Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота"

РГ8 Ой 1 1 11011 1386

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ

АКАДЕМИЯ

ИГОНИНА ЛЮДМИЛА МИХАЙЛОВНА

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТА ГИАЛУРОНИДАЗЫ ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской Государственной Химико-фармацевтической Академии (ректор - д.ф.н., профессор Г.ГГЯковлев)

Научные руководители:

Л.В. Дмитренко

доктор химических наук, профессор

кандидат химических наук, доцент Н.В. Глазова

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор кафедры биофизики Санкт-Петербургского Государственного Технического Университета В.М. КОЛИКОВ

кандидат биологических наук, главный научный сотрудник Российского НИИ гематологии и трансфузиолопш Н. Д. СИДОРОВА

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный Технологический Университет

Защита состоится 1996 г. в /3 часов на заседании

специализированного совета К 084.63.01 при СПХФА (197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14)

С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке СПХФА.

Автореферат разослан 3 " СЪти^и^-1996 г. Ученый секретарь специализирован нр!^ сов кандидат биологических наук / ^Л.Н В. Кириллова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В последние годы интерес к ферментам, выделяемым из животного сырья, возрастает, особенно в связи с их применением в медицине при лечении различных заболеваний. Однако проблема повышения качества инъекционных ферментных препаратов требует новых подходов к методам их выделения, очистки и анализа. Наибольший интерес для промышленного получения высокочистых биопрепаратов представляют технически простые, масштабируемые методы, основанные на использовании сорбционно-хро мало графических процессов, которые позволяют улучшить качество получаемого препарата за счет избирательной сорбции целевого компонента и обратимой десорбции с него. С другой стороны применение хроматографии в промышленности создает чрезвычайно широкие перспективы для более рациональной организации технологячесхих процессов выделения и очистки биологически активных веществ. Хроматографии ее кие методы еще недостаточно используются в медицинской промышленности, и только в последнее время была показана перспективность и целесообразность использования макропористых носителей для выделения и получения высокочистых ферментных препаратов (Рудометова, 1994).

Объектом данного исследования был выбран фермент гиалуроаадаза (КФ 3.2.1.35), являющийся основным компонентом препарата "Ладаза" и выделяемый из семенников крупного рогатого скота. Фермент уменьшает вязкость межклеточного вещества, способствует увеличению проницаемости тканей и облегчает движение жидкостей в межтканевых пространствах. Препарат "Дидаза" применяется в медицине для ускорения всасывания лекарственных веществ, рассасывания рубцов, вводится подкожно, внутримышечно или путем ингаляций. До настоящего времени препарат

г

получали по технологии, основанной на фракционировании фермента от балластных примесей из осветленного экстракта семенников крупного рогатого скота органическим растворителем - ацетоном. Данная технология имеет ряд существенных недостатков: шрывоопасность производства, токсичность производства, большие энергозатраты на регенерацию органического растворителя. Получаемый ферментный препарат обладает низкой удельной активностью.

В связи с вышеизложенным разработка сорбционно-хромато графического процесса выделения и очистки фермента гиалуронидазы представляется перспеетивной и актуальной. С другой стороны, до сих пор ни один из ферментов, катализирующих синтез или гидролиз гиалуроновых кислот не был изучен в деталях (Kreil, 1995), поэтому изучение физико-химических свойств высокоочшцеиного фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота является также актуальным.

Задачи исследования. Целью работы являлось хроматографическое выделение и изучение свойств высокоочшценной гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота н разработка сорбционного метода получения препарата "Лидаза". Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследование физико-химических и биохимических свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.

2. Изучение закономерностей сорбции гиалуронидазы на ионитах различной природы в статнчесхих условиях.

3. Выбор оптимального сорбента для выделения фермента.

4. Разработка на основе полученных данных процесса сорбциояно-хромато графического выделения фермента;

5. Оптимизация и масштабирование сорбционного процесса выделения с цепью использования технологии в промышленном масштабе.

Научная новизна. Впервые выделен протомер гиалуронидазы га семенников крупного рогатого скота и изучены его биохимические свойства, получены данные о наличии дисульфидных связей между протомерами.

Впервые изучены равновесные и термодинамические параметры сорбции полимерных форм гиалуронидазы в статических условиях на различных ионогенных и неионогенных сорбентах. Установлена взаимосвязь структуры матрицы молекулярного сорбента на основе стирола (Полисорб) с модифицированной поверхностью и макропористого ионогенного сорбента (КУ-23), имеющего в основе ту же матрицу, с избирательностью сорбции гиалуронидазы, определяемой ион-ионным и молекулярным взаимодействиями.

Сформулированы факторы, определяющие взаимодействие фермента с ионогеняыми и неионогенкыми сорбентами в динамических условиях. Впервые осуществлено концентрирование фермента гиалуронидазы из экстракта на макропористом сульфокатионнте в ионообменных колонках. Показано, что выявленные закономерности полностью масштабируются и оптимизируются с помощью критериального параметра к, что создает возможность осуществления крупномасштабного процесса ионообменого выделения фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.

Практическое значение. На основе экспериментальных данных исследования был разработай патент "Способ получения гиалуронидазы". Способ апробирован в условиях цеха ферментных препаратов завода медицинских препаратов АО "Самсон" (Санкт-Петербург). Предлагаемый способ позволил сократить время технологического

процесса почти в 2 раза и улучшить качество ферментного препарата, а также условий труда.

Основные положения, выносимые tía защиту.

1. Фермент гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота представляет собой совокупность полимерных форм (серий) с различными молекулярными массами (10 -200 кДа), обладающих одинаковой удельной активностью.

2. Концентрирование полимерных форм фермента гиалуронидазы из экстракт семенников крупного рогатого скота возможно в равновесных условиях в процессе сорбции-десорбции вмйсто традиционного метода г использованием органического растворителя.

3. Очистка фермента возможна с применением фронтально-хроматорграфического процесса сорбции в неравновесных условиях на макропористых неионогенных сорбентах.

Апробация работа. Основные положения диссертации доложены и обсуждены

на:

Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных веществ" (Санкт-Петербург, 1994);

Семинаре "Теория и практика ионного обмена, ионообменная хроматография", Всероссийского химического общества им. Д.И. Менделеева (Спб, 1994) 10-ом Интернациональном симпозиуме "Advances and application of chromatography m industry" (Братислава, 1996) По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, двух глав, содержащих материалы собственных исследований и

обсуждения результатов, приложения, заключения, выводов и списка литературы. Приложение включает в себя акт апробации и технологии получения фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота с использованием экстракции ионообменного выделения гиалуронидазы из экстракта с последующим осаждением сульфатом аммония. Часть материалов и результатов исследовательской работы по проекту "Фундаментальные и практические аспекты разделения биополимеров с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного электрофореза (КЭ)" выполнены в Институте Хроматографии национального исследовательского центра Италии (Рим).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

С учетом цели и задач настоящей работы экспериментальные исследования проводились по следующим направлениям:

- сравнительный анализ ферментного препарата "Лидаза" и стандартов гиалуронидазы из семешшкоз крупного рогатого скота фирмы "Sigma" и "Fluka";

- получение высокоочшценного протомера гиалуронидазы и изучение его физико-химических и биохимических свойств;

- исследование сорбции полимерных форм гиалуронидазы из раствора препарата "Лидаза" и нз экстракта семенников крупного рогатого скота в статических условиях на различных ионогеиных и неионогенных сорбентах;

- изучение возможности выделения фермента в равновесных процессах сорбции-десорбции в динамических условиях на макропористых ионитах и очистки в процессе неравновесной сорбции на молекулярных сорбентах с модифицированной поверхностью.

Тонкую очистку и сравнительный анализ препарата Лидаза и стандарта гиалуронидазы m семенников крупного рогатого скота фирмы "Sigma" и "Fiuka" проводили на установке HPLC фирмы "Весктап"(США) с использованием следующих колонок для HPLC: SP-5PW LKB Ultropac column (7,5x75 мм), основу которой составляет гидрофильный полимерный гель G5000PW с функциональными группами -C.3H«-S03"Na'; HPLC gdffltration column Bio-Sil SEC 125 (300x7,5 мм); и PENTAX column с пористыми шарообразными гранулами гаяроксилапатита SH-0710F (7,5x100 мм).

Дегликозилирование фермента гиалуронидазы проводили с помощью фермента peptide-N-glycosidase F (Е 5003), выделенного из Flavobacterium meningosepticum, и полученного от фирмы Oxford GlycoSystem (Великобритания). Ферментативное дегликозилирование проводилось в течение 5 часов при температуре 37±1°С и pH = 6,5 (H.M.Baker,1994; D.Laee,1990). Активность гиалуронидазы определяли Турбодиметрачсским методом (Dorfiaan, 1995) и разработанным сотрудниками кафедры биотехнологии СПХФА количественным методом, в основе которого лежит полуколичествешшй Фармакопейный метод (ВФС - 42 -188 - 72).

В процессе работы использовали следующие ионогенные и неиокогснные сорбенты: макропористый судьфокатионит КУ-23, карбоксильный катеонит СГ-1М, имеющий макросетчатую структуру, шшонигы АМП и БАК, гемосорбент СКН-4М, макропористый сополимер стирола и дивинилбензола Полисорб. Модификацию поверхности молекулярных сорбентов проводили поверхностно-активным веществом катонного типа - 2 % раствором алкилбензилдиметил аммония хлорида. Перед началом работы сорбенты подвергали кислотно-щелочной обработке. В статических условиях сорбцию проводили при постоянном перемешивании на качалке.

Установление равновесия в системах определяли по предварительно полученным кинетическим кривым. По результатам экспериментов рассчитывали емкость сорбции по общему белку (метод Лоурн) и равновесный коэффициент распределения Kd.

Гельхроматографический анализ раствора препарата "Лидаза", а также экстракта и фракций до и после сорбции проводили на колонке (ДхН =12x630 мм), заполненной сефадексом G-75-120 фирмы "Sigma". Фракции анализировали на содержание белка, углеводов и ферментативную активность.

Фронтально-динамические процессы сорбции фермента из раствора препарата "Лидаза" и промышленного экстракта семенников проводили на колонках (ДхН = 5 х120 мм) и (ДхН = 10 х150 мм). Оптическая плотность растворов на выходе из колонки регистрировалась автоматически с помощью оборудования для быстрой хроматографии - установке FPLC Sistem фирмы Pharmacia LKB (Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные сравнительного анализа препарата Лидаза и стандартов гиалуронидазы фирмы "Sigma" и "Fluka" представлены на рисунке 1, in которого видно, что фермент представляет собой совокупность серии полимерных форм, соотношение которых меняется при длительном хранении фермента в растворе, вероятно, из-за деполимеризации. Молекулярная масса полимерных форм фермента представлена довольно широким диапазоном от 200 KDa до 10 jcDa, полимерные формы и протомер обладают одинаковой удельной активностью. По нашему мнению, полимеризация фермента связана как с наличием дисульфидных связей между протомерами, так и с наличием в составе фермента приблизительно 5-7% углеводов (C.L.Bcrders,1968; J-C.Micha!ski,1984). В доказательство этому предположению было проведено

Рис. 1. Гелъхроматографический анализ гиалуронвдазы семенников крупного рогатого скота а) стандарт фирмы "Sigma"; б) стандарт фирмы "Fiuka"; с) препарат Лвдаза . Слева - свежеприготовленные растворы фермента 5 мг/мл, справа -после хранения в течение 7 дней при +5 °С.

HPLC geffiltration column Bio-SU SEC 125 (300x7,5 мм), элюент - 0,2 М буферный

Ш фосфорной кислоты, рН=б,0, скорость пропускания раствора 1 мл/мин. _ - фракции с гиалуронидазной активностью

инкубирование фермента (стандарт тиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота фирмы "Sigma") при комнатной температуре с 2-меркаптоэтанолом (рисунок 2) и проведена ферментативное дегликозилировние с peptide-N-glycosidase F. Оба метода приводили к деполимеризции фермента и увеличению пика протомерных форм. В динамических условиях на колонке PENTAX с пористыми шарообразными гранулами гидроксиапатита в режиме изократическон элюции ОД м буферным раствором фосфорной кислоты (pH = 6,0) была выделена фракция протомера гиалуронидазы с удельной активностью 2800 Ед/мг. Гельхромато графический анализ фракции на колонке Bio-Sil SEC 125 позволил определить молекулярную массу протомера, составляющую 10 700 Da.

Изучение физико-химических свойств полученного протомера гиалуронидазы показало, что фермент наиболее стабилен в области pH 3,5 - 3,8. Оптимальными условиями реакции гидролиза гиалуроновой кислоты протомером гиалуронидазы являются pH = 4,0 - 5,5 (рис. За) и температура 37 - 40°С (рис. 3 б). Повышение температуры до 50°С приводило к потере активности фермента в течение 15 минут. В таблице 1 представлены рассчитанные значения констант Михаэлиса-Ментен Km и максимальной скорости ферментативной реакции Vmax для различных субстратов, показывающих влияние их концентрации на активность протомера гиалуронидазы. Наибольшую субстратную специфичность протомер гиалуронидазы имел к гиалуроновой кислоте, наименьшую - к хоидроитин-4-сульфату.

________Таблица 1

Субстрат Km, мг/мл Vmax, мкмоль/мин

Гиалуроновая кислота 0,176 0,00148

Хондроитин-4-сульфат 1,47 0,00249

Хондроитин-6-сульфат 0,83 0,00233

Б 280

0.02

ш О,

о И

V) V-

nS

Рис. 2. Гельхро маю граф ичгсхий анализ раствора стандарт! пчлурокндази фирмы "Sigma* в процессе кнкубироваяи* фермента с 2-ыериптоэтанолом в концентрационном соотношении к ферменту 0,022 % 5 иг/мл. HPLC gdffltr&don column Bio-Sil SEC 125 (300x7,5 мм), эюоснг - ОД М буферный раствор фосфорной кислоты, рН=б,0, скорость пропускания раствора 1 мл/мин.

120 100 80 60 40 20

РН

Рис. 3 а. Влияние рН на активность протомера гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота.

я »

<3

1,0 0,8 0,6 0,4 0.2

10 20 30 40 50 60 °с Температура

Рис. 3 б. Влияние температуры на ход гидролиза гиалуроновой кислоты протомером гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота.

Изучение влияния неорганических и органических компонентов на активность протоиера гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота показало, что протомер активируется ионами Са2+ (100 мМ), альбумином (0,1 %), мочевиной (4 М) и ингнбируется ионами Мп2+, 2п2*, Си2', Ре3+ (1 мМ), цианидом калия {1 мМ), и цистеином (4 мМ).

В работе было показано, что полимерные формы гиалуронидазы, включая протомер, обладают одинаковой удельной активностью, поэтому разрабатывался метод сорбционного выделения из экстракта семенников крупного рогатого скота фермента гиалуронидазы, представленной различными полимерными формами.

На различных иояогенных и молекулярных макропористых сорбентах были изучены рН-завношости емкости сорбции полимерных форм гиалуронидазы из раствора препарата "Лмдаза" (модель экстракта семенников крупного рогатого скота) и изотермический процесс сорбции. Как видно из представленных данных на рисунке 4 (а, б), наибольшей сорбционной емкостью обладают сульфокатиоиит КУ-23 и карбоксильный катеонит СГ-1М. На анисните БАК и амфолите АМН емкость сорбции при рН экстракта, то есть рН = 4,3-4,8, мала. Молекулярные сорбенты тоже отличаются незначительной емкостью сорбции. Эффект повышения емкости сорбции отмечается после обработки поверхности молекулярных сорбентов Полисорб и СКН-4М поверхностно-активным веществом кахионного типа. Однако в данном случае, как показало дальнейшее изучение, молекулярные сорбенты с модифицированной поверхностью селективно сорбируют примесные компоненты. Эти сорбенты предложены для очистки гиалуронидазы от примесей с использованием фронталыю-хроматографнческого процесса.

Рис. 4 а). Изотермы сорбции белха из раствора препарата "Лидаза" на различных ионогенных сорбентах: 1 - СГ-1М, 2 - КУ-23, 3 - АМП, 4 - БАК

Рис. 4 б). Изотермы сорбции белка из раствора препарата "Лидаза" на различных молекулярных сорбентах: 1 - СКН (модифицированный), 2 - Полисорб (модифицированный), 3 - Полисорб, 4 - СКН-4М.

Одним из факторов, определяющим возможность препаративного сорбциониого выделения вещества является его избирательная и обратимая десорбция с носителя. В динамических условиях на лабораторных колонках (ДхН = 10x150 мм) были проведены опыты по изучению сорбции-десорбции гиалуронидазы из раствора препарата "Лидаза" на выбранных сорбентах для концентрирования фермента: катеонитах КУ-23 и СГ-1М. Из рисунка 5 видно, что обратимость сорбции на карбоксильном катиониге составляет не более 60 %, тогда как на сульфокатионите она достигает 80-100 %. Учитывая недостаточную степень десорбции фермента, представляется целесообразным осуществить выбор оптимального сорбента для выделения гиалуронидазы в пользу макропористого сульфокатионнга КУ-23. Аналогичные опьпы были проведены с использованием промышленного экстракта семенников крупного рогатого скота. Гельхроматографический анализ экстракта до и пезае сорбции (рисунок 6) подтверждает возможность выделения фермента на макропористом сульфокатионите с использованием сорбциониого хромато графического процесса. На основе полученных экспериментальных данных с учетом подбора условий проведения процесса был разработан способ получения гиалуронидазы, подана заявка на патент № 94039657/039108 (дата приоритета -20.10.1994), получено положительное решение о выдаче патента. Предлагаемый способ полностью исключает использование ацетона, и тем самым, изменяются условия труда, категория взрывоопасности помещения, уменьшается время технологического процесса в два раза.

Успешность внедрения технологии в производство и эффективность её использования зависит от того, насколько оптимальны выбранные режимы и условия проведения процесса. Решечу задачи оптимизации как раз и состоит V ййхожд<е((йи

Рис. 5. Выходные кривые сорбции и десорбции гиалуронидазы на сорбентах-а) СГ-1М; б) КУ-23

Рис. 6. Гельхроматографический анализ: а) экстракта семенников крупного рогатого скота; б) в проскоке; в) элюата

таких режимов и условий. В данной работе масштабирование и оптимизация процесса проводилось с использованием критериального параметра А, (формула 1.1), куда входят: Кб - объемный коэффициент распределения;

ИэФ+ - эффективный коэффициент внутренней диффузии;

\Vpo6 - рабочая скорость протекания раствора через колонку;

А, - диаметр частиц сорбента;

Но - высота колонки;

р - относительный радиус непоглощающего ядра сорбента;

&о - порозность слоя сорбента..

Я = Кй-^н. (1.1)

(1-р) ^р1бс1

Для расчета нам понадобилось определить истинные значения Кё и для

полимерных форм ферме/гга гиалуронядазы. Для этого на колонке с сефадексом С-75 нарабатывалась фракция полимерных форм фермента (М = 40 - 80 кДа), которую затем использовали в дальнейших опытах.

Оценку скорости процесса сорбции полимерных форм гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота производили по времени достижения сорбциошюго равновесия вещества между раствором и сорбентом. Равновесие при сорбции на сульфокатионате устанавливается быстрее, чем при сорбции на карбоксильном катконите СГ-1М (десять часов против тридцати), коэффициент внутренней диффузии увеличивается на порядок.

Используя полученные нами экспериментальные данные, проводили кииэтико-динамический анализ сорбционно-хроматографического процесса по программе,

разработанной сотрудниками кафедры биотехнологии СПХФА. Для различных 4, сорбента были рассчитаны различные параметры процесса.

В качестве параметра оптимизации была выбрала производительность колонны Б = п/Ыо&ц, где п - общий выход. Из рисунка 7 видно, что при использовании колонн со стационарным споем число колонн минимально, а производительность максимальна при с! =200-500 мкм. Это регулярный режим сорбции и X >0,35. При диаметре зерен сорбента большем 500 мкм - режим нерегулярный, сокращается время проскока, увеличивается число колонн. При диаметре меньше 200 мкм замедляется рабочая скорость процесса, ухудшаются его гидродинамические характеристики. Хорошими данными характеризуется псевдоожиженный слой, но для ферментов он ещё не применялся и требует дополнительных экономических затрат из-за сложности конструкции оборудования. В результате оптимизации подобраны условия сорбции и оптимальные размеры колонн, число колонн работающих на сорбции, общее число колонн, предложен оптимальный диаметр частиц для проведения процесса. Предложенная технология была апробирована в условиях цеха ферментных препаратов на заводе Медицинских препаратов акционерного общества "Самсон", получен акт об апробации.

^общ

<31 >с 10 , М

регулярный режим нерегулярный режим X > 0,35 Я. <0,35

Рис. 7 Оптимизация процесса сорбции гиалуронидазы на сульфокатиошгге КУ-23 Р - производительность колонны, N„6«! - общее число колонн, <3ч - диаметр зерен сорбента.

ВЫВОДЫ

1. Проведен сравнительный анализ препарата "Лидаза" со стандартами гиалуронидазы фирмы "Sigma" и "Fluka". Показано, что как в препарате, так и в стандарте гиалуронидазы семенников крупного рогатого скота фермент представляет собой совокупность полимерных форм (10 ООО - 200 ООО Da), соотношение которых изменяется при длительном хранении в водном растворе.

2. Показано, что полимеризация фермента связана с образованием дисульфидных связей между протомерами и наличием углеводов в составе фермента. Получена фрахция протомгрной формы гиалуронидазы и определена ее молекулярная масса - 10700 Da, изучены физико-химические свойства.

3. Изучены особенности ионообменной сорбции полимерных форм гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота (препарат "Лидаза") в статических условиях - влияние рН растворов на сорбционную емкость различных иошптш, рассчитаны равновесные и кинетические параметры сорбции. Показано, что фермент избирательно сорбируется на карбоксильном катиоките СГ-1М и сульфокатиошгге КУ-23.

4. Исследован равновесный процесс сорбции фермента на различных сорбентах. Показана возможность концентрирования гиалуронидазы из экстракта семенников крупного рогатого скота на макропористом сульфокатионите за счет избирательной сорбции и обратимой десорбции. Молекулярные сорбенты с модифицированной поверхностью предложено использовать для очистки фермента от низкомолекулярных примесных компонентов.

5. Проведена оптимизация и масштабирование сорбционно-хроматографического процесса. Рассчитаны оптимальные параметры процесса, проведена

апробация способа. Данный метод позволяет сократить время технологического процесса почти в два раза и увеличить удельную активность препарата в 2,0-2,5 раза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.В.Глазоза, Т.Б.Ефимова, Л.М.Игошша, Н.В.Рудометова, Л.ВДмнтренко

Использование хромэто графических методов для оценки эффективности очистки ферментных препаратов, /кн. "Препаративная и масштабируемая хроматография биологически активных веществ и другие альтернативные методы", Ленинград: ЛДНТП, 199], с. 105-112

2. Л.М.Игоннн», Н.В.Глазова, Л.В-Дмитренко, Н.ВЛяникояа. Применение сорбционко-хроматографических методов для очистки ферментного препарата Лидаза. /кн. "Химия и технология лекарственных веществ, Санкт-Петербург, 1994, с. 14.

3. Л-М.11пн;;ша, Н.В.Глйзовл, Н.Ч.Згияхопа. Использование сорбентов для удаления примесей из инъекционного препарата Лидаза. Международный симпозиум "Проблемы сорбцнонной детоксикации внутренней среды организма". Н6воскб?!р«с, ноябрь 1995.

4. СГ.Юиышева, Л.М.Игсниия, П.В.Зяникоаа, Н.В. Глазова, Г.Э.Елькня

Равновесие и кинетика сорбции гиалуронидазы на сетчатых полимерных нонитах СГ-1М и КУ-23. //ж. "Прикладная Х1!мия", 1996, т. 69, в. 5, с. 764 - 767.

5. N.V.GUzova, L.M.Igonina, G.E.Elkin. Chromatographic purification of enzyme medicines from macromolecuiar impurities./ 10th Bratislava International Conference on Macromolecules" Chromatography of polymers and related substances", Bratislava, 1995.

6. N.V-Zjunkov*, UMJgoaina, N.V.Rndcmetov», G.E.Elkia, N.V.GUzova. Chromatographic purification of enzyme medicines./ 10th International Symposium "Advances and application of chromatography in industry" Bratislava, 1996, p. 175.

7. D.Corradini, L.MJgoniaa, G.Cannaru. Effect of the addition of metal ions in the mobile phase on the chromatographic behaviour of protons in ion-exchange HPLC./ там же, р.ЗОЗ.

8. D.Corradini, G.Canoarea, I-M.Igouina. Evaluation of interactions between proteins and ionic species in solution by capillary electrophoresis./11th Convegno Nationale "Proteine96", Siaia (Italia) 1996, p.91.

Работа представлялась на различные конкурсы и была удостоена следующих наград:

- премии мэра Санкт-Петербурга за 1995 год

- стипендии Президента Российской Федерации для прохождения научной стажировки зарубежом в 1995/96 уч.году,

-почетного диплома конкурса "Молодые дарования", 1996.