.ЗЗ, №2. - С. 210-212.

46. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Типы режимов.// ЖФХ, 1995. Т.69, №6. - С. 1080-1084.

47. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Обращение порядка элюирования компонентов.// ЖФХ, 1997. Т.71, №6. - С. Ш7-1120.

48. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И., Паэгле Б.Я., Знаменская Л.В., Михлин

49. Э.Д. Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы.// Авторское свидетельство СССР №1010125. Опубл. 7.04.83.

50. Лукьянова Ö.H., Писарев O.A., Муравьева Т.Д. и др. Десорбция противоопухолевого антибиотика даунорубицина с гелевых и гетероеетчатых карбоксильных катионитов.// ЖПХ, 1991. Т.64, №6. - С. 1361-1363.

51. Лурье A.A. Хроматографические материалы /справочник/. -М.: Химия. 1978. - 440 с.

52. Максимов В.И. Стабильность ферментов при очистке.// В кн.: Кристаллические ферменты: методы получения, их характеристика и использование. Вильнюс, 1975. - С.22-25.

53. Малиновекий H.H., Цацаниди К.Н., Пугаев A.B. и др. Применение панкреатической РНК-азы в комплексе консервативной терапии острого панкреатита.//Хирургия, 1982. Коб.-С. 8-17.

54. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. - 404 с.

55. Мчедлишвшш Б.В., Коли ко в В.М., Черкасов А.Н. Трековые мембраны в процессах тонкой очистки.// Тезисы докладов Всерос. симпозиума «Биосепарация-96». С-Петербург, 1996. - С. 13.

56. Островский Д.Й., Дмитренко Л.В., Самсонов Г.В. Взаимодействие инсулина с полиэлектролитами макропористой структуры. // Изв. АН СССР. Сер.хим., 1973. №5. - С. 1145-1146.

57. Павлюченко H.H. Сравнительная биохимическая и физиологическая характеристика ферментных препаратов поджелудочной железы.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук. -Ростов-на-Дону, 1987. 16 с.

58. Паскевич Й.Ф., Чиеханова М.А., Лиходед B.C. Исследование РНК-азы, связанной с гистонами печени и селезенки крыс.// Биохимия, 1972. - Т.37, №3. - С. 585-589.

59. Патент JP № 460031476. Способ выделения физиологически активных веществ из экстракта поджелудочной железы млекопитающих.// Amano pharm К.К. Опубл. 22.07.85.

60. Патент US № 4973554. Аффинный способ очистки и стабилизации трипсина.-Опубл. 27.11.90.

61. Пирогова О.В., Хохлова Т.Д., Петрова В.Н. Применение трековых мембран для разделения белковых смесей.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биоеепарация-96». С-Петербург, 1996. - С. 15.

62. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В., Быченкова О.В. Кинетическое регулирование селективности сорбции в жидкостной хроматографии низкого давления.// ДАН, 1998. Т.362, №3. - С. 357-360.

63. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В., Быченкова О.В. Хроматографические разделения БАВ в кинетически селективных режимах динамики сорбции.// ЖФХ, 1999. Т.73, №9. - С. 750-754.

64. Писарев O.A., Самсонов Г.В., Богданова Л.П., Муравьева Т.Д. Ионно-гидрофобное взаимодействие эремомицина с сетчатыми структурно сегрегированными биосорбентами.// ЖПХ, 1993. Т.66, №12. - С. 2825-2828.

65. Полянский Н.Г., Горбунов Г.В., Полянская Н.Л. Методы исследования ионитов. М.: Химия, 1976. - 208 с.

66. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Йозеп A.A. Исследование полимерных комплексов, включающих ферменты и растворимые полимеры.// ЖПХ, 1997. Т.70, №6. - С. 1040-1043.

67. Рудометова Н.В. Разработка сорбционного хроматографического выделения панкреатических ферментов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. - СПб.: СПбТИ, 1994.

68. Салганик Р.И., Тухачев A.A., Баталина Т.А. Противовирусное действие дезокеирибонуклеазы и рибонуклеазы.// В кн.: Ингибиторы вирусной активности. Рига: Зинатне, 1972. - С. 147-152.

69. Самсонов Г. В., Тростянекая Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен. Сорбция органических веществ. Л.: Наука, 1969. - 333 с.

70. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сороционно-хромато графические методы физико-химической биотехнологии. Л.: Наука, 1986.

71. Самсонов Г.В., Писарев O.A. Новые принципы ионообменной препаративной хроматографии и их применение для выделения, очистки и суперочистки антибиотиков.// Прикладная химия и микробиология, 1992. -Т.28,Ш.-С. 5-18.

72. Селезнева A.A., Бабенко Г.А., Елькин Г.Э. и др. Кинетика сорбции ферментов в поверхностном слое карбоксильных катионитов.// Коллоид. Журн, 1974. -Т.36,№3. -С.511-514.

73. Селезнева A.A., Дубинина H.H., Бабенко Г.А., Лукницкая 0.Ф., Самсонов Г.В. Особенности сорбции белков карбоксильным катионитом.// Коллоид. Журн., 1975. Т.37, №6. - С. 1138-1142.

74. Селеменев В.Ф. Обменные процессы и межмолекулярные взаимодействия в системе ионит-вода-аминокислота.// Автореферат диссертации на соискание степени доктора химических наук. Воронеж: В ГУ, 1993. - 49 с.

75. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 224 с.

76. Смирнов H.H., Аронова Е.Б., Беленький Б.Г., Наследов Д.Г. Экспериментальное исследование поведения белков на ионообменной хромато графической мембране.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биосепарация-96». С-Петербург, 1996. - С.22.

77. Стрелке В.В., Плаченов Т.Г., Картель Н.Г. Углеродные адсорбенты. М., Наука, 1983.- 170 с.

78. Таре A.A., Ярве В.Ю., Сийгур Ю.Р., Аавиксар В.А. Способ выделения эндонуклеазы из яда кобры.// Авторское свидетельство СССР № 1203902. Опубл. 30.11.90.

79. Тенникова Т.Б. Полимерные мембранные адсорберы. Высокоэффективная мембранная хроматография белков.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биосепарация-96». С-Петербург, 1996. - С. 13-14.

80. Троицкая В.Б. Электролиты и ферменты поджелудочного сока.// В кн.: Руководство по физиологии. Физиология пищеварения. Л.: Наука, 1974. -С.339-359,

81. Тугунов С.С., Константинов В.Л., Манойлов С.Е., Дмитриева В.А.

82. Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратовферментов трипсина, химотрипеина и РНК-азы из панкреатической железы.// Труды ЛХФИ, 1967. Вып.20. - С.9-18.

83. Федосов Ю.В., Кожемяко В.Б., Рассказов В.А. Способ получения кислой дезоксирибонуклеазы.// Авторское свидетельство СССР № 1100308. Опубл. 30.06.84.

84. Филимонова М.Н., Беиедик М.Дж., Уразов Н.Г., Лещинская И.Б.

85. Полидисперсность нуклеазы Serratia marcescens при оптимальном значении pH.// Прикладная биохимия и микробиология, 1999. Т.35, №1. - С. 20-24.

86. Хмара М Е. Влияние РНК-азы на интерферирующие, интерферогенные и цитопатичеекие свойства некоторых РНК-содержащих вирусов.// Здравоохранение Белоруссии, 1977. №8. - С. 14-16.

87. Цюрупа М.П., Ослонович К). В., Нистратов А.И., Радченко Л.Г., Даванков В.А. Фазовое расслоение в условиях синтеза сверхсшитых полистирольных сеток в среде циклогекеана.// ВМС, 1995. Т.37А, №6. - С.964-968.

88. Цюрупа М.П., Даванков В.А., Кривоносова Л.Г., Селеменев В.Ф., Чикин Г.А. Поглощение окрашенных веществ из ферментационных растворов лизина сверхсшитым сорбентом.// Прикладная биохимия и микробиология, 1985. Т.21, ML - С.72-77.

89. Цюрупа М.П., Панкратов Е.А., Даванков В.А. Влияние среды синтеза на физико-химические свойства макросетчатых изопористых полимеров стирола.// ВМС, 1980. Т.22Б, №10. - С.746-748.

90. Цюрупа М.П. Структура и свойства полимерных сорбентов на основе сверхсшитого полистирола.// Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. ~ Москва, 1988.

91. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. Л.: Химия, 1991.-240 с.

92. Чичкова Н.В., Пейсениекс В.Э., Залите Й.К. Способ получения рибонуклеазы из E.eoli.// Авторское свидетельство СССР № 1495377. Опубл. 23.07.89.

93. Шапот B.C. Нуклеазы. М.: Медицина, 1968. 212 с.

94. Шатаева Л.К., Кузнецова H.H., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. Л.: Наука, 1979. - 229 с.

95. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Р.: Зинанте, 1988. 104 е.

96. Шиманко И.И., Берелавичус В.Ю., Владимиров В.Г. Использование РНК-азы в терапии острого панкреатита.// Сов. медицина, 1981. №1. - С. 50-54.

97. Яскович Г.А., Кошева Е.П., Елькин Г.Э., Воробьева В.Я., Самсонов Г.В. Кинетика сорбции дезоксирибонуклеазы Actinomyces streptomycini из нативного раствора карбоксильным катионитом КМТ.// Хим.-фарм. Журнал, 1974. №10. - С.47-51.

98. Atkinson В., Mavituna F. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook.- England: Macmilan Publishes Ltd., 1983.

99. Aranyl P., Laszlo B. Sorption equilibria between proteins and cation exchangers.// J. Chromatogr., 1974. ¥.89. - P.239-250.

100. Bemtema J.J., Hofsteen J., Jwama M., Morita Т., Ohgi K., Irie M., Sugijama R.H., Schieven G.L. Amino-acid sequence of the nonsecretory ribonuclease.// Biochem., 1988. V.27. - P. 4530-4538.

101. Bell D.J., Hoare M., Dunniil P. Formation of Protein Precipitates and Their Centrifugal Recovery.// Adv. Biochem. Eng./ Ed. Fiechter A. Berlin, N. Y., 1983.- V.26. P. 2.

102. Ben-Naim A. Water aqueous solutions interactions to a molecular theory. N.Y., L.: Plenum Press, 1974. - 474 p.

103. Biotechnoiogical Applications of Proteins and Enzymes./ Ed. by: Zvi Bohak, Nathan Sharon. N. Y., San-Francisco, London: Academic Press, 1977. - 368 p.

104. Blackburn P., Moore S. The Enzymes./ Ed. P.O. Boyer, 1982. V.15. - P. 317433.

105. Brooks C.L. Proteins: A theoretical perspective of dynamics, structure and thermodynamics. N.Y. etc.: Wiley and Sons, 1988. - XIII, 259 p. - Advances in chem. Physics, ¥.71.

106. Bucke C. The biotechnology of enzyme isolation and purification.// In Principles of Biotechnology. Glasgow: Blackie and Son Ltd., 1983. - P. 151-171.

107. Cafaro V., Bracale A., Formiggini F., Notomista E., B'Alessio G., Di Donato A. Protein engineering of ribonucleases.// Biochemie, 1998.—¥.80, №11. P. 905909.

108. Comprehensive biotechnology./ Ed. Cooney C.L., Humphrey R.E. N.Y, L.: Pergamort Press, 1985. - V.2. - 632 p.

109. Corradini D, Filippetti, Corradini C. Salt mediated elution behavior of proteins on a silica-based stationary phase for size exclusion high performance liquid chromatography.// J. Liquid Chromatog., 1993. V. 16. - P.3393-3408.

110. Cramer J.A., Bailey L.C. A reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography method for bovine testicular hyaluronidase.// Anal. Bioehem.,1991. V.196, №1. - P. 183-191.

111. Curling J.M. Methods of plasma protein fractionation. N.Y.: Academic Press, 1980. - 532 p.

112. Davankov V.A., Tsyurupa M.P. Structure and properties of porous hypercrosslinked polystyrene sorbents styrosorb.// Pure and Appl. Chem., 1989. -V.61.-P. 1881-1888.

113. Davankov V.A., Tsyurupa M.P. Structure and properties of hypercrosslinked polystyrene the lsl representative of a new class of polymer networks.// Reactive Polymers, 1990. - V. 13. - P. 27-42.

114. Desifets C.P., Rounds M.A., Regnier F.E. Semipermeable-surface reversed-phase media for high-performance liquid chromatography.// J. Chromatogr., 1991. -Y.544. P.25.

115. Desnuelle P. In the Enzymes.// 2nd Ed. Academic Press, New York, 1960. V.4. -P.93.

116. Engelhardt H. Hochdruck-flussigkeits-chromatographie. Berlin: Springer. -Verlag, 1977.

117. Fritz J.S. et al. Ion chromatography. Heidelberg etc.: Huthig, 1982. - X, 203 p.

118. Glazova N.V., fgonina L.M., Elkiii G.E. Chromatographic purification of enzyme medicines from macromolecular impurities.// Macromolecular Symposia. -Bratislava, 1995.

119. Glazova N.V. Sorption technology protein medicines including of non-equilibrium chromatographic effects. // 10-th International Symp. of Chromatography in Industry.-Bratislava, 1996. P. 173-174.

120. Glukhov V.M., Jerusalimsky A.P., Canter V.M., Salganik R.I. Ribonuclease treatment of tick-born encephalitis.// Arch. Neurol., 1976. - V.33. - P. 598-603.

121. Gomes E., SerzedeHo A., Da SHva R. Purification and physico-chemical properties of a ribonuclease produced by Aspergillus flavipes.// Microbiol., 1998. -V.96,№383. P. 39-50.

122. Gozzinf L., Moiitecucclii P.C. High performance liquid chromatography in protein and peptide chemistry. Berlin, N.Y.: Walter de Gruyter, 1981. - 365 p.

123. Grabender G.C., Giafz C.E. Protein precipitation: analysis of particle size distribution and kinetics.// Chem. Eng. Commun., 1981. V. 12. - P. 203.

124. Hagglund I. Development of new and modified stationary phases in chromatography: Doctoraithesis. Stockholm, 1994. - 102 p.

125. Henschen, K.P. Hupe, F. Loitspeieh, W. Voelten High Performance Liquid Chromatography in Biochemistry, пер. с англ., под ред. JI.B. Березина. М.: Мир, 1988. - 687 с.

126. Janca J. Size exclusion chromatography.// J. of Liquid Chromatogr. V.13, № 9. -P. 1669.

127. Jansen J.C., fled man P. Large scale chromatography of proteins.// Advances in Biochemical Engineering, 1982. V.25. - P. 43-49.

128. Josic D., Reutter W., Molnar I. Practical aspect of modern HPLC. Berlin, N.Y.: Waiter de Gruyter, 1982. - 123 p.

129. Karlstom В., Vincent J., Jochansson В., Bryno C. A simple purification method of squeezed krill for obtaining high levels of hydrolytic enzymes.// Prep.Biochem. -1991. -V.21, т.- P. 237-256.

130. Kato Y. High-performance hydrophobic interaction chromatography of proteins. Advances in chromatography// Eds. Giddings J.C., Grashka E., Brown P.K. New York, Basel: Marcel Dekker Inc., 1987. - V.26. - P.97-115.

131. Khng Hwee Peng, Cimfiffe В., Davies S., Turner N.A., Vulfson E.N. Hie synthesis of sub-micron magnetic particles and their use for preparative purification of proteins.// Biotechnol. and Bioeng., 1998. V.60, №4. - P. 419-424.

132. Kolbanovskaya E.Yu., Satfryanarayana B.K., Wlodaver A., Karpeisky M.Ya. Intramolecular interactions in pancreatic ribonucleases.// Protein Science, 1992. -V.l.-P. 1050- 1060.

133. Melander W., Horvath C. Salts effects on hydrophobic interaction in precipitation and chromatography of proteins.// Arch. Biochem. Biophys., 1977. V.183. -P.200-215.

134. Moore S., Stein W.H. Chemical structure of pancreatic ribonuclease and deoxyribonuclease.// Science, 1973. V. 180, № 4085,- P. 458-464.

135. Morita T., Sanda A., Takizava Y., Ohgi K., Irie M. Distribution of a kidney acid-ribonuelease-like enzyme and the other ribonucleases in bovine organs and body fluids.//Agr. Biol. Chem., 1987. V.51. - P. 2751-2761.

136. Net Kenneth E. Cooperativity in enzyme function: equilibrium and kinetic aspects.// Meth. in Enzymol.,1980. -V.64. -P. 139-192.

137. Norde W., Zouugrana T. Surface-induced changes in the structure and activity of enzymes physically immobilized at solid/liquid interfaces.// Biotechnol. and Appl. Biochem., 1998. V.28, №2. - P. 133-143.

138. Optimization of Chromatographic Selectivity.// Ed. Peter G. Schoenmakers. -Amsterdam etc., 1986.

139. Paul A.B., Cussler E.L. Bioseparations: Downstream processing for biotechnology. N.Y. etc.: Wiley and Sons, 1988. - XVI, 368 p.

140. Petebauer Z., Lukas J., Svec F., Kadal J. Morphology of polymeric sorbents based on glyeidyl methacrylate copolymers.// J. Chromatogr., 1979. V. 171, №1. -P. 101-107.

141. Proteases and antiproteases.// American J. of respiratory and critical care medicine. V. 150, №6. - P.2.

142. Protein Missassemhly.// Ed. by R.Wetzel. San Diego etc.: Academic Press, 1997. - XX, 282 p.

143. Ravindranath B. Principles and practice of chromatography. Chichester: Horwood; N.Y. etc.: Halsted Press, 1989. - 502 p.

144. Recovery and Purification of Byproducts.// Ed. M.-R.Kula, Steven M. Cramer. -N.Y. etc.: Wiley, 1995. P. 301-427, 429-555.

145. Richards F.M., Wichoff H.G. Bovine pancreatic ribonuclease.// The Enzymes/ Ed. Boyer P.D. New York: Academic Press, 1971. - V.4. - P. 647-806.

146. Richards F.M., Wichoff H.G. Atlas of molecular structures in biology. Oxford: Clarendon Press, 1973. - V. 1. - 369 p.

147. Sewell P.A., Clarke B. Chromatographic separations. London: Chichester etc.: Wiley and sons on behalf of ACOL, Thames Polytechnic, 1987. - XX, 333 p.

148. Svec F., Frechet J.M.J. Modified poiy(glycidyl methaciylate-co-ethylene dimethaeiylate) continuous rod columns for preparative scale ion-exchange chromatography of proteins.// J. Chromatogr., 1995. V.702A. - P.89-95.

149. Tanford C. The hydrophobic effect. Formation of micelles and biological membranes. N. Y.: Willey-Interscience, 1973. - 200 p.

150. Tennfkova T.B., Svec F.// J. Chromatogr., 1992. V.590. - P.353.

151. Ultrafiltration, Membranes and Application.// Ed. by A. Cooper. N.Y.: Plenum Press, 1980. -705 p.

152. Wang Q.C., Svec I ., Frechet J.M.J. Rod of macroporous polymers stationary phase as continuous separation medium for reversed phase chromatography.// Anal. Chem., 1993. V.65. - P.2243-2248.

153. Wang Q.C., Svec F., Frechet J.M.J. Reversed-phase chromatography of small molecules and peptides on a continuous rod of macroporous poly(styrene-co-divinylbenzene).// J. Chromatogr., 1994. V.669. - P.230-235.

154. Wfodawer A. In: Biological Macromolecules and Assemblies. V.2: Nucleic Acids and Interactive Proteins./ Ed. A. McPherson, F. Jurnak. N.Y.: Wiley and Sons, 1985.-P. 395-439.

155. Wolf M., Ransberger K. Enzyme-therapy.- New York: Vantage Press, 1972. -232 p.

156. Zegers I., Maes D., Dao-TM M.-H., Poortmans F., Palraer R., Wyns L. Thestructures of Rnase A complexed with 3-CMP and d(CpA): active site conformation and conserved water molecules.// Protein Sci., 1994. V.3. - P. 2322-2339.

157. По данной технологии получена субстанция фермента с удельной активностью 15000-18000 Ед/мг.

158. Показано , что сорбционная технология является перспективной .так как:

159. Уменьшается время технологического цикла очистки производственного высола рибонуклеазы в 5 раз;

160. Сокращаются потери целевого продукта и увеличивеатся съем фермента с единицы сырья в 3.7-4 раза;

161. Увеличивается удельная активность препарата в 2 раза.

162. К.х.н.,доцент СПХФА Глазова Н.В.1. Шенгер А.А.