Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение стафилококковых гиалуронидаз и перспективы их практического применения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение стафилококковых гиалуронидаз и перспективы их практического применения"

ТБИЛИССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ!'! УНИВЕРСИТЕТ гол. Й.Джавахишвили

На правах рукописи

ЛОВДЗЕ Манана Киулиевна

ШДЕЛЕНИЕ И ИЬУЧЕНИЕ СТАФИЛОКОККОВЫХ ЫАЛУРОНЗДАЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

03.00.07 - Микробиология

А в т оре'Т)ерат диссертации на соискание ученой степенл кандидата биологических наук

Тбилиси - 1952

Работа выполнена в Тбилисском научно-исследовательской инотитуте вакцин и сывороток.

Назчные руководителя - член-корреспондент АН Грузия

доктор биологических наук, профессор Т.Г.Чанишвили

кандидат биологических наук Ц.С.Турманидзе

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, професс!

Г.К.Кацитадзе

кандидат биологических наук Р.Ш.Адамия

Ведуцая организация - Тбилисский государственные медицин ский институт, кафедра микробиологии, вируоояогии и иммунологии

Защита диссертации состоится " 2М " _19Е

в " I?03 " час. на заседании Специализированного совета К 057.03.12 Тбилисского государственного университета.

Адрес: 380043 - Тбилиси, Университетская, К 2. Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тбилисского государственного университета.

Автореферат разослан " ^ " _ 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета , ,,

кандидат биол.науя, доцент И{((СНО&?{( Н.М.ЦИНЦАДЗЕ

ВВЕДЕН ЙЕ

Актуальность проблема. В последние года в большом яоли-естве появились публикации об использовании различных фер-ентнах препаратов в медицине. Широков внедрение ферментов в едицинской практике обусловлено их свойством действовать вы-окоспецифично, отборочно, относительно быстро и, в болыпинст-е случаев, без побочных явлений. На сегодня большинство ис-ользованннх в терапевтической практике ферментов являются хя-ютного или растительного происхождения. В то же время особен-:о перспективными для использования в медицине считаются фер-[ентн микроорганизмов. Большим преимуществом последних является разнообразность каталитической активности, неограниченность, ;ешевизна и доступность источников их получения.

Гиалуронидаза принадлежит к числу наиболее широко исполь-¡уемых ферментов в медицине. Она расщепляет основное вещество ¡оединительной ткани - гиалуроновую кислоту и вызывает увели-генае проницаемости тканей, что в свою очередь улучшает прохо-симость веществ через лимфатическую и кровеносную систему. Гиа-¡уронидазосодержащЕе препараты применяются в офтальмологии, ги-■екологнз, травматология, анастезиологии и в ряде других сфер ¡едицины.

Гиалуронадазосодерлацие препараты в основном производятся [з животного сырья. В напгей стране применяются препараты "липаза" , "рошдаза" из тестикул бит и барана, но из-за дефяцит-юстя источника получения производство этих препаратов лимити-юваяо, что ограничивает возможности их использования.

Поль и ватачк исследования. Целью настоящей работа являл-

Те

ся подбор условий культивирования и питйЛьной ореды для максимального биосинтеза гиалуронидазы ¡it.aureus 015 , создание лекарственного препарата стафилококковой гиалуронидаз и его практическое применение, а также подбор резервны! высо коактивных продуцентов и сравнительное изучение физико-хими ческих и иммунологических свойств гиалуронидаз из разных ста филококковых штаммов.

Научная новизна. Изучены закономерности биосинтеза гаа луронидазы st.aureus 015 . Разработаны оптимальные уел вия культивирования продуцента, обеспечивающие высокий урове гиалуронидазной активности, селекцированы высокоактивные шта мы-продуцента стафилококковой гиалуронидазы, изучены физико-химические и иммунологические свойства, в частности молекуля нне формы, массы, еубстратспецифичность, им8*уноопешгфичност1 антигенный состав, термоставильнос ть гиалуронидаз различных стафилококковых шташов. Разработана технологическая схеме получения и контроля лечебного препарата гиалуронидазы из

üt,aureus 015.

Практическая ценность работы. Получена стерильная, алирс генная, нетоксичная лекарственная форма гиалуронидазы st.ai .tus oís , которая по данным экспериментального изученш на животных увеличивает проходимость веществ как подкояно, : и в центральную лимфатическую систему. На ограниченном числ( больных установлено безвредность и фармакологическая активность препарата.

Разработана стандартная полуоинтетическая питательная с]

да пригодная как для производства гиалуронидазы 3t.aureus с так и для селекции высокоактивных продуцентов, стафилококки

гиалуронядаз. Подобраны резервные шташы для производства.

Ацроботдая работы. Материала диссертации долояенн на 6-ом всесоюзной- вкипозиуме инженерной энзимологии (Вильнюс, 1988), на конференции иолодах ученых медиков (Баяурианя, 1988), на всесоюзной конференции "Актуальные вопросы разработки препаратов иедацинскй биотехнология" (Махачкала, I988), на итоговой конференции ТбилНИИВС (Тбилиси, 1991).

Шбжккяття. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Содержание н объезд шбогн. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, экспериментальной части, вкло-ч&кцей глава о тгатериалах к методах и результатах работы, обсуждения, ваводов и списка цитируемой литература. Работа изло-аена на /Ч^ страницах аеаннопиеного текста, включает 15" таблиц. рисунков, X, схем и 3 прилсшения.

ЗКСПтИЕНТАЛШЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОЛУ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качество основного иетода для определения активности

гягяуронидазн использовала турбидотлетрический метод ( I'olk-

sdorf , 1954). Гиалуронядознуи активность" выражали в тур-

бидЕ.чзтричэскпх единицах - в единицах уменьшения мутности

( Turbiditi reducing unit), tru ). За единицу гиалу-

ронндазной активности приникали такое количество фермента,

которое уизньпает наполозпну мутность, образущуссл при сме-

пвяии 0,2 мг гналуропота катая с подкисленной сывороткой при

определенных условиях - 37°С и рн - 5,5 (продолян^ельность реакции 30 а 5.

В качестве субстрата применяли гиалуроновую кислоту из стекловидного тела глаз.

Активность гиалуронидазы определяли также методом муцино-вого сгустка - реакцией предупреждения образования муциновогс •сгустка субстрата (гиалуроновой кислоты) - по временной фармг копейной статьи ВФС 42-182-72 (метод применяется для определения активности "Лидазы"). Субстратом служила гиалуроновая кислота, полученная из пупочных канатиков.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури ( uowry et.al. ( 1951) и спектрофотоглетрически ( Warburg , Chris-ti&n , 1941).

Исследование гомогенности гиалуронидазы проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле ( oavia , 1964) на приборе фирмы "Реанал" (ВНР). Молекулярную массу гиалуро-нидаз определяли методом гальфильтрации (Детерман, 1970).

В работе использованы ДЕАЕ - сефаделв фирмы""Sigma" Ж1).

Для ультрафильтрации использовали мембранные фильтры daw г* 29325 с размером пор 0,65 мкм или 0,85 мкм (фирмы "Миллипор"). Ш-10 и Ш-30 (фирмы "Амикон" - США).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Изучение закономерности биосинтеза гиалуронидазы в зави< МОСТИ от УСЛОВИЙ культивирования ot.aureus 015.

На начальных стадиях работы фермент гкалуронидазу получ) из културальной жидкости st.aureus 015, предназначенной; производства стафилококкового анатоксина. Для этой цели шта

3t.aureus 015 культивировался в 5 литровых баллонах в термо-¡тате при 37°С с подачей углекислого raáa ( I л СО в сутки на ¡аллон) на казенно-растительной кислотно-гидролизатной питате-1ноЗ среде в течение 5 дней. Была изучена в производственных словиях зависимость продолжительности культивирования штамма ¡t.aureus 015 на накопление в культуральной жидкости гиалу-онидазной активности. Максимальным титр гиалуронидазы отмечзл-я через 5 суток роста л соотавлял 5+2 ед/мл, что совпадало

0 времени с какоимумом накопления «v-токсина в культуральной реде. Однако значительное накопление гиалуронидазной актив-ости наблюдалось с первых дней культивирования продуцента,

го создавало перспективы подобрать условия выращивания проду-энта, обеспечивайте высокий уровень продукции гиалуронидазы а более короткое время.

Для в той цела st.aureus 015 культивировали на той se плательной среде в литровых колбах Эрленмейера с рабочим объе-ял 200 мл на качалке марки АВС-бс (скорость 100—125 встряхи— ший в мин. при температуре 37°С+0,^. Посевным материалом гулила 48-часовая бульонная культура st.aureus 015. При

1 учении динамики накопления гиалуронидазной активности в ку-.туральной жидкости в этих условиях было установлено, что '.алуронидазная активность достигала максимума 22- 1,3 ед/мл

6-ом часу культивирования. При параллельном изучения кине-жи роста продуцента было установлено, что динамика накопле-:я ферментативной активности не коррелирует с кинетикой раз-оаения бактерии (рис.1).

Для получения больших объемов культуральной хздкости (до

Рис.1, Зависимость между кинетикой роста st.aureus 015 и

динамикой накопления гиалуронидазнвй активности при выращивании продуцента в колбах на качалке:

».. — _» _ кривая рости микроорганизмов

"--" - кривая накопления гиалуронидазной активности

/30 литров''./ штамм st .aureus 015 выращивали в реакторе марки AF0-50 фирмы "ЛКБ" при 37°С методам глубинного культивирования при непосредственном аэрировании и перемешивании /количество подаваемого воздуха I л/мин /. Посевньг." материалом использовали ш-часввую глубинную культуру St.aureus 015. В этих условиях максимальный биосинтез гиалуронцдазы достигается через б часов культивирования и составляет 5I-I.7 ед/мл /рис.2/. При внращивании в реакторе происходит как получение большого объема культуральной нидкоати, так и значительное накопление гиалуронидазнвй активности на единицу объема. Исходя из этого данный метод культивирования успешно можно применять для производства стафилококковой гиалуронидазы.

Таким образом, изменением условий культивирования было достигнуто не только 20-кратное уменьшение времени культивирования, но и значительное увеличение гиалуронидазной активности в объеме культуральной жидкости.

Разработка оптимальной питательной среды культивирования St.aureus QI5 для продукции гиалуронидазы

Как отмечено выше культивирование штамма st.aureus 015, продуцирующего гиалуронидазу проводили на казеино-рястительной кислотно-гидролизатной питательной среде следующего состава (в %)•. неполный (кислотный) гидролпзат казеина - 33,3; экстракт отрубей - 1,07; дрохжевой экстракт - 1,8; однозамещен-ный фосфат калия - 0,1; двухзамещенный фосфат натрия - 0,1;рн-

- 7,4. Данная среда имеет ряд недостатков. В первую очередь это нестандартность составных компонентов и трудоемкость при--готовленяя. Для конструирования полусинтетичвской среды были заменены некоторые компоненты, в частности, экстракт отрубей it и дрожжевая вода, определенными химическими веществами для ^¿»достижения стандартности среды и высокого уровня гиалуронидаз-ной активности.

Базовой средой для нашей работы явилась сконструированная нами же под руководством Кикалишвили В.Н. "Питательная среда для выращивания st.aureus 015 продуцента * -токсина" (авторское свидетельство СССР № 4424194) следующего состава на I литр: панкреатический гидролизат казеина - 15,0 г; смесь витаминов - 0,2 г; глицин - 3,5 г; глицерин - 1,0 г; дистиллированная вода до I литра рн- 7,0-7,2.

Так как эта среда была предназначена для получения высокого уровня а -токсина и учитывая данные литературы о том.чтс дрожжевой экстракт способствует выработке гиалуронидаэы стафилококками в рецептуру среда ввели дрожжевой экстракт. С помопц математического метода оптимизации состава питательной среды и при количественном изменении дрожжевого экстракта паикриати-ческого гидролизата казеина и глицина сконструирована среда следующего состава: панкреатический гидролизат казеина - 30,0 смесь витаминов - 0,2 г; однозамещенный фосфат калия - 1,2 г; глицин - 3,5 г; глицерин - 1,0 г и дрожжевой экстракт - 0,5 г; дистиллированная вода до I литра, p¡(. 7,0-7,2. На этой среде при выращивании st.aureus 015 в колбах на качалке ; в течение 6 часов гиалуронидазная активность составляла 34+1,5

д/мл, что давало увеличение гиалуродиназной активности на 64$ :о сравнению с казеино-растительной средой. Статистическая еб-аботка данных, полученных при выращивании st.aureus 015 на |бейх средах показала, что полусинтетическая питательная среда владеет более высокой степенью стандартности (табл.1).

Таблица I

Результаты статистической обработки данных, полученных при выращивании st.aureus 015 на различных питательных средах

татистические данные Казеино-рас-тительная питательная среда Полусинтетическая среда

"иалуронидазная активность:

редняя арифметическая ед/мл (И) 21.28 34.9

реднее квадратное откло-ение (6 ) 4.82 2.73

тандартная ошибка ( ™ ) 1.83 0.27

оэффицие^т вариации 22.6 7.3

Селекшя высокоактивных продуцентов гиалуронидазы

В качестве тест-организмов использовали музейные штаммы 3t.aureus , полученные из лаборатории по изучению производственна культур ТбилННИВС, ВНИИ стандартизации и контроля им. Тара-:евича г.Москвы и свезевыделенные из Республиканской инфекцион-юй больницы и Всесоюзного научного центра хирургии г.Москвы.

Наличие гиалуронидазной активности проверяли методом муцин-

ного сгустка по Мак-Клини. Культуры стафилококка выращивали в течение 18-24 часов в пробирках при 37°С+0,1 в пептонной воде.

Для количественного анализа гиалуронидазной активности стафилококковые штаммы выращивали на сконструированной нами полусинтетической среде на качалке при 37°С в течение 6 часов.

На способность синтезировать гиалуронидазу было проверено 86 музейных штаммов st.aureus . Из них 83$ обладали гиалуронидаз ной активностью, большинство невысокой - от I до 3 ед/мл куль-туральной жидкости и только 1% - характеризовались высокими по-. казателями - выше 10 ед/мл (рис.За).

Из 54 штаммов st.aureus полученных из Всесоюзного научного центра хирургии 91$ продуцировали гиалуронидазу, из них 24$ - с высокой активностью. Эти штаммы в основном были выделены из ран (рис.36).

Из Республиканской инфекционной больницы г.Тбилиси поступило 56 штаммов st.aureus . Из них 88% обладали способностью синтезировать гиалуронизаду, в том числе 9$ с активностью 10 ед/мл и более (рис.Зв). Штаммы были высеяны из крови, гнойных выделений уха и дыхательных путей.

Таким образом, способность синтезировать гиалуронидазу не является абсолютным свойством патогенных стафилококков. Из изученных 196 штаммов гиалуронидазу синтезировали 87,2$. Свежевы-деленные штаммы характеризуются более высокой способностью биосинтеза гиалуронидазы, чем музейные. Активные продуценты гиалу-ронидазы наиболее часто встречаются (24$) среди штаммов непосредственно выделенных из ран (табл.2). К тому же как показали проведенные эксперименты сконструированная наш полусинтетичес-

а) - музейными Q

б) - из ран 0

в) - из гнойных выделений уха и дыхательных путей.S

кая среда' пригодна не только для выращивания штамма 3t.aureus 015 - продуцента гиалуронидазы, но и для селекции высокоактивных продуцентов этого фермента.

На основе проведенного скрининг-эксперимента были подобраны наиболее высокоактивные продуценты гиалуронизады: лтамм st. aureus 777, отобран из культур Всесоюзного научного центра хирургии, стабильно синтезирующий гиалуронидазу активностью 32+2 ед/ыг;'St»Hood 46, полученный из музея ВНИИ стандартизации и контроля, который обладает способностью образовывать гиалуронидазу с активностью 40+3,5 ед/мл.

Таблица 2"

Результаты изучения гиалуронидазной активности штаммов разного происховдения

Источник выделения Количество штаммов

штаммов Всего иоразование гиалуронилази

+ -

Колич. % Колич. %

I. Музейные штаммы 86 72 83,7 14 16,

2. Штаммы выделенные из ран 54 50 92,5 4 7,

3. Штаммы из гнойных выделений уха и дыхательных путей 56 49 87,5 7 12,

Получение, очистка и изучение свойств гиалуро-нидаз штаммов st.aureus 777 и st.i/.ood 46

Для получения гиалуронидаз штаммы st.aureus 777 и st.wood 46 выращивали на полусинтетической питательной среде в колбах. Микробную биомассу отделяли на сепараторе марки АсГ-ЭМ или ультрафильтрацией через фильтры типа 293.25 фирмы "Милипор" с размером пор 0.42 мкм. Фильтрат культуры охлаждали до 4°С и $ej мент осаждали добавлением равного объема этилового спирта, ох-лазденного до -20°С . После 30 мин осадок отделяли центрофигу-рованием при 3000 об/мин в течение 15 мин, растворяли в 0.006 I фосфатном буфере рн- 7.2 до полного перехода ферментативной аг тивности в раствор и концентрировали на фильтрующем аппарате фирмы "Минитан" (размер фильтрующих волокон 10000) до 50-60 мл. Последующую очистку фермента производили методом ионообменной хрономотографии на ДЗАЭ-сефецеле (фирмы "Сигма"). Спиртоосажден-ный ферментный препарат в 0.006 М фосфатном буфере наносили на колонку с ионообменником. Высота ионообменника 10 см (колонка

ирмы "Фармация" К 50/30). Скорость нанесения и элюции препа-ата 60 мд/мин. Элюциго ферментов проводила ступенчатым методом помощью фосфатного буфера рн- 7.0-7.2 увеличением ионной сп-ы 0.006 - 0.1 - 0.06М. Гиалуронидазные фракции элюировались .06 М фосфатным буфером. Эти фракции концентрировали с помощью льтрафильтрации двухкратным промыванием концентрата на фильтре ля удаления солей, после чего ферменты рехроматографировали в ех же условиях. Полученные ферментные фракции опять кояцентри-эвали и высушивали лиофильно.

Полученные по вышеуказанной схеме гиалуронидазы штаммов at. aureus 777 И St.'.Vood 46 ЯВЛЯЮТСЯ ВЫСОКООЧИИ0ННЫМИ пре-араташ. Степень очистки гиалуронидазы штаммы st.aureus 777 -39.4, удельная активность 2661 ед/мг (табл.3). А степень очис-иг гиалуронидазы штамма st.wood 46 - 720, удельная активность 320 мл/мг (табл.4).

Таблица 3

Очистка гиалуронидазы st.aureus 777

Стадии очистки Общая активность (ел/мл) Удельная активность (ел/мг) Степень очистки Выход по актив- воъ

гльтуральная жидкость 29800 4.16 0 100

шртоосазденный препарат '25780 Г45.8 35.04 86.5

юматографированный пре- 19370 420 100.9 65

tpaT

¡хроматографированный 21396 2661 639.4 72.8

wm ., ,

Степень очистки лиофильно высушенных препаратов определяли !Тодом диск-электофореза в полиакриламидном гелэ при рн- 8.3. ЭТИХ условиях гиалуронидазы St .aureus 777 И St .Wood 46 дают

Таблица 4

Очистка гиалуронидазы штамма st...ood 46

Стадии очистки Общая активность (ед/мл) Удельная активность (ед/мг) Степень очистки Выход актив ж

Культуральная жидкость 35500 5,3 0 100

Йпиртоосалденный препарат 31240 172,5 32,5 88

Хроматографический пре- 24850 556 104,9 70

парат

Рехроматографический пре- 27150 3820 L 720 76

парат

по 2 белковые полосы. Появление двух белковых полос можно объя нить наличием двух молекулярных форм фермента, что подтверадае ся с помощью получения этих форм гель-фильтрацией. Высокоочице: ные препараты гиалуронидаз st.aureus 777 и st.wood 46 при ¡ несении на колонку с сефадексом g -100 элшруются в виде двух белковых фракций, которые обладают гиалуронидазной активностью Молекулярные массы этих форм, определенные методом гель-фи. трации на сефадексе g -100 составляли для гиалуронидаз st.wood 46 - 72000 и 12300 и для гиалуронидаз st.aureus 777 -66000 и 13000 (рис.4).

Установлена строгая субстратспецифичность гиалуронидаз st ,е reus 777 и st.ivood 46. Эти ферменты расщепляют только гиа луроновую кислоту к не действуют на другие гликозаминогликаны, такие как хондроитинсульфаты и гепарин (табл.5).

Сравнительное изучение термостабилъностя при температуре 50°С и 60°С показало, что гиалуронидаза st.wood 46 характеризуется более высокой термостабнлыюеттло, чем гиалуронидаза

Рис. 4. Определение молекулярных масс гиалуронидаз st. a u re us 777 и st.wood 46 методов гель-фильтрации на сефадексе G -100.

st.aureus 777 (рис.5, рис.6). При инкубации при 60°С гиалуро-нидаза st.aureus 777 ухе на 5-ой минуте теряет 97£ активности, в то время как гиалуронидазa st.wood 46 на 10-ой минуте инкубации сохраняет 56% активности и только через 20 мин. инкубации наблюдается полная ее потеря. Гиалуронидазы обеих штаммов характеризуются высокой стабильностью при многократном замораживании и оттаивании.

Изучение иммунологических свойств стафилококковых гиалуронидаз

Изучение антигенных свойств гиалуронидазы шташа st.aureus 015 проводили методом двойной радиальной иммунодиффузии по Ух-

Таблица 5

Действие гиалуронидаз st.aureus 777 и st.wood 46 на различные гликозаминогликаны

Субстрат Активность гиаетоонилазы ея/мл

Si'faureue$77 Гиалуронидава st.waod 46

Гиалуроновая кислота 34 32

Хоцдроитинсульфат А , - -

Хоцдроитинсульфат Б - -

Хондроитинсульфат С - -

Гепарин -

Рио.5. Терыостабильность гиалуронидаз st.oureus777 ( )

и sr.woou 46 (----) при 50°С.

Рис.6. Термостабильность гиалуронидаз at.aureus777 ( --)

и st.wood 46 (----) при 60°С.

терлони в 1% геле агарозы. Для прециштационного анализа использовали с одной стороны полученную наш методом активной иммунизации кроликов специфическую антигиалуронидазную сыворотку (в качестве антигена при иммунизации использовали рехроматогра-фический препарат гиалуронвдазыst.aureus 015), с другой стороны вноокоочищенную стафилококковую гиалуронидазу в кратных разведениях. Стафилококковая гиалуронидаза дает одну линию преципитации со специфической антигиалуронидазной сывороткой, что указывает на гомогенность использованного антигена (рис.7). То же самое подтверждается при иммуноэлектрофорезе гиалуронидазы st • aureus 015. Здесь также выявляется одна дуга преципитации между гиалуронидазой и специфической антигиалуронидазной сывороткой.

Наш также изучена кммуноспецифичность гиалуронидаз полученных как из разных стафилококковых штаммов, так и из различных организмов. Для этой цели при иммуноэлектрофорезе антигенами были использованы высокоочищенные гиалуронидазы штаммов st.aureus 015. st.aureus 777 и st .wood 46, а также коммерческие препараты тестикулярной гиалуронидазы и гиалуронидазы грибе» и стрептококка. Данные иммуноэлектрофорезе приведенные в таблице 6 показывают, что стафилококковые гиалуронидазы характеризуются видоспэцифичностью. С помощью двойной радиальной иммуно-диффузии также установлено, что гиалуронидазы штаммов 3t*au_ reus 777, St.U'óod 46 И St .aureus 015 являются идентичными антигенамн.

Рис.7. Реакция двойной радиальной иммунодиффузии в центре -специфическая антигиалуронидазная сыворотка антиген -хиалуронидаза ы.аиreus 015 в кратных разведениях.

Таблица 6

Изучение иммуноспецифичности гиалуронидаз различных источников с помощью иммуноэлектрофореза

" - " - нет специфической дуги, " + " - наличие специфической дуги

Источник получения гиалуронидазн

йммуноэлектрофоретичес-

Гиалуронидаза St.aureus 015 Гиалуронидаза st.au reus 777 Гиалуронидаза st.wood ¡46 Тексгакулярная гиалуронидаза Стрептококковая гиалуронидаза Гиалуронидаза грибы

+ + +

Создание лечебного препарата стафилококковой гиалуронидазы

Основой дает лечебного препарата использовали высокоочищен-ый рехроматографический препарат гиалуронидазы st.aureus 015, олученный по методике описанной выше при получении внсокоочи-енных гиалуронидаз st*aureus 777 и ot.wood 46. Была раз-аботана схема для получения и контроля лечебного препарата тафилококковой гиалуронидазы (схема I).

Схема I

Получение рехроматографического препарата гиалуронидазы st.aureu3 015

I стадия контроля - контроль чистоты препарата

Разбавление фермента до нужной активности и добавление стабилизатора-наполнителя

Стерилизация ферментного растрова ультрафильтрацией

П стадия контроля - контроль стерильности

Разливка ферментного раствора в ампулах и лзофильное высушивание

Ш стадия контроля - контроль готового препарата

Контроль на чистоту препарата проводили при помощи диск-лектрофореза в полиакриламидном гело.

В качестве стабилизатора-наполнителя мы отобрали медицинскую желатину, поскольку при ее добавлении (концентрации 2 мг/мл)сохраняется после лиофильной сушки как 100^-ная активность, так и хорошая растворимость.

Контроль готовой продукции вклрчает в себя стерильность, токсичность, пирогенность, специфическую активность и растворимость.

Полученная по данной схеме лекарственная форма стафилококковой гиалуронидазы представляет собой лиофильно высушенный белый порошок в ампулах. Препарат ртерилен, апирогенен, нетоксичен, активность 500-1000 ТЕ. Срок хранения препарата не менее I года.

Экспериментальное изучение специфической активности

лечебного препарата стафилококковой гиалуронидазы на животных

Изучали способность лечебного препарата гиалуронидазы at> aureus 015 действовать на распространение красителя под кожей. Опыты ставили на кроликах, рода Шинвшла. Красителем иопользова-ли 1% раствор трепанового синего 1:1000 разбавления. При совместном введении красителя с препаратом гиалуронидазы наблюдалось увеличение площади распространения красителя. Коэффициент распространения или in vivo активность препарата составляла 4.2+0.3.

С использованием специально разработанной экспериментальной модели на собаках, было изучено действие лечебного препарата стафилококковой гкалуронидазы на проходимость центральной лимфатической системы стафилофага. Собакам контрольной группы

f

вводили 250 мл стафилофага (4*1 U фаговых частиц на мл). Опытной группе вводили то же количество стафилофага совместно со стафилококковой гиалуронидазой (1000 УЕ/мл). Лямфу брали у обеих групп животных из дренированного лимфатического протока через разные промежутки времени и измеряли в них титр стафилофага. Как показали данные эксперимента при введении совместно с лечебным препаратом стафилококковой гиалуронидазы распространение фаговых частиц в лимфатическую систему увеличивается.

Сравнительное изучение лечебного препарата стафилококковой гиалуронидазы и препарата "Лидазы"

Степень чистоты этих препаратов устанавливали электрофо-ретически и с помощью гель-фильтрации. Как уже отмечали, очищенный препарат st.aureus 015 до добавления стабилизатора-наполнителя давал две белковые полосы (рис.8а), а при гель-фильтрации на сефадексе ü -ТОО препарат элюировался в ряде двух белковых фракций, обладающими гиалуронидазной активностью. Это объясняется наличием двух молекулярных форм гиалуронидазы st. aureusOI5. В этих же условиях при электрофоретическом изучении "Лидаза" дает 6-7 белковых линий (рис.86), а при гель-фильтрации элшруется 6 белковых фракций (рис.10). Рехромато-графировакный препарат стафилококковой гиалуронидазы удельной активностью в 8714 раза превышает "Лидаз$1".

Изучение анафилактогенных свойств этих препаратов мотодом активной анафилаксии на морских свинках показало, что лечебная доза стафилококковой гиалуронидазы в отлкчпе от "Лидазы" не обладает анафилактогонной активностью.

Рис.

I оз

vü OC ir

=r la

O.-l

8. Электрофоретическое изучение резфоматографированного препарата гиалуронидазн st.aureus 015 (а) и препарата "Лидазы" (tí).

/Я ti *■

вцок

Í

/

п

\

\

Л^Г-нчй \\

У -А

fe ■5С

— so

Рис.

10 30 фикции

9. Профиль элюцил рехроматографирования препарата гиалуронидазн st.aureus 015 при гель-фильтрации на сефа-дексе G -100.

х

<11

Фракии:

'ис.Ю. Профиль элпции препарата "Лидазн" при гель-фильтрации на сефадексе ^ -100.

Использование лечебного препарата гиалуронидазы st .aureus_015 в медицинской практике_

На основании данных доклинического токсилогического и зкс-:ериментаяьного изучения препарата с разрешения Министерства дравоохранения Грузии было проведено изучение безвредности и ффективности лечебного препарата гиалуронидазы jt.aureus 015 а ограниченном числе больных. Препарат применяли для лечения ослеожоговых гипертрофических и келоидных рубцов, венной и имфованной недостаточности, лимфостаза п остеоартрозов в трех азличных клиниках.

Клинические заключения свидетельствуют о безвредности и высокой фармакологической активности препарата.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения закономерности биосинтеза гиалуро-нидазы staphiiococcus aureus 015 подобраны условия культивирования продуцента которые как в лабораторных, так и производственных условиях обеспечивают увеличение активности фермента в культуральной жидкости соответственно 4,4 и 10,2 раза при 20-кратном уменьшении времени культивирования.

2. С помощью математического метода оптимизации питательных сред разработана дешевая и практически доступная полусинтетическая питательная среда дам культивирования штамма st.aureus 015, которая характеризуется более высокой степенью стандартности и на которой достигается увеличение гиалуронидазной активности на 64$ по сравнению со средой использованной для культивирования этого же штамма на производстве стафилококкового

анатоксина. Указанная среда может быть использована как при про-

i

изводстве стафилококковой гиалуронидазы,' так и дам селекции высокоактивных продуцентов этого фермента.

3. Проведенная селекция как среди музейных, так и среди свежевыделенных штаммов из различных источников инфекции показала, что биосинтез гиалуронидазы не является абсолютным свойством патогенных стафяококков. Свежевыделенные штаммы характеризуются более высокой способностью синтезировать гиалуронида-зу чем музейные. Подобраны высокоактивные продуценты стафилококковой гиалуронидазы итамм St.aureus 777 и Штамм St.Wood

46. Эти штаммы по биохимическим свойствам и антибиотикочувстви-тельности не отличаются от штамма st.aureus 015.

4. Разработан способ выделения и очистки гиалуронидаз стафилококковых штаммов включащий: осаждение этиловым спиртом, ионообменную хроматографию, ультрафильтрацию и лиофильное высушивание. Данная схема дает возможность получить высокоактивные препараты гиалуронидазы st,aureus 777 удельной активностью 2661 -ед/мг и степенью очистки 639 и st../ood 46 удельной активностью 3820 "я /мг. Гомогенность по белку полученных препаратов установлена электрофоретически.

5. Было установлено, что гиалуронидазы как at.aureus 777, так и st.wood 46 состоят из двух молекулярных форм. Молеку- . лярные массы этих форм в случае гиалуронидазы st.aureus 777 составляют 66000 и I300C, а в случае гиалуронидазы st.wood 46 7200 и 12300. Гиалуронидазы синтезируемые обеими продуцентами характеризуются строгой субстратспецифичностью - действуют только на гиалуронозую кислоту и не расщепляют другие гликозами-ногликаны, такие как хондроитинсульфаты и гепарин. Эти ферменты обладают высокой стабильностью при многократном замораживания и оттаивании. На основе проведенного исследования штаммы

St.aureus 777 И at.Wood 46 МОГуТ бЫТЬ ИСПОЛЬЗОВЗНЫ КЭК

резервные для производства стафилококковой гиалуронидазы.

6. Полученные нами высокоочищенные гиалуронидазы технологически гомогенны и характеризуются видоспецифичностью. Гиалуронидазы штаммов at.aureus 777, st.k.'ood 46 И St.auruus 015 являются идентичными антигенами.

7. На основе высокоочиденной гиалуронидазы нами разработана технологическая схема получения и контроля лечебного препз-

рата стафилококковой гиалуронидаэн. Препарат, полученный по этой схеме является стерильным, апирогеннвга, нетоксичным лно-фально высушенным белым порошком в ампулах, активностью 500-1000 ТЕ. Экспериментально было установлено, что препарат увеличивает проходимость веществ как подкожно, так и в центра льную лимфатическую систему. Лечебный препарат стафилококковой гиалуронидазы гсмогекен по белку, не характеризуется ана-филактогеиными свойствами и превышает препарат "Лидазу" по удельной активности в 8714 раз.

Рекомендации по практическому применению стафилококковой гиалуронидазы в медицинской практике

На основе данных, полученных вследствие проведенных иссле^ дований на ограниченном числе больных, лечебный препарат стаф; лококковой гиалуронидазы может быть рекомендован для применен] при лечении: а) послеожоговых гипертрофических и квлоидных ру< цов; б) хронической венной и лкыфо-венной недостаточности и лиыфостаза; в) остеоартритов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Турианидзе Ц.С., Миканадзв Ю.С., Броладзе ГЛ., Квеси-тадзе Г.И., Лоладзе М.К. - Гиалуронидазы патогенных микроорганизмов. Тезисы докладов на Ш конференции "Биосинтез ферментга микроорганизмами". Кобулетк, 1986.

2. Лоладзе М.Ж., Алибегашвшш М.Г. Гиолуронидазная активность стафялокогжов. Труда молодых ученых. Т1У, 1987.

3. Биркадзе T.B..Лоладзе М.К.Дбуашвили Н.М., Турманидзе Ц.М., Чанишвили Т.Г., Пучковская Л.Ю., Миканадзе Ю.С., Бро-ладзе Г.Л. - Селекция продуцента и влияние условии вырадрва-ния на биосинтез стахгилококковвй гиалуронидазы. /Известия АН ГССР, сер. биологическая. Актуальные вопросы биологии и медицины. - IS68. С.363 - 368.

4. Лоладзе М.Ж., Биркадзе Т.*В.. Чанишвили Т. Г., Ригвава 1 С.А., Бубашвили М.Г., Абуашвили Н.М. - Свойства стафилококковых гиалуронтдаз к перспектива их применения. Инженерная ан-зимология. Материалы 6-го всевоюзного симпозиума. Вильнюс, 1968.

5. Биркадзе Т.В., Лоладзе М.Ж., Абуашвили H.H., Алибега-лвили М.Г., Чанишвили Т.Г., Пучковская Л.Ю., Еубашвшш М.З.-1олучение высокоочищенниЯ гиалуронидазы и ее иммунохимическая характеристика. Всевоюзная конференция : Актуальные вопроси разработки препаратов медицинской биотехнологии. Махачкала, [988.

6. Лоладзе М.Ж., Алибегашвили М.Г. - Иммунологические сво:-. 5ства гяалуронидаз разного происховдения. Конференция молодых гченых медиков. Бакуриани, 1988.

^"ч^^о эобоб* ,рй 9бо>о ¿^¿¿п^дс^п ^дЭгоу дбд&пЬ ЗдЛЬЗд¿Зфпддй«

ПЕЧАТНЫХ.Л. - '.5

УЧЕЛ.ИЗЛАТ.Л.- ],(

бесплатно

IЧ 88

ЗАКАЗ И ТИРАЖ .100

УОП ГРУЗГИИРОМЕГА, ТБИЛИСИ гр. ДАВИДА АтАШЕ НЕЬЕЛИ 150