Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие гиалуронидазы с гентамицином и полимерами различной структуры

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие гиалуронидазы с гентамицином и полимерами различной структуры"

^ министерство здравоохранения и медицинской !>> промышленности российской федерации

санкт-петербургская государственная _химико-фармацевтическая академия

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

РАДЧЕНКО Ирина Геннадьевна

взаимодействие гиалуронидазы с гентамицином и полимерами различной структуры

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ _ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ_

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

РАДЧЕНКО Ирина Геннадьевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГИАЛУРОНИДАЗЫ С ГЕНТАМИЦИНОМ И ПОЛИМЕРАМИ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работ« выполнен* на кафшдрв биотехнологии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии (ректор - д.б.н., профессор Г.П.Яковлев)

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Н.В.ГЛАЗОВА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологически» наук, профессор Санкт-Петер бур г ской Химико-Фар мацевтич еской Академии Г.А. ВИТОВСКАЯ

кандидат химических наук,старший научный сотрудник Института Высокомолекулярных Соединений РАН О.А.ПИСАРЕВ

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский Государственный Технологический Университет

1997р. в /Л

Защита состоится ___2. 1997р. в ! <Л/ часов на

заседании специализированного совета К 084.63.01 при СПХФА <197376,С.-Петербург,ул.проф.Попова,14)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СПХФА.

Автореферат разослан

1997 г.

Учений секретарь специализированного совета кандидат биологических наук__0

Н.В.Кириллова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность тени. В последнее время важное значение в области медико-биологическим исследований занимает проблема создания комплексных лекарственных форм, включающих в себя модифицированные ферменты. Кодифицированные ферментные препараты обладают рядом преимуществ по сравнении с нативными предшественниками: пролонгированным действием, регулируемой активностью, повышенной устойчивостью к действию различных факторов, деструктирующих ферменты. Одним из актуальных направлений в этой области является модификация медицинских ферментных препаратов растворимыми полимерами-носителями, что приводит к увеличению активности самих лекарств. Методы модификации открывают широкие возможности для создания лекарственных препаратов комплексного действия путем совместной модификации ферментов, антибиотиков, гормонов и других соединений, обладающих выраженным терапевтическим свойством.

Задачей данного исследования являлась изучение биохимических свойств и физико - химических закономерностей межмолекулярного взаимодействия гидролитического фермента гиалуронидаза, являющегося активным началом лекарственного препарата "Лидаза", с природным полимером декстраном и его модифицированными производными.

Выбор фермента гиалуронидазы в качестве объекта исследования основан на том, что модификация этого фермента с целью получения активных производных представляет большой практический интерес как в медицине, так и в аналитической биохимии при изучении структуры биополимеров. Препарат "Лидаза" применяется в медицине для ускорения всасывания лекарственных веществ, рассасывания рубцов, вводится подкожно, внутримышечно или путем ингаляций. Фермент уменьшает вязкость межклеточного вещества, способствует увеличению проницаемости тканей и облегчает движение жидкостей в межтканевых пространствах. Поэтому проблема регулирования активности фермента и пролонгации его действия является очень актуальной.

Выбор декстрана и его карбоксиметилпроизводных для создания макромолекулярного комплекса основан на том, что

при получении лекарственных соединений, предназначенный для введения в организм, необходимо учитывать способность полимера ассимилироваться в организме и выделять« из него после выполнения своих функций. С этой точки ярения использование для создания полимерных комплексов производных декстрана, которые обладают высокой биосовместимостью, могут постепенно гидролизоваться в организме, представляет

значительный интерес.

Иа литературных данных известно, что путем введения антибиотиков в систему полимера-носителя достигается улучшение его терапевтического действия. Гентамицин — аминогликозидный антибиотик широкого спектра действия, подавляющий как грамотрицательные, так и грамполежительные микроорганизмы. Гентамицин широко применяется в медицинской практике. В виде мааей и линиментов используется при лечении пиодермитов, фоликулезов, свборейных дерматитов,

суперинфекции кожи, ожогах. 1С одним из его недостатков относится плохая всасываемость через кожные покровы. Вследствие атого локальное и,особенно, длительное применение мазей и линиментов, содержащих гентамицин, может привести к тяжелым нефротоксическим и ототоксическим осложнениям.

Гиалуронидаза облегчает всасывание лекарственного препарата в ткань, и, вследствие атого, возможна уменьшение его дозировки, улучшение терапевтического действия, снижение аллергических реакций.

Поэтому является актуальным получение и изучение биохимических свойств и физико-химических закономерностей образования комплексов фермента гиалуронидаза с гентамицином • присутствии растворимых полимерных структур на основе декстрана.

Задачи исследования. Целы« работы являлось изучение физико-химических закономерностей образования

межмолекулярных комплексов гиалуронидаэы с природными модифицированными полимерами и гентамицином. Для достижения «тай цели были поставлены следующие задачи!

1. определение основных кинетических параметров гидролиза гиалуроновой кислоты тестикулярной гиалуронидазой; разработка количественных методов тестирования

гиалуронидазы, выделенной из семенников крупного рогатого

скота;

2. изучение физико — химических закономерностей межмолекулярного взаимодействия гиалуронидазы с природными модифицированными полимерами 1 декетраном, карбоксиметилдекстраном различным степеней замещения, гентамициновой солью карбоксиметилдекстрана со степенью замещения 0.15 (ГКМД 0.15), гентамицинсзм, ковалентно связанным с этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана со степенью атерификации О.23 (ГЭЭКМД 0.23).

3. Изучение биологической активности полученным полимерных комплексов.

Научная новизна работы. Впервые проведены исследования биохимическим свойств препарата "Лидаэа", включающего в себя фермент гиалуронидаза.

Изучены физико-мимические закономерности

мехмолекулярного взаимодействия тестмкуяярной гиалуронидазы с природными модифицированными полимерами и гентамицином. Показано, что задавая структуру полимера-носителя и меняя условия взаимодействия в системе антибиотик-полимер, можно получить набор комплексов гиалуронидаза-полимер-гентамицин, обладающим иными свойствами по сравнению с немодными веществами.

Впервые рассчитаны кинетические параметры гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой, рассчитаны константы ингибирования в системам фермент-полимер-антибиотик.

Практическая значимость работы. Разработаны

количественные методы определения активности гиалуронидазы, которые могут быть использованы для тестирования не только конечного продукта, но и на различным стадиям темнологического процесса выделения и очистки фермента, в том числе, непосредственно а сырье (семенниках крупного рогатого скота) для определения его качества.

Получен набор растворимых комплексов гиалуронидаза -полимер - гентамицин, которые были использованы для создания лекарственным форм на мазевой основе, в растворам. Проведены биологические испытания.

Апробация результатов. Основные результаты работы представлены и доложены нас

- 3 Всероссийском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996г.)

- Международной конференции "Современные антибиотики: проблемы,перспективы,безопасность" (С.-Петербург, 1996г);

- Всероссийском симпозиуме "Теория и методы биосепарации и суперочистки биологически активных веществ" (С.-Петербург, 199&г>;

- Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" (С.-Петербург, 199Ьг);

- Медико-биологическом конгрессе, Международной конференции " Борьба с инфекцией и здоровье человека на рубеже веков" (С.-Петербург,1997г>.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано В печатных работ.

На защиту выносятся следующие основные полажемияг

- возможно связывание гиалуронидазы с полимером и антибиотиком по статистическому и кооперативному типу;

- в зависимости от типа связывания и природы комплекса полимер-фермент возможно целенаправленное ингибирование и активирование фермента;

- разработаны лекарственные формы в виде мазей пролонгированного действия, дано физико-химическое обоснование способов получения лекарственных форм с заданными свойствами.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка используемых литературных источников, включающих /б-Ь наименования. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 3/ рисунок , -б таблиц <

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

В качестве объектов исследования использовали ферментный лекарственный препарат "Лидаза", получаемый из семенников крупного рогатого скота на заводе медпрепаратов АО "Самсон" (С.Петербург), гентамицина сульфат (АО "Биосинтез" Пенза), декстран с молекулярной массой 60 + 10 кДа (завод медпрепаратов г.Саранск "Полиглмкин"), «го кжрбоксимятил- и г внтамициноаыв производные (кафедр* органической химии СПХФА).

Для анализа активности нативной гиалуронидазы и гиалуронидазы в комплексах фермент - полимер использовались специальна разработанные количественный метод определения гиалуронидазной активности препарата "Лидаза" и метод получения гиалуроновой кислоты из пупочных канатиков новорожденных.

В работе были использованы также стандартные методики!

- определение концентрации белка по модифицированному методу Лоури, основанном на восстановлении фенильной группы тирозина фосфомолибденовой кислотой реактива Фолина-Чиокальтеу}

- метод определения концентрации углеводов, в основе которого лежит цветная реакция моно- и олигосахаридов с фенолом и концентрированной серной кислотой;

- метод гельхроматографического анализа, основанный на разделении молекул различных веществ в соответствии с их размерами при прохождении через молекулярное сито. В качестве молекулярно-ситового геля использовали сефадекс фирмы " Sigma " 0-75-120. Оптическая плотность растворов на выходе из колонки (Д * Н» 12 к ¿30 мм) регистрировалась автоматически с помощью оборудования для быстрой хроматографии - установке FRLS Sistem фирмы Pharmacia LKB (Швеция).

- методика оценки процесса взаимодействия фермента с полимерами различной структуры по изучению кинетики диффузии через пористые мембраны (слабонабухахивие пористые мембраны фирмы "Millipore"c диаметром пор 10 мкм.>

- для оценки биологической активности комплексов использовали фармакопейный метод диффузии в агар.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Исследованы состав и свойства ферментного препарата "Лидаза". Экспериментальные данные о составе препарата "Лидам" были получены с помощь» гельхроматографического анализа (рис.1). Ив рисунка видно, что ферментный препарат представляет собой многокомпонентную систему, содержащую, кроме совокупности полимерных форм гиалуронидазы, ряд примесей белковой и углеводной природы. Нами было доказана, что данные примеси не оказывают существенного влияния на физико-химические свойства гиалуронидазы,входящей в состав препарата "Лидаза".

рис.1 Гельхроматографический анализ препарата "Лидаза"

«> Гельхроматографический анализ раствора препарат« "Лидаза" на сефадексе В-75-120

1- V 280, 2- анализ на гиалуронидазную активность, б) Анализ фракций на белок по модифицированному методу Лоури (1) и на содержание углеводов (2).

Изучены биохимически» свойства препарата "Лидаза". Показано, что фермент стабилен в области рН 3.7-3.8 и при твмпвратуре+5 С. Экспериментальные данные, представленные на рис.2,свидетельствуют о том,что оптимум рН-двйствия фермента составил 4.4-4.В ; определение ферментативной активности растворов гиалуронидазы проводили при соответствующих значениях рН цитратно-фосфатного буферного раствора при температуре +37° С.

■-1---<---1— рН

0 1 2 3 4 5 6

рис.2 Определение рН-оптимума действия гиалуронидаза

Для изучения процесса гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой разработана методика приготовления субстрата (гиалуроновой кислоты) из пупочных канатиков новорожденных. Полученный субстрат (рабочий субстрат) по вязкости, содержании белков и углеводов, по отношению оптической плотностей при»?=260нм — 280нм близок к швейцарскому

субстрату фирмы " ЯХика " и субстрату, полученному в ВНЖБХАН (табл. 1).

табл.1

Характеристики гиалуроновых кислот различных фирм

Производители Белок Углеводы Д 260/280

Новосибирск ВНИИБХ АН фирма "ЯЛика"(Швейцария) Рабочий субстрат 10% 10.3% 21% 31. ЗУ. 31.5% 50% 1.1-1.5 1.1 1.11

Для изучения кинетики гидролиза гиалуроновой кислоты полимерной формой гиалуронидазы и для характеристики полученного нами субстрата определен ряд кинетических параметров - максимальная скорость (Утл), константа

Михаэлиса-Ментена (Км). Кинетические кривые гидролиза представлены на рис. 3(4.

Для сравнения аналогичные исследования были проведены

со стандартом гиалуроновой кислоты фирмы 'Т1ика".

Полученные результаты позволяют говорить о том, что в первом приближении кинетика гидролиза изученных субстратов нативной гиалуронидазой подчиняется теории Бриггса—Холдена и кинетические кривые могут быть описаны уравнением Михазлиса-Ментена. Как видна из графиков, с изменением состава субстрата происходит изменение величины Км и Умах. С увеличением степени чистоты применяемого субстрата Км убывает, а скорость реакции возрастает.

Метод определения ферментативной активности

гиалуронидазы, описанный в ФС 42-2606-88 ; является полуколичественным, основанным на визуальном наблюдении за результатом реакции. Его сложно применить для определения гиалуронидазной активности на различных технологических стадиям выделения и очистки гиалуронидазы, а также при тестировании сырья. Поэтому разработан количественный метод определения ферментативной активности гиалуронидазы, лишенный перечисленных выше недостатков. Данные, полученные по разработанной нами методике, сравнимы с данными, полученными по ФС 42-2602-93, применяемой в настоящее время. Однако пользоваться ФС 42-2602-93 было затруднительна, так как требовалась закупка государственного стандартного образца фермента и субстрата за рубежом (Белоруссия), что невозможно для проведения большого количества экспериментов диссертационной работы. Поэтому были разработаны

количественные методы определения активности гиалуронидазы.

Основу предложенных методов составляет реакция гидролитического расщепления гиалуроновой кислоты

гиалуронидазой в течение определенного времени при заданной температуре и осаждение продуктов гидролиза альбумином при □пределнных условиях в кислой среде. Образующийся муциновый сгусток представляет собой комплекс альбумина с фрагментами гиалуроновой кислоты большой молекулярной массы.

При разработке турбидиметрического метода приняли во внимание тот факт, что при изменении концентрации фермента перед формированием муцинового сгустка образуется помутнение, оптическая плотность которого пропорциональна концентрации гиалуронидазы. Измерение оптической плотности растворов проводили при длине волны 565 нм.

рис.3 Зависимость скорости гидролиза гиалуромовой кислоты от концентрации субстрата

1 - гиалуронидаэа - гиалуроновая кислота (Р1ика)

2 - гиалуронидаэа - рабочий субстрат

рис.4 Определение константы Нихаэлиса для ферментативных систем«

1 - гиалуронидаэа - гиалуронавая кислота (Р1ика)

2 - гиалуронидаэа - рабочий субстрат

Предлагаемый метод прост для количественного определения активности гиалуронидазы, но в узкой области концентраций. Поэтому возникла необходимость в модификации представленной методики.

Второй метод основан на определении концентрации белка в надосадочной жидкости, полученной в - результате

центрифугирования раствора после гидролиза и осаждения. Так как концентрация альбумина постоянна, а концентрация субстрата подбиралась с учетом кривых Михаэлиса-Ментена, то количество осажденной гиалуроновой кислоты будет зависеть от концентрации фермента в растворе.

К преимуществам разработанного метода относятся;

- возможность точного количественного определения активности гиалуронидазы;

- данный метод может применяться при малых концентрациях фермента в растворе, что делает возможным его применение на различных стадиях технологического процесса получения препарата, а также для оценки содержания гиалуронидазы в сырье и в конечном продукте;

- незначительные финансовые затраты на реактивы, простота выполнения.

В предыдущих работах (Витовская Г.А., (Сомов В.П.) показано влияние полисахаридов на ферментативную активность. В работе Глазовой Н.В. доказано, что взаимодействие панкреатической РНК-азы с природными модифицированными полисахаридами — сульфатами декстрана зависит от количества функциональных групп и молекулярной массы декстрана. Поэтому представлялось интересным изучить взаимодействие

гиалуронидазы с декстраном и его модифицированными производными.

Было изучено влияние декстрана, его карбоксиметильных производных, а также модифицированных форм с гентамицином на активность гиалуронидазы в растворе. Результаты эксперимента представлены на рис.5,6.

На рис.5 показана зависимость относительной активности гиалуронидазы в растворе от степени замещения КМД и концентрации КМД. Как видно из графиков, при увеличении степени замещения и концентрации полимеров происходит

значительное падение активности гиалуронидазы в растворе, что, по-видимому, связана с взаимодействием гиалуронидазы с перечисленными выше полимерами. Были проведены исследования по определению влияния гентамицина, ГКМД 0.15 и ГЗЭКМД 0.23 на активность гиалуронидазы в растворе. Результаты

представлены на рис.6, где показана зависимость

относительной активности гиалуронидазы в растворе от концентрации системы полимер - антибиотик.

Из графиков видно, что в присутствии гентамицина, при определенных соотношениях фермент — гентаницин, относительная активность гиалуронидазы увеличивается на 40Х; при введении гентамицина в полимерную систему, в зависимости от типа связи в полимерной системе, возможно как повышение (2), так и понижение (3> относительной активности гиалуронидазы в растворе.

Для изучения взаимодействия гиалуронидазы с исследуемыми полимерами—носителями использовали метод изучения кинетики диффузии через пористые мембраны. Данный метод дает возможность рассчитать количество связанного и свободного фермента, используя зависимость концентрации перешедшего через мембрану белка из буферного раствора фермента и смеси его с полимером и антибиотиком от времени (рис.7).

Уменьшение количества фермента, перешедшего через мембрану за время ^ в присутствии полимера свидетельствует о связывании гиалуронидазы с ним. По указанному методу определяли свободную концентрацию фермента в растворе и из этих данных рассчитывали количество связанного в комплекс фермента. Изотермы связывания представлены на рис.8,9, где показана зависимость степени связывания от равновесной концентрации фермента в растворе.

Так, взаимодействие гиалуронидазы с декстраном,КМД 0.15, системой декстран-гентамицин, а также ГКМД 0.15 характеризуется изотермой насыщения ленгмюровского типа, то есть реализуется статистическая фиксация молекул гиалуронидазы на полимере-носителе, не способных

взаимодействовать между собой. Увеличение степени замещения в полимере, а также изменение типа связи в полимерном комплексе, приводит к изменению типа взаимодействия фермента

рис.5 Влияние степени замещения и концентрации декстрана и его карбоксиметилпроизводных на активность гиалуронидазы в растворе

1-С п/м = 0.33 мг/мл

2-С п/м ■» 3.3 мг/мл

рис.6 Влияние гвнтамицина и гентамициновых производным

карбоксимвтилдвкстрана на активность гиалуронидазы в растворе

1 - гиалуронидаза - гентамицин

2 — гиалуронидаза - гентамициновая соль Ю1Д 0.15

3 - гиалуронидаза - ГЭЭКМД 0.23

рис.7 Скорость диффузии свободной гиалуронидазы из раствора через пористую мембрану фирмы "Mi.ll.ipor" в присутствии различных полимерных структур

1 - гиалуронидаза,

2 - гиалуронидаза - ГЗЭКМД 0.23,

3 - гиалуронидаза - КМД 1.1,

4 - гиалуронидаза - ГКМД 0.15,

5 - гиалуронидаза - КМД 0.19,

6 - гиалуронидаза - декстран- гентамицин,

7 — гиалуронидаза — декстран

с полимером. Для этих систем изотермы связывания характеризуются возрастанием первой производной по концентрации, что соответствует кооперативному типу мехмолекулярного взаимодействия. То есть, кооперативный процесс, сводящийся к непосредственному влиянию первых присоединенных молекул на присоединение последующих молекул гиалуронидазы, более вероятен при взаимодействии фермента с КМД 1.1 и с ГЗЗКМД 0.23.

и M/M

рис.S Изотерма связывания гиалурониаазы

1 - гиалуронидаза - КМА 1.1,

2 - гиалуронидаза - КНД О.15,

3 - гиалуронидаза - декстран - гентамицин,

4 - гиалуронидаза - декстран

м M/M

рис.9 Изотерма связывания гиалуронидаза с различными полимерными системами

1 - гиалуронидаза - ГЗЭ1СМД 0.23

2 - гиалуронидаза - ГКМД 0.15

Связывание ферментов с растворимыми

полимерами-носителями приводит к образованию более компактных комплексов, чем отдельные структуры самого полимера-носителя, что показано при изучении конформационных изменений в изучаемых системах.

Экспериментальные данные, характеризующие зависимость приведенной вязкости изучаемых растворов от степени связывания, полученной из соответствующих изотерм связывания, представлены на рис.10.

Как видно, существует взаимосвязь между типом взаимодействия гиалуронидазы с полимером-носителем и структурой получаемых комплексов в растворе. Статистическая фиксация гиалуронидазы приводит к возрастанию приведенной вязкости раствора комплекса при увеличении количества

рис.10 Зависимость приведенной вязкости комплексов

гиалуронидазы с различными полимерными системами от степени связывания м.

1 - гиалуронидаза - декстран

2 - гиалуронидаза - декстран - гентамицин

3 - гиалуронидаза — КМД 0.15

4 — гиалуронидаза — ГКМД 0.15

5 - гиалуронидаза - КМД 1.1

6 - гиалуронидаза - ГЗЗКМД 0.23

связанного белка, что позволяет говорить о фиксации молекул фермента поверхностными функциональными группами

полимера-носителя. Эффект кооперативного взаимодействия макромолекул в комплексе привадит к резкому снижению приведенной вязкости, что указывает на высокую компактность частиц полимерного комплекса.

Влияние функциональных характеристик модифицированных растворимых полимеров—носителей на рН—оптимум действия представлен на рис.11.

Экспериментальные данные дают возможность говорить о различном влиянии модификаторов на рН-оптимум действия гиалуронидазы в растворе. Для поликомплексов характерен сдвиг оптимума рН—действия в щелочную сторону по сравнению с максимумом, наблюдающимся в случае нативного фермента, а также расширение рН — зависимости, вследствие чего скорость ферментативной реакции, катализируемой модифицированным

А X

100

50

V 3

рН

рис.11

01 23456789

Влияние функциональных характеристик полимерных комплексов на рН-аптимум действия гиалуронидазы

1 — гиалуронидаза

2 — гиалуронидаза — декстран - гентамицин

3 — гиалуронидаза - ГКМД 0.15

4 - гиалуронидаза - ГЗЭКМД 0.23

ферментом, становится менее чувствительной к изменениям рН. Такое различие в изменении каталитических свойств гиалуронидазы при взаимодействии с модифицированными носителями можно связать с неодинаковыми конформационными изменениями гиалуронидазы, обусловленными различными

энергиями комплексообразования с полимерами различной структуры. Возможно, что в некоторых конформационных состояниях полимерным комплексов гиалуронидаза более эффективно связывает субстрат, чем в других. Кроме того, введение полимерных комплексов в ферментативную систему вызывает, по-видимому,дополнительную ионизацию аминокислот, входящих в состав активного центра гиалуронидазы, что приводит, вероятно, к усилению фермент-субстратного взаимодействия.

Исследование влияния температуры на кинетику инактивации форманта ■ растворе я присутствии двкстранж, ГКМД 0.15, ГЗЗКМД 0.23 проводили при соответствующих рН -оптимумах действия комплексов . с гиалуронидазой при температуре! +3,'с, +20°С, +37"с, +Ь0°С в течение 3 часов. Установлено, что полимерные системы значительно влияют на кинетику инактивации • растворе. Максимальное

стабилизирующее влияния оказывает декстран (соотношение белок - полимер 1:10> (рис.12). При 60ВС в течение 5 часов падение активности составило 25%. В то время как в присутствии гентамициновой соли КМД 0.15 гиалуронидаза инактивируется за тот же промежуток времени на 35%, в присутствии ГЗЗКМД 0.23 на 472, а нативная - на 99Х за тот я* промежуток времени.

рис.12 Влияние температуры на кинетику инактивации гиалуронидазы в растворе в присутствии декстрана 1-1-+5°С, 2-^+ 20С С, 3 - 1 = + 37е С, 4 - 1 =+ 60е С

Уменьшение скорости инактивации гиалуронидаэы в присутствии декстрана связано, по-видимому, с многоточечной фиксацией фермента на поверхности полимера за счет водородных взаимодействий, приводящих к дополнительной стабилизации, препятствующей изменению конформации и в области активного центра при изменении температуры. Увеличение скорости инактивации, характерное для системы гиалуронидаза-ГЭЗКМД 0.23, связано с кооперативным типом взаимодействия между ферментом и полимером - носителем, приводящим к конформационным изменениям в области активного центра.

Одной из проблем при использовании в качестве лекарственой формы растворов ферментов является их нестабильность. Так, при температуре + 20*С в течение 24 часов активность гиалуронидазы падает на 70%. Поэтому важным направлением является поиск стабилизатора фермента в растворе. Результаты предыдущих опытов дали возможность сделать заключение о том, что в качестве стабилизаторов могут быть использованы декстран и КМД 0.15. Было изучено действие декстрана и КМД 0.15 на активность гиалуронидазы в растворе в течение & суток при температуре +36°С. В качестве растворителя использовали цитратно-фосфатный буферный раствор, рН 4.6. Соотношение белок-полимер составило 1:1, 1:10. Дальнейшее увеличение концентрации полимера незначительно влияло на результаты эксперимента. Данные представлены на рис.13.

Наилучший стабилизирующий аффект был достигнут в присутствии в растворе фермента декстрана в соотношении белок-полимер 1(10 (график 1). Инактивация фермента при наличии в растворе КМД 0.15 наступает быстрее, чем в присутствии декстрана.

Как указывалось выше, существенное влияние на конформацию комплексов гиалуронидазы с растворимыми носителями оказывают свойства полимера-носителя и тип связи между полимером и гентамицином. Анализ активности комплексов гиалуронидазы, проведенный в тех же условиях (рН, температура, соотношение полимер-белок), при которых были получены ранее изотермы связывания (рис.8,9), позволил

У г

3

4

' 0 40 80 120

рис.13 Стабилизация гиалуронидазы декстраном и КМД О.15 при различном соотношении полимера и фермента в растворе, t = + 36° С.

1 - гиалуронидава - двкстран (1 в 10),

2 - гиалуронидаза - двкстран (Il 1),

3 - гиалуронидаза - КМД 0.15 (1(10),

4 - гиалуронидаза - КМД 0.15 (lsl).

Аотн %

300

200 100

м M/M

0 0.5 I.o

рис.14 Изменение активности гиалуронидазы, связанной с различными растворимыми полимерными системами

1 - гиалуронидаза - декстран - гентамицин,

2 - гиалуронидаза - ГКМД 0.15,

3 - гиалуронидаза - декстран,

4 - гиалуронидаза - ГЗЗКМД 0.23

5 - гиалуронидаза - КМД 1.1

установить взаимосвязь между типом межмолекулярного взаимодействия и активностью гиалуронидазы в комплексе.

Для каждой из систем была рассчитана удельная гидролитическая активность, приходящаяся на фермент, связанный с полимером-носителем и выражена в процентах от удельной активности нативного фермента (Аотн).

Экспериментальные данные, представленные на рис.14, показывают, что при взаимодействии гиалуронидазы с различными полимерными структурами возможно как значительное падение, так и увеличение гидролитической активности связанного фермента. Сопоставление изотерм связывания с данными по активности для соответствующих систем показывает, что связывание гиалуронидазы по кооперативному типу способствует понижению гидролитической активности

фиксированного фермента, вплоть до значительного его ингибирования при высокой степени кооперативности процесса, когда происходит значительная структурная деформация лабильных конформаций обоих участков - и белка, и полимера, что приводит к существенному изменению ферментативной активности связанной гиалуронидазы. В отличие от этого, при статистическом расположении молекул гиалуронидазы на полимере наблюдается увеличение гидролитической активности. Наибольшая активность связанного фермента (до 280%) характерна для комплекса гиалуронидаза - декстран — гентамицин, где взаимодействие между ферментом и растворимой полимерной системой описывается изотермой Ленгмюра.

Полученные результаты еще раз подтверждают предположение о том, что тип изменения активности гиалуронидазы надежно детерминирован структурой применяемых полимеров и полимерных комплексов: расположением ионогенных функциональных групп, определяющих энергию взаимодействия гиалуронидазы с полимерами, а также типом связи между полимером-носителем и гентамицином. Задавая структуру полимера - носителя и меняя условия взаимодейтсвия, можно получить набор комплексов, обладающих иными свойствами по сравнению с исходными веществами.

Изменение активности гиалуронидазы при образовании комплексов с различными полимерными системами несомненно должно отразиться на величине кинетических параметров

ферментативной реакции. Для характеристики ферментативого катализа гиалуранавой кислот« модифицированной

гиалуронидавой воспользовались величиной максимальной скорости реакции гидролиза (Ум), константой диссоциации фермент-субстратного комплекса - константой Михаэлиса (Км), константой ингибирования (К!).

Полученные результаты позволяют говорить об активирующем влиянии гентамицина, ГКМД О.15 на

каталитическую активность фермента и об ингибирующем действии КМД 1.1, ГЭЗКМД 0.23 (табл.2).

табл.2

Определение кинетических параметров нативного и модифицированного фермента

состав полимерных систем К1 мг/мл Кт мг/мл Ум мМ/сек

1 гиалуронидаза -1- КМД 1.1 1.1342 0.5681 4.7619

2 гиалуронидаза + ГЗЗКМД 0.23 0.5095 0.3003 5.9523

3 гиалуронидаза - 0.2222 6.5359

4 гиалуронидаза + ГКМД 0.15 - О.1897 6.6225

5 гиалуронидаза + гентамицин - 0.1814 7.4626

Ингибирующий аффект связан, по-видимому, с

кооперативным типом межмолекулярного взаимодействия в системе полимер-фермент, ведущему к образованию очень компактной структуры комплекса, способствующей значительным конформационным изменениям 8 области активного центра, препятствующим взаимодействию гиалуронидазы с субстратом.

Взаимодействие между гиалуронидазой и полимерными системами с гентамицином, по всей вероятности, должно оказать влияние на биологическую активность гентамицина.

Поэтому потребовалось проведение ряда экспериментов, подтверждающих наличие биологической активности и гентамицина в комплексах с гиалуронидазой. Был исследован ряд грамположительных (Bac.subtilis, Bac.cereus

uar.mycoides) и грамотрицательных (Ps.aeruginosa, E.coli) культур, входящих в список основных микроорганизмов, на которые действует гентамицин.

Для определения активности антибиотика использовали метод диффузии в агар. Экспериментальные данные,

представленные в табл. 3 показали, что в комплексе с гиалуронидазой активность гентамицина значительно

возрастает.

табл.3

Биологическая активность гентамицина в различных комплексах с гиалуронидазой (биологическая активность гентамицина и полимерных систем с гентамицином принята за 10071)

Вид микроор г аниэма гиалуронидаза + декстран+ гентамицин, X гиалуронидаза +ГКМД 0.15, % гиалуронидаза +ГЗЗКМД 0.23, X

Вас.subtilis 187.3 187.5 137.5

Bac.cereus var. mycoides 450 500 287.5

Ps.aer ug inosa 137.5 212.5 137.5

E.coli 162.5 236 175

Гентамицин в виде мазей и линиментов широко применяется в медицинской практике для лечения пиодермитов, себорейных дерматитов, суперинфекции кожи, ожогах. К одним из его недостатков относится плохая всасываемость через кожные покровы. Вследствии этого локальное, особенно длительное,

применение мазей и линиментов, содержащих гентамицин, может привести к: тяжелым нефротоксическим и ототоксическим осложнениям. Поэтому была проведена экспериментальная работа по созданию мазей, включающих гентамицин, декстран,ПСМД 0.19, фермент. Для сравнения был взят лекарственный препарат "Гентамициновая мазь 0.IX", состоящая из гентамицина сульфата 0.1г., парафина 5г., вазелина медицинского до 100г. Были взяты мази на той же основе, в качестве активного начала содержащие лекарственный препарат "Лидаза", гентамицина сульфат, декстран, ГЮ1Д 0.15 (табл.4).

табл.4

Сравнительный анализ комплексных лекарственных препаратов на мазевой основе

Активное начало □снова Биол. активность X

гентамицина сульфат,г ПСМД 0.15 г ГУ г декстран г парафин г вазелин г

0.1 - 0.01 0.1 5 до 100 154

к 0.5 0.01 - 5 до 100 186

Биологические испытания, проведенные методом диффузии в агар, показали, что и гентамицин, и гиалуронидаза сохраняют

свою активность в исследуемых мазях в течение Ь месяцев при

0 в

температуре хранения +2 - +4 С.

выводы

1.Исследованы физико-химические свойства препарата "Лидаза".

2.Разработаны метод получения гиалуроновой кислоты из пупочных канатиков новорожденных и метод тестирования препарата "Лидаза",позволяющий провести точную количественную оценку гиалуронидазной активности,как в готовом продукте,так и на различных стадиях технологического процесса получения лекарственного ферментного препарата "Лидаза".

3.Изучены кинетические и физико-химические характеристики нативной гиалуронидазы и гиалуронидазы в присутствии модифицированных форм декстрана. Определено, что для модифицированной гиалуронидазы характерен сдвиг рН—оптимума действия в щелочную сторону с расширением ветвей рН-зависимости. Установлено стабилизирующее влияние декстрана на кинетику температурной инактивации гиалуронидазы в растворе.

4. Установлены физико-химические закономерности взаимодействия гиалуронидазы с декстраном, карбоксиметилдекстраном различных степеней замещения, гентамицином, гентамициновыми производными декстрана, Методом изучения кинетики диффузии через пористые мембраны показано влияние типа межмолекулярного взаимодействия на активность модифицированного фермента. Установлена, что статистическая фиксация фермента на полимере-носителе ведет к повышению гидролитической активности с возрастанием приведенной вязкости комплекса при увеличении количества связанного фермента.При кооперативном типе взаимодействия наблюдается понижение активности фермента, обусловленное образованием более компактных структур.

5. Исследована биологическая активность гентамицина в растворе в присутствии фермента и полимера-носителя.Показана значительное увеличение микробиологической активности гентамицина в комплексе.

6. Показана возможность получения новой лекарственной

Формы в виде мазей, включающих комплексы

фермент-полимер-антибиотик. Полученные мази обладают повышенным антимикробным действием, что позволяет сократить антибиотическую нагрузку.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова. Разработка методов тестирования гиалуронидазы. 3-й Российский национальный конгресс "Человек и лекарство",Москва, апрель 1996, С.319.

2. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова. Изучение взаимодействия гентамицина с гиалуронидазой, полученной из семенников крупного рогатого скота. Международная конференция "Современные антибиотики - проблемы,перспективы, безопасность". С.-Петербург,апрель 1996,с.42

3. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова, М.Н.Пономаренко. Получение пролонгированных лекарственных форм ферментных препаратов. Научно-практическая конференция "Современное состояние и перспективы научных исследований в области фармации". Самара, сентябрь 1996,С.У&,

4. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова. Изучение взаимодействия гиалуронидазы с полимерными биологически активными веществами в растворе. Всероссийский симпозиум "Теория и методы биосепарации и суперочистки биологически активных веществ ".С.-Петербург, октябрь 1996 ,с.21

5. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова.Разработка количественного метода тестирования гиалуронидазы. Всероссийская конференция "Актуальные проблемы создания лекарственных средств ". С.-Петербург, ноябрь 1996, с.24

6. И.Г.Радченко,Н.В.Глазова. Получение и изучение свойств комплексов гентамицина,гиалуронидазы и декстрана. Всероссийская конференция "Актуальные проблемы создания

лекарственных средств". С.-Петербург, ноябрь 1996, с.24

7. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова, Н.В.Заинкова. Применение противоинфекционных комплексных препаратов гиалуронидаэы с гентамицином в педиатрии. Медико-биологический

конгресс.Международная конференция "Борьба с инфекцией и здоровье человека на рубеже веков ". С.Петербург, май 1997

В. И.Г.Радченко, Н.В.Глазова, М.Н.Пономаренко, А.А.Иозеп. Исследование полимерных комплексов, включающих ферменты и

растворимые полимеры. // ж ."Прикладная химия", 1997, т.70,в.6,с.1040-1043

РАДЧЕНКО Ирина Геннадьевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГИАЛУРОНИДАЗЫ С ГЕНТАМИЦИНОМ И ПОЛИМЕРАМИ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ

03.00.4 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано к печати 22.05.97. Формат 60 х 90'/16. Бумага тип. Печать

ризогр. Печ. л. 1,5. _Тираж 100 экз. Заказ 100._

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая

академия

197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14