Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источников

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источников"

Министерство здравоохранения Российской Федерации

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

Заинкова Наталья Вячеславовна

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ ГИАЛУРОПИДАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ.

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Министерство здравоохранения Российской Федерации

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

Заинкова Наталья Вячеславовна

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ ГИАЛУРОНИДАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ.

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии

Научные руководителя:

доктор биологических наук, профессор Комов В.П. кандидат химических наук, доцент Глазова Н.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лызлова С.Н. доктор технических наук, профессор Коликов В.М.

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский Государственный Технологический Университет

диссертационного . ербургской

Государственной Химико-Фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке академии.

Защита состоится

заседании

Автореферат диссертации разослан _

$ 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.В.Кириллова

1- Общая характеристика работы.

Актуальность ¡ремы. В связи с расширением сферы применения ферментов в различных областях, таких как пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина, косметология актуальной является проблема поиска новых дешевых источников сырья для их получения, особенно таких, которые являются отходами производств. Благодаря использованию новых современных методов, в том числе сорбционно-хроматографических, в технологии выделения и очистки, в настоящее время стало возможным получение высокоочищенных биологически-активных веществ, в частности ферментов, с высокой удельной активностью, а применение современных аналитических методов исследования, таких как ВЭЖХ, капиллярный и гельэлектрофорез позволило дать обоснованную оценку структуры и качества выделенных веществ.

На протяжении последних лет в СПХФА на кафедре биотехнологии проводятся исследования фермента гиалуронидазы. Как известно из литературных данных, гиалуронидазы различного происхождения выполняют разные биологические функции и могут отличатся друг от друга по своему строению и свойствам, поэтому изучение этого фермента, полученного из разных источников представляет большой интерес, так как дает возможность проследить эволюционные изменения фермента. Кроме того, получение этого фермента в чистом виде важно для - его практического использования в косметологии, сельском хозяйстве, а также в медицине, в качестве лекарственного препарата «Лидаза». В промышленном масштабе его получают из семенников крупного рогатого скота методом фракционирования органическими растворителями. Технология имеет ряд существенных недостатков, вследствие чего фермент загрязнен примесями и имеет низкую удельную активность. Кроме того, даже дальнейшая тонкая очистка от примесей не приводит к получению гомогенной формы фермента, так как гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота представлена совокупностью полимерных форм с разбросом по молекулярной массе от 10,7 до -200 кДа. Выделение же протомера возможно, но является трудной и дорогостоящей задачей.

В связи с этим, с одной стороны актуальным является, как поиск новых, дешевых альтернативных источников, в которых фермент является протомером, так и разработка сорбционно-хроматографических методов выделения гиалуронидазы, позволяющих получить очищенный фермент с высокой удельной активностью. С другой стороны, актуально проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических характеристик ферментов, выделенных из различных источников, который дает возможность выявить особенности в структуре и механизме действия

ферментов стоящих на разных ступенях эволюционного развития и определить область их применения.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение фермента гиалуронидазы из рыбного и микробного сырья, а также проведете сравнительного анализа физико-химических и биологических свойств ферментов, выделенных из источников стоящих на разных ступенях эволюционного развития. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Оценить возможность получения гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб и бактерий Pseudomonas Putida (36).

2. Изучить закономерности сорбции гиалуронидазы на ионитах различной структуры, а также подобрать оптимальный сорбент для выделения фермента из многокомпонентной смеси.

3. Разработать на основе полученных данных сорбционно-хроматографический метод выделения гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas Putida (36) и экстракта молок рыб.

4. Изучить свойства выделенных ферментов и дать сравнительную оценку физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы из молок рыб и гиалуронидазы из бактерий Pseudomonas Putida (36).

Научная новизна. Впервые исследованы в качестве источников гиалуронидазы молоки осетровых и лососевых рыб и бактерии Pseudomonas putida (36). Разработан высокоэффективный сорбционно-хроматографический метод выделения гиалуронидаз из этих источников, позволяющий получить высокоочищенный фермент с удельной активностью, значительно превышающей удельную активность гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота. Впервые выделен ингибитор микробной гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas putida (36), исследовано его влияние на кинетику ферментативных реакций и определен тип ингибирования. Впервые проведен сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств гиалуронидаз, выделенных из экстракта молок рыб и нативного раствора Pseudomonas putida (36) с использованием современных методов анализа, таких как ВЭЖХ, капиллярный электрофорез и гельэлектрофорез, позволяющих с высокой степенью точности оценить молекулярную гетерогенность выделенных ферментов. Обнаружены некоторые различия в свойствах ферментов и показан ряд преимуществ гиалуронидазы из молок рыб перед гиалуронидазой из Pseudomonas putida (36) и гиалуронидазой из семенников крупного рогатого ско га .

Теоретическая и практическая значимость. В результате работы подобраны новые, перспективные источники сырья для получения гиалуронидазы - молоки осетровых и лососевых рыб и микроорганизм-продуцент - бактерии Pseudomonas putida (36). Изучены закономерности сорбции гиалуронидазы на различных носителях и ,на основе полученных

данных, разработан сорбционно-хроматографический способ выделения данного фермента из таких многокомпонентных смесей как экстракты молок рыб и нативный раствор Pseudomonas putida (36). Изучены физико-химические и биологические характеристики выделенных ферментов, найден ряд общих свойств и различий ^подтверждающих литературные данные о многообразии и неоднородности свойств гиалуронидаз из различных источников. С помощью точных методов анализа произведена сравнительная оценка молекулярной гетерогенности гиалуронидаз из молок осетровых и лососевых рыб, позволяющая сделать предложение о структуре фермента. Выявлены преимущества гиалуронидазы из молок рыб и бактерий Pseudomonas Putida (36) по сравнению с гиалуронидазой из семенников крупного рогатого скота, что позволяет рекомендовать данное сырье для производства фермента в промышленном масштабе.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международном симпозиуме «Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма.» (Новосибирск,!995), на И Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Москва, 1996г.), на Международном симпозиуме «Chromatography in Industry» (Братислава, 1996г.), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 1996г.).

Получено решение о выдаче патента на способ получения гиалуронидазы из молок рыб №95102697/13(004857), а сам метод апробирован на заводе медицинских препаратов при АО «Самсон» (Санкт-Петербург) в полупроизводственном масштабе (Акт апробации от 12.02.93,).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 патент.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Молоки осетровых и лососевых рыб, а так же бактерии Pseudomonas putida (36) могут служить источниками сырья для получения фермента ГИаЛурОНИДаЗа.

2. Сорбционно-хроматографический способ выделения гиалуронидазы из многокомпонентных смесей (экстракт молок рыб, нативный раствор) дает возможность получить фермент с высокой удельной активностью за счет избирательной адсорбции на сульфокатионите и обратимой десорбции.

3. В нативном растворе Pseudomonas putida (36) содержится ингибитор гиалуронидазы, который отделяется от фермента в процессе сорбции-десорбции.

4. Гиалуронидаза из молок рыб и гиалуронидаза из Pseudomonas putida (36) имеют некоторые различия в физико-химических и биологических свойствах.

5, Гиалуронидаза из молок рыб является протомером и содержит в своем составе углеводную часть, которая оказывает влияние на активность фермента.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследование, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, библиографии. Работа изложена на/У/страницах, содержит таблиц, fá рисунков. Библиография включает !\(О работ отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы.

Объектами исследования в работе служили молоки осетровых рыб и лососевых рыб , а также штамм грамотрицателыюго микроорганизма Pseudomonas Putida (36), выделенный из отечественного препарата «Пушдойл» производства Бердского химического завода (ТЦ 64-14-11086). Для анализа активности гиалуронидазы использовались специально разработанные на кафедре биотехнологии количественный метод определения гиалуронидазы и метод получения гиалуроновой кислоты из пупочных канатиков.

Глубинное культивирование бактерий Pseudomonas Putida (36) осуществляли на качалке (220±10 об/мин) в колбах 750 мл с 50 мл среды при температуре 28°С. Состав питательной среды (г/л) МПБ - 15, крахмал - 20, рН=7,0.

В работе были использованы также стандартные методики:

- определение концентрации белка по модифицированному методу Лоури (Скоупс, 1985г.);

- метод определения концентрации углеводов, в основе которого лежит цветная реакция моно- и олигосахаридов с фенолом и концентрированной серной кислотой;

- метод гельхроматографического анализа на сефадексе фирмы «Sigma» G-75 и G-50. Оптическая плотность растворов на выходе из колонки регистрировалась автоматически с помощью оборудования для быстрой хроматографии - установке FRLS Sistem фирмы Pharmacia LKB (Швеция).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили па оборудовании фирмы «Becman» (США). В работе были использованы колонки: 1) Bio-Sil SEC125 column - биогель TSK Phenil 5 PW (300/7,5мм) для гельхроматографического анализа. 2) Pentax column с шарообразными гранулами гидроксилапатита SH-071QF(100X7,5 мм) для адсорбционной ВЭЖХ.

Капиллярный электрофорез проводили на оборудовании: P/FCT System 2100 (Beckman), включающей P/ACE UV Absorbance Detector, модель компьютера ШМ 555х. Внутренний диаметр полого силикосодержащего капилляра составлял 0,050 мм, наружный - 0,375 мм, общая длина

капилляра - 37 см. Результаты анализа регистрироватись автоматически при длине волны 214 нм.

Результаты и их обсуждение.

Выделение ферментов из животного и микробного сырья осуществляется в несколько этапов.

На первом этапе получения ферментов из животного сырья необходимой технологической операцией является дезинтеграция — молоки рыб измельчали в гомогенизаторе до получения однородной массы.

На следующей стадии для первичного выделения фермента проводили экстракцию 0,1 N раствором уксусной кислоты. Наибольший выход гиалуронидазы достигался при рН=2,8 через 2 часа проведения процесса.

Процесс биосинтеза гиалуронидазы бактериями Pseudomonas Putida (36) изучали при твердофазном и глубинном культивировании. Для выяснения способности Pseudomonas Putida (36) продуцировать гиалуронидазу, сравнивали процессы биосинтеза Pseudomonas Putida (36) и Staphylococcus aureus, так как из литературных данных известно, что Staphylococcus aureus продуцирует фермент в количестве, достаточном для его получения.

Полученные данные говорят о том, что Pseudomonas Putida (36) синтезирует гиалуронидазу, в количестве, достаточном для использования культуры в качестве продуцента, а при глубинном способе культивирования удельная активность фермента выше, чем при поверхностном.

Был тучен процесс биосинтеза гиалуронидазы и выбрано оптимальное время культивирования — 16 часов, когда количество фермента в культуральной жидкости максимально, а процесс образования бактериальных эндотоксинов еще не начался.

Гельхроматографичесий анализ компонентных составов нативного раствора и экстракта молок рыб показал, что это — многокомпонентные системы, содержащие большое количество белков и углеводов.

Выделение гиалуронидаз из таких многокомпонентных систем как ■экстракт молок рыб и нативный раствор Pseudomonas Putida (36) является сложной задачей, решить которую позволяет применение сорбционных технологий.

Для выбора оптимального сорбента исследовали ряд макропористых иопогеппых и неионогенных сорбентов: молекулярный сорбент Полнсорб, анионит АМП, карбоксильный катионит СГ-1М и карбоксильный сульфакатионит КУ-23.

Наилучшие результаты по сорбции гиалуронидазы как из нативного раствора, так и экстракта были получены на сульфокатионите КУ-23. Из рис.1 видно, что максимальная емкость сорбции для гиалуронидазы из нативного раствора наблюдается при рН<5, из экстракта молок рыб при

рН<4-4,5. При рН=4,0-5,0 емкость сорбции общих белков минимальна, при рН=9,0 фермент возможно десорбировать со смолы с большим выходом. Был изучен изотермический процесс сорбции гиалуронидазы из нативного раствора и экстракта в статических условиях на КУ-23 при рН=4,5 и 1=2 4 °С, и рассчитаны коэффициента распределения вещества между фазой сорбента и раствора (К<1). Процесс сорбции гиалуронидазы из нативного раствора описывается уравнением БЭТ, изотерма сорбции гиалуронидазы из экстракта молок рыб имеет начальный линейный участок и может быть описана уравнением Ленгмюра.

а) б)

Рис. 1 Зависимость емкости сорбции гиалуронидазы (1) и общего белка (2) на сульфвкатионите КУ-23 от pH равновесного раствора

а) из экстракта молок рыб;

б) го нативного раствора Pseudomonas Putida (36).

Изучен кинетический процесс сорбции гиалуронидазы и общих белков из экстракта молок рыб и рассчитаны эффективные коэффициенты диффузии.

Сорбцию гиалуронидазы из экстракта молок рыб в динамических условиях проводили при варьировании скорости протекания раствора через колонку при выбранном оптимальном значении рН=4,5.

По полученным данным строили выходные кривые сорбции и определяли режим проведения процесса, для чего рассчитывали критериальный параметр X. Максимальное отделение гиалуронидазы от сопутствующих примесных веществ белковой природы наблюдается при Wp=0,94xl04 м/с, то есть при переходе от нерегулярного режима к регулярному (>.=0,5).

Одним из условий, позволившим выделить вещество сорбционным методом, является его обратимая десорбция с носителя.

Выбор условий десорбции фермента осуществляли с помощью варьирования величины pH элюирующей системы. Десорбцию проводили буферной системой ОД N (NH^OH + 1 N (NHOSO4 при различных

значениях рН. Наиболее полная десорбция и концентрирование фермента происходит при значениях рН 9,3-9,7. Также возможно использование в качестве элюента 0,1 N (ЫНДОН + 1 N ацетата аммония с рН=9,3, что позволяет проводить процесс десорбции в более мягких условиях, по сравнению с сульфатом аммония.

Из выходных кривых сорбции-десорбции рис.2 видно, то подобранные условия являются оптимальными для выделения гиалуронидазы из экстракта молок, так как происходит избирательная сорбция и обратимая десорбция гиалуронидазы, позволяющая повысить удельную активность фермента более, чем в 2 раза (Ауд в экстракте — 6 Ед/мг, Ауд в элюате — 16 Ед/мг).

Рис.2. Входная кривая десорбции по общим белкам и пиалуронидазе из экстракта мояок осетровых рыб. \Ур=0,94-10'4 м/с. 1 - гиалуронидазная активность; 2 - общш бел)«;.

Разработанная схема выделения представлена на рис.3

ТЗт т паттига г?мтл тл1 тп1 чг г тжг» иоттюплгл поотол^о Рсли^лшлиос РиКЛа

«^ЫдУ^^аПУ 1 О 1 А^Ч/^ЬА 1 А ииии

(36) на сорбенте КУ-23 в динамических условиях проводили при выбранной оптимальной скорости \Ур=0,14х10~1 м/с, рН=4,6. В качестве элюента использовали Ш сульфат аммония с рН=9,3.

На выходной кривой — рис.4 наблюдается несоответствие - площадь пика гиалуронидазной активности при десорбции значительно превосходит площадь над выходной кривой сорбции по гиалуронидазной активности. Это позволяет предположить, что, возможно, в нативном растворе присутствует ингибитор гиалуронидазы и в процессе сорбции на КУ-23 происходит отделение его от фермента.

лиофильную сушку

Рис.3 Схема выделения гиалуронидазы из молок рыб.

Кроме этого, из рис.4 видно, что при десорбции наблюдается разница в объемах выхода гиалуронидазы и общего белка. Эти 2 фактора позволяют повысить удельную активность фермента на порядок по сравнению с исходной (Ауд в нагивном растворе - 5,4 Ед/мг, Ауд в элюате -58 Ед/мг).

г" у

VK

Рис.4 Выходные кривые сорбции и десорбции общего белка (1) и гиалуронидазы (2) из нативного раствора Pseudomonas putida (36) на сульфокатионите КУ-23.

Чтобы подтвердить предположение о присутствии в нативном растворе ингибитора фермента, проводили повторную сорбцию злюата на регенерированном сорбенте в тех же условиях.

Из рис.5 видно, что площадь пика, обладающего гиалуронидазной активностью при десорбции соответствует площади над выходной кривой сорбции по активности. Таким образом, подтвердилось предположение о том, что в нативном растворе присутствует ингибитор гиалуронидазы, отделяющийся в процессе сорбции на КУ-23.

Десорбцию предполагаемого ингибитора с носителя осуществляли 1N ацетатом аммония в присутствии ПАВ — «TWIN 20».

Методом гельхроматографического анализа была определена молекулярная масса ингибитора, она составила приблизительно 50 кДа, и изучен компонентный состав. На основе полученных данных трудно сделать вывод о природе ингибитора, так как элюат содержит как белковые, так и углеводные компоненты.

Рис. 5. Выходные кривые сорбции и десорбции общего белка (1) и гиалуронидазы (2) из элюата после первой сорбции на сульфокатионите КУ-23.

Известно, что гиалуронидазы, выделенные из различных источников, отличаются между собой как по физико-химическим, так и биологическим свойствам: имеют широкий разброс молекулярных масс (от И до 200 кДа), pH и температурный оптимум действия, стабильны при разных значениях pH и температуры, могут проявлять специфичность в отношении различных субстратов (гиалуроновой кислоты, хондроитан-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата), что может быть объяснено структурными различиями в молекуле ферментов. Кроме того, гиалуронидазы из различных источников выполняют разные биологические функции: ферменты животного происхоздения имеют важное значение в процессах оплодотворения, а микробные гиалуронидазы шрают важную роль в инфекционных процессах.

Поэтому одной из задач исследования являлось изучение свойств и проведение сравнительного анализа физико-химических и биохимических свойств гиалуронидаз выделенных из молок рыб и бактерий Pseudomonas Putida (36).

Определение молекулярных масс гиалуронидаз, полученных сорбционным методом, проводили с помощью гсльхроматографического анализа на сефадексе G-75 и G-50. Для гиалуронидазы из Pseudomonas Putida (36) молекулярная масса (Мг) составила приблизительно 70кДа, а для гиалуронидазы из молок рыб 12кДа (данные по Mr гиалуронидазы из

молок также подтверждены с помощью ВЭЖХ и гельэлектрофореза. Такая разница в молекулярных массах ферментов может быть связана с наличием в микробной гиалуронидазе полимерных или олигомерных форм, что характерно, например, для гиалуронидазы из Staphylococcus aureus 0-15, у которого выявлено 2 молекулярные формы.

Как правило, все ферменты проявляют высокую каталитическую активность в небольшом интервале рН.

Исследование влияния рН на ферментативную активность гиалуронидазы из молок рыб и гиалуронидазы из Pseudomonas Putida (36) проводили в цитратно-фосфатном буферном растворе при t=37°C.

Как видно из рис.6, рН-оптимум действия для гиалуронидазы из молок осетровых рыб лежит в интервале рН=4,5-6,0; а гиалуронидазы из Pseudomonas Putida (36) — 5,0-5,5. В случае гиалуронидазы из молок рыб максимум ферментативной активности наблюдается при рН=5,5; в случае микробной гиалуронидазы при рН=5,0. При рН менее 4,0 и выше 6,0 активность обоих ферментов понижается.

Изучение влияния рН на энзиматическую стабильность гиалуронидаз показало, что и гиапуронидаза из молок осетровых рыб и гиалуронидаза из Pseudomonas Putida (36) наиболее стабильны при рН=4,5. При сильнокислом рН=3.0 и сильнощелочном значении рН=9,0 в течение 6 часов оба фермента инактивируются практически полностью.

Известно, что все ферменты проявляют свою активность в определенном интервале температур.

Изучение температурного оптимума действия ферментов проводили при оптимальном значении рН цитратно-фосфатного буферного раствора.

Как видно из рис.7 обе изучаемые гиалуронидазы имеют оптимум действия при t=37°C, однако при повышении температуры до 70°С

А,едгм> 80 70-

й-аз

40

30 • 2010 0

Л

в

1

А,ед/мг

/ч

A4

^ V

N

7 8 pH

10 20 30 40 50 ВО 70

ТС

Рис. 6. pH-оптимум действия гиалуронидаз из

1) Молок осетровых рыб;

2) Pseudomonas Putida (36).

Рис. 7 Температурный оптимум действия гиалуронидаз из

1) Молок осетровых рыб.

2) Pseudomonas Putida (36).

гиалуронвдаза из молок осетровых рыб сохраняют свою активность, в то время как гиалуронидаза из Pseudomonas Putida (36) полностью инакгивируются. При низких температурах t=5-10°C обе гиалуронидазы проявляют минимальную активность.

Изучение влияния температуры на стабильность ферментов показало, что оба фермента наиболее стабильны при t=20°C

Параметром для сравнения активности различных ферментов или активности ферментов в различных условиях служит скорость ферментативной реакции, которая зависит прежде всего от природы фермента, поэтому важным этапом на пути изучения гиалуронидаз, выделенных из молок рыб и нативного раствора культуры Pseudomonas Putida (36) является определение кинетических параметров реакции гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазами: максимальной скорости гидролиза (Vm), а также константы Михаэлиса. Для расчета этих параметров изучали зависимость удельной начальной скорости гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой из молок рыб и гиалуронидазой из Pseudomonas Putida (36) от концентрации субстрата в смеси. Так как степень чистоты субстрата, в данном случае гиалуроновой кислоты, значительно влияет на кинетические параметры гидролиза, изучалось два субстрата — гиалуроновая кислота — стандарт фирмы «Fluka» и рабочий субстрат — гиалуроновая кислота, выделенная нами из пупочных канатиков человека.

На основе полученных данных (рис.8,9) можно предположить, что кинетика гидролиза гиалуроновой кислоты обоими ферментами — гиалуронидазой из молок рыб и микробной гиалуронидазой подчиняется теории Бриггса-Холдейна, а кинетические кривые могут быть описаны уравнением Михаэлиса-Ментен.

Для расчета Кш применяли метод «двойных обратных величин» Лайнуивера-Бэрка.

Значения Кт приведены в таблице 1, из которой видно, что Кш обоих ферментов уменьшается с повышением степени чистоты субстрата. Следует отметить тот факт, что значение Кт для микробной гиалуронидазы несколько выше, чем для гиалуронидазы из молок.

Таблица 1

Значения Km и Уш для ферментативных систем._

Ферментативная система Km, МГ/МЛ V„, М сек"1

Гиалуронидаза из молок рыб — гиалуроновая кислота (стандарт) 0,40 1100

Гиалуронидаза из молок рыб — рабочий субстрат 0,52 900

Гиалуронидаза из Pseudomonas Putida (36) — гиалуроновая кислота (стандарт) 0,58 2700

Гиалуронидаза из Pseudomonas Putida (36) — рабочий субстрат 0,91 1600

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

[S], MC/MI

О 0,2 0,4 0,S 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

[S], мг/мг

Рис.8. Зависимость скорости гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой а) из Pseudomonas Putida (36) б), из молок осетровых рыб от концентрации субстрата. 1 — гиалуронидаза - стандарт гиалуроновой кислоты фирмы "Fluka"; 2 — гиалуронидаза - рабочий субстрат.

а)

-4-3-2-10 1234 5

[1/S], мг/мл

-4-3 -2 -1 012345

[1/S], мг/мл

Рис.9, Определение кажущихся констант Михаэлиса для гиалурогшдазы а) из Pseudomonas Putida (36) б) из молок осетровых рыб для ферментных систем 1_гнзлуронид23м - стандарт гиалуроновой кислоты фирмы "Flulcs'1;

2 — гиалуронидаза - рабочий субстрат.

Были изучены кинетические параметры реакции гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой из Pseudomonas Putida (36) в присутствии выделенного ингибитора.

На рис. 10,11 представлены кинетические кривые, из которых можно предположить, что ингибирование является неконкурентным, константа ингибирования Ку=0,13 мг/мл. Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратом, при этом ингибитор и субстрат присоединяются к ферменту одновременно, образуя малоактивный комплекс: фермент-ингибитор-

V0M 100 •

Рис. 10 Кинетическиая кивая скорости гидролиза гиалуроновой кислоты

микробной гиалуронидазой в присутствии ингибитора. 1 — концентрация субстрата 1 мг/мл; 2 — концентрация субстрата 2 мг/мп.

Рис. 11 Определение вида ннгибирования и константы ингибирования К;1

субстрат. В данном случае, в роли ингибитора выступает, очевидно, какой-либо метаболит, присутствующий в нативном растворе Pseudomonas Putida (36).

Существуют различные современные методы оценки степени чистоты полученных препаратов. Применение ряда этих методов, основанных на принципах разделения веществ по молекулярной массе, подвижности молекул в электрическом поле, способности селективно адсорбироваться на различных носителях, позволяет сделать вывод о молекулярной гетерогенности или гомогенности веществ, выявить как примесные соединения, так и молекулярные формы одного и того же вещества и определить с высокой степенью точности их молекулярную массу.

Исследование ферментов с помощью этих методов проводилось в институте хроматографии в Италии на оборудовании фирмы «Bekman».

Исследование гиалуронидазы из молок рыб методами молекулярно-шговой ВЭЖХ и гельэлектрофореза показало, что гиалуронидаза из молок осетровых и лососевых рыб, в отличие ог гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота (стандарт «Sigma») является, возможно, протомсркм , то есть на гельхроматограмме наблюдается

1 пик, соответствующий молекулярной массе 12 кДа, в то время как гиалуронидаза из семенников КРС является олигомером, с молекулярной массой от 10 до 120 кДа. Рис 12.

Ранее на кафедре биотехнологии проводилась работа по изучению тестикулярной гиалуронидазы из семенников КРС и в работе Л.М Игониной было показано, что возникновение олигомерных форм гиалуронидазы происходит за счет образования дисульфидных связей между протомерами, для доказательства чего проводилось инкубирование фермента с 2-меркаптоэтанолом (2МЭТ). Воздействие 2-МЭТ на гиалуронидазу из молок рыб приводит к образованию 2го пика, с молекулярной массой 10 кДа, и со временем происходит его количественное увеличение(рис. 13}

Полученные данные позволяют высказать предположение, что оба фермента из молок рыб состоят из 2 полипептидных цепей с близкими молекулярными массами, соединенных между собой дисульфидными связями. Под воздействием 2-МЭТ происходит восстановление SH групп цистина, и, как следствие, разрыв дисульфидных связей между двумя цепями.

С целью уточнения молекулярной гетерогенности гиалуронидазы из молок рыб воспользовались методом адсорбционной ВЭЖХ на гидроксилаппатите, который дает возможность разделять сложные смеси, кажущиеся гомогенными по данным гельфильтрации и электрофореза. Принцип метода заключается в разделении веществ в зависимости от их сорбционной способности. Данные, полученные с помощью адсорбционной ВЭЖХ подтвердили результаты молекулярно-ситовой ВЭЖХ и гельэлектрофореза. Из хроматограмм (рис. 14) видно несколько пиков для гиалуронидазы из семенников КРС, и один основной пик, соответствующий Мг=12 кДа для гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб; наличие второго, минорного пика для гиалуронидазы из молок лососевых рыб может быть обусловлено небольшим количеством низкомолекулярных примесных соединений в препарате.

Другим критерием для оценки молекулярной гетерогенности может служить принцип разделения веществ по их подвижности в электрическом поле, реализуемый с высокой степенью точности методом капиллярного электрофореза.

Проведение капиллярного электрофореза позволило выявить серию молекулярных форм гиалуронидазы из семенников КРС и 3 молекулярные формы для гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб (рис5.)

Из литературных данных известно, что в гиалуронидазе из семенников КРС содержится от 5 до 7% углеводов, в основном гексоз. В зависимости от типа олигосахаридов и их содержания может различаться и молекулярная масса ферментов. В данном, случае, наличие 3 пиков на элсктрофорограмме может быть связано с существованием

Рис.12 Гельхроматографический анализ гиалуронидазы а) из семенников крупного рогатого скота (стандарт «Sigma»); б) из молок

осетровых рыб; в) из молок лососевых рыб; методом ВЭЖХ

Рис. 13 Гельхроматографическнй анализ гиалуронидаз а) из молок осетровых рыб, б) молок лососевых рыб в процессе инкубирования с 2-меркаптоэтанолом.

Рис, 14 Анализ гиалуронидазы а) из семенников крупного рогатого скота (стандарт «Sigma»), б) молок осетровых рыб, в) молок лососевых рыб методом адсорбционной ВЭЖХ на гидроксилаппатите.

ГЧ

о

^JJr^

Рис. 15 Анализ а) гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота (стандарт «Sigma»), б) гиалуронидазы из молок осетровых рыб, в) гиалуронидазы из молок лососевых рыб методом капиллярного электрофореза.

3 молекулярных форм гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб, различающихся как по заряду макромолекулы, так и по структуре и содержанию гликозидной части. Также, по данным капиллярного электрофореза можно судить о небольшом содержании примесных компонентов. Из литературных данных известно, что ферментативное деглнкозилированяе гиалуронидазы из семенников КРС пептидо-N-гликозидазой-F не приводило к потере активности фермента. Однако, воздействие пептидо-М-гликозидазы-Р на гиалуронидазу из молок рыб приводит к полной инактивации обоих ферментов, из чего можно заключить, что углеводные компоненты, являющиеся составными частями фермента, прямо или опосредованно связаны с активным центром .

Полученные результаты позволяют сделать вывод о структурной идентичности гиалуронидаз из молок осетровых и лососевых рыб, и, как следствие, близких физико-химических и биологических свойств.

На основе данных литературы, а также собственных исследований в заключение следует отметить, что несмотря на то, что гиалуронидазы, выделенные из источников, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, таких как микроорганизмы, гельминты, насекомые, рыбы, млекопитающие и выполняющие различные биологические функции имеют ряд общих свойств, а именно: проявляют высокую специфичность к гиалуроновой кислоте, близки, в большинстве случаев, по pH и температурному оптимуму действия, однако значительно различаются по таким параметрам, как удельная активность, стабильность, молекулярная масса и молекулярная гетерогенность. Сравнивая гиалуронидазу из молок рыб с гиалуронидазой из бактерий Pseudomonas Putida (36) и из семенников КРС можно отметить некоторые преимущества гиалуронидазы из молок рыб, а именно: фермент имеет высокую удельную активность, стабилен в более широком диапазоне pH и температур, имеет низкую молекулярную массу и является протомером. Кроме того, сами молоки рыб являются отходами производства, поэтому можно рекомендовать использовать данное сырье для производства гиалуронидазы разработанным сорбционным методом в промышленном масштабе и применять выделенный фермент в косметологии, сельском хозяйстве, для аналитических целей, а после проведения необходимых исследоваяий(в качестве медицинского препарата.

Выводы.

1. Впервые исследованы в качестве источников гиалуронидазы молоки осетровых и лососевых рыб и бактерии рода Pseudomonas Putida (36). Изучены процессы экстракции гиалуронидазы из молок рыб и биосинтеза гиалуронидазы бактериями Pseudomonas Putida (36), установлено оптимальное время проведения процессов, при котором выход фермента максимален.

2. Изучены равновесные, кинетические и динамические параметры сорбции гиалуронидазы из экстракта молок рыб и нативного раствора Pseudomonas Putida (36) и, на основе полученных данных разработан сорбционно-хромато Графический метод выделения гиалуронидазы из экстракта молок рыб и нативного раствора на макропористом сульфокатионите КУ-23, позволяющий получить очищенные ферменты с высокой удельной активностью, превышающей удельную активность препарата «Лидаза» в 4-10 раз.

3. Использование сорбционно-хроматографического метода позволило выделить из нативного раствора Pseudomonas Putida (36) ингибитор микробной гиалуронидазы. Показано, что выделенный ингибитор понижает скорость ферментативной реакции на порядок, рассчитана константа ингибирования и определен тип ингибирования (неконкурентный).

4. Проведен сравнительный анализ физико-химических и биохимических свойств гиалуронидаз, полученных из молок рыб и бактерий Pseudomonas Putida (36). Выявлены различия в молекулярных массах ферментов. Показано, что температурный и pH оптимум действия ферментов близки, однако гиалуронидаза из молок рыб стабильна в более широком диапазоне pH и температур. Изучена кинетика фермент-субстратных реакций и показано, что кинетика гидролиза гиалуроновой кислоты обоими ферментами - гиалуронидазой из молок рыб и микробной гиалуронидазой подчиняется теории Бригса-Холдейна; а кинетический кривые могут быть описаны уравнением Михаэлиса-Ментен.

5. Проведен анализ гиалуронидаз, полученных из молок осетровых и лососевых рыб с помощью современных методов анализа. Выявлено, что гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб идентичны друг другу, являются протомерами с молекулярной массой 12 кДа, состоят из 2 полипептидных цепей и имеют в своем составе углеводную часть (гликопротеид).

6. Выявлен ряд преимуществ гиалуронидазы из молок рыб перед микробной гиалуронидазой из Pseudomonas Puíida (36) и гиалурсгпгдазой из семенников крупного рогатого скота, который дает возможность рекомендовать данное сырье для производства фермента в промышленном масштабе.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Игонина JI.M., Глазова Н.В., Дмитренко Л.В., Заинкова Н.В. Применение сорбционно - хроматографических методов очистки ферментного препарата «Лидаза». /В кн:. Тезисы докладов Всероссийской научной конференции «Химия и технология лекарственных веществ.» -СПб. -1994. -с.14.

2. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Заинкова Н.В.,Елькин Г.Э. Использование сорбентов для удаления примесей из инъекционного препарата

«Лидаза». /В кн: Гез.Междунар. Симпозиума «Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма.» -Новосибирск, -1995.-е 133-135.

3. Юношева С.Г., Игонина JI.M., Заинкова Н.В., Глазова Н.В., Елькин Г.Э. Равновесие и кинетика сорбции гиалуронидазы на сетчатых полимерных ионитах СР1М;КУ-23/ ж. Прикладная химия, СПб, 1996, -т 69, -N 5, -с 762-767.

4. Курдявка Л.В., Заинкова Н.В., Глазова Н.В., Елькин Г.Э., Инверсия порядка выхода компонентов при хроматографии биополимеров,/ тезисы 7-го Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии, Москва. 1996, -с 78.

5. Zainkova N.V., Igonina L.M., Rudometova L.V., Elkin G.E., Glazova N.V., Chromatographic purification of enzyme medicines, / 10-th International Symposium of Chromatography in Industry, June 30-July 4, 1996, Bratislava, -s 175.

6. Заинкова H.B., Неймарк Ю.Г., Абрамова Н.И., Глазова Н.В., Комов В.П., Получение фермента гиалуронидаза из различных источников с использованием сорбционных методов. /В кн.: Тезисы докладов Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы создания лекарственных средств», СПб, 1996.,с 14-15

7. Рудометова Н.В., Заинкова Н.В., Глазова Н.В., Елькин Г.Э. Феноменологический подход к оптимизации препаративных сорбционно-хроматографических процессов выделения лекарственных веществ. /В кн: Тезисы докладов 7-го Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии -Москва, -1996.,с36

8. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Елькин Г.Э., Заинкова Н.В. Сорбция гиалуронидазы на макропористых сорбентах, /ж. Прикл. биохим. и микробиол. -Москва, -1998., N 5, -с 485-489.

9. Положительное решение о выдаче патента на способ получения гиалуронидазы из молок рыб N9502697/13(004857)

Заинкова Наталья Вячеславовна

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ ГИАЛУРОНИДАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ.

Специальность 03.00.04 - биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия ЛР№ 021251 от 23.10.97. Подписано к печати 19.10.98. Формат бОхЭО'Лб. Бумага тип. Печать ризограф. Тираж экз. Заказ 170._

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия 197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Заинкова, Наталья Вячеславовна, Санкт-Петербург

/ |>т»< и* (^г

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи УДК 577.152.32:66.081

ЗАИНКОВА НАТАЛЬЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

ПОЛУЧЕНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ ГИАЛУРОНИДАЗ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

03.00.04 — биохимия ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Комов В.П кандидат химических наук, доцент Глазова Н.В.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Содержание

Введение...............................................................................................................5

Обзор литературы...............................................................................................8

1.1. Источники получения ферментных препаратов............................................8

1.1.1. Растительное сырье.............................................................................................8

1.1.2. Органы и ткани животных и рыб.................................-..................................9

1.1.?. Микроорганизмы.........................................................................................10

1.2 Гиалуронидазы. Сравнительный анализ биологических

и физико-химических свойств гналуронидаз из различных

источников. Методы выделения и очистки гналуронидаз...........................12

1.2.1. Бактериальные гиалуронидазы........................................................................14

1.2.2. Гиалуронидазы из слюны пиявок и гельминта ые гиалуронидазы...............16

1.2.3. Тестикулярные гиалуронидазы.......................................................................16

1.2.4. Выделение и очистка гналуронидаз...............................................................21

13. Общие принципы и особенности выделения и очистки

ферментов из экстрактов и культуральных жидкостей.............................23

1.3.1. Хроматографические методы, применяемые на стадии концентрирования.......................................................................................32

1.3.2. Хроматографические методы, применяемые на стадии тонкой

очистки........................................... .....................................................................38

2. Экспериментальная часть...........................................................................47

2.1. Объекты исследования.....................................................................................47

2.1.1. Источники получения гиалуронидазы............................................................47

2.1.2. Физико-химические характеристики сорбентов.............................................48

2.2. Методы исследования................................. .................................................52

2.2.1. Твердофазное культивирование бактерий Рз.рийёа (36)...............................52

2.2.2 .Глубинное культивирование бактерии Рв.рийёа (36)...................................52

2.2.3. Определение бактериальных эндотоксинов по ЛАЛ-тесту...........................53

2.2.4. Определение концентрации белка по методу Лоури..................................54

2.2.5. Метод определения углеводов....................................................................55

2.2.6. Определение гиалуронидазной активности..................................................56

2.2.7. Г ельхроматографический анализ.................................................................60

23. Использование сорбентов в работе..............................................................62

2.3.1. Кислотно-щелочная обработка сорбентов....................................................62

2.3.2. Исследование сорбции белков в статических условиях (pH -зависимость

и изотермические процессы сорбции).......................................................62

2.3.3. Исследование кинетики сорбции белков.....................................................63

2.3.4. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях........64

2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография..........................................65

2.5. Капиллярный электорофорез.........................................................................65

2.6. Гельэлектрофорез..........................................................................................66

2.7. Математические методы обработки результатов............................................66

3. Результаты и их обсуждение......................................................................69

Э.1. Разработка сорбционного метода выделения гиалуронидазы из

экстракта молок рыб и нативного раствора Pseudomonas putida (36).........69

3. LI. Изучение процесса экстракции гиалуронидазы из молок рыб..........................69

3.1.2. Гелъхромато графический анализ компонентного состава

экстракта молок осетровых рыб.....................................................................70

1.3 3. Подбор штамма - продуцента гиалуронидазы и условий его

культивирования..................................................................................................73

3.1.4. Гельхроматографический анализ компонентного состава нативного

раствора Pseudomonas putida (36) на различных часах ферментации.............77

3.1.5. Исследование равновесных и кинетических параметров сорбции гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas putida (36) и экстракта молок рыб.......................................................................................................81

3.1.6. Изучение сорбции гиалуронидазы из экстракта молок рыб в

динамических условиях на сульфакатионите КУ-23...................................90

3.1.7. Изучение процесса сорбции гиалуронидазы из нативного раствора

Pseudomonas putida (36)...............................................................................96

3.2. Сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы из бактерий Pseudomonas putida (36) и молок осетровых рыб..........................................................................................103

3.2.1. Изучение pH-оптимума действия и влияния pH на стабильность гиалуронидазы в растворе.........................................................................104

3.2.2. Изучение температурного оптимума действия и влияния температуры

на стабильность гиалуронидазы в растворе...............................................108

3.2.3. Определение кинетических параметров реакции гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой..........................................................111

3.2.4. Изучение кинетических параметров реакции гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой из Pseudomonas putida (36) в присутствии ингибитора................................................................................................115

3.3. Изучение гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб современными аналитическими методами..............................................117

Заключение......................................................................................................124

Выводы............................................................................................................125

Список литературы.......................................................................................127

ВВЕДЕНИЕ

В связи с расширением сферы применения ферментов в различных областях, таких как пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина, актуальной является проблема поиска новых дешевых источников сырья для их получения, особенно таких, которые являются отходами производств. Благодаря использованию новых современных методов, в том числе сорбционно хроматографических, в настоящее время стало возможным получение высокоочшценных биологически-активных веществ, в частности ферментов, с высокой удельной активностью, а применение современных аналитических методов исследования, таких как ВЭЖХ, капиллярный и гелъэлектрофорез позволило дать обоснованную оценку структуры и качества выделенных веществ.

На протяжении последних лет в СПХФА на кафедре биотехнологии проводятся исследования фермента гиалуронидазы. Выбор фермента гиалуронидазы в качестве объекта исследования основан на том, что в настоящее время этот фермент широко используется в медицине, косметологии, сельском хозяйстве — на станциях искусственного оплодотворения. Гиалуронидаза уменьшает вязкость межклеточного вещества, способствует увеличению проницаемости тканей и облегчает движение в межклеточных пространствах.

Как известно из литературных данных, гиалуронидазы различного происхождения выполняют разные биологические функции и могут отличатся друг от друга по своему строению и свойствам, поэтому изучение этого фермента, полученного из разных источников, представляет большой интерес, так как дает возможность проследить эволюционные изменения фермента. Кроме того, получение этого фермента в чистом виде важно для его практического использования. В медицине препарат "Лидаза", действующим началом которого является гиалуронидаза, применяют для ускорения всасывания лекарственных веществ, рассасывания рубцов, понижения вязкости эксудатов и отеков [42], а также для определения гиалуроновой кислоты. В промышленном масштабе его получают из семенников крупного рогатого скота методом фракционирования

органическими растворителями. Технология имеет ряд существенных недостатков, вследствие чего фермент загрязнен примесями и имеет низкую удельную активность. Кроме того, даже дальнейшая тонкая очистка от примесей не приводит к получению гомогенной формы фермента, так как гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота представлена совокупностью полимерных форм с разбросом по молекулярной массе от 10,7 до 200 кДа. Выделение протомера возможно, яо является трудной и дорогостоящей задачей.

В связи с этим, с одной стороны актуальным является как поиск новых, дешевых альтернативных источников сырья, в которых фермент является протомером, так и разработка сорбционно-хроматографических методов выделения гиалуронидазы, позволяющих получить очищенный фермент с высокой удельной активностью. С другой стороны, актуально проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических характеристик ферментов, выделенных из различных источников, который дает возможность выявить особенности в структуре и механизме действия ферментов и определить область их применения.

Целью данной работы являлась разработка способа получения фермента гиалуронидазы из рыбного и микробного сырья, а также проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических свойств ферментов, выделенных из источников, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить возможность получения гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб и бактерий Pseudomonas putida (36).

2. Изучить закономерности сорбции гиалуронидазы на ионитах различной структуры, а также подобрать оптимальный сорбент для выделения фермента из многокомпонентной смеси .

3. Разработать на основе полученных данных сорбционно-хроматографический метод выделения гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas putida (36) и экстракта молок рыб.

4. Изучить свойства выделенных ферментов и дать сравнительную оценку физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы из молок рыб и гиалуронидазы из бактерий Pseudomonas putida (36).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Источники получения ферментных препаратов.

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, присущи всем живым объектам и содержатся во всех растениях, животных и микроорганизмах.

Процесс биосинтеза в организме связан с обеспечением метаболизма клеток, и, соответственно, количество синтезируемых ферментов строго определяется жизненной потребностью организма. Поэтому такие объекты не могут служить источником получения ферментных препаратов. Для этой цели пригодны только некоторые растительные организмы или отдельные органы растений и животных, способные накапливать значительные количества ферментов [18 ],

1.1.1. Растительное сырье.

Источником ферментов могут служить пророщенные зерна различных злаков (солод), которые используются непосредственно как технический ферментный препарат, либо служат исходным материалом для получения очищенных ферментных препаратов [18]. Например, в ячменном солоде содержится до 1% амилаз, в хрене содержится такой фермент, как пероксидаза, картофель является источником кислой фосфатазы [3].

В тропических и субтропических странах в качестве сырья для промышленного производства протеиназ используют латекс дынного дерева (фермент папаин), латекс растений, относящихся к виду фикусовых, например листья, побеги инжира (фицин); сок зеленой массы ананаса (бромелин) [3, 18]. Перспективы использования растительного сырья существенно расширяются в связи с успехами в области клонирования. С тех пор, как удалось индуцировать регенерацию целого растения из отдельной клетки, техника культуры клеток стала все чаще применяться для клонирования .

Культивирование растительной массы клеток в крупных масштабах было освоено в 1976г. японскими исследователями, которым удалось получить биомассу в объеме 20м3 [62]. Как правило, содержание биологически-активных веществ в

тканях, выращенных in vitro (процент от веса сухого вещества), равно или выше, чем их содержание в тканях исходных растений [98}.

Примером могут служить ферменты супероксиддисмутаза, каталаза и пероксвдаза, получаемые из культуры ткани раувольфин змеиной [38].

1.1.2. Органы и ткани животных и рыб.

Как известно, ферменты животного происхождения выделяют из органов, в которых протекают интенсивные биохимические процессы [3]. На всех мясоперерабатывающих комбинатах собирают сырье, содержащее ферменты, консервируют его и используют для получения ферментных препаратов. Таким сырьем являются, например, поджелудочная железа, слизистые оболочки желудков и тонких кишок свиней, сычуги крупного рогатого скота (КРС), сычужки молочных телят и ягнят, семенники половозрелых животных. В поджелудочной железе содержится большое количество разнообразных ферментов: трипсин, химотрипсин, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза, коллагеназа, эластаза, амилаза, липаза и другие. Слизистая оболочка желудков свиней и сычугов КРС содержит пепсин и липазу. Из сычужков молочных телят и ягнят получают ренин -сычужный фермент. Из семенников половозрелого скота выделена гиалуронидаза [18].

В настоящее время ведется активный поиск ферментов, источником которых является рыбное сырье. Например, фермент ацетилхолинэстеразу получают из мышечной ткани электрического угря [3 J. Из отходов переработки креветок в крупном масштабе получают целый ряд ферментов: [3-N-ацетилглюкозамидазу, щелочную фосфатазу, гиалуронидазу и хитиназу [123]. Из внутренних органов черноморского анчоуса получают фермент гиалуронидазу в количестве, достаточном для ее промышленного производства. [ 53, 126 }.

Ферменты из животного сырья являются наиболее близкими в эволюционном отношении к ферментам человека, и поэтому обладают меньшей иммунотоксичностью, чем ферменты микробного и растительного происхождения.

1.13. Микроорганизмы.

Микроорганизмы в качестве продуцентов ферментов представляют особый интерес, поскольку их метаболизм, а следовательно, и работа ферментных систем осуществляется с очень большой интенсивностью. Быстрый прирост биомассы позволяет получить такие количества сырья для выделения ферментов, которые не смогут сравниться с их содержанием в растениях и тканях животных. [50]. В клетках микроорганизмов найдено порядка 1500 различных ферментов, причем в каждой клетке, по расчетам, содержится в среднем 100 тысяч молекул фермента, а на один фермент приходится 0,1-5% от общего количества белка.

Для промышленного получения ферментного препарата используют как природные штаммы микроорганизмов, выделенные из естественных объектов, так и мутантные штаммы. Продуцентами ферментов могут быть различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи, актиномицеты. Микроорганизмы могут синтезировать одновременно целый комплекс ферментов, но есть и такие, особенно среди мутантных штаммов, которые являются моноферментными, то есть образуют в больших количествах только один фермент [18 ].

За последние 40 лет почти все новые ферментные препараты получены с помощью микроорганизмов, что объясняется быстротой размножения большинства микробов на доступных и относительно дешевых питательных средах, а также возможностью их изменения в желаемом направлении с помощью методов генетической инженерии. С помощью микробиологического синтеза освоено крупномасштабное производство таких гидролаз, как протеазы и гликозидазы [9]. Сериновые протеазы широко используются в моющих средствах. Основными продуцентами этих ферментов являются бациллы. Кислые протеазы полезны в изготовлении сыров. Их продуцируют, например, различные виды низших грибов (Mucor, Endothea и др.). Грибной реннин с успехом заменяет сычужный фермент из желудков телят. Из гликозидаз большое значение приобрели грибные и бактериальные амилазы, катализирующие реакции гидролиза крахмала. Пектиназы, основным продуцентом которых является Aspergillus niger, успешно применяют

при изготовлении фруктовых соков. В промышленных условиях производят и другие ферменты [ 24 ].

Технологически очень важно то, что микроорганизмы выделяют ряд ферментов из клеток в окружающую среду, что существенно облегчает их выделение и очистку. К экскретируемым ферментам, главным образом, относятся гидролазы, амилазы, протеазы и целлюлазы. [18}. Различия в локализации экзоферментов у грамположигельных и грамотрицательных бактерий вызваны, очевидно, неодинаковыми физико-химическими свойствами клеточной стенки [50, 24].

Внеклеточные ферменты грамположигельных бактерий проникают через мембрану и могут временно удерживаться клеточной стенкой, но в конечном итоге они диффундируют в окружающую среду. Однако некоторые ферменты остаются связанными с наружной поверхностью мембраны. Так как эти молекулы проникают через мембрану, их рассматривают как внеклеточные [49}.

У грамотрицательных бактерий существует несколько способов локализации фер�