Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиоксидантное, мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие аминогликозидных антибиотиков, введеных в эритроцитарных носителях (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антиоксидантное, мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие аминогликозидных антибиотиков, введеных в эритроцитарных носителях (экспериментальное исследование)"

На правах рукописи

ШЕВЦОВА Елена Михайловна

АНТИОКСИДАНТНОЕ, МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ, ВВЕДЕНЫХ В ЭРИТРОЦИТАРНЫХ НОСИТЕЛЯХ (экспериментальное исследование)

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Курск - 1998

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете г. Курск.

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Л.Г. Прокопенко доктор биологических наук, профессор Л.Е. Сипливая

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г.А. Чалый кандидат биологических наук ЕШ. Безтн

Ведущее учреждение: Воронежский государственный агроуниверситет

Защита диссертации состоится " " 1998 г.

в часов на заседании специализированного совета К 120.25.03 в Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова по адресу: 305021, г. Курск, ул. Карла Маркса 70, КГСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. ИВАНОВА

Автореферат разослан"" "

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических нау! доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По современным представлениям, важное место в развитии патологии, в том числе инфекционной, отводится активным метаболитам кислорода (АМК) (В. А. Барабой, 1989; Fukuzzumi Kazuo, 1986; С.С. Boster ,1989). Считается, что АМК проявляют цитотоксическое действие через инициацию свободнорадикального окисления фосфолипидов мембран, приводящего к развитию окислительного повреждения липидов, биополимеров и надмолекулярных структур клеток (О. Н. Воскресенский, А. ПЛевицкий, 1970; А. И. Арчаков, И. М. Махосоев, 1989; О. Yukawa, 1988).

Нарушение структуры клеточных мембран и выход в кровеносное русло продуктов повышенного метаболизма клеток приводит к развитию метаболической иммуносупрессии и может быть одной из причин изменения чувствительности клеток к различным химическим агентам, в том числе к лекарственным препаратам (Е.Г. Кирдей и др., 1992; Л.Г.Прокопенко и др. ,1995).

При инфекционной патологии широко используются аминог-ликозидные антибиотики, обладающие мощным бактерицидным действием и широким антимикробным спектром (А. В. Ухин, 1991). Наряду с этим, этиотропная антибиотикотерапия, безусловно необходимая при активном течении инфекционного процесса, может усугублять нарушения, вызванные инфицированием (В.П. Сильвестров и др., 1990). В последнее время обнаружено, что антибиотики, в том числе аминогликозиды, активно вовлекаются в процессы свободнорадикального окисления (СРО), что может лежать в основе как их токсичности, так и антивоспалительного действия, обусловленного влиянием не только на микробный агент, но и на кислэродзависимое повреждение тканей фагоцитами (Н.Ф. Абдрашитова и др., 1996; P.P. Фар-хутдинов и др., 1996). Перспективным направлением в химиотерапии является использование систем целенаправленной и контролируемой доставки в организм различных лекарственных средств, позволяющих значительно снизить их системную токсичность и удлинить время полувыведения препаратов из организма (А.Е. Гуляев и др., 1994; А.И. Перепелкин и др., 1996). Наиболее выгодными с точки зрения биологической совместимости считаются системы доставки, в которых используются собственные клетки организма, в частности эритроциты. В литературе описаны лишь единичные экспериментальные и клинические исследования по введению в организм антибиотиков в

в эритроцитарных носителях (Т.П. Генинг и др., 1988; Ж.Ш. Жу-мадилов и др.,1990;Т.П. Генинг, К. К. Мануйлов, 1991). Практически не изучено их влияние на процессы СРО и иммунологическую реактивность организма.

Цель работы - изучение влияния некоторых аминоглико-зидных антибиотиков, введенных в эритроцитарных носителях, на интенсивность свободнорадикальных процессов и иммунологическую реактивность организма при инфекционной патологии.

Задачи:

1. Разработать чувствительную, точную и экспрессную методику определения концентрации гентамицина и амикацина в биожидкостях.

2. Изучить кинетику свободных и включенных в тени эритроцитов (ТЭ) антибиотиков в биожидкостях.

3. Изучить влияние свободных и включенных в ТЭ антибиотиков на активность ферментов антиоксидантной системы (АОС) эритроцитов и содержание продуктов перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ) в сыворотке крови.

4. Изучить влияние свободных и включенных в ТЭ антибиотиков на выраженность процессов цитолиза и холестаза.

5. Изучить влияние свободных и включенных в ТЭ антибиотиков на иммуномодулирующую активность эритроцитов и имму-ноцитов.

6. Выяснить роль гуморальных факторов клеток селезенки в реализации про- или антиоксидантного и иммуномодулирущего эффектов свободных и введенных в ТЭ антибиотиков.

Новые научные положения, выносимые на защиту:

1. Инфицирование и введение аминогликозидных антибиотиков в высоких дозах снижает активность ферментов АОС, усиливает ПОЛ, процессы цитолиза и холестаза, супрессирует развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) на эритроциты барана (ЭБ).

2. Введение антибиотиков в эритроцитарных носителях нормализует показатели ПОЛ, АОС, цитолиза и холестаза, стимулирует иммунологическую реактивность у инфицированных животных.

3. Эссенциале, поливинилпирролидон (ПВП) и лизоцим в разной степени корригируют прооксидантное и иммуносупрессор-ное действие свободных антибиотиков. Дополнительная обработка

ТЭ с включенными антибиотиками эссенциале повышает их дефективность.

4. Антибиотики, введенные в свободном состоянии, появляются в кровеносном русле в высоких пиковых концентрациях. Введение антибиотиков в эритроцитарных носителях обеспечивает плавное нарастание их концентрации в крови.

5. Свободные антибиотики аминогликозиды индуцируют выделение цитокинов неприлипающей к стеклу фракцией спленоци-тов, обладающих прооксидантной и иммуносупрессирующей активностью. ТЭ с включенными антибиотиками индуцируют выделение цитокинов прилипающей к стеклу фракцией спленоцитов, проявляющих антиоксидантную и иммуностимулирующую активность.

Научно - практическая значимость результатов исследований. Разработана чувствительная, точная, экспрессная методика спектрофотометрического определения гентамицина и амикацина в субстанции (р.п. №№ 1277-97, 1278-97 от 8.04.97) и биожидкостях. С применением этой методики изучено включение гентамицина и амикацина в эритроцитарные носители, исследована их кинетика в биожидкостях инфицированных стафилококком животных, отработаны оптимальные дозы и схемы введения. Установлено антиоксидантное, мембраностабилизирующее и иммуномодулирующее действие введенных в эритроцитарных носителях аминогликозидных антибиотиков в условиях стафилококковой инфекции. Выявлена роль гуморальных факторов клеток селезенки в реализации антиоксидантного и иммуностимулирующего эффектов эритроцитарных носителей с включенными антибиотиками-аминогликозидами. Экспериментально обоснована перспективность клинических испытаний эффективности эритроцитарных носителей с включенными антибиотиками при инфекционной и других видах патологии .характеризующихся развитием окислительного стресса и снижением иммунологической реактивности организма.

Апробация работы. Основные положения диссертации были обсуждены на научных конференциях молодых ученых Курского государственного медицинского университета (1996,1997,1998); III и IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 1996, 1997).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследований (глава 2), изложения результатов собст-

венных исследований (главы 3 - 7), заключения и выводов. Работа изложена на 181 странице машинописи и включает 49 таблиц, 9 рисунков, указатель литературы, содержащий 177 источников отечественной и ИЗ зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 150 - 180 г и на мышах СВА и FI (СВА х С 57 BL) массой 19 - 21 г.

Модель генерализованной стафилококковой инфекции воспроизводили путем заражения животных суточной агаровой культурой Staphylococcus aureus (штамм "Жаев"), вьщеленный от больного с нагноением раны и приготовленный на 0,9%-ном растворе натрия хлорида. Животных инфицировали внутрибрю-шинной инъекцией предварительно оттитрованных доз стафилококка, содержащих 1x10е или 2х109 микробных тел (летальная доза) в 0,5 мл. Наблюдение за инфицированными летальной дозой стафилококка мышами проводили в течение 10 дней с момента заражения. На протяжении этого периода определяли выживаемость мышей в процентах по отношению к контролю.

В работе использовали: амикацина сульфат (флаконы с содержанием активного вещества 0,5г,ФАО "Ферейн", Россия), гентамицина сульфат (флаконы с содержанием активного вещества О.Овг.ФАО "Ферейн", Россия), эссенциале (раствор в амп.. по 10мл, содержащий 1г фосфолипидов, Natterraann & Cié. GmbH Германия), лизоцим (флаконы с содержанием активного вещества 100мг,ФАО "Ферейн", Россия), гемодез (6% водно-солевой раствор низкомолекулярного ПВП, MM 12600+/-2700). Ами-кацин, гентамицин и лизоцим перед введением растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия. Свободные антибиотики вводили внутримышечно трех- и пятикратно с интервалом 24 часа в дозах : гетамицин - 0,5; 1,5 и 3 мг/кг, амикацин -3; 7 и 15 мг/кг. Препараты-корректоры (эссенциале, лизоцим и ПВП) вводили пятикратно внутримышечно, одновременно с антибиотиками в дозах: эссенциале - 1 мг/кг (в пересчете на фосфолипи-ды), лизоцим - 1 мг/кг, ПВП вводили в количестве 0,5 мл в одном шприце с антибиотиками. Способ введения и выбор -разовых доз препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в аннотациях к применению и экспериментальным данным.

Для включения антибиотиков в эритроцитарные носкгел^ использовали метод гипоосмотического гемолиза в модификации Ж.Ш. Жумадилова с соавт. (1990). Процент включения ген-тамицина в ТЭ составил 18,3±2,1%, амикацина - 12,7*1,5%.

Разовые дозы гентамицина, введенного в ТЭ и амикацина равнялись соответственно 1,5 и 7 мг/кг. ТЭ с антибиотиками вводили внутривенно двух- и пятикратно о интервалом 24 часа.

Аллогенные эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Т.В. Кобозев и др., 1978). Получали две фракции эритроцитов: легкую (плотность меньше 1,097 г/см3) и тяжелую (плотность более 1,117 г/см3). Фракционирование эритроцитов, во избежание гемолиза тяжелой фракции, проводили ex tempore. В части опытов аллогенные эритроциты или их фракции инкубировали в сыворотке крови здоровых и инфицированных животных, получавших инъекции антибиотиков. Эритроциты вводили здоровым животным внутрибрюшинно двухкратно с интервалом 24 часа в дозе 107 клеток на 0,1 кг массы тела.

Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Э.Ф. Полушкина и др., 1983). Аутологичные эритроциты из взвеси спленоцитов удаляли гемолитическим шоком (Бурмейстер Ю. В., 1979). Клеточные взвеси культивировали в среде 199 (5х106 клеток на 3 мл среды) с добавлением 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина) в течение 3 ч в ламинарбок-се при периодическом обновлении газовой среды (95% 02 и 5% С02). По истечении срока инкубации клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 мин и готовили пул надо-садочной жидкости клеток селезенки (НЖКС), используя для этого надосадочные жидкости 5-6 однотипных по опыту животных.

НЖКС фракционировали на сефадексе G - 150, при этом получали три фракции: 1-я фракция содержала белки с молекулярной массой (ММ), превышающей 150 кДа; 2-я фракция - преимущественно белки с ММ 50-60 кДа; 3-я фракция - белки с ММ 10-15 кДа и ниже. Иммуномодулирующую активность полученных фракций, а также их влияние на антиоксидантный статус определяли путем однократного внутрибрюшинного введения их интактным животным в объеме, содержащем 0,2 мг белка на 0,1 кг массы тела, с одновременной инъекцией антигена.

Оценку выраженности окислительного стресса проводили через 24 часа после заключительного введения препаратов и через

10 суток путем определения в сыворотке крови концентрации диеновых конъюгатов жирных кислот (ДК) и малонового диаль-дегида (МДА) (И. Д Стальная, 1977; И.Д. Стальная, Т. Г. Гари-швили, 1977), в эритроцитах - активности супероксидцисмутазы (СОД) и глутатионредуктазы (ГР) (Е. В. Макаренко, 1988).

Индикаторами синдрома цитолиза служили величины активности ферментов - астартатаминотрансферазы (АсТ) и аланина-минотрансферазы (АлТ), синдрома холестаза - активность щелочной фосфатазы (ЩФ) и концентрация билирубина. Величины перечисленных показателей определяли через 24 часа после заключительной инъекции препаратов и через 10 суток унифицированными методами с использованием стандартных наборов реактивов.

ГИО индуцировали однократным внутрибрюшинным введением ЭБ в дозе 2 х 10' и 5 х 108 клеток на 0,1 кг массы тела соответственно для крыс и мышей. Интенсивность развития ГИО на ЭБ оценивали на 5-е сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа клеток, образующих антитела (АОК) к ЭБ, (К Мальберг, Э.Зигль, 1987) методом прямого локального гемолиза, а также числа клеток, формирующих розетки (РОК) к ЭБ (X. Зауэр, 1987).

Результаты исследований обрабатывали статистически, вычисляли средние арифметические и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по показателю Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1980) и по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Е.В. Гублер, А.А. Генкин, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка методики спектрофотометрического

определения амикацина и гентамицина в субстанции и

биожидкостях. Предлагаемый способ определения основан на образовании труднорастворимого соединения антибиотиков с красителем кислотным черным С (КЧС) и последующим измерением оптической плотности надосадочной жидкости с помощью спектрофотометра. Для достижения высокой точности и чувствительности методики определяли оптимальные значения следующих параметров: аналитическая длина волны, рН среды, кон-

центрация реагента, время центрифугирования, температура, состав буферного раствора.

В качестве аналитической выбрана длина волны 675 нм, соответствующая максимуму поглощения КЧС. Исследования влияния рН среды показали, что оптимальный интервал значений рН составляет 1,8-2,6. Для его создания выбран 0,1 М раствор хлороводородной кислоты. Оптимальные условия центрифугирования - 10 мин при 8000 об/мин. Интервал температур, в котором оптическая плотность остается практически неизменной в течение 24 часов, от 16 до 25° С. В качестве реагента использовали 0,02% водный раствор КЧС. Оптимальное стехиометриче-ское соотношение антибиотик: КЧС для амикацина соответствует 1:4, для гентамицина - 1:5. Подчинение объединенному закону светопоглощения наблюдается при концентрации амикацина 111 мкг/мл, гентамицина -1-6 мкг/мл. Предел обнаружения (чувствительность) амикацина и гентамицина - соответственно составил 0,7 и 0,4 мкг/мл, что послужило основанием для использования разработанной методики при анализе антибиотиков в биожидкостях. Выделение антибиотиков из биожидкостей осуществляли методом колоночной гель-фильтрации. На первом этапе были подобраны оптимальные условия выделения препаратов из сыворотки крови и мочи. Пробы биожидкостей вносили на колонку (1x50 см), предварительно уравновешенную 0,01М раствором хлороводородной кислоты и ею же проводили элюирование. Сыворотку крови предварительно депротеинизиро-вали добавлением 30% трихлоруксусной кислоты в соотношении 2:1. Изучение распределения амикацина и гентамицина, внесенных с сывороткой крови и мочой, показало, что антибиотики в предлагаемых условиях выходят из колонки в свободном объеме, при этом общий объем фракций с препаратами при их определении в сыворотке составил 8 мл, а при определении в моче -5 мл. Оптимальная высота слоя сефадекса в колонке - 33 см, при этом происходит полное отделение амикацина и гентамицина от мешающих компонентов и проведение контрольного опыта с сывороткой и мочой, не содержащих препаратов, не требуется.

Для проверки воспроизводимости и точности методики были приготовлены и проанализированы модельные растворы антибиотиков в биожидкостях. Расчет содержания препаратов проводили по калибровочным графикам и их уравнениям с учетом объема образца, взятого на определение, и его последующего разведения. Разработанная нами методика позволяет определить в сыворотке крови в среднем 88,6% амикацина и 87,8%

гентамицина. Относительная ошибка определения амикацина не превышает ± 4,94 %, гентамицина - ± 4,73%. В моче определяется в среднем 95% амикацина и гентамицина, относительная ошибка определения амикацина - ± 2,65%, гентамицина -±2,77%. Эти данные позволили в дальнейших опытах "in vivo" судить об истинном содержании препаратов в биожидкостях.

Изучение кинетики гентамицина и амикацина в

биожидкостях при различных технологиях введения.

Для изучения кинетики антибиотиков препараты вводили одно-, двух- и трехкратно с интервалами 24 ч в форме субстанции и в эритроцитарных носителях. Разовые дозы свободных антибиотиков составляли для гентамицина 3 мг/кг, амикацина - 15 мг/кг, при введении в ТЭ- 1,6 и 7 мг/кг соответственно.

При введении свободных антибиотиков их максимальные концентрации в сыворотке крови обнаруживались через 1 час после инъекции и в среднем составляли в первый день 7,8 мкг/мл для гентамицина и 19,0 мкг/мл для амикацина. Через 36 часов после введения концентрации антибиотиков постепенно снижались, а через 24 часа не обнаруживались. При повторных введениях отмечалась кумуляция препаратов. Уровни антибиотиков в моче через 3 часа после первого введения составили 64,2 мкг/мл для гентамицина и 364,6 мкг/мл для амикацина. К 24-му часу они снижались до минимальных значений. При повторных инъекциях содержание антибиотиков в моче уменьшалось, что также является признаком кумуляции препаратов.

Антибиотики, введенные в ТЭ, были обнаружены в сыворотке крови черев 3 часа после инъекции, что свидетельствует об устойчивости эритроцитарных "контейнеров" к десорбции включенных в них антибиотиков. Через 12 часов после первого введения концентрация гентамицина достигала 4,1 мкг/мл, амикацина -7,4мкг/мл, а через 24 часа антибиотики в сыворотке крови не обнаруживались. В моче уровни антибиотиков нарастали в течение всего срока наблюдения и через 24 часа после 3-го введения составляли для гентамицина 154,5 мкг/мл, амикацина - 344,8 мкг/мл.

Состояние мембран и коррекция нарушений в условиях инфекционной патологии и введении аминогли-

козидных антибиотиков. Изучено влияние различных доз и схем введения амикацина и гентамицина на процессы ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов эритроцитов у здоровых и инфицированных стафилококком животных.

В результате проведенных исследований выявлено, что введение гентамицина в дозе 3 мг/кг и амикацина - 15 мг/кг здоровым животным в течение 5 суток приводило к достоверному увеличению уровней ДК и МДА в сыворотке крови при одновременном снижении активности СОД и ГР по сравнению с животными, не получавшими антибиотиков. Инфицирование стафилококком вызывало усиление процессов ПОЛ и снижение активности ферментов АОС. Введение низких доз антибиотиков (гентамицина - 0,5 мг/кг и амикацина - 3 мг/кг) в этих условиях приводило к повышению активности СОД и ГР и снижению концентрации продуктов ПОЛ как при 3-х-, так и при 5-тикратном введении, однако полной нормализации изучаемых показателей не происходило, 3-х- и 5-тикратные инъекции высоких доз антибиотиков (гентамицина-3 мг/кг, амикацина -15 мг/кг) снижали активность ферментов АОС и повышали концентрацию продуктов ПОЛ у инфицированных стафилококком животных, причем наиболее выраженный прооксидантный эффект оказывал гента-мицин (таблица 1).

Сопоставление полученных результатов с данными мониторинга свободных антибиотиков в сыворотке крови дает основание предполагать, что прооксидантное действие гентамицина и амикацина обусловлено появлением их в крови в высоких пиковых концентрациях, оказывающих дестабилизирующее действие на мембраны клеток и повышающих их проницаемость для АМК.

Инициация СРО фосфолипидов мембран рассматривается в настоящее время как одна из основных причин, приводящих к воспалительно-некротическим процессам и развитию синдрома цитолиза. При введении аминогликозидных антибиотиков в высоких дозах возрастает риск проявления их гепатотоксического действия. Учитывая это, изучено действие высоких доз аминогликозидных антибиотиков на процессы цитолиза и холестаза. Установлено, что 3-хкратные инъекции гентамицина и амикацина в дозах 3 и 15 мг/кг соответственно не влияли, а 5-тикратные - существенно повышали показатели цитолиза и холестаза как у здоровых, так и у инфицированных животных.

Нарушение структуры клеточных мембран в условиях инфицирования и антибиотикотерапии диктует необходимость совместного применения антибиотиков с антиоксидантными и мем-бранопротекторными препаратами. С этой целью изучено влияние сочетанного введения амикацина и гентамицина с эссенциале, ПВП или лизоцимом на показатели ПОЛ, АОС, цитолиза и холестаза. Результаты опытов показали, что эссенциале, ПВП и ли-

К)

Таблица 1

Выраженность ПОЛ и АОС эритроцитов у инфицированных животных при пятикратном внутримышечном введении антибиотиков

N п/п Условия опыта ПОЛ АОС

дк нмолъ/мл ВДА нмоль/мл СОД ЕД/мл/ эритроцит ГР мкМ/мл/ эритроцит

1. Контроль (интактные животные) 4,1+0,6 13,8±1,2 61,8+6,0 119,8+9,8

2. Инфицирование (без введения 7,4+0,7 19,8+1,4 42,3+4,1 04,8+6,4

(антибиотиков) Р1'0,05 Р1<0,05 Р1<0,05 Р1<0,05

3. Введение ГМ в дозе 0,5 мг/кг 6,0+0,6 17,1+1,3 54,4+3,9 95,4+8,1

Р1.2<0,05 Р1,2<0,05 Р1.£<0,05 Р1.2<0,05

4. Введение ГМ в дозе 1,5 мг/кг 7,5+0,9 22,4+1,1 49,4+3,3 91,8+7,1

Р1<0,05 Р1<0,05 Р1<0,05 Р1<0,05

5. Введение ГМ в дозе 3 мг/кг 10,4+1,2 31,4+3,5 36,8+3,3 63,3+5,9

Р1.2<0,05 Р1.2<0,05 Р1.2<0,05 Р1.2<0,05

6. Введение АМ в дозе 3 мг/кг 5,0+0,5 16,8+1,7 57,9+4,1 102,8±7,8

Р1,2<0,0 Р1.2<0,05 Р1.2<0,05 Р1.2<0,05

7. Введение АМ в дове 7 мг/кг 7,9+0,6 21,2+1,9 40,8+3,4 08,4+7,3

Р1<0,05 Р1<0,05 Р1<0,05 Р1<0,05

8. Введение АМ в дозе 15 мг/кг 9,5+1,1 25,8+2,6 34,5±2,9 70,1±5,3

Р1.2<0,05 Р1.2<0,05 Р1.2<0,05 Р1.2<0,05

зоцим в разной степени корригируют указанные выше показатели, дестабилизированные инфицированием и введением высоких доз аминогликозидных антибиотиков. Наиболее выраженное и пролонгированное действие оказывало сочетанное введение антибиотиков с эссенциале.

Использование клеточных систем для целенаправленной и контролируемой доставки лекарственных препаратов к органам и тканям позволяет значительно снизить их побочные эффекты при сохранении высокой терапевтической эффективности (Т.П. Генинг и до., 1988). Установлено, что антибиотики, введенные в ТЭ, не влияют на показатели, характеризующие ПОЛ, АОС, процессы цитолиза и холестаза у здоровых и нормализуют их у инфицированных животных.

Инверсия действия антибиотиков на изучаемые показатели может быть обусловлена отсутствием высоких пиковых концентраций препаратов в крови животных, так как они высвобождаются из эритроцитарных носителей постепенно, что подтверждено в исследованиях их кинетики. Однако, при исследовании показателей ПОЛ и АОС, цитолиза и холестаза через 10 дней отмечалась их дестабилизация, что, вероятно, связано с недостаточно продолжительной циркуляцией эритроцитарных носителей с антибиотиками в организме. Выживаемость эритроцитарных носителей in vivo определяется степенью отличия их структуры от нативных клеток (форма, размеры, архитектоника наружного примембранного слоя) (Т.П. Генинг и др., 1988). Увеличить время циркуляции носителей в организме, по-видимому, можно путем их обработки препаратами, стабилизирующими или модифицирующими мембраны клеток: эссенциале, ПВП и лизоци-ма. В результате исследований установлено, что наиболее четкая и стабильная нормализация показателей ПОЛ, АОС, цитолиза и холестаза, сохраняющаяся в течение 10 суток, наблюдается при введении ТЭ с включенными антибиотиками, дополнительно обработанных эссенциале.

Эритроцитарные носители с включенными антибиотиками проявляли высокую протективную активность при их введении животным, инфицированным летальными дозами стафилококка. Двухкратное введение ТЭ с антибиотиками обеспечило выживаемость до 65 % инфицированных животных.

Изменение функционального состояния иммуноци-тов и эритроцитов в условиях инфекционной патологии и введении аминогликозидных антибиотиков. Наруше-

ние структуры клеточных мембран и повышение в крови концентрации продуктов ПОЛ (ДК, МДА, ацилгидроперекисей) и цитолиза может приводить к развитию метаболической им-муносупрессии (Л.Г. Прокопенко и др., 1995). Учитывая это, изучено действие различных доз аминогликозидных антибиотиков на ГИО. Установлено, что введение здоровым животным гента-мицина и амикацина в низких дозах (0,5 и 3 мг/кг) стимулировало развитие ГИО на ЭБ, в то время как высокие дозы антибиотиков (3 и 15 мг/кг) оказывали иммуносупрессирующее действие.

Инфицирование живой культурой стафилококка приводило к угнетению иммунологической реактивности животных в отношении не родственных стафилококкам Т-зависимых антигенов (ЭБ). Низкие дозы антибиотиков не изменяли интенсивности иммунного ответа на ЭБ. Введение гентамицина в дозах 1,5 и Змг/кг и амикацина - 7 и 15 мг/кг дозозависимо усиливало им-муносупрессию у инфицированных животных.

Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют, что эритроциты являются важным звеном метаболической системы иммунологического гомеостаза, обеспечивающей сопряжение между биохимическими сдвигами возникающими в различных органах и функцией иммунорегуляторных популяций макрофагов (Л.Е. Сипливая, 1992). Установлено, что инфицирование стафилококком не вызывает появления у эритроцитов иммуномо-дулирующих свойств. Введение гентамицина и амикацина вызывает появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов здоровых и резко выраженных иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов инфицированных животных. Выявлено, что появление иммуносупрессирущей активности эритроцитов животных, получавших инъекции антибиотиков, обеспечивается гуморальными факторами сыворотки крова

Эритроциты, циркулирующие в сосудистом русле, представляют собой гетерогенную популяцию клеток, отличающихся по возрасту и соответственно этому - по плотности и функциональной активности (Т.В. Кобозев и др., 1978). Установлено, что выраженной иммуносупрессорной активностью обладает фракция легких эритроцитов, представленная в основном "молодыми" клетками. Тяжелые ("старые") эритроциты проявляли слабовыра-женную иммуностимулирующую активность.

Результаты экспериментов позволяют обосновать целесообразность поиска способов коррекции иммуносупрессорной активности гентамицина и амикацина с помощью препаратов, эк

ранирующих клеточные мембраны от воздействия гуморальных факторов сыворотки крови. С этой целью использовали эссен-циале, ПВП и лизоцим. Инъекции эссенциале совместно с антибиотиками стимулировали развитие иммунного ответа у здоровых и инфицированных животных. Введение гентамицина и ами-кацина совместно с ПВП или лизоцимом не изменяло иммунологическую реактивность здоровых животных. В условиях инфицирования сочетанное введение антибиотиков с лизоцимом нормализовано, а с ПВП - повышало (но не нормализовало) ГИО на ЭБ.

Эритроцитарные носители с включенными антибиотиками активно захватываются макрофагальными клетками печени и селезенки (Т.П. Генинг и др., 1988), и таким образом могут оказывать влияние на иммунологическую реактивность организма. Установлено, что ТЭ с амикацином и гентамицином стимулируют развитие иммуного ответа у здоровых и усиливают (но не нормализуют) у инфицированных животных (таблица 2).

С целью повышения иммуномодулирующей активности эритроцитарных носителей их обрабатывали эссенциале, ПВП или лизоцимом. Наиболее выраженной иммуностимулирующей активностью в условиях инфицирования обладали эритроцитарные носители с включенными антибиотиками, дополнительно обработанные эссенциале.

Взаимосвязь иммуномодулирующих факторов и факторов, влияющих на свободнорадикальные процессы. Иммуномодулирующий эффект стафилококка обусловлен как прямым влиянием на иммуноциты (М.М.Вядро, 1990; В.К. Позур и др., 1992), так и выделяющимися под его влиянием цито-кинами (С.А. Кетлинский и др., 1992; С.А. Кетлинский, Н.М. Калинина, 1995). Учитывая это, было изучено влияние надо-садочной жидкости неприлипающих и прилипающих клеток селезенки (НЖНКС, НЖПКС) инфицированных животных, получавших инъекции свободных и включенных в ТЭ антибиотиков, на ГИО, интенсивность ПОЛ и активность ферментов АОС у здоровых и инфицированных животных

Установлено, что НЖНКС, полученная от инфицированных стафилококком крыс, усиливает иммуносупрессию, вызванную введением стафилококка. НЖПКС инфицированных крыс при аллогенном переносе иммуномодулирующего эффекта не вызывала. Инъекции антибиотиков инфицированным крысам усиливали иммуносупрессирующую активность НЖНКС. НЖПКС инфицированных и получавших антибиотики крыс иммуномоду-

' Таблица 2

Изменение ГИО здоровых и инфицированных мышей при

введении ТЭ с включенными антибиотиками

N п/п Условия опыта АОК РОК

1. Контроль(здоровые мыши) 30,4+3,4 103,6+10,3

п ЗдороЕые мыши,введение 34,2±3,4 105,1+10,4

ТЭ

О о. Здоровые мыши,введение 41,2+4,1 131,8+13,8

ГМВТЭ Р1<0,05 Р1<0,05

4. Здоровые мыши,введение 51,3+5,1 156,2+14,3

АМВТЭ Р1<0,05 Р1<0,05

5. Инфицирование 13,6+1,3 53,4+5,3

Р1<0,05 Р1<0,05

6. Инфицированные мыши, 14,2+1,4 55,1+5,4

введение ТЭ Р1<0,05 Р1<0,05

7. Инфицированные мыши, 18,9+1,8 68,6+6,6

введение ГМВТЭ Р1.5<0,05 Р1.5<0,05

8. Инфицированные мыши, 22,4+2,4 79,6+7,1

введение АМВТО Р1.5<0,05 Р1.5<0,05

лирующей активностью не обладала. НЖНКС инфицированных крыс, не получавших и получавших антибиотики, увеличивали содержание ДК и МДА в сыворотке крови, уменьшали активность СОД и ГР в эритроцитах инфицированных животных. Свойством усиливать супрессию иммунного ответа и повышать НОЛ при аллогенном переносе обладала фракция НЖНКС содержащая белки с ММ 50-60 кДА.

Установлено, что инъекции инфицированным крысам ТЭ с включенными антибиотиками индуцируют выделение хелперно-го фактора прилипающими к стеклу спленоцитами. Введение инфищфоваыным крысам НЖПКС животных получавших инъекции ТЭ с антибиотиками снижало величины показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и активность ферментов АОС, усиливало ГИО на ЭБ. Фракционирование и введение животным белков НЖПКС с различной молекулярной массой показало, что антиоксидантным действием обладает низкомолекулярная фракция белков (ММ 10-12 кДа), а иммуностимулирующим. - высокомолекулярная (ММ более 150 кДа) (таблица 3).

Таблица 3

Влияние фракций НЖПКС инфицированных крыс,получавших ТЭ с гентамицином на показатели ПОЛ,АОС и ГИО инфицированных животных

N

п/п

Условия опыта

М

ОДА

СОД

ГР

АОК

РОК

1. Контроль(интактныэ крысы) з,0±о,4 11,9±1,9 59,2±5,4 128,6111,6 29,4*2,9 96.619,4

О А. . Инфицирование 6,1+0,6 19,1+1,0 41,2+4,2 91,8+9,8 15,311,3 63,4+6,9

Р1<0,05 р-1<.0,05 Pi <.0,05 Pi < 0,05 Р1<0,05 Р1<0,05

3. Введение 1-й фракции 4,1+0,5 12,8+1,3 57,9+5,1 121,4+10,9 16,0+1,7 59,315,8

(ММ 10 - 12 кДа) Р2<0,05 Р2<0,05 Р2<0,05 Р2<0,05 Р2>0,05 Р2>0,05

4. Введение 2-й фракции 6,4+0,7 22,9+2,3 38,1+3,2 92,3+9,3 13,8+1,1 62,2+6,4

(ММ 50 - 60 кДа) Р2>0,05 Р2>0,05 Р2>0,05 Р2>0,05 Р2>0,05 Р2>0,05

5. Введение 3-й фракции 5,9±Q,5 21,4+1,8 41,8+4,9 88,6+8,1 38,6+3,8 144,1+10,4

(ММ > 150 кДа) Р2>0,05 Р2>0,05 Р2>0,05 Р2>0,05 Р2<0,05 Р2<0»05

выводы

1. Разработана чувствительная, точная, экспрессная методика спектрофотометрического определения гентамицина и ами-кацина в биожидкостях организма, в основе которой лежит реакция взаимодействия антибиотиков с азокрасителем кислотным черным специальным.

2. При внутримышечном введении антибиотиков инфицированным животным наблюдаются высокие концентрации препаратов через час после инъекции. При введении антибиотиков, включенных в ТЭ, уровень препаратов в сыворотке крови нарастает постепенно, не создавая "пиковых" концентраций.

3. Гентамицин и амикацин, введенные внутримышечно в низких дозах ( соответственно 0,5 и 3 мг/кг), снижают выраженность ПОЛ и повышают активность ферментов АОС, не изменяя показателей цитолиза, холестаза и иммунологической реактивности инфицированных стафилококком животных. Введение этих препаратов в высоких дозах (соответственно 3 и 15мг/кг) усиливает ПОЛ, приводит к развитию синдромов цитолиза и холестаза, снижает активность антиоксидантных ферментов и иммунологическую реактивность как у здоровых, так и у инфицированных животных.

4. Введение антибиотиков в эритроцитарных носителях не влияет на показатели характеризующие выраженность процессов СРО, цитолиза и холестаза у здоровых и нормализует данные показатели у инфицированных стафилококком животных, стимулирует иммунологическую реактивность как у здоровых, так и у инфицированных животных.

5. Введение эссенциале, лизоцима и ПВП снижает проокси-дантное и иммуносупрессорное действие гентамицина и амика-цина. Наиболее эффективное и продолжительное действие оказывает эссенциале. Дополнительная обработка ТЭ с включенными антибиотиками эссенциале пролонгирует их действие.

6. Введение свободных антибиотиков вызывает выделение цитокинов неприлипающей к стеклу фракцией спленоцитов (ММ 50-60 кДа), обладающих иммуносупрессирующей и про-оксидантной активностью. Введение включенных в ТЭ антибиотиков вызывает выделение цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезенки, проявляющих антиоксидантное (ММ более 150 кДа) и иммуностимулирующее (ММ 10-15 кДа) действие.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коррекция иммуносупрессорного действия антибиотиков-аминогликозидов при стафилококковой инфекции//Тез. докл. Ill Российский национальный конгресс "Человек и лекарство".- М.,

1996. -С. 49-49. Соавт.: Л.Е. Сипливая, И. Л. Ласкова.

2. Влияние антибиотиков - аминогликозидов и модифицированных ими эритроцитов на процессы свободнорадикального окисления в условиях стафилококковой инфекции// Актуальные вопросы дерматовенерологии- Курск, 1997.- 0.76-77.

3. Антиоксидантное и иммуномодулирующее действие некоторых антибиотиков и обработанных ими эритроцитов при стафилококковой инфекции //Материалы итоговой научной сессии КГМУ.- Курск, 1997.: С. 141-141. Соавт.: Л.Г. Прокопенко, Л.Е. Сипливая.

4. Разработка методики количественного определения гента-мицина сульфата// Материалы итоговой научной сессии КГМУ.- Курск, 1997.- С. 177-177. Соавт.: Л.Е. Сипливая.

5. Спектрофотометрический анализ амикацина сульфа-та//Материалы итоговой научной сессии КГМУ,- Курск, 1997.-С. 177-177. Соавт.: Л. Е. Сипливая

6. Иммуномодулирукмцая активность некоторых аминогликозидов, введенных в эритроцитарных носите лях//Тез. докл. IV Российский национальный конгресс "Человек и лекарство".-М.,

1997,- С.293-293. Соавт.: Л. Е. Сипливая.

7. Сравнительная оценка иммуномодулирующей активности антибиотиков при различных способах введения //Актуальные вопросы медицины и фармации: Материалы итоговой научной конференции студентов и молодых ученых." Курск : КГМУ, 1997.- С. 22-22. Соавт.: Л. Е. Сипливая.

8. Влияние аминогликозидных антибиотиков на свободаора-дикалыюе окисление липидов в норме и при стафилококковой инфекции//Актуальные проблемы медицины и фармации: Материалы итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. - Курск, 1998. -С. 28- 29. Соавт. : Л. 1. Прокопенко, Л. Е. Сипливая.

9. Антиоксидантное действие аминогликозидных антибиотиков, введенных в эритроцитарных носителях//Актуальные проблемы медицины и фармации: Материалы итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. -Курск, 1998 ол 30. Соавт. : Л. Е. Сипливая, Л. Г. Прокопенко.

Формат 60X84 1/16. Бумага для множительных аппаратов, копировальном аппарате КГСХА. Усл. пен. л. 1,0. Уч. -изд. л. Тираж 100 зкз.