Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов

Волосова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов"

005004254

На правах рукописи

ВОЛОСОВА Елена Владимировна

СТАБИЛИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МЕТОДОМ ВКЛЮЧЕНИЯ ИХ В СТРУКТУРУ ПРИРОДНЫХ БИОРАЗЛАГАЕМЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Ставрополь-2011

005004254

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный университет»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Воробьева Оксана Владимировна доктор медицинских наук Коготкова Ольга Ивановна доктор биологических наук Селионова Марина Ивановна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля

Защита диссертации состоится «20» декабря 2011 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.109.01 при ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора по адресу: 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.

Автореферат разослан «// » ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Жарникова И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одна из наиболее перспективных задач современной биотехнологии - создание биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов. Преимущество иммобилизованных ферментов перед растворимыми заключается в большей их стабильности, возможности регенерирования и отделения иммобилизованного фермента от продукта реакции. В качестве таких катализаторов могут использоваться ферменты, включенные в пленочные покрытия.

Современные тенденции при разработке композиционных материалов, как основы для иммобилизации, состоят в придании им ряда положительных свойств: способность подвергаться разложению в естественных условиях среды, низкий уровень неспецифичсских взаимодействий с примесями и биологически активными веществами, механическая устойчивость, наличие функциональных групп, пригодных для селективной химической модификации; экологическая чистота процесса получения (Новиченко А.Н., Новикова Т.П., Зеленко И.Н., Мазолевский Д.М., Бондаренко А.П., 2006).

Очевидно, что применение научных подходов, направленных на создание данных материалов с заранее заданными свойствами и функциями на основе иммобилизованных биологических лигандов (ферментов, микробных клеток, антител и нуклеотидов), может способствовать их использованию в медицине, биохимии, фармакологии.

Работы по биоразлагаемым материалам актуальны и востребованы, о чем свидетельствует проведение первой Международной конференции по биоразла-гающимся полимерам и соответствующим композитам (Дербишер В.Е., Герма-шев И.В., Дербишер Е.В., 2008; Заиков Г.Е., Арцис М.И., 2008; Савостова T.JI., Бирюков А.Л., Саркисов П.Д., 2008; Ткачев А.Г., Михалева З.А., Рыбкин C.B., Долгова О.В., 2008).

Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд открытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д.В, 2005; Тулинов А.Б., Корнеев A.A., Овчаренко JI.B., Гармаш И.И., 2007; Андрианова Г.П., 2010; Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г., Азизов A.À., Алосманов P.M., Магеррамов A.M., 2010; Межиковский С.М., 2010; Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., 2010).

Включение ферментов в структуру природных биоразлагаемых полимеров продиктовано необходимостью создания лекарственных повязок нового по-

коления с регулируемым сроком службы и высоким процентом сохранения активности биологической субстанции (Чернобаева М.В., Салим Хусам, Скатков С.А., Демина Н.Б., 2010). В отличие от обычных сорбционных перевязочных средств (марлевых, ватно-марлевых, нетканых материалов, полимерных губок), у которых устанавливается динамическое равновесие концентрации микрофлоры на границе «повязка-рана», биологически активные гелевые повязки обеспечивают пластифицирующее воздействие на ткани раны, размягчают некротические образования, диффундируют под них, облегчая механическое удаление нежизнеспособных тканей, и предотвращая развитие инфекции под струпом (Юданова Т.Н., 2004).

В последние два десятилетия отмечается неуклонное увеличение доли острых гнойно-воспалительных заболеваний. Это связано в основном с неудовлетворительным состоянием экологии во многих регионах, низким социально-экономическим уровнем жизни значительной части населения, со снижением факторов неспецифической противомикробной резистентности, с развитием интегральных гормонально-метаболических нарушений в организме на фоне хронических соматических болезней (Легонькова О.А, 2007; Шавырин В.А., Ква-сенков О.И., 2008; Ухарцева И.Ю., 2009).

На сегодняшний день, параллельно с применением антибиотиков, возрастает число антибиотикорезистентных штаммов бактерий, частота и тяжесть инфекционных осложнений. Таким образом, очевидно, что, несмотря на все достижения современной медицины, инфекция не без основания остается «камнем преткновения» в лечении различных ран. Возникает необходимость в создании принципиально новых препаратов при их лечении.

Альтернативным решением данных проблем могут выступать препараты системной энзимотерапии, относящиеся к группе гидролаз и представленные высокоочищенными протеиназами животного и растительного происхождения, а также фиксированные на различных раневых покрытиях ферментные препараты для местного лечения ран (Ефименко H.A., 2005).

Цель диссертационной работы: стабилизация биологически активных соединений посредством включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов.

Основные задачи исследования:

1. Синтезировать биоразлагаемые пленочные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида, белкового комплекса и пластификатора.

2. Исследовать свойства полученного пленочного материала (спектры поглощения в УФ - области, предел прочности, влагоёмкость).

3. Разработать метод иммобилизации фермента Р - гиалуронидазы и исследовать влияние различных факторов (рН среды, температуры) на его активность. Изучить кинетику ферментативной реакции, динамику потери удельной активности при хранении в различных температурных условиях.

4. Иммобилизовать фермент трипсин в пленочные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его активность (рН среды, температуры, количества субстрата), изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности при хранении в различных температурных условиях.

5. Разработать метод иммобилизации лизоцима и исследовать влияние рН среды, температуры, времени постановки ферментативной реакции и длительности хранения в различных температурных условиях на его активность.

6. Провести апробацию биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных.

Научная новизна работы. Впервые получены принципиально новые пленочные материалы, подвергающиеся биодеградации в естественных условиях. Подобран оптимальный состав для получения биоразлагаемых пленок, обладающих следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, прочность структуры при разрывном напряжении. Проведена иммобилизация ферментных препаратов в структуру биоразлагаемых пленочных материалов с высоким сохранением удельной активности. Установлены факторы, влияющие на ее снижение. Впервые получены пленочные покрытия с иммобилизованными ферментами р - гиалуронидазой, трипсином, лизоцимом, которые могут быть использованы в качестве раневых покрытий в медицине и косметологии. Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые получены биоразлагаемые пленочные материалы с иммобилизованными в их структуру ферментами, способствующими процессу ранозаживления. Разработаны методические приёмы по определению активности ферментов р - гиалуронидазы и

лизоцима по прототипу определения амилазной активности слюны. Упрощена методика определения активности лизоцима относительно ранее известной. Разработаны технологические основы получения пленочных материалов, обладающих ферментативным действием. Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах «Высокомолекулярные соединения» (Лекция «Биоразлагаемые полимерные материалы как основа для иммобилизации фермента»), «Введение в нанотехнологии» (Лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГБОУ ВПО СГУ. В лаборатории микробиотехнологии Научно-образовательного центра «Технологии живых систем и биологические материалы» проведены испытания биодеградируемых пленок (протокол от 28 марта 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Научно-методические подходы к получению биоразлагаемых полимерных материалов.

2. Методы иммобилизации ферментов в структуру пленочных покрытий.

3. Свойства полученных биодеградируемых пленок и раневых покрытий на основе иммобилизованных ферментов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2008), XX симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва, 2009), V ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), 54 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2009), 55 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), 56 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011).

Апробация диссертации состоялась 14 сентября 2011 г. на расширенном заседании кафедры биологической и медицинской химии ФГБОУ ВПО СГУ и базовой кафедры «Технологии живых систем и биологические материалы» ЮНЦ РАН.

Личиын вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О.В., аспирантом Ивановой A.M. (ФГБОУ ВПО СГУ).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 14 опубликованных научных работах, три из которых опубликованы в журналах, рекомендуемых «Перечнем ВАК», имеется 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и приложения; иллюстрирована 14 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 148 отечественных и зарубежных литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована цель проведения исследований.

Материалы и методы исследований

Нами были использованы композиции, содержащие в качестве основы возобновляемый природный биоразлагаемый материал полисахарид - метилцел-люлозу (МЦ). Для получения пластичной пленки в композиции вводили пластификатор (глицерин). В качестве дополнительных компонентов, для придания твердости пленочному покрытию, использовали природный белковый комплекс желатина.

Прочность полимерных материалов определяли при деформации растяжения (ГОСТ 17035-86). Для испытания использовали разрывные и универсальные испытательные машины с электромеханическим приводом - по ГОСТ 7855-84.

Влагопоглощение оценивали по степени набухания исследуемых образцов. Способность пленки к биоразложению (кинетику биодеградации) оценивали по потере массы (Смирнова Е.А., 2006).

Количественное определение белка проводили по методу О. Warburg и W. Christian (1941) сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).

Определение протеолитической активности трипсина основывалось на количественном определении тирозина в продуктах расщепления казеина. Опти-

ческую плотность замеряли в пробе против контроля в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 260 и 280 нм (Алейникова Т.Д., Рубцова Г.В., 1988).

Для количественного определения удельной активности ß - гиалуронидазы и лизоцнма (муколитического (протеолитического) фермента) разработаны и оптимизированы методы иммобилизации ферментов в биоразлагаемые пленки и методы определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал.

Была проведена апробация на беспородных белых крысах разработанных пленочных покрытий с иммобилизованным ферментом трипсином по методу Поповой J1.H. (Кузин М.И., Костюченко Б.М., 1990). О процессе ранозаживле-ния судили по изменению показателя площади и скорости заживления ран.

Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на компьютере (программа EXCEL, STATISTICA 6.0). Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы (Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., 1969; Скутч Д., Уэст Д., 1979).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Синтез бноразлагаемых полимеров как основы для иммобилизации

ферментов

В основу синтеза материалов, обладающих деструктивной способностью, положен принцип разрушения межмолекулярных и внутримолекулярных связей в естественных условиях среды (Воробьева О.В., Иванова A.M., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андрусенко С.Ф., 2011).

Получали 3-5 % раствор метилцеллюлозы. Для этого метилцеллюлозу вносили в воду температурой 50+60 °С. Смесь выдерживали 1,5+2 часа. В полученный коллоидный гель метилцеллюлозы вводили белок животного происхождения - желатин в концентрации от 3 до 8 % от общей массы составляющих композиции. В качестве пластификатора, придающего изделию гибкость, использовали глицерин в концентрации от 0,5 до 1 % от общей массы составляющих композиции. Полученную композицию наносили на гладкую стеклянную поверхность желаемой формы толщиной от 1 до 3 мм и оставляли на воздухе при температуре 20+22 °С на 2-3 суток до полного высыхания (Патент РФ № 2395540). Для анализов использовали по пять экспериментальных серий каждого препарата.

Для получения данных о спектрах поглощения в УФ - области проводили измерения оптической плотности на спектрофотометре СФ-46 (рисунок 1).

185 195 205 215 225 235 245 255 265 275 285 245 305 315 325 335 345 355 365 375 3X5 3V5

. ___ ~ . __ п Л - длина волны.нм

без глицерина 0,1 глицерина А 0,25 глицерина

Рисунок ! - Влияние содержания пластификатора на оптические свойства пленок на основе МЦ, желатина, глицерина Из рисунка 1 видно, что увеличение массовой доли вводимого пластификатора способствует увеличению поглощения в УФ - области.

Данные сравнительного анализа спектров поглощения в УФ - области разработанных биоразлагаемых пленочных материалов свидетельствуют о повышении барьера поглощения, что может быть связано с повышением плотности упаковки в аморфных областях МЦ за счет модификации структуры молекулами глицерина и желатина (Воробьева О.В., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В. и др., 2011).

Таблица 1 - Определение прочности биоразлагаемых пленок по сравнению с полиэтиленом

Состав пленок h, мм 1(1, мм А 0п мм Фпо ширине« МПа бпо ДЛИНС'1 МПа

Состав пленок; МЦ (35,8 масс. %), желатин (8,3 масс. %); глицерин (54,28 масс. %); вода (1,62 масс. %) 0,047 15,0 0,712 15,2 15,26

Полиэтилен 0,040 15,0 0,600 13,7 14,70

ts=4,3; Р=0,95

Полученные пленки были исследованы на прочность по длине и ширине по ГОСТ 14236 - 81 (таблица 1). Из таблицы 1 видно, что полученные пленки по прочности не уступают пленкам из полиэтилена.

Формирование целостной структуры биоразлагаемых материатов и их способность поглощать влагу зависят не только от механизмов взаимодействия компонентов, составляющих основу пленок, но и от их количественного соотношения. Влагопоглощение оценивали по степени набухания исследуе-

мых образцов (рисунок 2) (Воробьева О.В., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В. и др., 2011).

3-е сутки

2-е сутки

8-е сутки

7-е сутки

6-е сутки

Рисунок 3 - Деструкция пленок на основе МЦ в естественных условиях при

контакте с почвой во времени Включение ферментов в структуру природных биоразлагаемых полимеров продиктовано созданием лекарственных повязок нового поколения с регулируемым сроком службы и высоким процентом сохранения активности биологической субстанции. Были выбраны ферменты, относящиеся к классу протеаз, об-

Степеиь

набухания, %

30 20 10 0

Время, сутки

а без глицерина ■ 0,1 г глицерина * 0,25 г глицерина Рисунок 2 - Кинетика набухания биополимеров состава МЦ - желатин с добавлением глицерина Увеличение массы глицерина в структуре материала повышает гидрофиль-ность системы и тем самым увеличивает степень набухания на 32 %. Данное свойство может быть использовано для разработки раневых покрытий на основе биологически активных веществ для применения в медицинской практике. Способность пленки к биоразложению (кинетику биодеградации) оценивали по потере массы (рисунок 3).

4-е сутки

- И -

ладающие свойствами, способствующими процессу заживления, р - гиалурони-даза, трипсин и лизоцим.

Иммобилизация фермента р - гиалуронидазы Для иммобилизации р - гиалуронидазы тестикулярного типа (КФ 3.2.1.35) в структуру пленочного материала использовали водный раствор фермента в объеме 1 мл с концентрацией 0,7-0,8 %.

Полученные пленки анализировали на вопрос сравнения поглощения в УФ -области с пленками, tie содержащими иммобилизованный фермент (рисунок 4).

S 1.5

IK5 145 205 215 225 235 245 255 265 275 285 295 305 315 325 335 345 355 365 375 385 3»5

—»- без фермента

-*»— содержание фермента 7,78 масс.% -Я - длина волны, им -*- содержание фермента 8,54 масс. %

Рисунок 4 - Влияние содержания фермента р - гиалуронидазы на оптические свойства пленок на основе МЦ, желатина, глицерина

Появление дополнительного пика поглощения при длине волны 280 нм связано с присутствием фермента в структуре пленки. Кроме того, повышение концентрации белка увеличивает высоту пика с 1,36 до 1,48, что может быть использовано для количественного определения фермента, иммобилизованного в пленки.

Для анализа активности растворимого и иммобилизованного фермента была разработана методика с использованием в качестве субстрата крахмала.

К 0,2-0,6 мл раствора Р - гиалуронидазы (0,03 г в 2 мл дистиллированной воды) вносили 0,6 мл фосфатного буферного раствора pH = 6,9 и термостатиро-вали 10 минут при 37 °С. Одновременно термостатировали 0,1 %- ный раствор крахмала в 0,9 %-ном водном растворе хлорида натрия. К анализируемому раствору ß - гиалуронидазы добавляли 0,6 мл 0,1 %-го раствора крахмала, смесь перемешивали и инкубировали в течение 30 минут. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 1 N раствора соляной кислоты. После остановки реакции к растворам с опытной и контрольной пробами добавляли 0,6 мл

раствора йода, перемешивали в течение 5 минут и колориметрировали на ФЭК-56 М с красным светофильтром при X = 670 нм в кюветах с толщиной слоя 5 мм.

С целью анализа влияния рН на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента 0 - гиалуронидазы проводили постановку ферментативной реакции в фосфатном буферном растворе с различным значением рН

(5,73; 6,90; 8,00).

Наибольшая удельная активность растворимого и иммобилизованного фермента р - гиалуронидазы наблюдалась при рН = 6,9 и составила 90 мэкв/г и 216 мэкв/г соответственно (рисунок 5).

а о21о « Е

г 5180

5 «

3 г 150

I §•

в ■е.120

I I 90 60

5 5 2

рН

—4— Растворимый фермент Иммобилизованный фермент

Рисунок 5 - Влияние рН на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента (3 - гиалуронидазы С целью анализа влияния температуры на удельную активность фермента пробы выдерживались в термостате при температурах 22 °С, 37 °С, 40 °С, 45 °С

и 55 °С. в течение 30 минут.

Определено, что растворимый и иммобилизованный фермент Р -гиалуронидаза имели максимальную удельную активность при температуре 37 °С, при этом удельная активность составила 80,95 мэкв/г и 134 мэкв/г соответственно (рисунок 6).

О 10 20

-♦— Растворимый фермент

50 „60

Темпфатура, °С -в— Иммобилизованный фермент

Рисунок 6 - Влияние температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента р - гиалуронидазы

Для ферментов, растворенного и иммобилизованного в пленки, была исследована кинетика ферментативной реакции. Были построены зависимости скорости ферментативной реакции от количества субстрата и найдены для них константы Михаэлиса - Ментен.

Полученные данные свидетельствуют о том, что фермент, иммобилизованный в пленки, увеличивает скорость ферментативной реакции в 1,3 раза, кроме того его активность выше растворимого в два раза (рисунки 7, 8).

1/У

10 20 30

■ Растворимый фермент /5е/, мг

■ Иммобилизованный фермент

1,5 ///5/

Иммобилизованный фермент Кт=!3,3 «"•"•Растворимый фермент Кш=9,09

Рисунок 8 - Графическое определение Кт методом двойных обратных величин Лай-нуивера - Берка

Рисунок 7 - Скорость ферментативной реакции растворимого и иммобилизованного фермента Р - гиалуронидазы

Важным аспектом является вопрос сохранения активности фермента в процессе хранения. В этой связи образцы пленок хранились в течении четырех месяцев при температурах +4 "С и 18-25 °С (рисунок 9). Установлено, что Удельная активность фермента составила при температуре 4 °С 66 %, а при температуре 18 - 25 °С - 10 % (рисунок 9). 96,393,0 96;

§ 100

II 80 § 1 60

5 I 40

| I 20

5 = А

67,0

66,5

£ 29,0

й§ ....................

10,0

¡8 Температура +4°С

3 4

Срок наблюдения, месяцы & Температура +18-25°С

Рисунок 9 - Изменение удельной активности иммобилизованного фермента р - гиалуронидазы при хранении

Полученные данные по увеличению активности фермента-биокатализатора при иммобилизации его в структуру пленочных материалов делают возможным использование биологически активных веществ в качестве компонента раноза-живляющих покрытий.

Иммобилизация фермента трипсина

Для иммобилизации трипсина (относится к классу протеиназ, которые гид-ролизируют пептидные связи, отличающиеся друг от друга по месту действия на полипептидную цепь белка) в структуру пленочного материала, была разработана методика, согласно которой фермент в структуру пленок вводили в виде его раствора объемом 1 мл -10 мг кристаллического трипсина в 100 мл 0,005 М раствора соляной кислоты.

Исследовали влияние рН, температуры, продолжительности постановки ферментативной реакции на удельную активность растворимого и иммобилизованного трипсина в ферментативной реакции (таблица 2). Установлено, что максимальное значение ферментативной активности растворимого и иммобилизованного фермента наблюдалось при рН 8,15 и температуре 37 °С и составило 47,5 мэкв/г и 215 мэкв/г соответственно. Продолжительность постановки ферментативной реакции составила 20 минут.

Таблица 2 - Оптимизация факторов, влияющих на постановку ферментативной реакции для растворимого и иммобилизованного трипсина

Факторы Фермент трипсин

растворимый иммобилизованный

рН 8,15 8,15

Температура, °С 37 37

Сохранение активности во времени (4 месяца), % 28 70

Продолжительность постановки ферментативной реакции, мин 20 20

Иммобилизация фермента лизоцима и исследование факторов, влияющих на активность растворимого и иммобилизованного фермента

Фермент лизоцим (муколитический (протеолитический) фермент муко-пептид-М-ацетил-мурамил-гидролазы, катализирующий гидролитическое разрушение многих грамм-положительных бактерий) в структуру пленочного материала вводили в виде водного раствора объемом 1 мл с концентрацией 2 мг/мл (0,082 г пленки растворяли в 8 мл дистиллированной воды).

Методика определения активности лизоцима фотонефелометрическим методом имеет ряд недостатков - необходимость использования эталонного

штамма Мсгососия 1у$о(1е'1кйси5, длительность по времени (Дорофейчук В.Г., 1968). В связи с этим была разработана следующая методика

К 1 мл раствора фермента добавляли 1,6 мл фосфатного буферного раствора рН 6,9. Затем в анализируемый раствор лизоцима вносили 1 мл 0,1 % раствора крахмала в 0,9 % растворе хлорида натрия, смесь перемешивали и инкубировали в течение 4 часов при 37 °С. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 1 N раствора соляной кислоты. После остановки реакции к растворам с опытной и контрольной пробами добавляли по I мл раствора йода, перемешивали в течение 5 минут и колориметрировали на ФЭК-56 М с красным светофильтром в кюветах с толщиной слоя 5 мм при А. = 670 нм.

Влияние входных факторов на выходные данные представлено на рисунке 10.

а) Иммобилизованный фермент б) Растворимый фермент

Рисунок 10 - Динамика изменения удельной активности лизоцима от температуры и рН Установлено, что растворимый и иммобилизованный в пленки лизоцим проявлял наибольшую удельную активность при рН 6,9 и температуре 37 °С, которая составила 83,4 мг крахмала/г фермента и 290 мг крахмала/г фермента соответственно.

Образцы пленок хранились в течении 6 месяцев при температурах 4 °С и 20 °С. При этом остаточную активность измеряли периодически 2-3 раза в неделю. Полученные данные представлены на рисунке 11.

7 30 60 90

Срок хранения, сутки

Я Температура +4 °С ■ Температура +20 °С Рисунок 11 - Сохранение ферментативной активности иммобилизованного лизоцима во времени Из полученной диаграммы можно сделать вывод: пленки, хранящиеся при температуре 4 "С к третьему месяцу хранения имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а пленки, хранящиеся при температуре 20 °С, теряли свою активность на 40 %.

Апробация биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных Апробацию на животных проводили на базе кафедры анатомии, физиологии и гигиены человека ФГБОУ ВПО СГУ. В работе с животными соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964, 2000 ред.). Результаты представлены в

таблице 3 и на рисунке 12 .

Таблица 3 - Результаты апробации на животных пленочных покрытий с ^^мобилизованным трипсином_______

Срок исследования, сутки Площадь раны Ме (25;75), % Статистические различия между группами (Р)

контроль (гр.1) пленка без фермента (гр.2) пленка с трипсином (гр.З) гр.1/ гр.2 гр.2/ гр.З гр.1/ гр.З

1 сутки 86 (58;136) 80(63;128) 86(64; 150) 0,95 0,79 0,89

3 сутки 81(55:125) 76(54; 108) 64(48:110) 0,57 0,95 0,41

5 сутки 59(40:98) 48(41;80) 47(31;77) ^0,57 0,57 0,22

7 сутки 48(28:76) 33(27;57) 29(21:49) 0,49 МУ4 0,18

9 сутки 20(14:31) 16(12;20) 10(8; 15) 0,20 0,07 0,01*

1 1 сутки 5(3:8) 3(2;4) 2(0;4) 0,05 0,47 0,02*

*- статистически значимые различия;

где, площадь раны - в квадратных миллиметрах по дням эксперимента; Ме - медиана (25%; 75%) - интерквартильный размах (Кузин М.И., Ко-

стюченко Б.М., 1990).

Ьо 90

53 80

а.

а; 70

«а

§ 60

* СЗ 50

{">

•С 5 40

о <ь. 30

¡с

и 20

1-3 сутки 4-6 сутки 7-9 сутки 10-12 сутки

Срок исследования, сутки

В Пленка с трипсином 63 Пленка без фермента @ Контроль

Рисунок 12- Скорость заживления ран ((15) для пленочных покрытий с иммобилизованным трипсином Раневой процесс с использованием разработанных пленок характеризовался достоверным уменьшением площади раны в абсолютных значениях в сравнении с контролем с девятых суток исследования. Скорость заживления ран была стабильно высокой с начала эксперимента с максимальным значением в первые трое суток. Повышенная скорость сохранялась на различных этапах эксперимента до девятых суток в сравнении с контролем. Так же достоверно подтверждено, что пленка без фермента обладает слабой ранозаживляющей активностью.

Таким образом, включение в состав биоразлагаемых пленок биологически активных веществ, в том числе протеолитических ферментов, делает возможным расширение спектра представленных на рынке ранозаживляющих материалов.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований получены биодеградируемые пленочные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида метилцеллюлозы, белкового комплекса желатина и пластификатора -глицерина.

длине и ширине соответствует прочности полиэтилена при одинаковых условиях и составляет 15,20 и 15,26 Мпа соответственно.

Показано влияние на влагоёмкость пленочного материала пластификатора -глицерина, введение которого в структуру пленочного материала в количестве 10,28 масс. %, повышает гидрофильность системы и увеличивает степень набухания на 32 %.

3. Разработан метод иммобилизации фермента Р - гиалуронидазы и исследовано влияние факторов на его активность. Определены оптимальные параметры, при которых фермент р - гиалуронидаза, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 216 мэкв/г: рН среды - 6,9; температура - 37 °С; время постановки ферментативной реакции - 40 минут. Установлено, что скорость ферментативной реакции для иммобилизованного фермента выше скорости реакции для растворимого фермента в три раза. Показана динамика потери удельной активности при хранении иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев. Установлено, что при температуре 4 °С удельная активность фермента составила 66 %, а при температуре 18-25 °С- 10%.

4. Проведена иммобилизация трипсина в пленочные материалы и определен оптимум рН, температуры и времени постановки ферментативной реакции. Установлено, что трипсин, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность - 171,5 мэкв/г при рН среды - 8,15 и температуре - 37 °С, время постановки ферментативной реакции - 20 минут. Определено, что оптимальное массовое соотношение компонентов в системе субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг казеина на 0,025 мг фермента (40:1). На основании результатов исследования установлено, что иммобилизованный трипсин, хранящийся при температуре 4 °С, к четвертому месяцу хранения имел стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а хранящийся при температуре 20 °С, потерял свою активность на 80 %.

5. Установлено влияние рН и температуры на активность растворимого и иммобилизованного лизоцима. Определено, что лизоцим, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 290 мг крахмала/г фермента при рН среды - 6,9 и температуре - 37 °С, при этом время постановки ферментативной реакции составило 4 часа. Показано, что пленки с иммобилизованным лизоцимом, при температуре 4 °С к третьему месяцу хранения имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности - 80 %.

6. В ходе апробации полученных биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных (крысах) в качестве

ранозаживляющих покрытий, установлено, что скорость заживления была стабильно высокой с начала эксперимента с максимальным значением заживления в первые трое суток, что свидетельствует об эффективности разработанных материалов при лечении ран различной этиологии. Раневой процесс с пленкой с трипсином характеризовался достоверным уменьшением площади раны в абсолютных значениях и отмечался с третьих суток эксперимента по сравнению с контролем и пленкой без фермента.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Аванесян С.С., Андрусенко С.Ф., Воробьева О.В., Иванова A.M., Волосова Е.В., Каданова A.A., Филь A.A. Пленка для «авоськи» // Экология и жизнь. - 2009. - № 10. - С. 30-32 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

2. Воробьева О.В., Иванова A.M., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андрусенко С.Ф., Каданова A.A. Получение ферментативных пленочных материалов на основе природных полисахаридов // Известия высших учебных заведений. Химия и химическая технология. Иваново. - 2011. - Т. 54, Вып. I. - С. 53-56 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

3. Воробьева О.В., Иванова A.M., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андрусенко С.Ф. Модификация природных полимеров для синтеза материалов подвергающихся биодеградации // Химия в интересах устойчивого развития. -2011. - № 19. - С. 137-140 (из перечня ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий).

4. Андрусенко С.Ф., Филь A.A., Каданова A.A., Козлитина Е.В. Разработка биотехнологии получения, исследования состава и биологических свойств биоразлагаемых полимеров на основе природных полимерных структур // Материалы Московской международной конференции «Мир биотехнологии». - М.: ЗАО «Экспобиохимтехнологии»: 2008 . - С. 44.

5. Аванесян С.С., Андрусенко С.Ф., Воробьева О.В., Каданова A.A., Волосова Е.В., Филь A.A. Природные биоразлагаемые материалы на основе белков и полисахаридов // XX симпозиум: Современная химическая физика. - Туапсе: 2008. -С. 30.

6. Воробьева О.В., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Филь A.A., Каданова A.A., Андрусенко С.Ф. Биодеградируемые материалы на основе полисахаридов и белковых компонентов // Перспективные разработки науки и техники. Przemyst, Польша. - 2008. - С. 42-46.

7. Филь A.A., Волосова Е.В., Воробьева О.В., Аванесян С.С., Ростова М.С., Иванова A.M. Иммобилизация ß - гиалуронидазы методом включения в биоразлагаемые полимерные пленки // Материалы V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва 2-4 декабря 2008 г./ Под ред. Р.Г. Васильева. - М.: ИАЦ, 2008. - С. 187-188.

-208. Андрусенко С.Ф., Каданова A.A., Волосова Е.В. Модификация природных полимеров для получения материалов, подвергающихся биодеструкции // Материалы V съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва 2-4 декабря 2008 г./ Под ред. Р.Г. Васильева. - М.: ИАЦ, 2008. -С. 14-16.

9. Волосова Е,В. Получение биодеградируемых пленок для использования в " качестве раневых покрытий // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона. Университетская наука региону. Материалы 54-научно-методической конференции «Университетская наука -региону». - Ставрополь: СГУ, 2008. - С. 51-52.

Ю.Воробьева О.В., Филь A.A., Аванесян С.С., Пшеничная Э.Н., Волосова Е.В. Иммобилизация ферментов методом включения в биоразлагаемые материалы // Материалы Московской международной конференции «Мир биотехнологии».- М.: ЗАО «Экспобиохимтехнологии»: 2009 г. - С. 222.

I \ .Волосова Е.В., Иванова A.M., Воробьева О.В., Филь A.A., Аванесян С.С. Гиалуронидазные биоразлагаемые полимерные материалы // Материалы V ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН: 8-27 апреля 2009 г. - Ростов-на-Дону: ЮНЦ РАН, 2009. - С. 11-12.

12.Воробьева О.В., Иванова A.M., Аванесян С.С., Волосова Е.В. Биосенсоры для обнаружения фосфорорганических пестицидов // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона. Университетская наука региону. Материалы 55 научно-методической конференции «Университетская наука региону» - Ставрополь: СГУ, 2010. - С.101-102.

13.Аванесян С.С., Волосова Е.В., Воробьева О.В. Создание раневых покрытий ферментного действия // Биоразнообразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье населения региона Университетская наука региону. Материалы 56 научно - методической конференция. «Университетская наука региону» -Ставрополь: СГУ, 2011 г. - С. 152-153.

14. Волосова Е.В., Аванесян С.С., Воробьева О.В. Высокоактивные биоматериалы // Материалы IV Международной научно - практической конференции. - Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г. - Ростов н/Д: СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. -С. 138-139.

15. Аванесян С.С., Андрусенко С.Ф., Волосова Е.В., Воробьева О.В., Каданова A.A. Способ получения композиций, подвергающихся биодеструкции на основе простого эфира целлюлозы. Патент РФ RU № 2395540 С 2 -№ 2008140578/04; заявлено 13.10.2008; опубл. 27.02.2010, Бюл. № 21. - 2 с.

Выражаю искреннюю благодарность инженеру кафедры биологической и медицинской химии ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный университет Аванесян Светлане Суреновне за помощь, оказанную при постановке и проведении научных исследований.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ И ЕДИНИЦ

УФ - ультрафиолетовая область

ОП - оптическая плотность

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ФГБОУ ВПО - федеральное государственное бюджетное

СГУ образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный университет»

МЦ - метилцеллюлоза

ТХУ - трихлоруксусная кислота

МПа - мега паскаль

У.Е. - условные единицы

ФЭК-56М - фотоэлектроколориметр 56 М

мэкв/г мин - микроэквивалент на грамм фермента в минуту

мэкв/г - микроэквивалент на грамм фермента

Кщ - константа Михаэлиса - Ментен

ВОЛОСОВА Елена Владимировна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 16.11.2011

Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman Бумага офсетная. Печать трафаретная Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. 0,9. Тираж 100 экз. Заказ № 442.

Отпечатано в ООО «Ставропольское издательство «Параграф»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волосова, Елена Владимировна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ,

СИМВОЛОВ И ЕДИНИЦ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

5 1.1. Анализ методов получения, свойств биоразлагаемых композитов и их применение в качестве основы для иммобилизации биокатализаторов.

1.2. Иммобилизация биологически активных веществ на носители различной природы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, ОБРОРУДОВАНИЕ И МЕТОДЫ ИС

СЛЕДОВАНИЯ.

2 • 1 • Материалы и реактивы.

2.2. Оборудование.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Определение удельной активности растворимого трипсина.

2.3.2. Приготовление фосфатного буферного раствора.

2.3.3. Метод определения прочности полимерных материалов при деформации растяжения.

2.3.4. Определение степени набухания полимерных материалов из жидкой фазы воды.

2.3.5. Количественное определение белка в растворе.

2.3.6. Количественное определение удельной активности

Р-гиалуронидазы.

2.3.7. Определение активности лизоцима.

2.3.8 Проведение апробации биоразлагаемых пленочных материалов на экспериментальных животных.

2.3.9. Методы математической и статистической обработки материалов.

Глава 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ БИОРАЗЛАГАЕМЫХ МАТЕРИАЛОВ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ФЕРМЕНТАМИ 3.1 Синтез биоразлагаемых полимеров как основы для иммобилизации ферментов.

3.2. Иммобилизация фермента р - гиалуронидазы.

3.2.1 Влияние рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента (3 - гиалуронидазы.

3.2.2. Влияние температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента Р - гиалуронидазы.

3.2.3. Изучение кинетики ферментативной реакции.

3.3. Иммобилизация фермента трипсина.

3.3.1. Влияние рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента трипсина.

3.3.2. Влияние температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента трипсина.

3.3.3. Влияние времени постановки ферментативной реакции и количества фермента на изменение удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента трипсина.

3.4. Иммобилизация фермента лизоцима и исследование факторов, влияющих на активность растворимого и иммобилизованного фермента лизоцима.

3.4.1. Влияние рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента лизоцима.

3.4.2. Влияние температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента лизоцима.

3.4.3. Изучение влияния времени постановки ферментативной реакции на изменение удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента лизоцима.

3.5. Апробация биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов"

Одна из наиболее перспективных задач современной биотехнологии - создание биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов. Преимущество иммобилизованных ферментов перед растворимыми заключается в большей их стабильности, возможности регенерирования и отделения иммобилизованного фермента от продукта реакции. В качестве таких катализаторов могут использоваться ферменты, включенные в пленочные покрытия.

Современные тенденции при разработке композиционных материалов, как основы для иммобилизации, состоят в придании им ряда положительных свойств: способность подвергаться разложению в естественных условиях среды, низкий уровень неспецифических взаимодействий с примесями и биологически активными веществами; механическая устойчивость, наличие функциональных групп, пригодных для селективной химической модификации; экологическая чистота процесса получения (Новиченко А.Н., Новикова Т.П., Зеленко И.Н., Мазолевский Д.М., Бондаренко А.П., 2006).

Работы по биоразлагаемым материалам актуальны и востребованы, о чем свидетельствует проведение первой Международной конференции по биоразла-гающимся полимерам и соответствующим композитам (Дербишер В.Е., Герма-шев И.В., Дербишер Е.В., 2008; Заиков Г.Е., Арцис М.И., 2008; Савостова Т.Л., Бирюков А.Л., Саркисов П.Д., 2008; Ткачев А.Г., Михалева З.А., Рыбкин C.B., Долгова О.В., 2008).

Овчаренко Л.В., Гармаш И.И., 2007; Андрианова Г.П., 2010; Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г., Азизов A.A., Алосманов P.M., Магеррамов A.M., 2010; Межи-ковский С.М., 2010; Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А., 2010).

Включение ферментов в структуру природных биоразлагаемых полимеров продиктовано необходимостью создания лекарственных повязок нового поколения с регулируемым сроком службы и высоким процентом сохранения активности биологической субстанции (Чернобаева М.В., Салим Хусам, Скат-ков С.А., Демина Н.Б., 2010). В отличие от обычных сорбционных перевязочных средств (марлевых, ватно-марлевых, нетканых материалов, полимерных губок), у которых устанавливается динамическое равновесие концентрации микрофлоры на границе «повязка-рана», биологически активные гелевые повязки обеспечивают пластифицирующее воздействие на ткани раны, размягчают некротические образования, диффундируют под них, облегчая механическое удаление нежизнеспособных тканей, и предотвращают развитие инфекции на поверхности раны под струпом (Юданова Т.Н., 2004).

В последние два десятилетия отмечается неуклонное увеличение доли острых гнойно-воспалительных заболеваний. Это связано в основном с неудовлетворительным состоянием экологии во многих регионах, низким социально-экономическим уровнем жизни значительной части населения, со снижением факторов неспецифической противомикробной резистентности, с развитием интегральных гормонально-метаболических нарушений в организме на фоне хронических соматических болезней (Легонькова О.А, 2007; Шавырин В.А., Квасенков О.И., 2008; Ухарцева И.Ю., 2009).

На сегодняшний день, параллельно с применением антибиотиков, возрастает число антибиотико-резистентных штаммов бактерий, частота и тяжесть инфекционных осложнений, попутно изменяющих свои клинические черты. Таким образом, очевидно, что, несмотря на все достижения современной медицины, инфекция не без основания остается «камнем преткновения» в лечении ч различных ран. Возникает необходимость в создании принципиально новых препаратов при их лечении.

Основные задачи исследования:

4. Иммобилизовать фермент трипсин в пленочные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его активность (рН среды, температуры, количество субстрата), изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности при хранении в течение в различных температурных условиях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые получены принципиально новые пленочные материалы, подвергающиеся самостоятельной деградации в естественных условиях. Подобран оптимальный состав для получения биоразлагаемых пленок, обладающих следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, прочность структуры при разрывном напряжении.

Проведена иммобилизация ферментных препаратов в структуру биоразлагаемых пленочных материалов с высоким процентом сохранения удельной активности.

Проведены исследования, направленные на изучение факторов, влияющих на снижение удельной активности ферментов при их иммобилизации в структуру биоразлагаемых пленочных материалов.

Впервые получены пленочные покрытия с иммобилизованными ферментами р - гиалуронидазой, трипсином, лизоцимом, которые могут быть использованы в качестве раневых покрытий в медицине и косметологии.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена 1 патентом РФ на изобретение.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Получены биоразлагаемые пленочные материалы с иммобилизованными в их структуру ферментами, способствующими процессу ранозаживления.

Разработаны методические приёмы по определению активности ферментов р - гиалуронидазы и лизоцима по прототипу определения амилазной активности слюны. Упрощена методика определения активности лизоцима относительно ранее известной.

Разработаны технологические основы получения пленочных материалов, обладающих ферментативным действием.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах «Высокомолекулярные соединения» (Лекция «Биоразлагаемые полимерные материалы как основа для иммобилизации фермента»), «Введение в на-нотехнологии» (Лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГБОУ ВПО

СГУ. В лаборатории микробиотехнологии Научно-образовательного центра «Технологии живых систем и биологические материалы» проведены испытания биодеградируемых пленок (протокол от 28 марта 2008 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Научно-методические подходы к получению биоразлагаемых полимерных материалов.

2. Методы иммобилизации ферментов в структуру пленочных покрытий.

3. Свойства полученных биодеградируемых пленок и раневых покрытий на основе иммобилизованных ферментов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты диссертационной работы были представлены на Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва,

2008), XX симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва,

2009), V ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), 54-научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2009), 55-научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010), IV Международной конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины"(Ростов-на-Дону, 2011), 5 научно-практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О.В., аспирантом Ивановой A.M. (ФГБОУ ВПО СГУ).

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание диссертации отражено в 14 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК - 3 статьи), имеется 1 патент РФ на изобретение.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 133 страницах, содержит 14 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 148 отечественных и зарубежных литературных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Волосова, Елена Владимировна

выводы

2. Установлено, что при увеличении массовой доли пластификатора в составе пленочного материала увеличивается светопоглощение в УФ - области спектра. Прочность разработанных пленочных материалов, на разрыв по длине и ширине соответствует прочности полиэтилена при одинаковых условиях и составляет 15,20 и 15,26 Мпа соответственно.

3. Разработан метод иммобилизации фермента Р - гиалуронидазы и исследовано влияние факторов на его активность. Определены оптимальные параметры, при которых фермент Р - гиалуронидаза, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 216 мэкв/г: рН среды - 6,9; температура - 37 °С; время постановки ферментативной реакции - 40 минут. Установлено, что скорость ферментативной реакции для иммобилизованного фермента выше скорости реакции для растворимого фермента в три раза. Показана динамика потери удельной активности при хранении иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев. Установлено, что при температуре 4 °С удельная активность фермента составила 66 %, а при температуре 18-25 °С-10%.

4. Проведена иммобилизация трипсина в пленочные материалы и определен оптимум рН, температуры и времени постановки ферментативной реакции. Установлено, что трипсин, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность - 171,5 мэкв/г при рН среды - 8,15 и температуре -37 °С, время постановки ферментативной реакции - 20 минут. Определено, что оптимальное массовое соотношение компонентов в системе субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг казеина на 0,025 мг фермента (40:1). На основании результатов исследования установлено, что иммобилизованный трипсин, хранящийся при температуре 4 °С, к четвертому месяцу хранения имел стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а хранящийся при температуре 20 °С, потерял свою активность на 80%.

6. В ходе апробации полученных биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных (крысах) в качестве ранозаживляющих покрытий, установлено, что скорость заживления была стабильно высокой с начала эксперимента с максимальным значением заживления в первые трое суток, что свидетельствует об эффективности разработанных материалов при лечении ран различной этиологии. Раневой процесс с пленкой с трипсином характеризовался достоверным уменьшением площади раны в абсолютных значениях и отмечался с третьих суток эксперимента по сравнению с контролем и пленкой без фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Создание биоразлагаемых материалов с иммобилизованными в их структуру протеолитическими ферментами представляет большой интерес с точки зрения использования в медицине в качестве ранозаживляющих повязок.

Синтезированы пленочные материалы на основе природного полисахарида метилцеллюлозы с использованием глицерина как реагента-пластификатора и белкового комплекса желатина для модификации реологических характеристик с иммобилизованными в их структуру ферментами класса протеаз. В ходе выполнения исследований было доказано, что иммобилизованные ферменты имеют большую способность к деструкции субстрата, чем растворимые.

Структурные особенности пленочных материалов были подтверждены исследованием физико-химических свойств.

Данные сравнительного анализа спектров поглощения в УФ - области разработанных и традиционных пленочных материалов свидетельствуют о повышении барьера поглощения, что может быть связано с повышением плотности упаковки в аморфных областях МЦ за счет модификации структуры молекулами глицерина и желатина. Модификация МЦ молекулами желатина может осуществляться путем ковалентного связывания боковых аминокислотных остатков полипептидных цепей последнего с функциональными группами МЦ.

Прочностные характеристики материала-основы обеспечивают их практическое применение. Полученные данные по величинам прочности на разрыв по длине и ширине - 15,2 и 15,26 (МПа) соответственно обусловлены изменением потенциальной энергии межмолекулярного взаимодействия, преимущественно потенциальной энергии вращения вокруг ковалентных связей монозвеньев МЦ.

Влагопоглощение оценивали по степени набухания исследуемых образцов. Увеличение массы глицерина в структуре материала повышает гидро-фильность системы и тем самым увеличивает степень набухания на 32 %.

Данное свойство может быть использовано для разработки раневых покрытий на основе биологически активных веществ для применения в медицинской практике.

Разработан и оптимизирован метод иммобилизации фермента Р - гиалу-ронидазы тестикулярного типа в биоразлагаемые пленки и метод определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Удельная активность иммобилизованного фермента - 216 мэкв/г, что составляет 240 % от удельной активности растворимого.

Анализ влияния рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента р - гиалуронидазы показал, что наибольшая удельная активность растворимого и иммобилизованного фермента Р - гиалуронидазы наблюдалась при рН = 6,9 и составила 90 мэкв/г и 216 мэкв/г соответственно.

С целью анализа влияния температуры на удельную активность фермента был поставлен ряд экспериментов, которые показали, что растворимый и иммобилизованный фермент р - гиалуронидаза имеют максимальную удельную активность 80,95 мэкв/г и 134 мэкв/г соответственно при температуре 37 °С.

Была изучена кинетика ферментативной реакции растворимого и иммобилизованного фермента Р - гиалуронидазы. При достаточно высоких концентрациях субстрата ферментативный процесс не может контролироваться диффузией субстрата, и, следовательно, реакция протекает в кинетической области. Этот факт подтверждается прямолинейной зависимостью Лайнуивера

1 1

Берка в координатах — +. Кроме того, характер температурной зависимости ферментативной реакции с использованием фермента Р - гиалуронидазы подтверждает выше изложенное высказывание, т.к. повышение температуры должно способствовать переводу реакции из кинетической области в диффузную и активность фермента растворимого и иммобилизованного не должна уменьшаться, чего на практике не происходит.

Полученные данные по константам Михаэлиса-Ментен свидетельствуют о том, что фермент, иммобилизованный в пленки увеличивает скорость ферментативной реакции в 1,3 раза, кроме того его активность выше растворимого в два раза. Увеличение активности связано со стерическим фактором, отвечающим за беспрепятственное перемещение молекул субстрата к активным центрам фермента.

Важным аспектом является вопрос сохранения активности фермента в процессе хранения. В результате хранения иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев при температуре 4 °С удельная активность фермента составила 66 %, а при температуре +18 °С - 10 %. Следует отметить, что ферменты, являясь биологически активными субстанциями, способны терять активность в процессе хранения.

Для иммобилизации трипсина в структуру пленочного материала была разработана методика определения удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов.

Для образцов полученных пленочных материалов были проанализированы спектры поглощения в УФ области. Появление дополнительного пика поглощения при длине волны 280 нм связано с присутствием фермента трипсина в структуре пленки. Этот факт может быть использован для определения содержания фермента в структуре пленки.

Анализ влияния рН среды и температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного трипсина показал, что максимальное значение ферментативной активности наблюдалось при рН 8,15 и температуре 37 °С и составило 47,5 мэкв/г и 215 мэкв/г соответственно. Предполагается, что высокая удельная активность иммобилизованного фермента может сохраняться при повышении температуры. Установлено, что время постановки ферментативной реакции составляет 20 минут.

Определено, что оптимальное массовое соотношение компонентов в системе субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг казеина на 0,025 мг фермента (40:1).

Анализ полученных данных показал, что удельная активность иммобилизованного фермента выше растворимого в среднем в 4 раза, кроме того, иммобилизованный фермент проявляет высокую ферментативную активность в процессе длительного хранения.

Было изучено влияние сроков хранения и температурных условий на сохранение удельной активности фермента, иммобилизованного в пленки. Иммобилизованный трипсин, хранящийся при температуре 4 °С к четвертому месяцу хранения имел стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а хранящийся при температуре 20 °С, потерял свою активность на 78 %. При включении протеолитических фермента в пленочные покрытия можно добиться стабилизации их против автолиза за счет изменения микроокружения.

Пленки с иммобилизованным ферментом трипсином отличаются гидро-фильностью, эластичностью, прозрачностью и способностью к деградации путем гидролиза основных связей макромолекул основы при взаимодействии с физиологической средой. Это позволяет получить ферментный препарат пролонгированного действия, который может найти применение в медицине и косметологии.

При иммобилизации лизоцима (муколитического, протеолитического фермента), в структуру биоразлагаемых пленок была разработана методика определения удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Предлагаемый метод прост в использовании, экспрессен.

Доказано, что растворимый и иммобилизованный в пленки фермент ли-зоцим проявлял наибольшую удельную активность при рН 6,9 и температуре 37 °С, которая составила 83,4 мэкв/г и 290 мэкв/г соответственно.

Разработанные пленочные материалы с иммобилизованным в его основу ферментом трипсином прошли апробацию на животных, по результатам которых можно сделать следующие выводы.

Раневой процесс с использованием разработанных пленок характеризовался достоверным уменьшением площади раны в абсолютных значениях в сравнении с контролем с девятого дня исследования. Скорость заживления была стабильно высокой с начала эксперимента с максимальным значением первые три дня. Повышенная скорость сохранялась на различных этапах эксперимента до девятого дня в сравнении с контролем. Так же достоверно подтверждено, что пленка без фермента обладает слабой ранозаживляющей активностью проявляющейся к концу эксперимента.

Таким образом, включение в состав основы биоразлагаемых пленок биологически активных веществ, в том числе различных ферментов, обладающих определенным набором свойств, делает возможным расширить спектр представленных на рынке ранозаживляющих материалов.

111

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волосова, Елена Владимировна, Ставрополь

1. Аверко-Антонович И.Ю., Бикмуллин Р.Т. Методы исследования структуры и свойств полимеров: Учебное пособие. Казань: КГТУ, 2002. - С. 45-49.

2. Адамян Р.Т., Зелянин A.C. Современные подходы к разработке эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных им-плантатов // Материалы III межд. конф. М.: МЗ РФ, 1998. - С. 368.

3. Алейникова Т.Д., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. М.: Высшая школа, 1988. - С. 44-69.

4. Александров A.A., Стрекалова Г. Р. Новые полимерные материалы с биодеградабельными свойствами // Успехи в химии и химической технологии. Вып.13. Тез. докл. 13-й Междунар. конф. мол. по химии и хим. технол. МКХТ 99. -Ч. 2. - Москва: 1999. - С. 35.

5. Андреев Д.Ю., Парамонов Б.А., Мухтарова A.M. Современные раневые покрытия. Часть 2 // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2009. -Т. 168.№ 4.-С. 109-112.

6. Андреев Д.Ю., Парамонов Б.А., Мухтарова А.М. Современные раневые покрытия. Часть 1 // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2009. -Т. 168. № 3.-С. 98-102.

7. Андрианова Г.П, Физико-химические основы создания и модификации многослойных композиционных пористых и волокнисто-пористых полимерных материалов // Дизайн и технологии. 2010. - № 17. - С. 7081.

8. Балабушевич Н.Г., Сухоруков Г.Б., Ларионова Н.И. Включение белков вполиэлектролитные микрокапсулы из декстрансульфата, протамина и меламин формальдегид // Вестник Московского университета. 2002. -Серия 2. Химия. - Т. 43. № 6. - С. 374-377.

9. Белов A.A., Филатов В.Н., Белова E.H., Лебедева А.Н. Разработка и исследование свойств текстильных материалов, содержащих протеоли-тические ферменты // Химические волокна. 2008. - № 5. - С. 52-54.

10. Березин И.В., Киесов A.A., Швядас В.К. и др. Инженерная энзимология. М.: Высшая школа, 1987. - 144 с.

11. Березин И.В., Мартынек K.M. Введение в прикладную энзимолоппо. -М.: МГУ, 1982. С. 26-100 с.

12. ОНПО «Пластполимер», 1989. С. 42-49.

13. Богомольный В .Я., Даурова Т.Т., Афиногенов Г.Е. и др. Антимикробные пленки на основе поливинилового спирта // Тез. докл. VI всесоюз. симп. «Синтетические полимеры медицинского назначения». Алма-Ата: 1983. -С. 111-113.

14. Богуш JI.K., Шварцман Л.Я. Применение протеолитических ферментов при туберкулезе легких. М.: Медицина, 1970. - 128 с.

15. Большаков И.Н., Кириченко А.К., Еремеев A.B., Власов A.A. Применение коллаген- хитозанового раневого покрытия с культурой эмбриональных фибробластов при местном лечении глубоких ожогов // Фундаментальные исследования. 2008. - № 10. - С. 59-60.

16. Бородина Т.Н. Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений: автореф. дис. канд. хим. наук: 03.00.23.-М., 2008.-20 с.

17. Бородина Т.Н., Румш Л.Д., Кунижев С.М., Сухоруков Г.Б., Ворожцов Г.Н., Фельдман Б.М., Марквичева Е.А. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ // Биомедицинская химия. 2007. - Т. 53. № 5. - С. 557-565.

18. Воронин А.М. Имобилизация клеток микроорганизмов: биотехнологические аспекты // Микробиология. 1999. - Т.68. - № 6. - С. 809-815.

19. Будневский C.B. Новые раневые покрытия, содержащие серотонин и трипсин, в лечении экспериментальных гнойных ран (экспериментальное исследование): автореф. дис. канд. мед. наук: 14.01.17. Москва,2006. 20 с.

20. Буниятзаде И.А., Мамедов Г.Г., Азизов A.A., Алосманов P.M., Магер-рамов А.М. Магнитный сорбент для удаления тонких нефтяных пленок // Известия вузов. Химия и хим. технология. 2010. - Т. 53. Вып. 4.1. С. 114-117.

21. Буряк В.П. Биополимеры настоящее и будущее // Полимерные материалы. - 2005. - №12 (79). - С. 22-27.

22. Валуев И.Л., Талызенков Ю.А., Обыденнова И.В., Валуев Л.И., Платэ H.A. Синтез и функциональные свойства термочувствительных полимерных производных белков // Высокомолекулярные соединения.2007.-Т. 49.№ 6.-С. 1131-1135.

23. Васильева Т.С., Субботко O.A. Перевязочный материал с пролонгированным лечебным действием. Патент RU 2101033, А61 L 15/22. Опубл. 10.01.98, Бюл.№1.

24. Введение в прикладную энзимологию иммобилизованные ферменты / Под ред. И. В. Березина, К. Мартинека. - М.: Изд-во МГУ, 1982. - С.383.

25. Берниковский В.В., Степанова Э.Ф. Иммобилизованные протеазы для очищения раневых поверхностей // Российский химический журнал. -2010.-Т. 54.№ 6.-С. 94-100.

26. Берниковский В.В., Степанова Э.Ф.Иммобилизация трипсина в некоторых мазевых основах // Вестник новых медицинских технологий. -2006. T. XIII. № 4. - С. 130-132.

27. Вилкинсон Д., Диксон М., Уэбб Э. Принципы и методы диагностической энзимологии. Т. 1-3. - М.: Ферменты, пер. с англ., 1982.1. С. 289-295.

28. Вилкинсон Д., Диксон М., Уэбб Э. Принципы и методы диагностической этимологии. Т. 1-3. - М.: Ферменты, пер. с англ., 1982. - С. 486488.

29. Во Тхи Хоай Тху, Аксенова Т.И., Сдобникова O.A., Самойлова Л.Г. Принципы создания биоразлагаемого биобезопасного полимерного материала // 7-ая международная специализированная выставка «Мир биотехнологии 2009». Москва: 2009. - С. 250-251.

30. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - С. 106.

31. Володысин Д.В. Иммобилизация белков в микрочастицы, сформированные методом последовательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов: автореф. дис. . канд. хим. наук: 02.00.15, 03.00.23.-М., 2005.-24 с.

32. Воробьева О.В. Биосорбенты для иммобилизации белковых комплексов ферментных препаратов // Биотехнология. 2004. - № 2. - С. 70.

33. Воробьева О.В., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Филь A.A., Каданова A.A., Андрусенко С.Ф. Биодеградируемые материалы на основе полисахаридов и белковых компонентов // Перспективные разработки науки и техники. Przemyst, Польша. 2008. - С. 42-46.

34. Воробьева О.В., Иванова А.М., Аванесян С.С., Волосова Е.В., Андрусенко С.Ф. Модификация природных полимеров для синтеза материалов подвергающихся биодеградации // Химия в интересах устойчивого развития. 2011. - №19. с. 137-140.

35. Воронин A.C. Применение раневых покрытий в комплексном лечении ран и раневой инфекции кожи и мягких тканей // Аспирантский вестник Поволжья.-2010.- № 7-8.-С. 158-161.

36. Гайда A.B. Модифицированные кремнеземные носители в биотехнологии // Вестник химического общества им. Д.И. Менделеева. 1989.1. Т. 34, № 3.-С. 350-361.

37. Гальбрайх JI.C., Скокова И.Ф., Талаленкова О.С., Юданова Т.Н. Получение и свойства полимерных композиций, содержащих лизоцим и протеазу С // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - № 2. - С. 67-71.

38. Гафаров М.Р., Юсупов P.A., Михайлов О.В. Сорбция ионов Ag(I) Агар-агар иммобилизованными метасульфидами // Тезисы Поволжской конференции по аналитической химии. Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2002. - № 8. - С. 45.

39. Глухов В. Химия и бизнес. 1997. - № 25. - С. 34-35.

40. Голованова П. М., Евстафьева Е. А., Тузова Н. Н., Макарова JL Р., Добыт С. В. О разработке раневых покрытий на основе биосинтетических полимеров // Все о мясе: Состояние. Проблемы. Перспективы. -2005.-№1.-С. 57-58.

41. ГОСТ 11262-80 (CT СЭВ 1199-78) «Пластмассы. Методы испытания на растяжение». Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 21 ноября 1980 г. № 5521 срок введения установлен с 01.12.80. М.:- 11 с.

42. Гусейнов А.И. Раневые покрытия с протеолитической и антиоксидант-ной активностью в лечении гнойных ран: автореф. дис. канд мед. наук: 14.00.27 . Москва, 2006. - 20 с.

43. Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Савинцева И.В., Гаврилюк Б.К. Биосинтетические раневые покрытия субстраты для роста клеток // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. - № 1. - С. 52-58.

44. Дегтярева С.Н., Донцова Э.П., Жаренкова О.А., Кириллова Т.Н. Саморазрушающиеся полимерные пленки // Пластические массы. 1999. -№ 10.-С. 12.

45. Дербишер Е.В., Гермашев И.В., Дербишер В.Е. Нечеткие множества в химической технологии // Известия вузов. Химия и хим. технология. -2008. Т. 51. Вып. 1. - С. 104-110.

46. Дорофейчук В.Г. Определение активности лизоцима нефелометриче-ским методом // Лабораторное дело. 1968. - № 1. - С. 28-30.

47. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991.-464 с.

48. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. -М.: Мир, 1991.- С. 154.

49. Егоров Н.М. Практикум по микробиологии. Москва: МГУ, 1976. -С. 58.

50. Жагарт Р.А. Иммобилизация ферментов на силикатных носителях // Успехи биологической химии. 1977. - Т.18. - С. 140-158.

51. Заиков Г.Е., Арцис М.И. Первая международная конференция по био-разлагающимся полимерам и соответствующим композитам // Известия вузов. Химия и хим. технология. 2008. - Т. 51. Вып. 1. - С. 123125.

52. Зуев Ю.Ф., Захарченко Н.Л., Ступишина Е.А., Файзуллин Д.А., Вы-легжанина Н.Н. Особенности иммобилизации субстрата и каталитическая активность трипсина в обращенной микроэмульсии // Вестник s МГУ: Серия 2. Химия. 2003. - Т. 44. - С. 13-15. i

53. Игнатюк Т.Е., Медушева О.Е, Белов А.А. Перевязочные материалы сметаллокомплексами на основе иммобилизованного трипсина // Тез. доклада IV симпозиума «Химия протеолитических ферментов». М.: ИБХ РАН, 1997. - С. 146.

54. Икоев Т.М., Синицына Н.И., Лебедев А.П. Ранозаживляющий препарат и хирургическая ранозаживляющая салфетка. Патент RU 2114639, А 61 L 15/44. Опубл. 10.07.98, Бюл. №19.

55. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудвор-да. М.: Мир, 1988.-215 с.

56. Кивман Г.Я., Ляшенко Ю.В., Рабинович Э.З., Флейдерман Л.И. Гидроколлоидные покрытия новое поколение средств для лечения ран и ожогов // Химико-фармацевтический журнал. 1994. - Т. 28. № 9 .1. С. 58-61.

57. Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова A.C. Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. - Т. 8. № 6.1. С. 1035-1041.

58. Коровина М.А. Разработка технологии получения лечебных текстильных материалов для хирургии и онкологии: автореф. дис. канд. техн. наук: 05.19.03. М., 2000. - 32 с.

59. Котельникова Н.Е., Михайлова С.А., Власова E.H. Иммобилизация протеолитических ферментов трипсина и а-химотрипсина на целлюлозной матрице // Журнал прикладной химии. 2007. - Т. 80. № 2. - С. 323-330.4, Д.

60. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Володина В.П., Колесов C.B. Биодеградация пленочных полимерных покрытий на основе хитозана // Вестник Башкирского университета. 2008. - Т. 13. № 1. - С. 23-26.

61. Кумарев В.П. Иммобилизация белков и ферментов на альдегидосило-хромах // Биоорганическая химия. 1976. - Т. 2. №5. - С. 700-705.

62. Купцова C.B. Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами: авто-реф. дис. канд. хим. наук: 03.00.04. М., 2000. - 24 с.

63. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Применение иммобилизованных физиологически активных веществ белковой природы в медици-не.Введение в прикладную энзимолоппо. М.: МГУ, 1982. - С. 284-305.

64. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Современное состояние и перспективы использования в медицине иммобилизованных физиологически активных ве ществ белковой природы // Хим. фарм. журн. 1980. - № 4.1. С. 21-36.

65. Легонькова O.A. Биоразлагаемые полимерные материалы в пищевой промышленности // Пищевая промышленность. 2007. - № 6. - С. 2628.

66. Лисичкин Г.В. Достижения, проблемы и перспективы химического модифицирования поверхности минеральных веществ // Журн. Всесоюз. хим. общества им. Д.И. Менделеева. 1989. - Т. 34. № з. с. 291 -297.

67. Масько A.A. Иммобилизация трипсина на углеволокнистых носителях, различающихся структурой, пористостью и химией поверхности // Прикладная биохимия и микробиология. 19992. - Т. 28, № 2. - С. 211 -216.1. А Î».и122 1I

68. Масько A.A., Морозова A.A., Лыга Л.К., Галушко H.A. Иммобилизация hтрипсина на углеволокнистых носителях, различающихся текстурой, ||-Япористостью и химией поверхности // Прикладная биохимия и микро- !биология. 1994. - Т. 28. № 2. - С. 211-216. $г

69. Медушева Е.О., Филатов В.Н., Рыльцев В.В. Новые изделия медицинского назначения на основе модифицированной целлюлозы с иммобилизованными лекарственными средствами // Материалы конгресса. -Москва: Ч. 1,2005. С. 52 -54.

70. Межиковский С.М Об истории создания и 50-летней деятельности отдела полимеров и композиционных материалов // Клеи. Герметики. Технологии. 2010. - № 9. - С. 3-8.

71. Методические рекомендации под редакцией Главного хирурга МО РФ, профессора Ефименко H.A. Полиферментные препараты в гнойной хирургии. 150 с.

72. Мирзарахметова Д.Т., Дехконов Д. Б., Рахимов М.М. Свойства инвер-тазы, ковалентно иммобилизованной на активированном угле // Прикладная биохимия и микробиология. 2009 . - Т. 45. № 3. - С. 287-291.

73. Моисеева A.A. Разработка технологии получения текстильных лечебных материалов с адгезионными свойствами: автореф. дис. . канд. техн. наук: 02.00.06. М., 1998. - 34 с.

74. Мосс Д. Ферменты. «Мир» - М.: Мир, 1970. - С. 63-65.

75. Муродов Э.А., Уринов Э.У., Тураев A.C. Молекулярно-массовые и конформационные характеристики карбоксиметилцеллюлозы и ее нит-роэфиров // Пластические массы. 2010. - № 5. - С. 17-19.

76. Николаев А Я. Биологическая химия. М.: Мир, 1989. - С. 76-77.

77. Новиченко А.Н., Новикова Т.П., Зеленко И.Н., Мазолевский Д.М.,

78. Бондаренко А.П. Применение новых отечественных раневых покрытий для местного лечения ожоговых ран // Скорая медицинская помощь. -2006.-№3.-С. 127-128.

79. Олтаржевская Н.Д., Коровина М.А. Текстиль для медицины: новые лечебные композиционные материалы // Текстильная промышленность. -2010.-Т. 5.-С. 58-62.

80. Практическая химия белка / пер. с англ. / под ред. А. Дарбре М: Мир, 1989.-С. 22-23.

81. Прямые инвестиции // Наука и жизнь. 2006. - № 11(55). - С. 59.

82. Раны и раневая инфекции. Под ред. М.И. Кузина и Б.М. Косиоченко // М., Медицина. - 1990.- С. 592 .

83. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ. М.: Медиа Сфера. - 2006. - 312 с.

84. Савинцева И.В., Селезнева И.И., Давыдова Г.А., Гаврилюк Б.К. Нано-композитные биосинтетические раневые покрытия субстраты для роста клеток // Альманах клинической медицины. - 2008. - № 17-2. -С. 350-353.

85. Савостова Т.Л., Бирюков А.Л., Саркисов П.Д. Управление интеллектуальными ресурсами основа инновационной деятельности // Известия вузов. Химия и хим. технология. - 2008. - Т. 51. Вып. 1. - С. 114-119.

86. Скобелева В.Б., Руденская Г.Н., Руденская Ю.А. Изучение энзиматиче-ской активности иммобилизованной морикразы // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2000. - № Т. 41. № 6. - С. 395-398.

87. Скуч Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. М.: Мир, 1979. -Т. 1. - С.71- 73. с.

88. Смирнова Е.А. Термодинамика совместимости компонентов и реологические свойства смесей синтетических полимеров с полисахаридами: автореф. дис. канд. хим. наук: 02.00.04. Екатеринбург, 2006. - 24 с.

89. Солдатенкова В.Н. Лазерное изучение и новая микроволокнистая форма иммобилизованного трипсина в комплексном лечении гнойных ран. Москва: Государственный Научный Центр лазерной медицины Министерства здравоохранения РФ, 2005. - С. 17-65.

90. Солдатова Л.С., Бабич О.О. Повышение каталитической активности и стабильности химотрипсина за счет ковалентной иммобилизации на магнитных наночастицах Рез04 // Техника и технология пищевых производств. 2010. - Т. 16. № 1. - С. 69.

91. Способ получения иммобилизованной пероксидазы / Брыкалов A.B., Воронина О.В., Несмеянова И.В., Маслова И.В. // RU N2005784 С 1, кл. С. 12, №11/14.-1994.

92. Страйер Л. Биохимия. Т.1 изд. - М.: Мир, 1984. - 227 с.

93. Суворова А.И., Тюкова И.С., Труфанова Е.И. Биоразлагаемые полимерные материалы на основе крахмала // Успехи химии. 2000. - № 5. -С. 494-504.

94. Сыновей A.C., Левицкий А.П. Ингибиторы протеолитических ферментов в медицине. Киев: Здоровье, 1979. - 78 с.

95. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журнал микробиологии. -1969. № 10. - С. 26-31.

96. Ткачев А.Г., Михалева З.А., Рыбкин C.B., Долгова О.В. Создание катализаторов для производства углеродных нанотрубок // Известия вузов.

97. Химия и химическая технология. 2008. - Т. 51. Вып. 1. - С. 86-90.

98. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир, 1983. - С. 208.

99. Троицкий A.B. Дис. канд. мед. наук. Новосибирск, 1998. - 109 с. Разработка способа получения лекарственных препаратов на основе иммобилизованных протеаз Вас. Subtilis: автореф. дис. канд. мед. наук: 14.02.03. - Новосибирск, 1998. - 24 с.

100. Устинов М.Ю., Артеменко С.Е., Овчинникова Г.П., Вихорева Г.А., Гу-зенко А.Н. Состав и свойства биодеградируемых полимеров // Химические волокна. 2004. - № 3. - С. 25-28.

101. Ухарцева И.Ю. Самодеструктируемые полимерные материалы // Пластические массы. 2009. - № 6. - С. 45-48.

102. Фармокопейная статья предприятия // ФГУП НПО «Микроген» -Томск, 1995. С. 6-9.

103. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе. М.: Мир, 1991. -204 с.

104. Хигтинс И., Бест Д., Джонс Дж. Биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 1988. - 480 с.

105. Хирургия тяжёлых гнойных // Под ред. Е.Г. Григорьева, A.C. Когана. -Новосибирск: Наука, 2000. С. 314.

106. Чернобаева М.В., Салим Хусам, Скатков С.А., Демина Н.Б. Пленочные покрытия пероральных лекарственных форм // Фармация. 2010. -№8.-С. 45-51.

107. Чудо пленка, или Слово о бактериальной целлюлозе // Электронная версия журнала. - СПб., 2007. - №3 (3751)

108. Шавырин В.А., Квасенков О.И. Экологическая безопасность тары и упаковки // Хранение и переработка сельхозсырья. 2008. - № 12.1. С. 61-63.

109. Шаскольский Б.Л. Биотехнология // Теоретический и научно-практический журнал. 2009. - № 1. - С. 71-80.

110. Шеховцова Т.Н., Мугинова C.B., Веселова И.A. Enzymatic methods of analysis: novel approaches and applications // Известия Российской академии наук. Серия химическая. 2007. - № 4. - С. 583.

111. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф. Применение волокнистых полиэлектролитов в качестве носителей а -амилазы // Журнал прикладной химии. 2005. - Т. 78. № 6. - С. 1003-1005.

112. Юданова Т.Н. Полимерные раневые покрытия с ферментативным и антимикробным действием: автореф. дис. . д-ра хим. наук: 02.00.06. -Москва, 2004.

113. Юданова Т.Н., Решетов И.В. Современные раневые покрытия: получение и свойства. П. Раневые покрытия с иммобилизованными протеоли-тическими ферментами (обзор) // Химико-фармацевтический журнал.2006.-Т.40.№ 8.-С.24-31.

114. An environment for healing: the role of occlusion / Ed. by T J.Ryan. London, The Royal Society of Medicine, 1985. 158 p.

115. Baaden В., Carnevale K. Production and consumption of polypropylene fibers and filaments move on // The Chemical Journal. 2005. - № 6-7.1. P. 43.

116. Beyond occlusion: wound care proceedings / Ed. by T J.Ryan. London, The Royal Society of Medicine Services, 1988. 141 p.

117. Cao, L. Immobilised enzymes. / L. Cao, L. van Langen, R.A. Sheldon // Curr. Opinion in Biotehnol.-2003. -V. 11.-N.14. P. 387-394.

118. Chen Zun. Исследование по иммобилизации глюкоамилазы на привитой крахмальной подложке / Chen Zun, Kong Wei, Zhou Hui, Li Wei, Shen Jia-Cong //Shengwu huaxue zazhi. Chin. Biochem.j. 1995. - V.ll, №2. - P. 150-154.

119. Chonde, Y. Acrylate based adsorbent resin for the immobilization of enzymes / Chonde, Y., Paul, M.A. // Pat. 4897352. USA С 12 № 11/08. -1990. P. 168.

120. Jchijo Hisao, Nagasawa Junichi, Yamauchi Aizo. Immobilization of bio-catalysis with poly (vinyl alcohol) supports //J.Biotechnol. 1990. - V.I 4, №2.-P. 169-178.

121. Kabanov V.A., Skobeleva V.B., Rogacheva V.B. and Zezin A.B. Sorption of Proteins by Slightly Cross-Linked Polyelectrolyte Hydrogels: Kinetics and Mechanism. J. Phys. Chem. B, 2004, v. 108, - P. 1485-1490.

122. Nakasaki K. et al. Kagaku Kogaku / Chem. Eng., Jap., 1995. V.59, - № 7, -P.496-497.

123. Nano Letters., 2003, -3(6), P. 829-832.

124. S. abuek, Polymery / S. abuek, J. Pajk, B. Nowak, E. Majdiuk., 2002. Vol. 47, № 4. - P. 256 - 261.

125. Schlicht R. Kunststoffe., 1998. B. 88, № 6. - P. 888-890.

126. Sinclair R.G. J. Macromol. Sci. A., 1996. V. 33, № 5, - P. 703.

127. T. Kagaku to Kogyo / Chem. And Chem. Ind., 1997. V.50, № 7, - P. 1024.

128. Tailleur J.-P. Usine nouv., 1998. Hors serie nov. P. 76-77.

129. Walters M.P., Littlewood J.M., 1996. P. 196-200.

130. Wang Jing et al. Huanjing kexue / Chin. J. Environ. Sei., 1998. V. 19, № 5, -P. 52.

131. Wang Jing et al. Huanjing kexue / Chin. J. Environ. Sei., 1998. V. 19, №12, - P.57.

Информация о работе

Волосова, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Ставрополь, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы